53252572 Informe Cinetica Enzimatica Biorreactores

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÒGICAS E.A.P. DE GENÈTICA Y BIOTECNOLOGÌA

ALUMNAS: ASIGNATURA: PROFESOR: AÑO DE ESTUDIOS: SEMESTRE ACADEMICO:

Jiménez Espinoza, Alejandra Katia Villafani Bravo, Yvette Verónica Ingeniería Bioquímica Raymundo Erazo Erazo Cuarto año 2010-I y

TEMA: por lote y FECHA DE ENTREGA:

07100067 07100071

con y flujo continuo

Miércoles, 11 de Agosto de 2010 Lima, Ciudad Universitaria, 2010

SEMINARIO III

Modelos y mecanismos de reacción enzimática con inhibidores:

Cinética y diseño de biorreactores por lote y de flujo continuo

1. Antecedentes de las enzimas

2. Propiedades y características de las enzimas

3. Introducción a la cinética básica de las enzimas

4. Ecuación de Michaelis-Menten

5. Acción de efectores sobre la actividad enzimática

6. Biorreactores enzimáticos: Cinética y diseño de biorreactores por lote y de flujo continuo

•

Reactor por lotes

•

Reactor de flujo continuo (CSTR y PFTR)

7. Inhibición en los reactores enzimáticos

8. Bibliografía

9. Anexos

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ANTECEDENTES DE LAS ENZIMAS La palabra “enzima” se deriva del griego que significa “en las levaduras” y fue usada primero por Kuhne en 1878. Sin embargo, el primer informe publicado acerca de la capacidad de los extractos celulares (malta) para llevar a cabo una reacción característica de las células vivas (la hidrólisis del almidón a glucosa) fue escrito inicialmente en 1833 por Payen y Persoz. Más tarde, Buchner (1897) demostró la capacidad de los extractos de levadura para catalizar la conversión de azúcar a alcohol, mientras que Emil Fischer (1894) demostró la especificidad de las enzimas para su substrato. Subsecuentemente, Sumner (1926) cristalizó la primera enzima, la ureasa, la cual hidroliza la urea a CO2 y NH3 y mostró que las enzimas eran proteínas. Fue hasta la década de los años sesenta que se conoció la composición química precisa de las enzimas mediante la secuencia de la ribonucleasa, junto con los estudios de conformación tridimensional por cristalografía de rayos X. Estos trabajos permitieron que se postulara el mecanismo de acción enzimática, junto con loas proposiciones para la forma que en ésta se regula. Por último, en 1969 se sintetizó químicamente la primera enzima (ribonucleasa) a partir de los aminoácidos precursores y, aunque su actividad y su pureza eran escasas, se demostró que las enzimas no son cualitativamente distintas a los catalizadores no biológicos. Una enzima, E, es una proteína o sustancia tipo proteína con propiedades catalíticas. Un sustrato, S, es la sustancia que se transforma químicamente a velocidad acelerada gracias a la acción de la enzima sobre ella. Una propiedad importante de las enzimas es que son específicas en cuanto a que una enzima solo puede catalizar una reacción. Por ejemplo, una proteasa hidroliza únicamente enlaces específicos entre aminoácidos específicos en las proteínas, una amilasa actúa sobre enlaces entre moléculas de glucosa en el almidón, y una lipasa ataca a las grasas, degradándolas a ácidos grasos y glicerol. Por tanto, es fácil controlar los productos indeseables. Solo los organismos vivos producen enzimas, y las enzimas comerciales normalmente son producidas por bacterias. Las enzimas casi siempre operan (es decir, catalizan reacciones) en condiciones suaves: pH de 4 a 9 y temperaturas de 24 a 71 °C. En la figura 7-10 se muestra un esquema de la enzima quimotripsina. En muchos casos, los sitios catalíticos activos de la enzima se encuentran en los puntos donde interactúan los diversos bucles. En el caso de la quimotripsina, los sitios catalíticos se marcaron con los números 57, 102 y 195 en la figura 7-10.

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La mayoría de las enzimas se nombra en términos de la reacción que cataliza. Se acostumbra añadir el sufijo –asa a una parte importante del nombre del sustrato sobre el que la enzima actúa. Por ejemplo, la enzima que cataliza la descomposición de la urea es ureasa y la que ataca la tirosina es la tirosinasa. Existen tres tipos principales de reacciones enzimáticas: I. II. III.

