7-Pertumbuhan Mikroba (Kultur Kontinyu Dan Perhitungan)

Mikrobiologi Laut (Pertemuan Ketujuh) PERTUMBUHAN MIKROBA (Kultur Kontinyu dan Metode Pengukuran Pertumbuhan)

Dr.Ir. Arniati Massinai, M.Si Jurusan Ilmu Kelautan Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan Unhas 2015

• Kultur Kontinyu • Metode Pengukuran Pertumbuhan

Kultur Kontinyu

• Kultivasi mikroba menggunakan teknik kultur kontinyu/sinambung, mikroba ditumbuhkan secara terus menerus pada fase paling optimum untuk fase pertumbuhan yaitu fase eksponensial dimana sel membelah diri dengan laju yang konstan, massa menjadi dua kali lipat mengikuti kurva logaritmik. • Hal ini dilakukan dengan memberi nutrisi secara terus menerus sehingga mikroba tidak pernah kekurangan nutrisi. • Penambahan nutrisi/media segar ke dalam bioreaktor dilakukan secara kontinyu, dimana dalam waktu yang sama larutan yang berisi sel dan hasil produk hasil metabolisme dikeluarkan dari media dengan volume yang sama dengan substrat yang diberikan.

• Kondisi tersebut menghasilkan keadaan yang “STEDY STATE” dimana pembentukan sel-sel baru sama dengan sel-sel yang dikeluarkan dari fermentor. • Pada kondisi steady state konsentrasi nutrisi, konsentrasi sel, laju pertumbuhan dan konsentrasi produk tidak berubah walaupun waktu fermentasi makin lama

Kelebihan Kultur Kontinyu • Produktivitas lebih tinggi, disebabkan lebih sedikit waktu persiapan bioreaktor persatuan produk yang dihasilkan, laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol, pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diatur. • Dengan demikian hanya butuh pabrik lebih kecil (pengurangan biaya modal untuk fasilitas baru). • Dapat dijalankan pada waktu yang lama. • Cocok untuk proses yang kontaminasnya rendah dan produk yang berasosiasi dengan pertumbuhan. • Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana. • Tidak ada akumulasi produk yang menghambat.

Kelemahan Kultur Kontinyu • Aliran umpan yang lama, resiko kontaminasi besar • Peralatan untuk operasi dan pengendalian proses harus biasa tetap bekerja baik untuk waktu yang lama. • Memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi, karena akan digunkan pada waktu yang lama (Irianto, 2007).

• Pertumbuhan bakteri dalam kultul kontinyu (biak sinambung) tidak akan mengikuti kurva pertumbuhan. • Dalam pertumbuhan bakteri ini terdapat prosedur yang menjadi dasar biak sinambung yang dilakukan dalam kemostat dan turbidostat

Pertumbuhan dalam kemostat • Kemostat terdiri dari bejana biak yang dimasuki larutan biak dari bejana persediaan dengan kecepatan aliran tetap. • Diusahakan dalam bejana biak terdapat pemasokan O2 secara optimum dan supaya selekas mungkin terjadi distribusi merata dari nutrien yang dialirkan masuk sebagai larutan biak. • Kecepatan pertambahan dinyatakan sebagai μx = dx/dt dan kerapatan bakteri meningkat dengan x = x0 e μ/t. • Biak dalam kemostat dikendalikan subtrat. Stabilitas sistem ini berlandaskan keterbatasan kecepatan tumbuh oleh konsentrasi subtrat yang diperlukan pertumbuhan (donor H, sumber N, Sumber S, atau sumber P).

Kultur dalam Kemostat d a

e

b

1

c

2

f g 3

Gambar : Perinsip Biak sinambung dalam kemostat

1. Bejana persediaan dengan filter keseimbangan (a) pipa pengisi (b) 2. Pompa peristaltik 3. Kemostat dengan penambah larutan biak (c), pengaduk (d), filter udara masuk (e) dan pengambil cuplikan bahan (f) 4. Bejana penampung dengan filter udara keluar (g)

4

Fig. The cell crop of a bacterial culture in chemostat

Pertumbuhan dalam turbidostat • Sistem ini didasarkan pada kerapatan bakteri tertentu atau kekeruhan tertentu yang dipertahankan konstan. • Ada perbedaan mendasar antara biak statik klasik dengan biak sinambung dalam kemostat biak statik harus dilihat sebagai sistem tertutup (boleh disamakan dengan organisme sel, tahap stationer dan tahap kematian. • Kalau pada biak sinambung merupakan sistem terbuka yang mengupayakan keseimbangan aliran untuk organisme selalu terdapat kondisi lingkungan yang sama. • Dalam pertumbuhan sinkron akan terjadi sinkronisasi pembelahan sel. • Sinkronisasi populasi sel dapat dicapai dengan berbagai tindakan buatan antara lain dengan merubah suhu rangsangan cahaya, pembatasan nutrien atau menyaring untuk memperoleh sel-sel yang sama ukurannya. • Sinkronisasi pertumbuhan ini juga dimaksudkan untuk menyediakan stater dengan usia yang sama.

Kultur dalam turbidostat

Keterangan 1. penampungan medium steril 2. katub pengontrol aliran media 3. pengeluaran medium 4. Foto sel 5. Sumber cahaya 6. Turbistat

Metode Pengukuran Pertumbuhan

Laju Pertumbuhan Bakeri berkembang biak dengan pembelahan biner melintang.

