6.- Cultivo de Linfocitos de Sangre Periférica

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MÉXICO CAMPUS CHAPULTEPEC PRÁCTICAS 6 “CULTIVO DE LINFOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA” OBJETIVOS   

Realizar por medio de una técnica especial el cultivo de linfocitos de sangre periférica Estimular el crecimiento de los linfocitos para observar sus fases de crecimiento celular Observar y analizar los cromosomas extraídos de los linfocitos con ayuda del microscopio

INTRODUCCIÓN El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estará formado por cuatro elementos: 1. la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células. 2. las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio. 3. la naturaleza y composición de la fase gaseosa. 4. las condiciones de incubación, especialmente la humedad y la temperatura. 1.

El sustrato de cultivo

La mayor parte de las líneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte más o menos sólido. El crecimiento en suspensión está usualmente restringido a algunas líneas celulares especialmente de células hematopoyéticas y tumores ascíticos. Según si la línea celular precise o no unirse al sustrato para proliferar se dice que es dependiente o independiente de anclaje. Materiales usados como sustrato Los tipos de sustrato más empleados en la actualidad son los siguientes: a. Vidrio. Empleado usualmente como sustrato de cultivo tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y esterilización. Asimismo es especialmente útil para su posterior observación al microscopio por su calidad óptica. b. Plástico desechable. Empleado como material desechable estéril por irradiación. El plástico más empleado es el poliestireno, de buena calidad óptica debido a que es hidrofóbico requiere un tratamiento mediante irradiacióngamma, químico, o mediante descargas eléctricas que produzca una superficie mojable. Otros plásticos que se emplean son polivinil-cloruro, policarbonato (PVC), politetrafluoretileno (teflón, PTFE), thermanox (TPX). c. Microsoportes ("microcarriers"). Se trata de soportes plásticos (poliestireno, Nunclon, GIBCO), sephadex (Flow Lab. y Pharmacia) y poliacrilamida (BioRad) en forma de pequeñas bolas ("beads") a las que se unen las células dependientes de anclaje. Estas bolas con las células adheridas se mantienen en suspensión. d. Otros sustratos artificiales. Se han desarrollado técnicas para crecer células de glia en sustratos metálicos, de paladio o en discos de acero. e. Superficies tratadas. La adherencia y crecimiento de las células en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido a la presencia de colágeno o fibronectina liberada por las células, o bien sobre superficies recubiertas de proteínas de matriz extracelular (fibronectina, colágeno, vitronectina, Matrigel, etc...). Así, se pueden tratar los recipientes de cultivo con fibronectina (1 ngr/ml) añadido al medio, o con colágeno. El tratamiento con colágeno desnaturalizado aumenta la adhesión de muchos tipos celulares, y especialmente de las células epiteliales. Otros tratamientos que se han usado han sido: gelatina (músculo), poli-D-lisina (algunos teratomas de ratón). f. "Feeder layers". Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus características diferenciadas precisan de suplementos específicos. Una manera de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares. Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente por irradiación X o gamma). Este efecto podría ser debido a dos posibilidades: suplementación del medio, o modificación del sustrato. Una de las monocopas más empleadas son los fibrobastos de ratón 3T3 irradiados. g. Matrices tridimensionales. Son sustratos en los que las células penetran, estableciendo una distribución tridimensional: geles de colágeno, esponja de celulosa sola, o recubierta de colágeno, o "gelfoam". En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una manera análoga a como lo hacen en el tejido de

