Aislamiento e Identificacion de Cocos Gram Positivos

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS: GENERO STAPHYLOCOCCUS INTRODUCCION Los Estafilococos pertenecen a Familia Micricococcaceae y son organismos redondos u ovales, agrupados generalmente en forma de racimos, inmóviles, no esporulados y Gampositivos en los cutivos jóvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como patógeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde forunculos, abscesos, intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus, solo dos tienen importancia medica. Solo la especie patógena S. aureus produce una enzima llamada coagulasa. MARCO TEORICO Este género Estafilococos pertenece a la familia Staphylococacceae, orden Bacillales, clase Bacilli, Phylum Firmicutes. Dentro del género Staphylococcus hay 55 especies y subespecies, siendo las más importantes desde el punto de vista clínico las siguientes: - Staphylococcus aureus subsp. aureus - Staphylococcus epidermidis, y - Staphylococcus saprophyticus subsp. Saprophyticus El microorganismo más importante por su patogenicidad es Staphylococcus aureus, que se caracteriza por poseer una enzima que coagula el plasma: la coagulasa. Esta prueba permite distinguir a S. aureus del resto de especies de estafilococos que aparecen clínicamente, que no poseen dicho enzima. Los estafilococos de interés en patología humana que no pertenecen a ninguna de las especies anteriores se informan en el laboratorio como estafilococos coagulasa negativos (SCN) y aunque son colonizadores habituales del ser humano no producen enfermedad tan importante como los anteriores. Patógenos comunes S. haemolyticus S. lugdunensis Patógenos infrecuentes S. capitis S. saccharolyticus S. hominis S. warneri S. auricularis S. cohnii Algunas especies de géneros diferentes, anteriormente relacionados taxonómicamente, como Micrococcus luteus o Kocuria rosea, que raramente producen infecciones en humanos, tienen características fenotípicas muy similares desde el punto de vista morfológico y bioquímico a los estafilococos, por lo que conviene saber diferenciar ambas especies de las del género Staphylococcus.

Características microscópicas y de tinción . Las bacterias pertenecientes a esta especie son cocos, con forma casi esférica. Forman masas arracimadas, viéndose como bacterias Gram positivas. No tienen flagelos, no forman esporas y excepcionalmente pueden tener cápsula. En los cultivos viejos los estafilococos pueden aparecer como bacterias Gram negativas. Características de cultivo . Son poco exigentes en sus necesidades; crecen bien en cualquier medio ordinario, aunque lo hacen mejor en los medios enriquecidos. Son aerobios y anaerobios facultativos, con una temperatura óptima de crecimiento entre 30-37ºC. Una particularidad de los miembros de este género es que crecen en medios con una elevada concentración de ClNa que no soportan el resto de los microorganismos (son bacterias halófilas). Esto permite la creación de medios de cultivo casi específicos para los estafilococos. Las colonias son visibles fácilmente, sobre todo en agar sangre, con forma redonda y aplanada, bordes netos, superficie lisa y brillante, consistencia variable y en algunas ocasiones, hemolíticas. Algunas cepas pueden producir un pigmento carotenoide que les da una coloración amarillenta (S. aureus). La producción de este pigmento es mucho más evidente en agar chocolate o a temperatura ambiente. En caso de partir de una muestra con flora polimicrobiana, será conveniente utilizar medios diferenciales o inhibidores que nos permitan evitar el crecimiento de aquellos microorganismos no deseados, o visualizar mejor las colonias de S. aureus cuando éstas aparezcan en el medio.

