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UNIVERSIDAD DEL NORTE PROGRAMA DE MEDICINA  – II SEMESTRE

PCR

Técnica adaptada y modificada por la profesora Alma Polo Barrios de la técnica de Sambrook et al. y las anotaciones del profesor José Villarreal Camacho.   1.

OBJETIVO

Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction  – PCR) a partir de  ADN genómico humano con la adición de primers específicos para la región polimórfica del gen apoE   que permitan genotipificar el ADN de la muestra. Esta técnica le permitirá al estudiante

adquirir algunas de las habilidades requeridas para la interpretación de resultados en el diagnóstico clínico a nivel molecular. 2.

RESPONSABLE

Los responsables de esta práctica son los estudiantes, supervisados por el docente de Biología Molecular y asistidos por el auxiliar de laboratorio. 3.

DEFINICIONES.

PCR: es una técnica para amplificación de ADN. En esta técnica se   utiliza una enzima

denominada ADN polimerasa que se encarga de sintetizar ADN complementario a una fragmento molde de ADN en un proceso que simula la forma en la que el ADN se replica in vivo. La PCR permite sintetizar un gran número de copias de ADN a partir de poca concentración de  ADN, pero cabe aclarar que no permite replicar genes de gran tamaño ni un genoma completo. MASTER MIX: es la solución que contiene los componentes esenciales para una reacción de

PCR. Está compuesta por:    

BUFFER DE AMPLIFICACIÓN Contiene KCl, Tris-HCl y MgCl2. El cloruro de magnesio es el componente más influyente en la reacción ya que actúa como cofactor de la enzima Taq polimerasa mediante la donación de iones Mg2+. PRIMER Es un oligonucleótido sintético de unos 18-30 nucleótidos. Este ADN posee una secuencia complementaria a la región adyacente o vecina al fragmento que se desea amplificar. Para la técnica de amplificación se preparan dos soluciones de trabajo: Primer F y Primer R. El Primer

 

F tiene una secuencia complementaria a la región adyacente que se localiza corriente arriba de la diana que se quiere amplificar. El Primer R es complementario a la región adyacente que se localiza corriente abajo de la diana que se va a amplificar. Los Primers definen la longitud del fragmento que se va a amplificar. Es usual que se amplifiquen sólo regiones específicas del gen y no el gen completo. Los primers actúan como iniciadores del proceso de síntesis de ADN. A la hora de elegir los primers o cebadores para la amplificación de un determinado fragmento se debe tener en cuenta:   

La longitud de los primers debe estar comprendida entre 18 y 30 nucleótidos. En los experimentos se ha comprobado que los primers de más de 30 nucleótidos no aumentan el rendimiento de la reacción y los primers muy cortos carecen de especificidad. 

 

Ambos prim primers ers deben tener una temperatura de hibridación similar. similar. Como máxima diferencia entre las temperaturas de hibridación de los primers se acepta que estas sean de aproximadamente +/- 5°C). 

 

La relación purinas-pirimidinas debe ser 1:1 o en su defecto de 40:60. Recuerde que se está hablando de un fragmento de ADN de una sola hebra. Se sugiere que en el extremo 3´- de los primers esté una G o C, pero esto no es un requisito indispensable. 

 

DESOXINUCLEÓSIDOS TRIFOSFATOS (dNTP) Es una mezcla de moléculas ATP, GTP, CTP y TTP que suelen agregarse en altas concentraciones (ya que se gastan en la reacción rápidamente) para que sean incorporados por la ADN polimerasa a las cadenas de ADN que se están sintetizando. La concentración de dNTP y el MgCl2  siempre va relacionada. Para una concentración de 200 μM de cada uno de los dNTP se suele añadir una concentración de 1.5 mM de Mg2+.

 

Taq POLIMERASA

Es una  enzima de tipo ADN polimerasa que inicialmente fue extraída de una bacteria extremófila, el Thermus aquaticus. Hoy día se obtiene en el laboratorio a partir de bacterias recombinantes que poseen el gen y sintetizan la enzima a partir del mismo. Esta enzima se encarga de incorporar nucleótidos al extremo 3’- del primer o cebador que previamente se ha unido por complementariedad a la zona adyacente al fragmento que se desea amplificar. La principal característica de esta enzima es que es termoestable por lo que puede soportar temperaturas elevadas y mantener una media de extensión (procesamiento) de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. Las cantidades óptimas de Taq  polimerasa necesarias para la síntesis de ADN están alrededor de 2 unidades por cada 25 μL

de volumen final de reacción. La actividad de esta enzima se ve influenciada por la

 

concentración de dNTPs, Mg+2  y de algunos iones monovalentes. Las concentraciones elevadas de estos iones inhiben la actividad de dicha enzima.    