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origen : células epiteliales de mama se organizan en disposición tubular, mientras que las células del carcinoma de mama lo hacen de una forma mucho más desordenada. h. Sustratos no adherentes. Son sustratos que no permiten la adhesión celular, por ejemplo agar, agarosa, o methocel (metilcelulosa de alta viscosidad). Son de utilidad en situaciones en las que no conviene que exista dispersión de las células derivadas de una originaria, por ejemplo en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus. i. Interfases líquido-gel o líquido-líquido. Se han observado en algunas situaciones proliferación celular y adhesión a las interfases líquido-líquido o líquido-gel, a pesar de que se desconocen exactamente los mecanismos. j. Haces microcapilares permeables. Son cámaras de crecimiento de células formadas por un recipiente cilíndrico en el que se siembra, y en el interior del cual hay un haz de capilares plásticos permeables adecuados para que las células se adhieran. Los capilares se encuentran conectados a un circuito de recambio del medio. Este dispositivo ofrece una gran superficie de crecimiento apta para el crecimiento celular, y un eficaz sistema de recambio del medio (por ej. Vitafiber Chamber de Amicon). 1.2 Recipientes de cultivo. Tal como se ha descrito previamente, el material más utilizado como sustrato es el plástico desechable, en forma de diferentes tipos de recipientes. Los más comunes son: - placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaños: 3.5, 6.0 y 10 cm de diámetro son las más empleadas cuando se trata de crecer las células para usar directamente en experimentos. No es recomendable, por su escasa estanqueidad, emplearlas para el mantenimiento de líneas. - multiplacas. Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96 pocillos. - frascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaños, son recomendables para el mantenimiento de las líneas y la producción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión. - "roller bottles". Se trata de tubos, con una cara plana sobre la que se fija el cultivo, y que se incuban en los incubadores dotados de "roller". Existen variantes con una gran superficie de adhesión (espirales de plástico...) y que se destinan a la producción de gran número de células 2. La fase gaseosa Los componentes más significativos de la fase gaseosa son el oxígeno y el dióxido de carbono. 2.1 Oxígeno Las necesidades de oxígeno para la mayor parte de los cultivos celulares son cubiertas con la tensión atmosférica, aunque existen cultivos, especialmente los cultivos de órganos que requieren una tensión de oxígeno superior (del 95%) posiblemente debido a la geometría del órgano y a las dificultades de difusión del gas en su interior. Se ha propuesto que los requerimientos de selenio en el medio podrían ser debidos a su papel en la detoxificación de radicales de oxígeno, especialmente en los medios sin proteínas séricas. 2.2 Dióxido de carbono El dióxido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO 2 disuelto, el pH y la cantidad de iones HCO3-. De modo que para establecer un pH determinado se debe tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato sódico y la tensión de CO2. Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO2 para alcanzar el pH correcto. Sin embargo, se emplean otras sustancias tamponadoras en la formulación de muchos medios en la actualidad, lo que permite una estabilidad superior del pH en el medio, así como una mayor capacidad tamponadora (los denominados Good's buffers : HEPES, Tricita. Una alternativa es la suplementación del medio con piruvato. Esto permite a muchos tipos celulares incrementar su producción de CO2 endógeno, haciendolas independientes de la aportación de CO2 exógeno. En resumen, los cultivos crecidos a baja densidad en un recipiente abierto precisan una atmósfera de CO 2, cuya concentración esté en equilibrio con el bicarbonato sódico en el medio. A concentraciones celulares muy reducidas (por ej. durante el clonaje) es necesario añadir CO2 en la fase gaseosa de los frascos cerrados. Cuando la concentración celular es más elevada puede no ser necesario añadir CO 2 a frascos cerrados, pero si en frascos abiertos. En los casos en los que la densidad celular sea elevada, con mucha producción de ácido es recomendable, por la elevada producción de CO2 endógeno, mantener abierto el recipiente de modo que se pueda eliminar el exceso. En estos casos es especialmente recomendable suplementar el medio con HEPES para asegurar un correcto control del pH del medio. 3. Propiedades físicas 3.1 pH y capacidad tamponadora. El pH óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7.4, aunque existen pequeñas variaciones: algunas líneas normales de fibroblasto crecen mejor entre pH 7.4 y 7.7, y células transformadas lo hacen en el margen de pH de 7.0 a 7.4, células epidérmicas pueden ser mantenidas a pH 5.5. El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a pH 7.4, naranja a pH 7.0, amarillo a pH 6.5, azul-rojo a pH 7.6 y púrpura a pH 7.8.