Enzima soluble-sustrato insoluble Enzima insoluble-sustrato soluble Enzima soluble-sustrato soluble

Un ejemplo de reacción de tipo I es el uso de enzimas como las proteasas o amilasas en los detergentes para la ropa; sin embargo, esta reacción enzimática ha causado cierta controversia en relación con la contaminación del agua. Una vez en solución, la enzima soluble podría dirigir (es decir, descomponer) un sustrato insoluble como una mancha de sangre. Actualmente se esta intensificando la investigación de las reacciones tipo II. Al unir grupos enzimáticos activos a superficies sólidas se pueden crear unidades de procesamiento continuo similares al reactor de lecho catalítico empacado que veremos en el capitulo 10. Es evidente que la más intensa actividad en el estudio de las enzimas ha estado relacionada con las reacciones biológicas, porque se ha demostrado que prácticamente todas las reacciones de síntesis y degradación en las células vivas se controlan y catalizan con enzimas especificas. Muchas de estas reacciones son homogéneas en la fase liquida; es decir, son reacciones tipo III (enzima solublesustrato soluble). En la breve presentación que sigue nos limitaremos a la reacciones tipo III, auque se ha comprobado que las ecuaciones que se obtienen son aplicables a las reacciones tipo I y tipo II, en ciertos casos. Al desarrollar algunos de los principios elementales de la cinética de las reacciones enzimáticas, estudiaremos una reacción enzimática que Levine y LaCourse han 4

sugerido como parte de un sistema que reduciría el tamaño de un riñón artificial. El resultado deseado es la producción de un riñón artificial que el paciente pueda llevar puesto y que cuente con una unidad reemplazable para eliminar productos de desechos nitrogenados como acido úrico y creatinina. En el esquema de microencapsulamiento propuesto por Levine y LaCourse, se utilizaría la enzima ureasa para eliminar urea del torrente sanguíneo. Aquí, la acción catalítica de la ureasa haría que la urea se descomponga para dar amoniaco y dióxido de carbono. Se cree que el mecanismo de reacción consiste en la siguiente sucesión de reacciones elementales:

Vemos que parte de la enzima añadida a la solución se une a la urea, y parte queda sin unirse. Aunque es fácil medir la concentración total de la enzima (Et ), es difícil medir la concentración de la enzima libre (E). Si representamos con E, S, W, ES y P la enzima, el sustrato, agua, el complejo enzima-sustrato y los productos de reacción, respectivamente, podemos escribir las reacciones (7-72), (7-73) y (7-74) simbólicamente así:

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La Forma final de la ley de velocidad:

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS Una enzima en un catalizador biológico y, como todos los catalizadores, las enzimas aumentan la rapidez de una reacción química sin sufrir un cambio químico 6

permanente en sí mismas. Un catalizador influye en la rapidez de una reacción química pero no afecta el equilibrio de esta. Las enzimas, sin embargo, exhiben muchas propiedades que difieren de las mostradas por los catalizadores en general. Las tres propiedades más importantes son: su alto contenido catalítico, su especificidad y la capacidad para regular su actividad catalítica mediante diversos compuestos de origen natural. < Poder catalítico Es difícil comparar la rapidez de reacción de las reacciones catalizadas por enzimas con rapidez de reacción que ocurre en ausencia de las enzimas bajo condiciones similares de temperatura, pH, etc. Este se debe principalmente a las dificultades para medir las rapideces demasiado bajas de las reacciones no catalizadas por enzimas. Koshland informo que las rapideces de ciertas reacciones eran mucho más altas en presencia de enzimas que en ausencia de estas. Así, la hexoquinasa, fosforilasa, deshidrogenasa alcohólica y la creatinina cinasa incrementaban las rapideces de reacción en > 1010, >3x1011, >2x108 y >104, respectivamente. Otra característica importante de las enzimas es su capacidad para funcionar como catalizadores en un intervalo moderado de temperatura (~300K), pH (2-10) y presión (~1atm). Un ejemplo es la fijación de nitrógeno catalizada por el complejo de la enzima nitrogenasa, la cual se realiza óptimamente a 300K, pH neutro y presión atmosférica. En contraste la síntesis industrial de amoniaco a partir de nitrógeno requiere una temperatura de 700-900K, presiones de 100-900atm y la presencia de hierro como catalizador. Enzima Anhidrasa carbónica Corismato mutasa Triofosfato isomerasa Carboxipeptidasa A AMP nucleosidasa Nucleasa estafilocal

Velocidad en ausencia de enzima 1.3x10-1 2.6x10-5 4.3x10-6 3.0x10-9 1.0x10-11 1.7x10-13