Entre los medios específicos para su recuperación tenemos el medio de Chapman, que posee manitol y una alta concentración de ClNa (10%). El ClNa impide el crecimiento de otros microorganismos, y el manitol, al ser metabolizado por el S. aureus, proporciona un pH ácido al medio que provoca el cambio de color del indicador rojo fenol, haciendo que las colonias tengan un color amarillo sobre un fondo rosado. El medio de Baird-Parker permite el crecimiento de estafilococos y otros gérmenes Gram positivos, presentándose las colonias de S. aureus negras, brillantes, convexas, y rodeadas de un halo brillante de 2 a 5 mm de diámetro. El agar sangre con inhibidores (Acido Nalidíxico) también se utiliza para la recuperación de este microorganismo, apareciendo las colonias de la misma manera que lo hacen en agar sangre. En C.L.E.D. las colonias de S. aureus aparecen con una coloración amarillenta no debida a la pigmentación, sino a la fermentación de la lactosa que lleva incorporada el medio y al cambio de color del indicador. El agar DNasa contiene DNA, y se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa en bacterias. S. aureus producirá una lisis del DNA presente en la placa si posee este enzima, con el consiguiente aclaramiento del medio. Pruebas bioquímicas para identificación del género Staphylococcus Además de la tinción de Gram, que debe mostrar un frotis con cocos Gram positivos, arracimados, existen otras pruebas que nos van a permitir identificar correctamente a los miembros del género Staphylococcus. La distinción fundamental debemos hacerla con aquellas bacterias que muestren unas características morfológicas y de tinción semejantes, como son Micrococcus, Kocuria, Streptococcus y Enterococcus.

Las dos pruebas más importantes para poder discernir entre los géneros aludidos anteriormente son:

Catalasa: La prueba de la catalasa se utiliza para diferenciar microorganismos procedentes de cultivos en los que, al hacer una tinción de Gram, se observan cocos Gram positivos. La prueba de la catalasa es positiva para los géneros Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria y negativa para Streptococcus y Enterococcus, que morfológica y tintorialmente pueden aparecer de forma similar. Lisostafina: La lisostafina es un enzima que rompe la pared de Staphylococcus y no tiene acción sobre Micrococcus / Kocuria; por esta razón se utiliza para diferenciar estos géneros. En presencia de lisostafina, una suspensión (turbia) de estafilococos acabará lisándose, y por lo tanto perderá esa turbidez inicial. La lisostafina, al no ejercer ningún efecto sobre Micrococcus / Kocuria; mantendrá la misma turbidez que originalmente tenía la suspensión. Otras pruebas que nos pueden ayudar a diferenciar con precisión entre ambos géneros se muestran en la siguiente tabla: Staphylococcus Micrococcus / Kocuria Fermentación de glucosa (*) + Lisostafina (*) S R Lisozima R S Oxidasa modificada - + Sensibilidad a Nitrofurantoína (*) S R Sensibilidad a Bacitracina (*) R S Crecimiento anaerobio - + Diferenciación de especies del género Staphylococcus Enfermedades producidas por los estafilococos Los estafilococos son parte de la flora bacteriana normal de piel, mucosas y tracto respiratorio superior. Sin embargo en determinadas ocasiones son capaces de lesionar gravemente al huésped dando lugar a diversos cuadros infecciosos, entre los cuales destacan: - Absceso cutáneo: foco localizado de infección en la piel, - Síndrome de piel escaldada ( dermatitis exfoliativa ), - Bacteriemia: paso del microorganismo a la sangre a partir de un foco dérmico, - Endocarditis: infección de válvulas cardiacas, - Osteomielitis: infección del hueso, - Neumonía: 2ª a gripe o a bacteriemia, - Infecciones urinarias: más frecuentes en mujeres, - Conjuntivitis: infección de la conjuntiva, y - Síndrome del shock tóxico: en mujeres que utilizan tampones absorbentes. Las toxinas estafilocócicas responsables de la mayor parte de los efectos perjudiciales de estos gérmenes sobre el huésped son: - Hemolisinas y leucocidina (actúan sobre células sanguíneas) - Enterotoxinas (responsables de las toxiinfecciones alimentarias) - Exfoliatina (responsable del síndrome de piel escaldada) - Exotoxinas pirógenas (productoras de hipertermia)

