Actividad enzimática de peroxidasas vegetales

Actividad enzimática de peroxidasas vegetales Pre Lab http://www.doschivos.com/display.asp?ID=132&f=13547 Antecedentes Una enzima es un catalizador biológico que lleva a cabo reacciones bioquímicas a muy altas velocidades y con un elevado grado de especificidad; en su ausencia, la mayoría de las transformaciones químicas requeridas para mantener activas las células tardarían mucho tiempo en efectuarse o simplemente no procederían. (Baudi 1999) Se conocen más de 2000 enzimas, de las cuales muchas han sido aisladas, purificadas y cristalizadas, su estructura química es de carácter proteínico globular. Su espeficidad de catálisis es única pues es mucho mayor que la de la gran mayoría de otros compuestos orgánicos e inorgánicos que se emplean en los distintos procesos industriales. Algunas de las enzimas tienen la capacidad de transformar más de un millón de moléculas de sustrato, por segundo, por molécula de enzima. Las enzimas sólo aceleran la velocidad de reacción que termodinámicamente son posibles. (Baudi 1999) Todas las enzimas son proteínas, tienen una estructura tridimensional globular, están formadas generalmente por una sola cadena peptídica, y sólo logran ser activadas cuando los polímeros desarrollan una conformación que permite establecer su centro activo. En muchos casos están integradas por una parte proteínica y otra que no lo es. La parte proteínica se conoce como apoenzima y la segunda como cofactor. Éste último es un compuesto de bajo peso molecular, estable al calor, que presenta varios grados de unión con la apoenzima. Los principales cofactores son vitaminas, los cationes, los aniones y otras sustancias orgánicas. (Baudi 1999) Las enzimas son específicas al sustrato con el que puede interactuar. El sustrato debe reunir ciertas características para que pueda ser utilizado como tal. La especificidad puede ser estereoquímica (isómeros L o D como ustratos), baja especificidad (atacan un determinado enlace químico), especificidad de grupo (un enlace y grupo químico específico al lado de éste) y especificidad absoluta (una sola sustancia). (Baudi 1999) En general las enzimas, se han nombrado de una forma poco sistemática. Entonces se juntaban varias enzimas que actuaban sobre la misma sustancia con el mismo nombre. Por esto, la comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica desarrolló un método que identifica las enzimas con 4 dígitos. El primero se refiere a qué grupo pertenecen. (Baudi 1999) 1. Óxido-reductasas ( Reacciones de oxido-reducción). Si una molécula se reduce, tiene que haber otra que se oxide 2. Transferasas (Transferencia de grupos funcionales) Grupos aldehídos, acilos, glucósidos y fosfatos

3. Hidrolasas (Reacciones de hidrólisis) Transforman polímeros en monómeros. Actúan sobre enlaces éster, glucosídico, peptídico y enlace C-N 4. Liasas (Adición a los dobles enlaces) Entre C=O, C=C y C=N

5. Isomerasas (Reacciones de isomerización)

6. Ligasas (Formación de enlaces, con aporte de ATP) Entre C-C, C-S, CN, C-C (Ruana 1998) El proceso de blanqueado en agua caliente ayuda a inactivar los sistemas de enzimas que descomponen las frutas y vegetales. Las peroxidasas deterioran el sabor de los vegetales en almacenamiento. Además se usan como un índice de tratamientos de blanqueado o de otros tratamientos de calor porque es muy resistente a la inactivación térmica. Si la peroxidasa se destruye, se asume que ningún otro sistema enzimático sobrevive. Existe relación entre la actividad de peroxidasa y la producción se sabor. (Reed 1975) Las peroxidasas son enzimas que catalizan la siguiente reacción:

La reacción importante de las peroxidasas es la anterior, sin embargo existen tres tipos de reacciones en las que puede intervenir: reacciones peroxidativas, oxidativas e hidroxilativas. Para la reacción peroxidativa se requiere de un peróxido orgánico o de agua. El número de compuestos que pueden ser aceptores de hidrógenos para algunas peroxidasas es pequeño. Los compuestos donadores de hidrógenos pueden ser fenoles, aminas u otros compuestos orgánicos. El mecanismo de la reacción se basa en la formación de complejos de enzima-donador de hidrógenos y dos pasos de oxidación univalente. (Reed 1975) Hay tres clases de peroxidasas: · Ferriprotoporfirina peroxidasa: color café e incluyen peoxidasas de plantas grandes, animales y microorganismos. Todas estas peroxidasas contienen ferriprotoporfirina III como grupo prostético. · Las verdoperoxidasas de la leche, lactoperosidasa. El grupo prostetico de esta enzima es un núcleo de hierro de porfirina que no es ferriprotoferrina III. (Reed 1975)

· Las peroxidasas de flavoproteínas se han purificado de estreptococos y de algunos tejidos animales. El grupo prostético es el FAD. (Reed 1975) La peroxidasa más estudiada es la derivada del rábano picante Justificaciones Las hojas se trituran para extraer de ellas los líquidos vasculares. El buffer de fosfato se usa para extraer las enzimas en pH estable ya que como son proteínas globulares son sensibles a los pH extremos. Esta solución se homogeniza para que se pueda extraer todo el líquido de las hojas posible. Sin embargo, para los pasos posteriores en la práctica los residuos de hojas son una interferencia en los resultados y observaciones por lo tanto se separan del líquido donde están disueltas las enzimas por centrifugación. Las diferentes concentraciones entre el extracto y el peróxido de hidrógeno modifica también la velocidad de reacción. En un mismo volumen de solución las variaciones entre los volúmenes agregados modifica también la cantidad de sustrato que reaccione y resulte en producto. De los 4 tubos que se usan en la comprobación de la esencialidad de los componentes, en parejas tienen pequeños cambios entre unos reactivos y otros lo que permite la comparación de la reacción y el efecto de las diferentes concentraciones de sustratos. La velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente está determinada por las concentraciones de enzima y sustrato. La absorbancia a 470nm es un indicador del estado de la reacción y su velocidad al medirse en 3 minutos cada 30segundos. Luego de modificar la estructura tridimensional de una enzima, ésta no puede realizar su función fisiológica ni catalizar reacciones. El pH de una solución puede cambiar la estructura de la proteína cambiando sus interacciones al protonar o desprotonar grupos R de las cadenas laterales de los aminoácidos. El efecto en la estructura de las enzimas del ácido tricloroacético y del sulfato de amonio se comparará, ya que aunque ambos son ácidos débiles, el amonio es un ácido mucho más débil. Hay proteína que precipita y es necesario determinar si la enzima peroxidasa está en el sobrenadante o en el precipitado. Bibliografía http://www.arrakis.es/~lluengo/enzimas.html Lourdes Luengo (1998) Badui S. QUÍMICA DE LOS ALIMENTOS. 3 ed. 5 reimpresión. Editorial Alambra Mexicana. México (1999)648pp. Reed, G. ENZYMES IN FOOD PROCESSING. 2 ed. Academic Press. Inglaterra (1975) 573p.p. Post Lab

Enzimas: actividad enzimática de peroxidasas en hojas de naranjo

Resumen En esta práctica se extrajo un extracto enzimático macerando las hojas en buffer de fosfato y centrifugándolo. Este extracto se diluyó en 1/3 y 1/6. Se realizó una prueba para comprobar la esencialidad de los componentes, es decir que en varios tubos se pusieron tampón fosfato, peróxido de hidrógeno, guayacol y extracto 1/3 en diferentes proporciones donde en los primeros tres hacía falta un componente. En el cuarto tubo, se observó reacción porque allí estaban presentes todos los componentes. Luego se comprobó la linearidad de la actividad enzimática de acuerdo a la concentración tomando la absorbancia a 470nm cada 30 segundos por 3 minutos por cada tubo de ensayo donde la concentración del extracto aumentaba 0.1mL y la concentración de la enzima disminuía 0.1mL manteniendo constante el volumen. Luego se observó el efecto de agentes precipitantes (sulfato de diamonio y ácido tricloroacético) en la actividad enzimática.