1

2

22

23

N = No ² n

24

25

2n

N = populasi akhir No = Populasi awal n = jumlah pembelahan sel waktu t

Waktu Generasi • Kecepatan pembelahan sel ditentukan dengan waktu generasi (generation time) atau waktu berganda (doubling time) • Waktu Generasi (G) dapat dihitung dgn rumus: t Dimana : G = ------------G = waktu generasi n t = waktu yg dibutuhkan dari jumlah No Lon N - Log No

n = ----------------------------Log 2

menjadi N No = populasi awal N = populasi setelah waktu t

Contoh soal : Jika 100 sel ditumbuhkan selama 5 jam menghasilkan 1.720.320 sel berapa waktu generasinya ????

Jumlah pembelahan, jumlah sel, logaritma jumlah sel

Grafik Jumlah pembelahan, jumlah sel, logaritma jumlah sel

Figure 6.13

Waktu generasi pada berbagai mikroba Kelompok Mikroba

Waktu generasi (jam)

Bakteri Heterotrofik Bacillus megaterium Escherichia coli Rhisobium meliloti Troponema allidum

0,58 0,28 1,80 34,0

Bakteri Fotosintetik Cholopseudomonas ethylicum Rhodpseudomonas spheroides Rhodospirillum rubrum

7,0 2,4 5,0

Khamir Saccharomyce cerevisiae

2,0

Protozoa Paramecium caudatum Stentor coureleus Tetrabyma geleti

10,5 32,0 3,0

Metode pengukuran pertumbuhan

• Perhitungan Jumlah Sel – Hitungan Cawan – Hitungan Mikroskopik – MPN (Most Probable Number)

• Perhitungan Massa Sel secara Langsung – Volumetrik – Gravimetrik – Turbidimetrik

• Perhitungan Massa Sel secara Tidak Langsung – Analisa komponen sel (protein, AND, ATP, dsb) – Analisis produk katabolisme (metabolit primer, metabolit skunder, panas) – Analisis komsumsi nutrien (karbon, nitrogen, oksigen, asam amino, mineral, dsb)

PERHITUNGAN JUMLAH SEL : HITUNGAN CAWAN Standard Plate Counts (SPC) Total Plate Count (TPC) Angka Lempeng Total (ALT)

Syarat-syarat Perhitungan • Catat pengenceran yang digunakan • Hitung jumlah koloni (yang hanya memenuhi syarat untuk dihitung), spreader tidak dihitung • kalikan jumlah koloni (atau rerata jumlah jika digunakan ulangan dalam pengenceran yang sama) dengan kebalikan pengencerannya. • Untuk mencegah kesalahan ketelitian dan akurasi, catat hanya dua digit pertama saja. Digit kedua dapat ditingkatkan jika digit ketiga di atas 5; gunakan nol untuk digit setelah digit kedua. • Laporkan jumlah (atau dugaan jumlah) sebagai CFU per g atau ml.

Perhitungan mikrobia berdasar jumlah koloni • Jumlah koloni: Dilakukan dengan pengenceran sampel

Figure 6.15, top portion

TNTC

Spreader

Kisaran Hitung untuk Plate Count • PDA BAM Ch.3 (2001) : kisaran 25-250 koloni percawan untuk pour plate • AOAC (AOAC OM 996.23) : kisaran 30-300 koloni per cawan pour plate dan spread plate • ISO 7218 (2007:38) : kisaran 10-200 koloni per cawan untuk spread plate; 10-300 coloni/cawan untuk pour plate; untuk koloni tipikal pada medium selektif 10-150 koloni per cawan • APHA AWWA WEF 9125 (2004:2) : kisaran 30-300 koloni per cawan untuk pour plate dan spread plate

Perhitungan mikroorganisme dalam satuan CFU/ml atau Gram 1. APHA AWWA WEF 9125 (2004:2) : CFU/ml or gram = jumlah koloni / (jumlah sampel yang dinokulasi x tingkat pengenceran)

Contoh : Hasil hitungan cawan : 50 koloni dari tingkat pengenceran 1/100 Jumlah sampel yang diinokulasi : 0,1 ml CFU/ml = 50 CFU/ (0,1 x 1/100) = 50 CFU / 0,001 = 50.000 CFU/ml

Jumlah mikroorganisme jika lebih dari satu pengenceran

N (CFU/ml or g) = (∑ C) / {(1 x n1) + 0,1 x n2) x d} Keterangan : N : Jumlah mikroorganisme CFU/ml or g ∑ C : Jumlah semua koloni pada semua cawan n1 : Jumlah cawan yang terhitung pada pengenceran pertama n2 : jumlah cawan yang terisi pada pengenceran ke dua /berikutnya d : Pengenceran dimana hitungan pertama (dari pengenceran pertama) diperoleh

Contoh Perhitungan 1/10 TNTC (>300) TNTC (>300)

1/100 232 (30-300) 244 (30-300)

n1 : 2 cawan n2 : 1 cawan (23 tdk masuk kisaran) d : 1/100 N = {(232+244+33)/(1 x 2) + (0,1 x 1) + (0,1 x 1) x (1/100)} = (509/0,021) CFU/ml dibulatkan = 24. 238,09 CFU/ml = 24.000 CFU/ml

1/1000 33 (30-300) 23 (