- Enzimas estafilocócicas: Coagulasa, hialuronidasa y estafiloquinasa. La inmunidad que dejan las infecciones estafilocócicas es generalmente escasa y poco duradera. Susceptibilidad antimicrobiana de los estafilococos En general, los estafilococos son microorganismos bastante sensibles a la mayoría de los antimicrobianos tradicionales. Sin embargo la aparición de resistencia ante un antibiótico parece extenderse a todos los demás, resultando algunas cepas resistentes a la mayoría de los antimicrobianos utilizados. La presencia de un enzima ß-lactamasa (codificada y trasmitida mediante plásmidos), condiciona la resistencia de estos microorganismos a todos los antibióticos beta lactámicos (penicilina y derivados). La aparición de penicilinas que resistían la acción de las beta lactamasas, como oxacilina o meticilina, pareció solucionar el grave problema que representaba la inutilidad terapéutica de la penicilina G. En la actualidad se utilizan sustancias no antibióticas que se unen irreversiblemente a las betalactamasas impidiendo su acción posterior. Son el ácido clavulánico y el sulbactam. En estos últimos años ha aparecido en España un aumento de resistencia de los estafilococos a la meticilina, considerándose un grave problema a nivel hospitalario. Estas cepas se denominan MRSA (Staphylococcus aureus meticilin resistentes). Antibióticos tradicionales tales como vancomicina o lincomicina siguen siendo buenas opciones para el tratamiento de las infecciones producidas por estos microorganismos. Sin embargo nuevas moléculas como roxitromicina o teicoplanina aparecen para aliviar la presión que sufren los hospitales ante este aumento de resistencias a los antibióticos comúnmente utilizados. El siguiente cuadro resume la susceptibilidad actual de S. aureus a los antimicrobianos más importantes: Resistencia 90% Penicilina G Ampicilina Aztreonam

CUESTIONARIO: 1.

Que factores condicionan la patogenicidad de Staphylococcus aureus.

Contiene varias características en sus factores de virulencia. En su estructura se encuentran los ácidos teicoicos y lipoteicoico, y lospéptidoglicanos. Los ácidos le sirven para adherirse a superficies corporales junto con las especies de estafilococo que tienen cápsula, y en conjunto los ácidos teicoicos y el péptidoglicano tienen la característica que activan el sistema inmune del complemento y sirven además de evasores de la fagocitosis. Entre sus factores de virulencia que le sirven para la invasión están: 

La presencia de catalasa.



La presencia de coagulasa en el caso del S. aureus (patognomónico).



La fermentación del azúcar Manitol específico como la coagulasa del estafilococo aureus (el más importante).



Presencia de B lactamasa, que rompe el anillo b lactámico de los antibióticos con esta estructura

2.

Que características fisiológicas identifican a Staphylococcus aureus. Al gram se evidencia como una cocácea gram positiva de 1um dispuesta en racimos, aunque también se le puede evidenciar en cadenas cortas o diplococos. Es inmóvil y no forma esporas. Es anaerobio facultativo y crece bien en agar sangre a 37ºC. Es habitual encontrar una colonia mediana, a veces Bhemolítica, de bordes definidos, blanca o en ocasiones dorada, conociéndose también como el Staphylococcus dorado. El hombre es portador asintomático entre un 20 y un 40% de los adultos sanos y forma parte de la flora normal de muchos sitios del organismo como piel y nasofaringe y tracto gastrointestinal, causando diversas manifestaciones clínicas.

3.

Mencione de que cuadros infecciosos son causantes las especies de Staphylococcus. Absceso cutáneo: foco localizado de infección en la piel, - Síndrome de piel escaldada ( dermatitis exfoliativa ), - Bacteriemia: paso del microorganismo a la sangre a partir de un foco dérmico, - Endocarditis: infección de válvulas cardiacas, - Osteomielitis: infección del hueso, - Neumonía: 2ª a gripe o a bacteriemia, - Infecciones urinarias: más frecuentes en mujeres, - Conjuntivitis: infección de la conjuntiva, y - Síndrome del shock tóxico: en mujeres que utilizan tampones absorbentes.

4.

Cuál es la composición del Medio hipertónico de Chapman. El medio de Chapman, posee manitol y una alta concentración de ClNa (10%). El ClNa impide el crecimiento de otros microorganismos, y el manitol, al ser metabolizado por el S. aureus, proporciona un pH ácido al medio que provoca el cambio de color del indicador rojo fenol, haciendo que las colonias tengan un color amarillo sobre un fondo rosado.

Volumen III de la segunda edición del Manual Bergey de Bacteriología Sistemática, en la sección de "Bacterias Gram positivas con bajo porcentaje de contenido en G+C" 1989, USA.

