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La curva de calibrado es un método de química analítica empleado para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración). Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibración, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del analito. Las curvas de calibración suelen poseer al menos una fase de respuesta lineal sobre la que se realiza un test estadístico de regresión para evaluar su bondad. ¿Qué se entiende por curva de calibración? Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albúmina sérica bovina que vimos antes) que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (proteínas) presente en una muestra incógnita. En muchas determinaciones se cumple una relación proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la provoca. Por ejemplo: si la presencia de 10 ug de proteínas en una solución genera la aparición de un color azul pálido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de proteína dará lugar a que la solución se torne azul más oscuro y así sucesivamente. La relación entre intensidad de color y concentración de la sustancia (una medida de la cantidad de esa sustancia) es proporcional y así, si se grafica el valor de intensidad de color medido con un aparato adecuado (espectrofotómetro o colorímetro) en función de las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de proteína, mayor cantidad de producto de reacción y por lo tanto, mayor intensidad de color. Curva de Calibración Dado que se ha trabajado con datos reales, los gráficos que se obtienen no son tan ideales, pero esta situación no es un obstáculo ya que dentro de ciertos valores es posible trazar la recta más probable que une una serie de puntos, con el uso de los programas de cálculo de las computadoras.

Hay que advertir que una respuesta lineal no se obtiene en todo el rango de concentraciones posibles sino dentro de un conjunto de valores que dependen de numerosos factores dependientes del método de medición. Por otra parte, este tipo de curvas no se limita solamente a la determinación de un elemento o compuesto químico sino que tiene múltiples aplicaciones. Ley de Beer y Linealidad La aplicación práctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de una sustancia podemos averiguar su concentración y esto lo podemos hacer de dos formas: 1. 2.

Por comparación con una solución conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema (P) y una estándar (S), podemos establecer la siguiente relación matemática entre ellas: A través de una curva de calibración: la curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentración se averigua por interpolación de las A de las soluciones problema en la curva de calibración. Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre Absorbancia y Concentración. Cuando la concentración del cromógeno sobrepasa los límites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtiéndose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los límites de linealidad se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno. En esta situación, hay que diluir la muestra para que su concentración entre en los límites de la linealidad. Linealidad y método de minimos cuadrados En muchos tipos de análisis químico se mide la respuesta del procedimiento analítico a cantidades conocidas de analito (llamadas patrones o estándares), y basándose en ellas se puede interpretar la respuesta a una muestra de contenido desconocido. Para ello, es preciso preparar una curva de calibrado que es un gráfico que muestra la respuesta de un método analítico en función de cantidades conocidas del analito. La mayoría de las veces se trabaja en una región en la que la curva de calibrado es recta. El método de los mínimos cuadrados es la técnica que nos permite trazar la mejor recta a la que se ajustan los puntos experimentales, que de hecho están más o menos dispersos y no se encuentran exactamente en línea recta. Este procedimiento supone que los errores de los valores de y son sustancialmente mayores que los de los valores de x. Esta condición normalmente es cierta en una curva de calibrado, si la respuesta experimental medida (valores de y) es menos cierta que la cantidad del analito (valores de x). Un segundo supuesto es que las incertidumbres (las desviaciones estándar) de todos los valores de y son similares. En la mayoría de los textos de Química Analítica se pueden encontrar las ecuaciones que permiten ajustar una serie de datos experimentales a una recta. Sin embargo, las calculadoras actuales permiten obtener de forman sencilla la ecuación y=a+bx, donde a es la ordenada en el origen y b la pendiente de la recta de calibrado. Para ello es necesario que cada alumno consulte el manual de su calculadora. También es posible obtener la regresión de la recta, r, que nos indica la bondad de la misma: cuanto más se aproxime este valor a 1 más se aproximan los puntos a una recta. En Química Analítica, una curva de calibrada ajustada por mínimos cuadrados debe tener una r 1>r>0,995. Si la r es menor deberemos de representar los puntos para descartar alguno de ellos. Finalmente, es posible también introducir el valor de y (señal analítica para la muestra de concentración desconocida) en la calculadora y obtener el valor de x (concentración).