ADN MOLDE (en inglés TEMPLATE) Es el ADN que se desea amplificar. La concentración de ADN necesaria para una reacción de PCR siempre va a ser muy baja, pero depende de la calidad del ADN. Cuando el ADN es de óptima calidad (puro) no surgen problemas durante la amplificación. Generalmente una concentración de mínimo 5 ng por cada 25 μL de reacción genera buenos resultados. El  

problema aparece cuando la calidad del ADN obtenido no es la idónea, debido a que está degradado o bien porque se encuentra mezclado con diferentes contaminantes.  contaminantes.   4.

FUNDAMENTO

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica cuyo objetivo principal es la amplificación (multiplicación) in vitro de uno o varios segmentos de ADN, por acción de una enzima ADN polimerasa termoestable. Durante el proceso, lo primero que sucede es la desnaturalización del ADN bicatenario con la finalidad de que se generen cadenas de ADN de una sola hebra a las que se les unirán por complementaridad los primers sintéticos, que delimitarán la región que se va a amplificar. Inmediatamente después, los primers van a ser alargados por la polimerasa termoestable que fue añadida al sistema, en un proceso de síntesis de cadenas bicatenarias de ADN in vitro. 5.

REACTIVOS Y ENZIMAS  

Buffer para la amplificación (contiene los cofactores necesarios para la amplificación como son el KCl, Tris-HCl y MgCl 2).

 

Primers o cebadores para el gen a poE : Primer 1F 5´CGG ACA TGG AGG ACG TGT 3´ Primer 2R 5´CTG GTA CAC TGC CAG GCA 3´ Primer 3F 5´ CTG GTA CAC TGC CAG GCG 3´ Primer 4R 5´ CGG ACA TGG AGG ACG TGC 3´   Muestras de ADN genómico humano y ADN genómico bacteriano.

6.

 

dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 

 

Taq polimerasa

 

Agua Milli Q

MATERIALES Y EQUIPOS  

Micropipetas de 0.5 l, 20 y 100 l y puntas para micropipetas.

 

Termociclador

 

Tubos eppendorf con capacidad para 200 l

 

Gradillas refrigeradas (coolers)

 

7.

PROCEDIMIENTO   

Todo el material debe mantenerse en frío de 0 - 4°C durante la preparación de la reacción de amplificación. No se debe abandonar la cadena de frío para la reacción. 

 

A 47 μl de la solución master mix, preparada según las indicaciones de la tabla, se le agregan 3μl de ADN. Se homogeniza la solución por pipeteo suave. COMPONENTE

CONCENTRACION INICIAL

CONCENTRACION REQUERIDA

Buffer de amplificación

10X

1X

MgCl2 

25mM

1.2 mM

Primer F

10 µM

1 µM

Primer R

10 µM

1 µM

dNTP

10 mM de cada dNTP

0.2mM de cada dNTP

Polimerasa

5 U / µL

1.25 U

H2O

Hasta 47 μL 

Hasta 47 μL 

REACTIVOS

   X    I    M    R    E    T    S    A    M

VOLUMEN POR TUBO

Hasta 47 μL  47 μL 

Total

Después de tener preparada la solución Master Mix, agregar el ADN ADN

?

0.2 ng/ µL

~

3 µL

 o primer en dirección 5´-3´; 5´-3 ´; Primer R: reverse primer  o  o primer en dirección 3´-5´ 3´ -5´ Primer F: forward primer  o  

Se llevan los tubos (en las gradillas refrigeradas) hasta el termociclador y se colocan en el portatubos del equipo. Se cierra la tapa del termociclador y se programa el equipo como sigue: 

30 ciclos: 

Homogeneización

95°C por 4 min.

Desnaturalización 

95°C por 30sec

Hibridación o Anillamiento 

57°C por 30sec

Extensión  Extensión Final

72°C por 30sec 72°C por 5 min

Temperatura de mantenimiento

4°C tiempo indefinido

 

Los primers amplificarán un fragmento específico de 173 pb.

 

Después de la amplificación, las muestras se deben guardar en refrigeración a -20°C o se pueden observar inmediatamente mediante una electroforesis en gel de agarosa. 

8.

REFERENCIAS  L aboratory Manual. CSHL Press. 4ª edición. Volumen I,  Green MR, Sambrook J. 2012. Molecular Cloning: A Laboratory II y III.  Dixon,

S.C., Horti, J., Guo, Y., Reed, E., and Figg, W.D. W .D. 1998. Methods for extracting and amplifying genomic DNA isolated from frozen serum. Nat. Biotechnol. 16, 91.  Ossendorf M and Prellwitz W. 2000. Rapid and easy apolipoprotein E genotyping using an improved PCRRFLP technique. QiagenNews issue I.