Velocidad de reacción catalizada 1.0x106 50 4300 578 60 95

Rendimiento 7.7x106 1.9x106 1.0x109 1.9x1011 6.0x1012 5.6x1014

Tabla 1. Eficiencia de las reacciones catalizadas por algunas enzimas

< Especificidad de las enzimas La mayoría de las enzimas, a diferencia de los catalizadores químicos, son altamente específicas en cuanto a la naturaleza del sustrato (s) que utilizan y al tipo de reacción que catalizan. Algunas enzimas son más específicas que otras. Así, las peptidasas, fosfatasas y esterasas utilizaran una amplia variedad de sustratos “siempre que” estos contengan el enlace químico requerido, a saber, enlace peptídico, unión fosfato ester y enlace carboxilato ester, respectivamente. A menudo, se encuentra baja la especificidad con las enzimas degradativas, pero rara vez con las enzimas biosintéticas. Otro grupo de enzimas, por ejemplo, la hexoquinasa, son intermedias 7

entre estos dos extremos que exhiben especificidad de grupo. Así, la hexoquinasa cataliza la fosoforilación de diversos azucares siempre que sean de aldohexosas. Muchas enzimas muestran especificidad absoluta en cuyo caso pueden utilizar un solo sustrato o un par de sustratos, si la reacción es bimolecular, a una rapidez apreciable. Ejemplos de estas son las L- y D-lactato deshidrogenasas que catalizan la reducción de piruvato a L- o D-lactato, respectivamente, pero no la mezcla de los dos estereoisómeros. Además, estas enzimas son absolutamente específicas en relación con el compuesto a reducir en la reacción. Por lo tanto, como muchas enzimas deshidrogenasas, son específicas para NAD o NADP, pero no para ambos.

Figura: A.- Reacción catalizada por la triosafosfato isomerasa; B.- Inhibidores de su catálisis. Nótese el parecido con la estructura de los sustratos y del intermediario

< Regulación de la actividad enzimática Otra propiedad importante de las enzimas es que, a diferencia de la catálisis química, su actividad catalítica a menudo puede regularse mediante iones o moléculas pequeñas. Así, el Ca+2 estimula a la enzima glucógeno fosforilasa, responsable del rompimiento del glucógeno a glucosa durante la contracción muscular. Un mecanismo regulatorio que ocurre comúnmente es la inhibición retroalimentada de las enzimas participantes en vías biosintéticas. Así la treonina deshidratasa, la primera enzima especifica en la ruta de síntesis de la isoleucina en E.coli, es inhibida fuertemente por la isoleucina, el producto final de la vía biosintética, que tiene poca semejanza estructural con el sustrato o producto de la reacción.

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CARACTERISTICAS GENERALES DE LA ENZIMAS < Cofactores Las enzimas son proteínas con longitudes de cadena de 100 a 2500 residuos aminoácidos. Algunas enzimas como la quimotripsina (que cataliza la hidrólisis de proteínas) y la trifosfato isomerasa (que cataliza la interconversión de gliceraldehído-3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato), no requieren de ningún componente además del sustrato para su actividad. Sin embargo, muchas enzimas requieren de un componente no proteico llamado cofactor para su actividad.

Un grupo de cofactores son los iones metálicos. Así, la piruvato cinasa necesita K+ (y Mg+) para su actividad; la carboxipeptidasa (que hidroliza proteínas del extremo C-terminal) necesita Zn2+, el cual forma parte integral de la estructura de la enzima. La eliminación del zinc por quelación con EDTA desactiva la enzima. Las cinasas necesitan Mg2+ para su actividad, aunque en este caso el ion metálico se une al sustrato en lugar de la enzima, así, el verdadero sustrato es Mg-ATP2- en de ATP.

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La segunda clase principal de cofactores son compuestos orgánicos que con frecuencia se derivan del grupo de vitaminas B. Por lo tanto, las carboxilasas (que incorporan CO2) necesitan la biotina que esta covalentemente unida a la enzima; las transaminasas requieren fosfato de piridoxal unido a la enzima. Los cofactores que se encuentran fuertemente unidos a la enzima a menudo se denominan grupos prostéticos. La enzima que contiene el cofactor o grupo prostético se conoce como holoenzima (activa), en tanto que la enzima que carece del cofactor se denomina apoenzima (inactiva). Compuestos orgánicos tales como NAD, NADP, FAD, Coenzima A (CoASH) y ATP pueden unirse en forma lábil a la enzima, un equilibrio entre la enzima, la apoenzima y el cofactor. Estos cofactores comúnmente se denominan coenzimas. Enfermedad Humana por deficiencia

Coenzima

Reacción

Fuente vitamínica

Biocitina

Carboxilación

Biotina

Coenzima A

Transferencia de acilos

Pantotenato

* *

Coenzimas de Cobalamima

Alquilación

Cobalamina (B12)

anemia perniciosa

Coenzimas de flavina

Oxidación-reducción

Riboflavina (B2)

Acido lipóico

Transferencia de acilos

-----

* *

Coenzimas de nicotinamida

Oxidación-reducción

Nicotinamida (niacina)

Pelagra

Fosfato de piridoxal oo

o

Tiamina pirofosfato

Transferencia de grupo amino

Piridoxina (B6)

*

Transferencia de un grupo de 1 Carbono

Acido fólico

anemia megaloblástica

Transferencia de aldehído

Tiamina (B1)

beriberi

Tabla: Relación entre algunas coenzimas y las vitaminas a partir de las cuales se producen. Enfermedades generadas por la deficiencia. * no tiene un nombre específico, su aparición es muy rara.