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El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios bruscos de pH. La solución tamponadora más empleada sigue siendo el tampón bicarbonato, que equilibra el CO2 atmosférico, a pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a: su bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el cultivo. HEPES es la solución tamponadora de elección por su elevada capacidad tamponadora en el rango 7.2 a 7.6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mM. Cuando se usa conjuntamente con CO 2 externo, debe estar a concentración doble del bicarbonato para un tamponamiento adecuado. 3.2 Osmolaridad Muchas células en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo bien en el rango de 260 a 320 mOsm/kg, con pequeñas variaciones dependiendo de la especie considerada. Es recomendable emplear medios ligeramente hipotónicos para compensar la evaporación durante el periodo de incubación, especialmente en incubadores sin control de la humedad ambiente. La osmolaridad se controla mediante la determinación del punto de congelación o la elevación de la presión de vapor. Hay que tener en cuenta que la adición de HEPES, de drogas disueltas en ácidos fuertes y la neutralización posterior pueden afectar fuertemente a la osmolaridad del medio. 3.3 Temperatura La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, de ahí la importancia de un buen control de ésta en la incubación. Influye asimismo en el pH del medio, por lo que se recomienda o bien ajustar el pH del medio 0.2 unidades por debajo del óptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar o/n en la estufa y después ajustar el pH, antes de añadirlo al cultivo. 3.4 Viscosidad La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre el crecimiento. Sí es importante para evitar el daño celular en la agitación del cultivo (menor daño a más viscosidad) y en la tripsinización. Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero, añadiendo al medio carboxi-metil-celulosa o polivinilpirrolidona. 3.5 Tensión superficial La tensión superficial se ha de mantener baja, y en general sólo se ve alterada por la aparición de espumas en los cultivos en suspensión donde se burbujea CO2. En estos casos es recomendable emplear un agente antiespumante de silicona pues en éstos casos se produce un aumento de la desnaturalización de proteínas y se incrementa el riesgo de contaminación si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo. 4. Condiciones fisiológicas Hacen referencia a la composición del medio. Ya se indicó que la principal dificultad para el establecimiento de las líneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio "natural" como extractos embrionarios, hidrolizados de proteína o sueros. Un primer grupo de medios tales como el medio basal de Eagle (MEM) y el más complejo 199 de Morgan y col. o CMRL 1066 de Parker y col. eran medios definidos pero que precisaban de un suplemento de suero entre el 5 y el 20 %. A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios más complejos como NCTC 109,135, MB572/1, Ham F10 y F12, serie de los MCDB y los medios de Sato suplementados con hormonas. La aproximación recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12, suplementado con elevada concentración de suero (20 %) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir. Después de años de investigación en la composición de los medios la elección de éstos sigue siendo empírica. Los principales medios empleados y sus aplicaciones son: 1. Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con sólo los aminoácidos esenciales. Se necesita siempre la suplementación con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratón y células HeLa. 2. Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). Medio de uso más corriente, contiene más aminoácidos y en mayor concentración que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adición de suero (10 %). 3. R.P.M.I. 1640. Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados. 4. Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentración de aminoácidos y vitaminas que el B.M.E. Se usa para la selección de hibridomas suplementado con HAT o HT. 5. Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina bovina, transferrina, selenito, et... Es muy útil para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. También sirve para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones. 6. McCoy 5A. Medio diseñado para el crecimiento para el crecimiento de líneas celulares diploides tanto de rata como humanas. 7. Medio L-15 de Leibovitz. Utilizado para el cultivo de virus.

