Actividad Enzimatica

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-INF-V1-2019-015

DEPARTAMENTO:

CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

CARRERA:

☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

ASIGNATURA:

Enzimologìa

PERIODO LECTIVO:

2020-2021

NIVEL:

DOCENTE:

Anabell Urbina

NRC:

3987

PRÁCTICA N°:

ESTUDIANTE(s): TEMA DE LA PRÁCTICA: INTRODUCCIÓN:

6to 1

Cando Merino Wendy Carolina

Actividad Enzimática

Las enzimas son el grupo más variado y experto de las proteínas cuya función es proceder como catalizador dando paso así a las reacciones químicas necesarias en los seres vivos para el metabolismo celular permitiendo desarrollarse a un ritmo preciso (Brix Lab, 2014). Un catalizador por definición es un compuesto que aumenta la velocidad de la reacción sin experimentar ningún cambio. Las enzimas por otro lado son capaces de acelerar reacciones químicas específicas en un medio acuoso, y en condiciones no biológico, serían incapaces de realizar iguales funciones (Franklin, 2006). Su capacidad catalizadora depende de su conformación, la supresión de alguno de sus niveles de estructuración, causa la pérdida de funcionamiento. Gran parte de sus propiedades catalíticas radica en el alto grado de especialización que presentan respecto a las sustancias reaccionantes o sustratos. Al igual que las proteínas, hay de diferentes tamaños y requerimientos; algunas necesitan para desarrollar su actividad tan sólo su estructura aminoacídica, mientras que otras requieren la presencia de un cofactor. Muchas vitaminas, o derivados de las mismas, funcionan como coenzimas. La enzima completa junto a su cofactor se denomina holoenzima y su parte exclusivamente proteica apoenzima (Merino Pérez et al., 2015).Se denomina reacción enzimática a las reacciones que se dan por enzimas, las reacciones sean catalizadas o no, dependen para su desarrollo de las leyes termodinámicas. El principal parámetro que, desde el punto de vista termodinámico, permite deducir si una reacción se desarrolla o no de forma espontánea, es el cambio en la energía libre de Gibbs, (ΔG) deducido de la segunda ley de la termodinámica (una reacción es espontánea si la entropía global del universo aumenta), que mide la capacidad de un sistema para desarrollar trabajo. Existen tres factores que están asociados con la actividad enzimática los cuales son el pH, la temperatura, estos son esenciales para actividad enzimática y tiene una relación con la apoenzima es decir la parte proteica de una enzima lo cual puede llevar a la enzima a acelerarla, disminuirla o desactivarla, mientras que concentración de la enzima y del sustrato tienen más relación con la velocidad de la reacción. Él pH permite que la velocidad de una reacción aumente o disminuya en la reacción enzimática. La temperatura optima hace que las reacciones sucedan sin problemas, pero si esta aumenta esto acelera la velocidad de la reacción, pero si se pasa de lo óptimo llega a la desnaturalización irreversible, si por el contrario es baja, la velocidad de reacción disminuye por ende si es más baja ya no hay actividad enzimática. Concentración de la enzima y del sustrato, están relacionado con la velocidad de reacción, pero si algo podemos rescatar es que, si la concentración del sustrato es constante y la concentración de la enzima se incrementa, lo que hace que aumente la velocidad de la reacción. Si bien es cierto en una reacción química la conversión de sustrato en producto requiere una situación energética intermedia que se denomina estado de transición, donde el nivel de energía es superior al del sustrato o del producto. La diferencia entre el nivel de energía basal y la correspondiente al estado de transición se denomina energía de activación y cuanto más alta sea menor será la velocidad de reacción. La presencia del catalizador provoca una disminución en la energía de activación requerida, y de esta forma aumenta la velocidad con que se desarrolla la misma (Merino Pérez et al., 2015). Finamlemte la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa (EC 3.2.1.168) hidroliza el enlace glucosídico de un sustrato que añadimos, la hesperidina, un glicósido natural formado por la unión de rutinosa con hesperetina. La rutinosa que se libera es el disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosa y tiene carácter reductor (en el C1 de la glucosa) (Neher et al., 2016).Las enzimas tienen variedad de funciones dentro de la célula: degradan azúcares, sintetizan grasas y aminoácidos, copian fielmente la información genética, participan en el reconocimiento y transmisión de señales del exterior y se encargan de degradar subproductos tóxicos para la célula, entre muchas otras funciones vitales (Ramírez, 2014). OBJETIVOS:

1. Realizar una simulación de enzima, sustrato a diferente pH y temperatura mediante el laboratorio virtual (Biomodel) con la enzima la 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa para observar cómo varía la absorbancia (540 nm). 2. Observar la variaciòn de la absorbancia a diferentes pH, temperatura y de forma constante para determinar el crecimiento enzimático como su decadencia. 3. Investigar cada uno de los resultados obtenidos para comprender y explicar cada uno de los CODIGO: FRM.6.3

REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-INF-V1-2019-015

comportamientos de la actividad enzimatica de 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, EC 3.2.1.168, de Actinoplanes missouriensis. MATERIALES: EQUIPOS:



Computadora

MATERIALES:

 

Internet Laboratorio Virtual (Biomodel) Excel

 PROCEDIMIENTO (METODOLOGÍA)

Se procedió a ingresar a el laboratorio virtual (Biomadel), luego se buscó el ensayo de actividad enzimática para realizar la misma practica una vez que se ingresó se procedió a leer todo lo descrito se usó de forma correcta el laboratorio virtual. Una vez leído todo se siguió los siguientes pasos: 1. Se desplazo los controles para elegir un pH y una temperatura para el ensayo. 2. Luego se pulso, en orden, los botones donde se añadió los componentes de la reacción a la cubeta del ensayo. El botón “añadir sustrato” permitió el vacío antes la cubeta. El botón “añadir muestra” inicio la incubación. 3. Una vez que se desarrolló el color, seguidamente se pulso el espectrofotómetro el botón que midió la absorbancia y se anotó su valor. 4. Se dio la modificación de forma sistemática en el pH o la temperatura y se anotó cada valor de absorbancia en el Excel y en el mismo simulador.

Ilustración 1. Simulación de laboratorio virtual con sus respectivos materiales. 5. Una vez que se guardo los datos en el Excel se realizó una gráfica de dispersión, así como una de líneas o áreas para poder explicar la actividad en cada uno de los ejemplares que se realizó. 6. Primer ejemplar a temperatura constante donde vario el pH como se observa en la siguiente tabla 1

Tabla 1. Datos del ejemplar 1 (Temperatura Constante y variación del pH) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

CODIGO: FRM.6.3

pH 2 4 5 6 7 8 9 10 11

Tº 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Abs 0,003 0,003 0,006 0,02 0,035 0,053 0,099 0,002 0,003

REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-INF-V1-2019-015

7. Segundo ejemplar a un pH constante y vario la temperatura y los datos del mismo se presenta en la tabla 2.

Tabla 2. Datos del ejemplar 1 (pH Constante y variación de la Temperatura) 1 2 3 4 5 6

pH 7 7 7 7 7 7

Tº 30 45 55 65 75 80

Abs 0,035 0,096 0,392 0,73 0,781 0,639

RESULTADOS OBTENIDOS:

Al trabajar con la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, EC 3.2.1.168, de Actinoplanes missouriensis cuando el ejemplar 1, trabaja a una temperatura constante de 30º C se observa que varía el pH es por ello que se puede apreciar en la figura 1 que hay un crecimiento de actividad enzimática desde cuando su pH es 2 con 0,0030 A540 hasta  9 con 0,099 A 540 siendo 9 su pH óptimo ya para cuando su pH es 10 este decae es decir la enzima se desnaturaliza, lo cual podemos corroborar en la figura 2 ya que hay exactitud con datos numéricos es por ello que se tomó más de 5 datos para saber cómo se comportaría y cuando decaería, estos datos se obtuvieron de la tabla1 con la ayuda de biomodel. Por otro lado, tenemos al ejemplar 2 cuando su pH de 7 es constante y varia la temperatura el cual se obtuvo con los datos de la tabla2 por ende se pudo apreciar la absorbancia de la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, EC 3.2.1.168, de Actinoplanes missouriensis esta va creciendo desde los 30º C con 0,035 A540 hasta los 75º C con 0,789 A540 donde se puede decir que su temperatura adecuada es a los 75º de ahí en adelante esta decae el cual es apreciable con más exactitud en la figura 4 y la figura 3 y a vez esta se desnaturaliza. GRAFICO/FOTOS:

Ejemplar 1: Temperatura Constante y variación del pH.