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< Isoenzimas Ocasionalmente, en una sola especie hay varias formas de enzimas que catalizan la misma reacción. Estas pueden diferir entre sí con respecto a la secuencia de aminoácidos, alguna modificación covalente como la fosforilación o por cambios de conformación. Las isoenzimas son aquellas formas de una enzima que provienen de diferencias determinadas genéticamente en la secuencia de aminoácidos y no incluyen modificaciones postraduccionales de la secuencia o estructura. Las enzimas aspartocinasas que participan en el primer paso de la vía biosintética de la familia del aspartato de los aminoácidos, son ejemplos de isoenzimas. Ciertas cepas de E.coli poseen tres isoenzimas, cuyas actividades están sujetas a inhibición por retroalimentación mediante diferentes productos de la vía. < Clasificación de las enzimas Es común dar a las enzimas nombres triviales que describen la reacción que catalizan, por ejemplo ureasa (cataliza la hidrólisis de la urea), lactato deshidrogenasa (cataliza la oxidación del acido láctico). En estos casos comúnmente se agrega el sufijo –asa al nombre del sustrato o de la reacción catalizada por la enzima. Sin embargo, con frecuencia los nombres no reflejan la reacción en la que participa la enzima, por ejemplo, renina, tripsina, enzima málica, papaína, etc. Como resultado, la European Comission dio a conocer una nomenclatura para las enzimas aceptada internacionalmente. Hay seis tipos principales de reacciones catalizadas por enzimas: reacciones de óxido reducción, de transferencia de grupo, hidrolíticas, de eliminación con formación de un enlace doble, de isomerización y donde se unen dos moléculas a expensas de una fuente de energía (ATP)

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< Bases de la catálisis enzimática Se describió a las enzimas como catalizadores biológicos que aceleran una reacción química sin alterar el equilibrio final. Un ejemplo de una reacción catalizada por una enzima es la conversión de glucosa-1fosfato (G-1-P) a glucosa-6-fosfato (G-6-P) en solución acuosa a pH 7. En estas condiciones, la reacción no catalizada por las enzimas es extremadamente lenta aun cuando el cambio de energía libre de G-1-P a G-6-P es negativo (-1.745kcal). Esto se debe a que existe una barrera para la reacción denominada energía de activación. El contenido de energía de las moléculas en una población sigue una curva de distribución. Solo aquellas moléculas con una energía suficientemente alta tienen posibilidad de reaccionar para formar el producto. Para hacer que la reacción proceda con mayor rapidez debe elevarse el contenido de energía de toda la población. Esto se podría lograr al calentar la mezcla o mediante la adición de un catalizador. En efecto, los catalizadores disminuyen la energía de activación de la reacción al permitir que una población mucho mayor reaccione a cualquier tiempo. El catalizador puede lograr lo anterior al formar un complejo o compuesto intermediario inestable con el sustrato, el cual se descompone rápidamente para formar el producto, con lo que se obtiene una ruta para la reacción a través de la barrera, es decir, la energía de activación. La reacción procede con rapidez cuando ha sido disminuida la energía de activación, sin embargo, como no hay diferencia en el contenido de energía relativa de G-1-P y G-6P en las reacciones catalizadas y no catalizadas, el punto de equilibrio es el mismo.

Evolución energética de una reacción química. Se observa la diferencia energética entre los estados de transición de las reacciones catalizada y no catalizada

La especificidad y sus propiedades regulatorias no se han entendido completamente. Las evidencias sugieren que la cadena polipeptídica de la enzima se dobla de tal forma que un grupo de aminoácidos “reactivos”, como el aspartato, cisteína, histidina, lisina, metionina, serina o treonina, se coloca para formar un sitio activo. Este sitio es la región en la que se localiza la actividad catalítica de la enzima. El sustrato se une a este sitio activo mediante varios enlaces débiles que incluyen puentes de hidrogeno y, ocasionalmente, enlaces covalentes, para formar un complejo enzima-sustrato. La reacción se lleva a cabo mediante una serie de mecanismos y los productos se liberan de este complejo en el sitio activo. La unión del sustrato es un área compleja, sitio activo y el sitio regulador, puede ser importante para la regulación de la actividad de la enzima. Una molécula efectora o inhibidora puede unirse a este sitio y causar un cambio conformacional en la

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proteína de modo que el sitio este mas disponible (o menos, en presencia del inhibidor) para la unión con el sustrato o para aumentar o para inhibir la rapidez de reacción. Una complicación mas es la presencia de enzimas con más de una subunidad (cadena polipeptídica). En estas enzimas multiméricas, por ejemplo, la hemoglobina, la unión del sustrato, el inductor o el inhibidor a una de las subunidades, provoca un efecto en la unión o actividad de las otras subunidades.