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8. Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de líneas celulares humanas, debe ser suplementado con proteínas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es útil para el cultivo de células amnióticas. 9. Medio F-12 de Ham. Útil para el crecimiento de líneas celulares son suplementos proteínicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero. 10. Medio 199. Muy usado para el cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías. Todo medio de cultivo está formado por los siguientes elementos:  Soluciones salinas equilibradas (BSS).  Aminoácidos.  Vitaminas.  Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular.  Hormonas y factores de crecimiento (suero).  Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos). Cultivo de linfocitos en sangre periférica Mediante el cultivo de linfocitos en sangre periférica y utilizando técnicas especiales, es posible observar y analizar los cromosomas con el microscopio. Se estimula el crecimiento de los linfocitos con el uso de diferentes lectinas, una de ellas es la fitohemaglutinina. El ordenamiento de los cromosomas según su tamaño y la localización del centrómero, se llama cariotipo. Los cromosomas no solamente tienen un número constante en cada especie, sino además presentan estructura y morfología definidas. Cada cromosoma consta de dos cromátides unidas por el centrómero. De acuerdo con la localización del centrómero hay tres tipos de cromosomas en el humano: metacéntrico, submetacéntrico y acrocéntrico. Los cromosomas humanos se han ordenado en siete grupos que se designan por las letras (A - G). En años recientes gracias a las técnicas llamadas en bandas, es posible identificar con precisión cada uno de los pares de cromosomas que constituyen el cariotipo. Estas técnicas han permitido establecer correlaciones más precisas entre los síndromes clínicos dismorfológicos y las alteraciones cromosómicas que los ocasionan. La técnica en bandas GTG es la más utilizada. Utilidad del cariotipo en linfocitos de sangre periférica El estudio citogenético y el cariotipo no sirve para diagnosticar cualquier padecimiento genético. Se debe sospechar que el paciente tiene una alteración cromosómica y por tanto el cariotipo será de utilidad: A) Cuando los pacientes presentan malformaciones múltiples que no se pueden englobar en alguno de los síndromes de etiología multifactorial o monogénica conocidos. B) Paciente con retardo mental, a quien se le hayan descartado otras causas de patología prenatal o postnatal condicionante como: hipoxia neonatal, secuelas de meningoencefalitis, errores inatos del metabolismo y otros. C) Paciente con ambigüedad de genitales. D) Pacientes con desarrollo inadecuado de caracteres sexuales secundarios. E) Pacientes con esterilidad o infertilidad. F) Pacientes con predisposición a neoplasias como el síndrome de Bloom, Anemia de Fanconi, Xeroderma pigmentoso y Ataxia Telangiectasia. G) Pacientes con algunos tipos de cáncer de tejido neoplásico. Para realizar esta prueba se requiere de una muestra de sangre periférica heparinizada, de aproximadamente entre 3 y 5 ml. Fitohemaglutinina La fitohemaglutinina (conocida como PHA por la abreviación de phytohemaglutinin.) Es una lectina Hemaglutinina, una lectina vista en posición lateral. Las Lectinas son proteínas que se unen a azúcares con una elevada especificidad para cada tipo distinto. Su principal papel está en los fenómenos de reconocimiento, tanto a nivel molecular como celular. Por ejemplo, algunas bacterias utilizan lectinas para acoplarse a las células del organismo hospedador durante la infección. La PHA fue reconocida por su capacidad para aglutinar eritrocitos y leucocitos. Además estimula inespecíficamente la proliferación de células T y es esta característica mitogénica lo que le da su principal aplicación. CARIOTIPOS Nomenclatura para cromosomas normales y aberraciones cromosómicas constitucionales. 

Cariotipo: arreglo sintetizado de los cromosomas. Se estudia usualmente en la metafase celular.

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Número y morfología de los cromosomas 

Técnicas sin bandeo:

Cuando se construye el cariotipo los autosomas se numeran del 1 al 22 en orden decesciente de tamaño y los cromosomas sexuales se llaman X y Y. Los símbolos p y q desigana el brazo corto y largo de cada cromosoma. Cuando los cromosomas se tiñen mediante técnicas que no producen bandas, se pueden ordenar en 7 grupos por tamaño y posición del centrómero: Grupo 1-3 (A): cromosomas grandes, que se distinguen por tamaño y posición de centrómero. Grupo 4-5 (B): submetacéntricos grandes, difíciles de distinguir entre si. Grupo 6-12-X (C): tamaño mediano, difíciles de distinguir entre si. Grupo 13-15 (D): acrocéntricos de tamaño mediano con satélites. Grupo 16-18 (E): Relativamente cortos metacéntricos (16) o submetacéntricos (17 y 18). Grupo 19-20 (F): metacéntricos cortos. Grupo 21-22-Y (G): acrocéntricos cortos con satélites (el Y es similar pero sin satélites)



Técnicas de bandeo cromosómico.

Producen patrones de bandas en los cromosomas metafísicos.  Banda: Parte de un cromosoma, que es claramente distinguible de los segmentos adyacentes, por aparecer más clara o más oscura con una o más técnicas de bandeo. Las bandas que se tiñen oscuras con un método pueden aparecer oscuras con otro. Tipos de Bandas: Banda Q G

Método Tinción con quinacrina T. Giemsa

R

Varias técnicas

T C NOR

Varias técnicas Extracción de DNA, T Giemsa T. con plata

Características Bandas fluorescentes Las bandas G oscuras corresponden a las Q brillantes Patrón inverso al de las Q, para extremos de cromosomas Resaltan regiones teloméricas Resaltan centrómeros Tiñen las regiones organizadoras del nucleólo (acrocéntricos en el hombre)