Resultados y Observaciones Tabla 1 Esencialidad de los componentes Tubo 1 2 3 4

Prueba +

Tabla 2 Linealidad entre actividad enzimática y concentración Tiempo (min) ± 0.5s 0 ½ 1 1½ 2 2½ 3

Tubo 1 (± 0.0005nm) 0.002 0.003 0.006 0.007 0.008 0.009 0.010

Tubo 2 (± 0.0005nm) 0.007 0.012 0.016 0.021 0.025 0.026 0.026

Tubo 3 (± 0.0005nm) 0.024 0.043 0.057 0.067 0.078 0.081 0.087

Tubo 4 (± 0.0005nm) 0.037 0.073 0.092 0.110 0.118 0.125 0.128

Gráfica 1

Gráfica 2

Gráfica 3

Gráfica 4

Tabla 3 Efecto de agentes precipitantes ATC

SA

Sob Sed Discusión de Resultados Para que una reacción enzimática se lleve a cabo es indispensable la presencia del sustrato, la enzima y dependiendo del caso, del cofactor. Sin embargo en la prueba de la esencialidad de los componentes para la reacción, el tubo 2 no mostró cambio a pesar de que estaban presentes el sustrato y la enzima. Lo que ocurre en esta reacción es que el peróxido de hidrógeno se convierte en agua y oxígeno. Aunque el Guayacol no interviene directamente en esta reacción es importante para atrapar ese oxígeno que se libera, lo cual promueve el equilibrio de la reacción hacia la formación de productos. Además al estar en presencia de oxígeno, el Guayacol reacciona y da una quinona que se le puede leer la absorbancia. En los tubos 1 y 3, hacía falta o el sustrato o la enzima y de esta manera no hay reacción. En el tubo 4, estaban todos los componentes presentes y a pesar de eso el color producido fue muy suave. Puede ser que la concentración de enzima en el extracto fuera muy bajo. La velocidad de una reacción enzimática depende de varios factores. Entre éstos está el pH. Cada enzima tiene un rango de pH en el que su actividad enzimática es óptima. Fuera de este rango la enzima por ser una proteína empieza a desnaturalizarse por la protonación o desprotonación de sus aminoácidos constituyentes. En la maceración para la obtención del extracto y para todas las pruebas de usó el buffer fosfato para mantener el pH dentro del rango óptimo de la fosfatasa.

La temperatura es otro factor importante en la actividad enzimática. Se puede decir que a mayor temperatura aumenta la velocidad de la reacción hasta que llega un punto en el que la velocidad disminuye con el aumento en el calor. No vale la pena discutir acerca de la influencia del calor en la reacción enzimática realizada en el laboratorio ya que todas las pruebas se realizaron a temperatura ambiente, a una temperatura constante. Otro factor fundamental en la velocidad a la que se realiza una reacción es la concentración de enzima y de sustrato. Esto se sabe teóricamente debido a que todas las reacciones cumplen con la reacción de Michaelis-Menten, donde si la concentración de sustrato o de enzima es muy baja, la velocidad aumenta proporcionalmente al aumento de concentración. En la determinación de la linearidad de la velocidad de acuerdo a la concentración de enzima, la concentración de peróxido de hidrógeno era constante en todos los tubos y lo que cambiaba era la concentración de enzima. En esta determinación se usó el extracto bien diluido 1/6 ya que como se iba a medir la absorbancia si estaba muy concentrado ésta no se iba a poder medir. En las gráficas y en la tabla 4 se puede ver cómo al aumentar la concentración de enzima, la absorbancia aumenta. Si se toma como referencia cuando habían transcurrido 30 segundos de la reacción, se puede ver que la absorbancia de todos los tubos va aumentado del 1 al 4 de la misma manera en la que aumenta la enzima. Conforme transcurre el tiempo se puede ver que la absorbancia aumenta, esto se debe a que la concentración del guayacol que ha reaccionado con el oxígeno aumenta. Conclusiones · El buffer de fosfato mantiene el pH en el rango óptimo de reacción de la enzima, el peróxido de hidrógeno es el sustrato, el extracto contiene la enzima y el guayacol forma un complejo colorido, por lo que todos los componentes son necesarios para la reacción. · A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de la reacción aumenta conforme aumente la concentración de la enzima. · Los agentes precipitantes inhiben la actividad enzimática por desnaturalización de la enzima.