0.2 0

0 2 f(x) 4 6= 08x +100 12 R² = 0.09

pH 7pH

0 f(x) = 0.02 x − 0.48 20 30 R² 40= 0.85 50 60 70 80 90

2. Lineas y 1.Figura Regresiòn Lineal T E MP E RATFigura URA areas 3 0 ºC

ABSORBANCIA

A B S O R B A N C IA

ABSORBANCIA

TEMPERATURA 30 ºC

0.050.1 0 0 0.04 0.02 00 00.01 2 4 5 6 7 8 9 1011

pH

A B S O R B A N C IA

TEMPERATURA TEMPERATURA

Ejemplar 2: pH Constante y variación de la Temperatura. CODIGO: FRM.6.3

REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

pH 7

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-INF-V1-2019-015

Figura 3. Regresión lineal

Figura 4. Lineas y areas

DISCUCIÓN/OBSERVACIONES

La cinética enzimática, permite determinar de manera ordenada todas las etapas por las que atraviesa la transformación de sustrato a producto; sin embargo, el proceso puede ser modificado a través de la manipulación de ciertos parámetros como pH, concentraciones salinas, temperatura, cofactores e inhibidores enzimáticos. En este caso la enzima 6-O-α-L-ramnosil-Dglucosidasa posee una adaptación y desarrollo óptimos, con una temperatura de 55ºC y un pH de 6, según (Mazzaferro et al., 2019). Durante el desarrollo de esta práctica, para el primer caso; el pH óptimo fue de 6 con una temperatura constante de 30ºC (0,392 A). (Andrea et al., 2016), expone que, el pH y sus cambios pueden originar desequilibrios en la dinámica ya que afectan tanto a la enzima como al sustrato, debido a la influencia que ejerce sobre la conformación de las proteínas y la distribución de cargas, además de la disociación de los grupos activos pertenecientes a la enzima. Mientras que, para el segundo escenario la temperatura óptima fue de 55ºC con un pH de 7(0.392 A). Dichas reacciones, se explican debido a que, cuando la temperatura aumenta, la energía cinética de las moléculas tiende también a incrementarse; sin embargo, al producirse un desmesurado aumento de temperatura se produce una violenta degradación de la naturaleza proteica de las enzimas, más específicamente en la estructura terciaria lo que implica la pérdida de la capacidad (Andrea et al., 2016) lo que explicaría el dramático descenso de la absorbancia en este escenario. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

   

Las enzimas son una herramienta eficiente para incrementar la velocidad de las reacciones químicas puesto que, pueden reducir su energía de activación sin sufrir modificaciones o a su vez, ser consumidas durante la reacción. Se pudo determinar, que bajo temperaturas de 30ºC, el pH óptimo será de 6, puesto que, con valores superiores a este, se producen problemas en la conformación de las proteínas; mientras que para reacciones con pH 7 la temperatura óptima será de 55ºC ya que, con temperaturas mayores a esta las enzimas tienden a sufrir daños por desnaturalización. Es recomendable, medir otros niveles de presión dinámica tales como sólidos solubles para determinar el consumo de energía, en la cinética de crecimiento. El campo de aplicación de las enzimas es vanguardista, por lo que es necesario realizar estudios para la optimización de su producción y orientar su uso direccionándolo a sectores como la biomedicina o el sector industrial.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA:

Andrea, J. B. S., Nelly, O. D. B., & José, E. Z. M. (2016). Efecto de Temperatura, pH, Concentración de Sustrato y Tipo de Enzima en la Hidrólisis Enzimática de VÍsceras de Tilapia Roja (Oreochromis spp.). Informacion Tecnologica, 27(6), 63–76. https://doi.org/10.4067/S0718-07642016000600007 Brix Lab. (2014). La actividad enzimática. 3. https://www.brix-lab.com/index.php/es/investigacion-2/119-la-actividad-enzimatica Franklin, B. (2006). \376\377\000C\000a\000p\000\355\000t\000u\000l\000o\000 \000I\000.\000 \000L\000a\000s\000 \ 000e\000n\000z\000i\000m\000a\000s. Mazzaferro, L. S., Weiz, G., Braun, L., Kotik, M., Pelantová, H., Křen, V., & Breccia, J. D. (2019). Enzyme-mediated transglycosylation of rutinose (6-O-α-l-rhamnosyl-d-glucose) to phenolic compounds by a diglycosidase from Acremonium sp. DSM 24697. Biotechnology and Applied Biochemistry, 66(1), 53–59. https://doi.org/10.1002/bab.1695 Merino Pérez, J., José, M., & Borge, N. (2015). FISIOLOGÍA GENERAL. Neher, B. D., Mazzaferro, L. S., Kotik, M., Oyhenart, J., Halada, P., Křen, V., & Breccia, J. D. (2016). Bacteria as source of diglycosidase activity: Actinoplanes missouriensis produces 6-O-α-l-rhamnosyl-β-d-glucosidase active on flavonoids. Applied Microbiology and Biotechnology, 100(7), 3061–3070. https://doi.org/10.1007/s00253-015-7088-x Ramírez, J. R. (2014). Qué Son Y Cómo Funcionan. Revista.Unam.Mx, 15, 961. http://www.revista.unam.mx/vol.15/num12/art91/ FIRMAS

F: ……………………………………………. Nombre: ALUMNO / RESPONSABLE

CODIGO: FRM.6.3

F: ………………………………………………. Nombre: DOCENTE / INSTRUCTOR

EVALUACIÓN

…………………………………………………… Nota:

REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20