INTRODUCCIÓN A LA CINÉTICA BÁSICA DE LAS ENZIMAS Muchos estudiantes de biología tienen un “miedo” inherente a la cinética enzimática porque requiere habilidad para manejar ecuaciones algebraicas básicas; asimismo, se les dificulta comprender el significado de los datos cuantitativos de la cinética, obtenidos generalmente “in vitro”, en relación co lo que ocurre en la célula viva. Es verdad que con frecuencia hay mucha información en los datos cinéticos, con teorías muy generales y, a menudo, dudosas acerca de la función de las enzimas en la célula. Un ejemplo es el glutamato deshidrogenasa, responsable de la asimilación del amoniaco. Frecuentemente se informa que esta enzima tiene una Km alta, poca afinidad por el substrato amoniaco, con un valor de hasta 40 mM. Esta Km alta se obtuvo con 1 mM α-oxoglutarato y 1 µM de NADH. Sin embargo, si se hubiera querido ser más real, se hubieran usado concentraciones de substrato in vivo, por ejemplo, 0.11 mM α-oxoglutarato y 1 µM de NADH, la Km para el amoniaco sería de aproximadamente 3-4 mM. A partir de este ejemplo resulta claro que las condiciones empleadas para medir la actividad enzimática deben variar en un intervalo amplio de condiciones fisiológicas antes de concluir acerca de la función de una enzima in vivo. El estudio de la cinética enzimática puede producir mucha información importante, particularmente cuando se combina otras técnicas, relacionada con el mecanismo

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de acción de una enzima, la forma en que responde una enzima a cambios fisiológicos en la concentración de substrato y cómo puede controlarse o regularse la actividad de una enzima bajo condiciones fisiológicas. Para los biotecnólogos interesados en el uso de enzimas aisladas o de sistemas enzimáticos para el rompimiento de substratos (celulosa) o para la formación de productos (jarabes ricos en fructuosa), la importancia de la cinética enzimática es clara en la determinación de las condiciones óptimas para la actividad enzimática y para la determinación de las rapideces de conversión óptimas. Es decir, el conocimiento de los datos cinéticos permite diseñar el proceso catalizado por enzimas de manera que se logre la máxima, o el máximo económico, conversión de los substratos en productos. Ensayos enzimáticos Para estudiar la cinética es importante crear métodos confiables y reproducibles para la medición de la actividad enzimática en condiciones específicas. El propósito del ensayo enzimático es medir la rapidez de formación del producto o la rapidez de la desaparición del substrato(s) en condiciones controladas de temperatura, pH y concentración de compuestos modificadores de la actividad. Se usan dos tipos básicos de ensayos enzimáticos denominados ensayos continuos y discontinuos. En cualquier caso se debe asegurar que la rapidez inicial de la reacción se pueda medir en presencia de una concentración de substrato(s) fija. La rapidez inicial es importante ya que evita complicaciones debidas a la acumulación del producto y porque la enzima puede desactivarse en el curso del ensayo. En estas condiciones, la rapidez medida será directamente proporcional a la concentración de la enzima. Además, la actividad se mide normalmente bajo condiciones de estado estacionario donde la concentración del substrato es mucho mayor que la concentración de la enzima, para que la rapidez difícilmente varíe debido a cambios en la concentración del substrato. Una práctica común es usar una concertación de substrato por lo menos cinco veces mayor que la Km de la enzima del substrato. Es posible estudiar la cinética de estado estacionario o de estado pre-estacionario donde la concentración de las enzimas y del substrato(s) es comparable, pero esto requiere equipo costoso para asegurar el mezclado rápido de los componentes y no se analizara aquí. fumarato + H2O € malato

5.1

Para ensayos continuos más complejos se necesita el acoplamiento o enlace de una reacción catalizada por una enzima, la cual puede seguirse de manera continua, con la reacción enzimática que se estudiará. D-glucosa + ATP € D-glucosa-6-fosfato + ADP

5.2

Ni los substratos ni los productos absorben a longitudes de onda específicas o tienen propiedades que puedan monitorearse continuamente. Esta reacción se

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puede acoplar a la reducción de NADP al añadir glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en exceso, es decir, a concentraciones que no limiten la rapidez de la reacción:

D-glucosa + ATP

D-glucosa-6-fosfato + ADP

5.3

NADP NADPH D-glucosa-S-lactone-6-fosfato (6- fosfogluconlactona) En esta reacción acoplada, la hexocinasa cataliza la formación de D-glucosa-6fosfato, la cual se reduce inmediatamente por la acción de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para producir NADPH. El NADP+ no absorbe a 340nm pero el NADPH sí. En consecuencia, la reacción se puede monitorear continuamente a 340nm. Estos ensayos acoplados requieren que el producto de la primera reacción, la Dglucosa-6-fosfato, sea convertida de inmediato 6-fosfogluconolactona. Es decir, la reacción acoplada debe proceder con una rapidez mayor que la de la reacción que se desea estudiar cinéticamente. La enzima acoplante debe estar pura, presente en concentraciones no limitantes de la rapidez de la reacción y debe estar libre de impurezas que pudieran afectar la actividad de cualquiera de las enzimas. La actividad de la hexocinasa también podría medirse con un procedimiento de ensayo discontinuo en el que la d-glucosa y la hexocinasa se mezclan en condiciones definidas, y las muestras se extraen a intervalos precisos para la determinación de la glucosa. Estos ensayos requieren que las muestras sean extraídas a intervalos precisos y que la reacción sea detenida inmediatamente, por ejemplo, mediante la adicción de acido tricloroacético para inactivar a la enzima. Siempre que es posible, se prefieren más ensayos continuos que los discontinuos. Sin importar el tipo de ensayo, es necesario tomar las precauciones siguientes para obtener datos confiables: 1) Los componentes del sistema de ensayo deben ser de la más alta pureza posible. 2) La preparación de la enzima debe estar libre de compuestos que inhiban o interfieran con las actividades enzimáticas. 3) La enzima, el substrato(s) y el (los) producto(s), deben ser estables el tiempo que dure el ensayo. 4) El pH y la temperatura deben mantenerse constantes mediante el uso de soluciones amortiguadoras y termostatos, ya que estos factores afectan marcadamente la rapidez de la reacción. 5) La rapidez de reacción medida debe ser constante durante el ensayo y debe ser proporcional a la cantidad de enzima adicionada.

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6) Debe medirse la rapidez inicial de la reacción para evitar cambios notables en la concentración del substrato, inhibición del producto o que se invierta la reacción.

Cinética de reacciones con un substrato La cinética enzimática simple se basa en tres principios experimentales: 1) Que el substrato, S, forma un complejo intermediario enzima-substrato, ES, con la enzima, E. 2) Que la rapidez de la reacción a tiempo t (es decir, la rapidez de desaparición de substrato, -ds/dt, o bien, la rapidez de formación del producto dp/dt) se representa con la pendiente de la curva P o S = f (t). Estas pendientes varían con el tiempo durante el curso de la reacción, debido a la desaparición del substrato. Las mediciones cinéticas se basan generalmente en la parte lineal de la curva, es decir, la velocidad inicial o la rapidez inicial de reacción. En esta región, la concentración del producto es extremadamente pequeña y, en consecuencia, la descomposición de producto a substrato es insignificante (determinado por la constante de rapidez K2 ) y se puede escribir:

3) Para una concentración dada de substrato, la determinación de la variación en la rapidez de reacción como función de la concentración de la enzima no es lineal, sino hiperbólica. Esto se debe a que todo el substrato esta en la forma de complejo enzima-substrato, [ES], a altas concentraciones de la enzima. En consecuencia, la rapidez inicial de la reacción como función de la concentración de la enzima permanece constante en estas condiciones. Para mediciones de cinética es necesario trabajar en la región lineal de la curva a baja [E] para que la rapideces de reacción dependan de la concentración de la enzima. También se puede decir que la concentración de la enzima debe ser muy pequeña comparada con la concentración del substrato de tal modo que la información del complejo enzima-substrato [ES], tiene poco o ningún efecto con la concentración de substrato. A. Ecuación de Michaelis-Menten Dado que la reacción entre la urea y la ureasa (ejemplo mencionado en la pág. 3) se efectúa en solución acuosa, el agua obviamente está en exceso y podemos considerar constante su concentración. Sea:

Dividiendo el numerador y el denominador de la ecuación (7-86) entre k1, obtenemos una forma de la ecuación de Michaelis-Menten: 16

Donde Km es la constante de Michaelis. Si además, representamos con Vmáx la velocidad de reacción máxima para una concentración total de enzima dada,

La ecuación de Michaelis-Menten adopta la conocida forma (7-89):

En la figura 7-11 se muestra, para una concentración de enzima dada, una grafica d la velocidad de desaparición del sustrato en función de la concentración del sustrato. Cuan la concentración de sustrato es baja,

Si la concentración de sustrato es alta,

Y

Consideremos el caso en que la concentración del sustrato es tal, que la velocidad de reacción es igual a la mitad de la velocidad máxima,

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Entonces Vmáx V (S ) = máx 1 / 2 2 K m + (S1 / 2 ) Si despejamos la constante de Michaelis de la ecuación (7-90) obtenemos: Km=S1/2 La constante Michaelis es igual a la concentración del sustrato en la velocidad de reacción es igual a la mitad de la velocidad máxima. Los parámetros Vmáx y km caracterizan las reacciones enzimáticas que se describen con la cinetica de Michaelis-Menten. Vmáx depende de la concentración total de la enzima, pero km no.