Nomenclatura de bandas cromosómicas: Las técnicas de bandeo fluorescente, permitieron la completa individualización de los cromosomas y se pudo comprobar que el cromosoma 21 asociado al síndrome de Down en realidad es más pequeño que el 22pero ambos mantuvieron el número ya asignado. Cada cromosoma en las células somáticas humanas esta formado por una serie de bandas continuas. Las bandas se ubican en regiones a lo largo de los brazos cromosómicos y las regiones tienen límites definidos que pueden ser los extremos de los brazos, los centrómeros y ciertas bandas. Las regiones y las bandas se enumeran desde el centrómero hacia el telómero del brazo correspondiente. Una banda considerada como límite pertenece en su totalidad a la región distal a ese límite y es la banda 1 de esa región. Para definir una banda en particular se requiere: # de cromosoma, símbolo del brazo, # de región y # de banda dentro de la región. Ej. 1p33 indica banda 3, de la región 3 del brazo corto del cromosoma 1. La coincidencia de los patrones observados con bandeo Q, G y R permitió la construcción de un diagrama único representativo de las 3 técnicas. Las técnicas de bandeo de alta resolución permiten descubrir sub-bandas y estas también se nombran con un número (creciente de centrómero a telómero) que se coloca después de un punto decimal que sigue al número de la banda. Ej. 1p33.1 indica sub-banda 1, del la banda 3, de la región 3, del brazo corto del cromosoma 1. Nomenclatura: En la descripción del cariotipo (fórmula cromosómica), se registra el # de cromosomas (incluyendo los sexuales) seguidos de una coma, luego de la cual se escriben los cromosomas sexuales; de existir aberraciones numéricas o estructurales de los autosomas, estas se escriben a continuación luego de una coma.

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Ejemplos:

− − ∗

46,XX

cariotipo femenino normal

46,XY

cariotipo masculino normal

Aberraciones numéricas:

  

47,XXY

cariotipo anormal con 47 cromosomas, 2X y un Y

45,X

cariotipo anormal con 45 cromosomas y un solo X

47,XY,+21 El signo (+) o (-), colocado delante dl no. De autosoma indica ganacia o pérdida de este cromosoma completo. Aquí se lee: cariotipo anormal masculino con 47 cromosomas y un cromosoma 21 adicional.  45X/46,XY Mosaico: 2 o más poblaciones celulares diferentes, se escriben separadas por una barra. Primero se escribe la que tiene menor no. D cromosomas y luego sucesivamente las de mayor número. Ej. Mosaico con 2 líneas ceulares, una con 45 cromosomas y un único X y otra con 46 cromosomas, un X y un Y.

∗

Disomía uniparental (upd):

Ambos miembros de un par cromosomico (los 2 homólogos) provienen de un solo progenitor y el del otro estan ausentes. Ej. 46,XY,upd(15)mat : Cariotipo masculino anormal con 46 cromosomas y disomía uniparental del cromosonma 15 por parte de la madre. ∗

Aberraciones Estructurales  46, XY,1q+ El signo (+)o (-) colocado detrás del símbolo del brazo indica ganacia o pérdida de material genético d ese brazo. Puede leerse: Cariotipo anormal masculino con 46 cromosomas, que muestra un aumento de la longitud del brazo largo en un cromosoma 1.



47,XY,+14p+ cariotipo anormal, masculino con 47 cromosomas que incluye un cromosoma 14 adicional que tiene incremento en la longitud del brazo corto.



46,XX,r(16) cromosoma 16 en anillo.

cariotipo anormal con 46 cromosomas, femenino que incluye un

Símbolos y abreviaturas. p t ins dup del inv mat hsr mar upd

Brazo corto translocación inserción Duplicación deleción invresión materno Región homogéneamente teñida Marcador Disomía uniparental

q ter r i fra dic pat ace dmin ish

Brazo largo Terminal Anillo isocromosoma Sitio frágil Dicéntrico Paterno Fragmento acéntrico Cromosoma diminuto doble Hibridación in situ