Katia Abarca V., Patricia García. y Pablo Vial C. Microbiología Clínica. Ediciones Universidad Católica de Chile, Santiago de Chile – Chile, 2001. AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS: GENERO STREPTOCOCCUS INTRODUCCION El genero Streptococcus comprende muchas especies agrupadas según la clasificación de Lancefield en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningún grupo). Con la coloración de Gram se comportan como positivos adoptando formas de cadenas. Algunos son patógenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del cuerpo y otros son saprofitos. Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, que permite diferenciar algunas especies en base a ala hemolisis producida. La hemolisis tipo α es incompleta, los globulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente dañados pero no lisados como sucede en la hemolisis tipo β. Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. El grupo de estreptococos alfa hemolíticos se denominan S. viridans. La mayoría de Streptococcus pueden desarrollar en presencia o ausencia de oxigeno. Diversas pruebas bioquímicas permiten la diferenciación de las especies de Streptococcus. MARCO TEORICO El género Streptococcus es un grupo de bacterias formado por cocos grampositivos pertenecientes al filo firmicutes y al grupo de las bacterias ácido lácticas. Estas bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada división celular ocurre a lo largo de un eje. De allí que su nombre, del Griego ςτρεπτοσ streptos, significa que se dobla o retuerce con facilidad, como una cadena. Los Streptococci son oxidasa– y catalasa– negativos. Las especies de estreptococus que producen enfermedades son: 

Estreptococos del grupo A: Streptococcus pyogenes producen amigdalitis e impétigo.



Estreptococos del grupo B: Streptococcus agalactiae producen meningitis en neonatos y trastornos del embarazo en la mujer.



Neumococo: Streptococcus pneumoniae, es la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad.



Streptococcus viridans, es una causa importante de endocarditis y de abscesos dentales.



Streptococcus mutans, causa importante de caries dental. Pertenece al grupo de estreptococos viridans.

Algunas especies de los grupos C y G tienen en su pared la proteína G, que, por su capacidad de unión a anticuerpos, tiene importantes aplicaciones en biotecnología. Características La mayoría de las especies de Streptococcus son anaerobios facultativos, y algunos crecen únicamente en una atmósfera enriquecida con dióxido de carbono (crecimiento capnofílico). Sus exigencias nutricionales

son complejas, y su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar carbohidratos produciendo ácido láctico y también son catalasa negativos a diferencia de los estafilococos.

Clasificación Véase también: Sistema de Lancefield. La diferenciación de las especies que componen este género es complicada debido a que utilizan tres sistemas diferentes: 

Propiedades serológicas (grupos de Lancefield). 





Grupos de la A a la W

Patrones hemolíticos: 

Hemólisis completa (hemólisis beta *β+)



Hemólisis incompleta (hemólisis alfa *α+)



Ausencia de hemólisis (hemólisis gamma *γ+)

Propiedades bioquímicas 

Pruebas bioquímicas

Los grupos de Lancefield (creados por Rebeca Lancefield en 1933) se basa en la identificación de antígenos específicos de grupo la mayoría de los cuales son carbohidratos de pared celular. Algunos pueden identificarse con pruebas inmunológicas instantaneas, por ejemplo, en la identificación de Streptococcus pyogenes para iniciar el tratamiento antibiótico. Desgraciadamente muchos estreptococos α-hemolíticos y no hemolíticos carece de los antígenos de pared celular y no son específicos. Patogénesis A pesar de las enfermedades infecciosas que causan algunas especies de estreptococo, otras no son patógenas. Los estreptococos forman parte de la flora saprófita de la boca, piel, intestino y el tracto respiratorio superior de los humanos. Por regla general, las especies individuales de los estreptococos se clasifican basados en sus propiedades hemolíticas. Estreptococo Alfa-Hemolítico Neumococo 

S. pneumoniae, causante de neumonía bacteriana, otitis media y meningitis.

Son diplococos gram positivos. Al microscopio óptico se ven como cocaceas gram positivas de aspecto lanceolado (forma de grano de arroz). En cultivo en agar sangre de cordero se observan a la lupa de luz como colonias umbilicadas (elevación central) Viridans y Otros 

S. mutans, un contribuyente para caries dental.



S. viridans, causa de endocarditis y Abscesos dentales.



S. thermophilus, usado en la manufactura de algunos quesos y yogurts.



S. constellatus, patógeno humano ocasional, notable como colonias con crecimiento en Agar Sangre con fuerte olor a caramelo.