ACCION DE EFECTORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Inhibición de reacciones enzimáticas Otro factor que influye considerablemente en las velocidades de la reacciones catalizadas por enzimas, además pH, es la presencia de un inhibidor. Las consecuencias más drásticas de la inhibición de enzimas se observan en los organismos vivos, donde la inhibición de cualquier enzima específica que interviene en una secuencia metabólica primaria hace que toda la secuencia deje de funcionar; el resultado es un daño grave o la muerte del organismo. Por ejemplo, la inhibición de una sola enzima, citocromo oxidasa, por el cianuro hace que se detenga el proceso de oxidación aeróbica; la muerte se presenta en cuestión de minutos. También existen inhibidores benéficos como los que se usan en el tratamiento de la leucemia y otras enfermedades neoplásicas. Los tres tipos más comunes de inhibición reversible que ocurren en las reacciones enzimáticas son la competitiva, anticompetitiva y no competitiva (vea el problema P7-12B). La molécula de enzima es análoga a la superficie catalítica heterogénea en cuanto a que contiene sitios activos. Cuando ocurre inhibición competitiva, el sustrato y el inhibidor suelen ser moléculas similares que compiten por el mismo sitio de la enzima. Ocurre inhibición anticompetitiva cuando el inhibidor desactiva el complejo enzima-sustrato, por lo regular uniéndose a las moléculas tanto de enzima como de sustrato del complejo. Ocurre inhibición no competitiva en el caso d enzimas que contienen al menos dos tipos de sitios distintos. El inhibidor se une a un solo tipo de sitio, y el sustrato, solo al otro. La rapidez de las reacciones catalizadas por enzimas se puede modificar en presencia de ciertos compuestos, distintos del sustrato, denominados efectores.

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Estos desempeñan una función principal en la regulación del metabolismo. Hay dos clases de efectores: activadores e inhibidores. Hay tres tipos principales de inhibición enzimática: competitiva, incompetitiva y nocompetitiva. < Inhibición competitiva El inhibidor es una sustancia con una estructura química y espacial análoga a la del sustrato, que se une al sitio activo de la enzima inhibiendo así la unión del sustrato. k1

k2

k-1

Grafica de Michaelis Menten para la inhibición competitiva

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Grafica de Lineweaver-Burk para la inhibición competitiva

Las constantes de rapidez son k1, k-1 y k2 mientras que ki es la constante de disociación del complejo EI: ;

[ES] (k-1+ k2)=k1 [E] [S] ET= [ES] + [E] + [EI]

Sustituyendo [EI]:

ET= [ES] + [E]

Sustituyendo [E]:

ET= [ES] + [E] ET= [ES]

Como en ausencia del inhibidor, V=k2 [ES], entonces al sustituir [ES] obtenida de la ecuación anterior:

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Esta ultima ecuación muestra que Km ahora esta aumentada por el termino , lo cual produce una disminución en la rapidez de reacción, V. El grado de inhibición depende claramente de la concentración del sustrato [S] y del inhibidor [I]. La representación de Lineweaver-Burk puede escribirse como:

< Inhibición incompetitiva En este casi el inhibidor se une a ES pero no a las enzimas libre; por lo tanto, aun cuando la concentración de sustrato sea saturante, la enzima se distribuirá entre el complejo formador de producto ES y el complejo que contiene el inhibidor EIS, en una relación que depende de Ki. Por lo tanto, EIS es un complejo “terminal” incapaz de dar producto directamente. En consecuencia, Vmáx aumentara por el factor (1=I/Ki), mientras que la Km realmente disminuirá. Esto se debe a que el inhibidor, I, “jala” la enzima hacia el estado unido con es sustrato y Km es una medida de la habilidad del sustrato para empujar la enzima hacia el complejo ES.

Ahora hay dos sitios de unión de la enzima, uno para el sustrato y otro para el inhibidor. Consecuentemente ET= [ES]

Con la ecuación de estado estacionario se puede derivar la siguiente ecuación para la expresión de Michaelis Menten:

La representación de Lineweaver-Burk de la ecuación de M-M es:

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Por lo tanto una inhibición incompetitiva, tanto Km como Vmax varían en función de la concentración de inhibidor.

< Inhibición no competitiva Un inhibidor no competitivo se puede unir a la enzima libre, E, y al complejo enzimasustrato, ES, para formar EI e EIS. EIS no se puede descomponer para dar el producto y la enzima.