Especificación de los rearreglos y puntos de quiebra Rearreglo: luego del símbolo que identifica el rearreglo, se coloca entre paréntesis el # de cromosoma involucrado, Ej.: inv(7), se lee inversión en el cromosoma 7. Si dos cromosomas están involucrados, se colocan los 2 por separado con punto y coma. Ej. t(8;14), se lee translocación ocho catorce. Puntos de quiebra: Se especifica lo mas precisamente posible el lugar donde las quiebras han ocurrido y se colocan entre paréntesis, separadas entre si por un punto y coma, inmediatamente a continuación del rearreglo. Ej.: t(8;14)(q12;q22). Se lee translocacion 8 catorce con puntos de quiebra en la banda 2, region 1, del brazo largo del cromosoma 8 y en la banda dos de la región 2 del brazo largo del cromosoma 14.(Siempre va en primer término el cromosoma menor). Hibridación in situ (ish)

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Esta técnica ha establecido un puente entre los niveles de resolución microscópico y molecular, permitiendo detectar secuencias específicas de DNA y localizarlas en un sitio cromosómico preciso, mediante sondas de secuencias complementarias de ADN marcadas con fluorocromos (técnica de FISH). Nomenclatura: la aberración estructural detectada por esta técnica se expresa mediante la sigla ish seguida por el símbolo de la anomalía estructural seguida en paréntesis separados por el # de/de los cromosoma/s, punto/s de quiebra, y locus/loci para la/s sonda/s usada/s designada de acuerdo a GDB (Genomic Data Base) ordenada de pter a qter. El signo +- que sigue al locus indica presencia o ausencia respectivamente. Ej: 1.- Si se ha hecho un estudio citogenético estándar, como los arriba mencionados, se agrega el resultado de ish a continuación, separándolos por un punto: 46, XY.ish del (22)(q11.2q11.2)(D22S75-) Se lee cariotipo masculino normal por citogenética, que por ish muestra una deleción en el cromosoma 22 identificada mediante una sonda para el locus D22s75. 2.- Si no se ha hecho un estudio citogenético estándar, pero se localizo mediante ish esa aberración se escribe simplemente el resultado de la ish: ish del (22)(q11.2q11.2)(D22s75-) Hibridación in situ en interfase nuclear (ish nuc: La ish también permite localizar secuencias específicas en núcleos en interfase. En ese caso lo que se expresa es el numero de señales observadas de la sonda utilizada de la siguiente manera: la abreviatura nuc ish es seguida por la banda cromosomita donde esta el locus, seguida entre paréntesis por la designación del locus según GBD, luego un signo de multiplicación y finalmente el # de señales. Ej: − − −

nuc ish 21q22(D21s65x2) nuc ish 21q22(D21s65x3) nuc ish Xcen(DXZ1x3)

Dos copias del locus D21s65 Tres copias Del lócus D21s65 Tres copias Del lócus DXZ1

MATERIAL  3 Frascos de Roux  3 Vacutainers con aguja  3 tubos con heparina  Ligadura  1 pipeta de 5ml  Gradilla

 3 tubos de ensayo 16x100ml  3 goteros  1 vaso de precipitados 50ml y 400ml  Portaobjetos  Cubreobjetos  Hisopos

REACTIVOS  Medio de Cultivo McCoy 5ª  Fitohemaglutinina M  Solución de Colchicina  Solución de antibióticos estreptomicina)  Solución hipotónica de KCl

 Solución fijadora de Carnoy (metanol-ácido acético 3:1) (penicilina



Hipoclorito de sodio al 10%  Etanol al 75%  Colorante de Giemsa  Agua destilada  Aceto-orceína

EQUIPO  Incubadora  Centrífuga

 Refrigerador  Microscopio

PROCEDIMIENTO 1) Cultivo Celular a. Tomar en condiciones de esterilidad mediante punción venosa periférica 2ml de sangre en un tubo vacutainer con heparina.

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b. c. sangre. d. e. f. g. h.