Estreptococos Beta-Hemolíticos Grupo A S. pyogenes (también conocido como GAS) es el agente causal en las infecciones estreptocócicas del Grupo A, (GAS) incluyendo faringitis estreptocócica (amigdalitis), fiebre reumática aguda, fiebre escarlata, glomerulonefritis aguda y fascitis necrotizante. Si la amigdalitis no es tratada, puede desarrollarse fiebre reumática, una enfermedad que afecta las articulaciones y lasválvulas cardiacas. Otras especies de Streptococcus también pueden poseer el antígeno del Grupo A, pero las infecciones en humanos por cepas no-S. pyogenes GAS (algunas cepas S. dysgalactiae subsp. equisimilis y del Grupo S. anginosus) parecen no ser comunes. La infección por Estreptococos Grupo A es diagnosticada generalmente con una Prueba Rápida de Estreptococos o mediante Cultivo. El método más comúnmente empleado en los laboratorios clínicos para la identificación presuntiva en cultivos de Streptococcus Beta-hemolítico del grupo A (Streptococcuss pyogenes) es la prueba de susceptibiidad a la bacitracina o Taxo A. Otra manera es detectar el antígeno A mediante enzimoinmunoanálisis o inmunoaglutinación. Grupo B S. agalactiae, o GBS, causa neumonía y meningitis en neonatos y en las personas más jóvenes, con bacteremia sistémica ocasional. Estos también pueden colonizar los intestinos y el tracto reproductor femenino, incrementando el riesgo de ruptura prematura de membranas y la transmisión al infante. El Colegio Americano de Obstétras y Ginecólogos, la Academia Americana de Pediatras y los Centros para el Control de las Enfermedades recomiendan a todas las mujeres embarazadas entre 35 y 37 semanas de gestación la evaluación para GBS. Las mujeres que obtengan un examen positivo debería recibir antibióticos profilácticos durante la labor, con lo cual usualmente prevendrá la transmisión al infante. En el Reino Unido, los clínicos han sido lentos en la implementación de los mismos estándares como en los Estados Unidos, Australia y Canadá. En el Reino Unido, solamente un 1% de unidades de maternidad han verificado la presencia del Estreptococo Grupo B. Aunque el Real Colegio de Obstetras y Ginecólogos expidieron normativas basadas en el riesgo en 2003 (dada la revisión en 2006), la implementación de estas normativas ha sido irregular. Algunos grupos sienten que como resultado 75 infantes en el Reino Unido mueren cada año por enfermedad relacionada con GBS y otros 600 o más sufren infección seria, la mayoría de los cuales pudieran ser prevenidos; no obstante, esto debe aún ser probado por RCT en el escenario del Reino Unido y, dada la evidencia para la eficacia de la evaluación y tratamiento desde otros países, podría ser que el necesario ensayo a gran escala no recibiría respaldo ni aprobación ética. Grupo C S. equi, el cual causa enfermedad en caballos, y S. zooepidemicus, el cual causa infecciones en varias especies de mamíferos incluyendo al ganado y caballos. Este también puede ocasionar muerte en gallinas y alces. Muchos habitantes de las montañas en Canadá han encontrado cadáveres de alces yaciendo en la

mitad del camino; las pruebas post mórtem han establecido la presencia de estreptococos del grupo C en su sangre.

Grupo D (Enterococos) *hemolísis de tipo variable Muchos estreptococos del Grupo D han sido reclasificados y ubicados en el Género Enterococcus (incluyendo S. faecalis, S. faciem, S. durans, y S. avium). Por ejemplo, Streptococcus faecalis se conoce en la actualidad como Enterococcus faecalis. Las cadenas remanentes no-enterocócicas del Grupo D incluyen Streptococcus bovis y Streptococcus equinus. Estreptococos no hemolíticos Los estreptococos no hemolíticos rara vez causan enfermedad. Sin embargo, estreptococos del grupo D betahemolíticos débilmente hemolíticos y Listeria monocytogenes no deben ser confundidos con estreptococos no hemolíticos.