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Si las concentración de EI e EIS están en equilibrio, las constantes de equilibrio para la unión de I a E (Ki ES) son idénticas e iguales a Ki, si se supone que la presencia del sustrato unido no afecta la unión del inhibidor. Como en el caso de la inhibición incompetitiva, hay dos sitios de unión sobre la enzima, el sitio activo para la unión des sustrato y un segundo sitio al cual se une el inhibidor sin importar si el sustrato ya está unido a la enzima o no. El resultado es que la Km permanece constante mientras que la Vmax cambia: Aquí se supone que EI no puede unirse al sustrato para formar EIS, o que la Ki es tan pequeña que es insignificante. Se puede llegar a la siguiente expresión:

Grafica de Michaelis Menten para la inhibición competitiva

La presentación de Lineweaver-Burk de la ecuación de M-M es:

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Grafica de Lineweaver-Burk para la inhibición competitiva

CINÉTICA ENZIMÁTICA EN LOS REACTORES Las expresiones cinéticas utilizadas aquí comienzan con las reacciones con las reacciones que implican un único producto sin que exista inhibición por el substrato o por el producto. Posteriormente se introducirán los efectos del flujo no ideal de los reactantes y las restricciones disfuncionales. La elección final de la temperatura, pH, concentración de substrato y extensión de la conversión a los que el reactor opera dependen de un balance económico global que tenga en cuenta los costos de operación, del sustrato, de trabajo, auxiliares, etc, y los costos de inversión del equipo necesario. El efecto global de esta aproximación es intentar minimizar el tamaño del reactor o la concentración de enzima necesario para conseguir una productividad dada. La cinética de Michaelis-Menten debe adaptarse para proporcionar una descripción cinética de los reactores discontinuos, aunque es mejor utilizar la ecuación en forma integrada con respecto al tiempo. Para una reacción irreversible sin inhibición que emplea un único enzima en un reactor discontinuo en condiciones isotérmicas se tiene que: XS - K m.ln(1 − X ) =

kEπ V

3.40

Donde kE es la actividad máxima del enzima total en el reactor en moles reaccionados por segundo, V e el volumen de trabajo del reactor, π es el tiempo de S − St operación y X es el grado de conversión donde S es la concentración inicial S de substrato y St la concentración después de un periodo de tiempo de reacción t. De la misma forma, par una reactor de flujo pistón:

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kE kEπ = 3.41 q V Donde q es la velocidad volumétrica de alimentación del substrato en segundos-1 y π es el tiempo medio de resistencia de la solución de substrato en el reactor en segundos, de tal forma que si se representa XS frente a 1n( 1-X ), la pendiente de la grafica resultante es igual a 2,303 veces la km aparente del enzima. XS - K m.ln(1 − X ) =

Esto tiene en cuenta el grado de conversión del substrato en producto y la velocidad de flujo de substrato a través del reactor. Otro factor a tener en cuenta es el grado de mezcla del fluido en el reactor, así como los eventuales efectos de los inhibidores. El enzima localizado en la entrada del reactor esta expuesto a una alta concentración de substrato con independencia del grado de conversión final conseguido en el reactor, y así opera en unas condiciones cinéticas efectivas de orden cero con respecto a los substratos presentes en exceso. Sin embargo, el enzima localizado hacia la salida del reactor estará expuesto en una concentración de substrato baja cuando el grado de conversión conseguido sea alto, operando así en condiciones cinéticas de primer orden. Para un reactor continuo de mezcla completa: XS + Km

kE kEπ X = = V 1− X q

3.42

Cuando S/Km es bajo, es decir, cuando se ha tenido un grado de conversión alto (o se ha usado una concentración de substrato baja) la velocidad de reacción es de primer orden, y el tiempo de reacción requerido para obtener un grado de conversión particular es directamente proporcional de S/Km, la reacción es esencialmente de orden cero, y en este caso el tiempo necesario para conseguir un grado de conversión dado que es virtualmente independiente de S/Km. para que un proceso resulte útil a nivel industrial se requiere usualmente un alto grado de conversión de substrato en producto. Un enzima inmovilizado opera generalmente en condiciones cinéticas de primer orden, en especial si se consideran las altas densidades de enzima que con frecuencia se utilizan en las preparaciones comerciales de enzimas inmovilizados. En estos casos el tiempo requerido para conseguir un incremento relativamente pequeño del grado de conversión depende claramente del valor de S/Km logrado en la operación, de forma que este parámetro tiene gran importancia experimental. Si se tienen en cuenta las ecuaciones que describen los reactores de flujo pistón y los reactores continuos con agitación, las prestaciones de ambos tipos de reactores son prácticamente idénticas cuando se usan concentraciones elevadas de substrato y S>Km, mientras que a concentraciones bajas de substrato S