Mezclar suavemente la heparina con la sangre para evitar la coagulación. Sembrar colocando en el frasco de Roux 4 ml de medio de cultivo McCoy 5A y 1ml de

Añadir 0.2ml de fitohemaglutinina M utilizando una jeringa del no. 20 (4 gotas) Agregar 0.1 ml de la solución de antibióticos. Incubar 72hrs a 37°C Agregar 0.2ml de solución de colchicina Incubar de 1-2hrs a 37°C i. Verter el contenido de los frascos de cultivo en tubos para centrífuga de 15ml y centrifugar a 1000rpm durante 10 min. j. Descartar con cuidado el sobrenadante k. Desintegrar el botón suavemente y resuspender las células en 4ml de solución hipotónica de KCl 0.075M l. Incubar a 37°C durante 20-30min m. Descartar cuidadosamente el sobrenadante n. Agregar solución fijadora de Carnoy hasta completar 4ml y resuspender hasta homogenizar o. Dejar en temperatura ambiente 5min. p. Centrifugar a 1000rpm durante 10 min. q. Descartar cuidadosamente el sobrenadante r. Repetir 2 veces el proceso de fijación s. Dejar en solución fijadora y refrigeración por 24hrs t. Centrifugar a 1000rpm durante 10 min. u. Eliminar el sobrenadante v. Agregar solución fijadora de acuerdo con el botón obtenido w. Hacer las preparaciones sobre portaobjetos previamente sumergidos en etanol al 70%, dejando caer 2 gotas de la suspensión celular desde una altura suficiente para lograr una dispersión adecuada de los cromosomas. x. Dejar secar al aíre. y. Colorear con Giemsa y realizar técnicas de bandas cromosómicas. z. Observación al microscopio. 2) Tinción Cromosómica  A cada una de las laminillas elaboradas en el procedimiento anterior, colocar colorante Giemsa (cubrir completamente).  Dejar 3-4min. Y enjuagar por goteo con agua y dejar secar al aíre.  Observar al microscopio con el objetivo 40X  Dejar más o menos tiempo para las siguientes laminillas dependiendo de la coloración observada.  Localizar 3 cariotipos y realizar el conteo. 3) Cariotipo humano  Observe la preparación del cariotipo con el objetivo 10X y elija una zona en las que no haya manchas de colorante y el fondo sea blanco.  Con el objetivo 40X elija una metafase similar a la mostrada en la figura 1 y céntrela.  Con el objetivo 100X observe si los cromosomas se hallan bien extendidos.  Centre la imagen, ponga el aceite y el objetivo de inmersión.  Deberá observar una metafase similar a la figura y distinguir cromosomas metacéntricos (m), submetacéntricos (s) y acrocéntricos (a).  Intente contar el número de cromosomas.

4)

Ejercicio de Cariotipo humano 1(Individual)

 Cuente los cromosomas de la fotografía 1 y recorte cada uno de ellos.  Ordénelos por tamaño e identifique por su patrón de bandas los pares cromosómicos. Para averiguar de que cromosoma se trata, compárelos con el patrón de bandas mostrado por el modelo 2.  Una vez ordenados los cromosomas, sujételos con resistol.  Anote la fórmula cromosómica correspondiente en el cuadro que se anexa.

 5)

Indique que cromosomas son metacéntricos, cuales son submetacéntricos (s) y acrocéntricos (a). Ejercicio de Cariotipo humano 2 (Individual)

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En esta práctica se trata de hacer un estudio del cariotipo humano. Para ello, los cromosomas deben fotografiarse en metafase, fase en la que mejor se visualizan. Aparecen duplicados (cada uno de ellos formados por 2 cromátidas) y unidos por el centrómero. a) b) c) d)

cuenta los cromosomas y agrúpalos por parejas. Determina el sexo del individuo. Recorta las parejas y pégalas en la hoja por orden de tamaños ¿presenta este individuo alguna anomalía? ¿Cuál?

RESULTADOS 1) Cultivo de linfocitos de sangre periférica:

2)

Tinción Cromosómica

3) cariotipo humano

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DISCUSIÓN DE RESULTADOS Primeramente se realizó el cultivo celular de linfocitos a partir de tomas de muestras de sangre de, los 3 integrantes del equipo para obtener así las muestras para el siguiente procedimiento que consistía en la obtención de los cariotipos de los cromosomas. Se utilizó el medio McCoy el cual es un medio diseñado para el crecimiento de líneas celulares diploides. Seguido de la adición de antibióticos para evitar la contaminación de las muestras, segudo de la fitohemaglutinina que es una lecitina con la capacidad aglutinar eritrocitos y leucocitos además de que estimula inespecíficamente la proliferación de células T y es esta característica mitogénica lo que le da su principal aplicación. Se utilizó solución de colchicina la cual impide la polimerización de los microtúbulos (tubulinas α y β) y de esta forma se detengan los cromosomas en la etapa de metafase para que no pasen a la anafase y así logremos visualizarlos más claramente. Al agregarse la solución hipotónica de cloruro de potasio lo que se hizo fue lisar las células. Al utilizar la solución fijadora de Carnoy, lo que se busca con la esta etapa es matar a las células sin deshidratarlas, y eliminar a la vez residuos citoesqueléticos; con la técnica de fijación Carnoy que esta diseñada para determinar el cariotipo (es decir, el número y la forma característica de los cromosomas) se logra observar una mayor diferenciación entre un cromosoma y otro, ya que estos presentan patrones de bandeo G espontáneo, el cual con procedimientos específicos puede ser mejorado. Y por último se dejaron caer las gotas de la muestra en suspensión aérea para romper los núcleos y así lograr observar los cromosomas. Al realizar la tinción cromosómica en la segunda parte de la práctica, se observó que entre 4 y 5 minutos eran los ideales en promedio para realizar las tinciones, pero esto dependía de cada caso ya que para algunas tinciones incluso 2 minutos eran suficientes; esto dependía del grado de absorbencia de las células de cada uno de los sujetos. El colorante era el de Giemsa que esta compuesto por Azur-Eosina-Azul de Metileno, lo que le dio la coloración a las células. Los núcleos celulares se podían observar con una coloración azul. Muchos de ellos no se rompieron para observar sus cromosomas posiblemente debido a que no se aplicó la fuerza necesaria para romper el núcleo y que de esta manera se lograran observar los cromosomas adecuadamente. Las observaciones que se realizaron de los cromosomas, se observaron en coloración rojo-rosa y se observaban junto al núcleo que se encontraba roto (por que de ahí salieron) e incluso en algunas de las observaciones se lograban observar parte de los cromosomas dentro y otra parte fuera del núcleo (no se alcanzaban a salir). Y en otras de las observaciones se veían varios cromosomas amontonados (de varias células juntas en el mismo lugar) que no correspondían a anomalías ya que los núcleos a los que correspondían los cromosomas se encontraban juntos. Se intentaron contar los cromosomas, pero se veían demasiado pequeños así que se utilizó aceite de inmersión, pero ya que el microscopio tenía algunas fallas técnicas se veían borrosos y no claramente, por lo que no se lograron contar de manera adecuada los cromosomas, sin embargo algunos de los cromosomas, aunque muy pequeños, se podían observar bien, e intuyendo por el tamaño se podría decir que eran cromosomas del grupo A y/o B los más grandes y visibles. En total se observaron clara y completos, 6 cariotipos, 5 a medias, y aprox. 3

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amontonados unos sobre otros, 4 incompletos y varios núcleos completos los cuales para la observación de los cromosomas debieron encontrarse en fase metafísica para visualizarse mejor. Los ejercicios de los procedimientos 4 y 5 se realizaron individualmente por lo que vienen en las hojas anexas a la práctica con los resultados de cada integrante del equipo por separado. CONCLUSIONES Por medio de esta práctica logramos observar y realizar todo el proceso que conlleva la observación de un cariotipo humano, desde la toma demuestra para obtener las células necesarias para la obtención de los cromosomas (en este caso linfocitos), su proceso de cultivación para madurarlos (ya que cuando se encuentran en circulación ya dejan de madurar y reproducirse) y de esta manera obtenerlos en metafase que es en la que se observan mejor a los cromosomas por medio de la ruptura de las células para que estos salieran de los núcleos; Se realizó la tinción cromosómica para hacer visibles a los cromosomas y de esta manera poderlos identificar. Se puede decir que estos procedimientos son muy laboriosos y dependen de la dedicación y la experiencia que se tenga para realizar el procedimiento de manera adecuada y así lograr obtener mayor cantidad de cariotipos y de mejor calidad de los que obtuvimos, ya que como todo con la práctica se realiza mejor. Por otra parte ya que no tenemos el equipo necesario para realizar la identificación específica de los cromosomas, se realizó un ejercicio de cariotipos humanos en los que se identificaron por bandas y tamaños los cromosomas para de esta manera tener una idea de cómo se realiza la identificación cromosómica de los cariotipos humanos. REFERENCIAS

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