48347858-Microbiologie

CURS I INTRODUCERE Obiectul de studiu al microbiologiei Obiectul de studiu al microbiologiei este biologia microorganismelor, mai precis forma, structura şi activitatea fiziologică a acestora. Microorganismele sunt organisme mici, vizibile doar la microscop. Deoarece micros (gr.) = mic, bios (gr.) = viaţă, logos (gr.) = ştiinţă, termenul de microbiologie ar însemna ştiinţa despre organisme cu viaţă scurtă, provenind de la cuvântul „microb”, introdus de Sedillot (1878). Acest termen se referă în special la microorganismele patogene şi, deşi frecvent folosit, nu este ştiinţific. Noţiunea de microorganism nu are semnificaţie taxonomică, deoarece reuneşte un grup foarte vast, heterogen de organisme diferite ca poziţie sistematică, dar care prezintă o serie de caractere comune: - au dimensiuni microscopice, dimensiunile lor se exprimă în µm (10-6m), iar ale organitelor lor în nm (10-9m) sau chiar în Å (10-10m); - prezintă organizare în general unicelulară, sub două forme: o celule de tip procariot o celule de tip eucariot. Chiar dacă unele microorganisme formează asociaţii pluricelulare, acestea nu prezintă diferenţiere celulară pentru a forma ţesuturi şi organe, iar o celulă izolată din aceste asociaţii îşi păstrează viabilitatea, creşte, se divide şi reface asociaţia; - structura lor internă este în general simplă. Heterogenitatea microorganismelor este definită prin alte caracteristici: - poziţia sistematică diferită; - activitatea biologică diversă; - morfologia şi structura internă a diferitelor grupe de microorganisme sunt de asemenea diverse. În categoria microorganismelor intră: - celule procariote: o Eubacterii (bacterii adevărate) o Cianobacterii (bacterii albastre-verzi) o Actinomicete (bacterii filamentoase, cu organizare de tip micelial) o Arhebacterii (microorganisme foarte asemănătoare din punct de vedere morfologic şi structural cu bacteriile adevărate, care se găsesc în medii de viaţă variate şi corespund bacteriilor extremofile) - celule eucariote: o Fungi microscopici, care includ:  levuri (drojdii)  mucegaiuri (fungi filamentoşi, cu organizare pluricelulară) o Alge microscopice o Protozoare. Microbiologia studiază şi virusurile şi entităţile moleculare infecţioase cu organizare subvirală (viroizii şi prionii), deşi acestea nu sunt microorganisme şi nu au structură celulară.

Diviziunile microbiologiei Diversitatea proceselor fiziologice bacteriene, rolul lor esenţial în ecosistemele naturale, capacitatea de a sintetiza substanţe utile sau dea produce procese infecţioase la organismele superioare au determinat diversificarea domeniilor de studiu al microorganismelor.

Clasificarea diferitelor domenii se poate face după criterii taxonomice (bacteriologie, virologie, algologie, micologie, protozoologie), după criterii funcţionale (fiziologia, biochimia, ecologia, genetica microorganismelor), după mediul din care provin microorganismele (microbiologia solului, hidromicrobiologia, geomicrobiologia) şi după aplicaţiile practice ale diferitelor categorii de microorganisme (microbiologie industrială, medicală, biotehnologia). Ecologia microorganismelor studiază legităţile generale de evoluţie şi interacţiune a microorganismelor în natură, interacţiunile dintre microorganisme şi interrelaţiile microorganismelor cu macroorganismele. Genetica microorganismelor studiază substratul molecular al eredităţii şi variabilităţii microorganismelor şi mecanismele de transfer al materialului genetic la bacterii. Microbiologia solului studiază ansamblul microorganismelor din sol, rolul lor în fertilitatea solului şi în circuitul elementelor biogene în natură, precum şi interacţiunile dintre aceste microorganisme şi plante. Hidromicrobiologia studiază microorganismele din mediile acvatice şi rolul lor în lanţurile trofice. Geomicrobiologia studiază în principal microbiologia petrolului, având un pronunţat caracter utilitar. Studiază rolul microorganismelor în geneza petrolului şi a zăcămintelor minerale, posibilitatea utilizării acestora în exploatarea, biodegradarea sau recuperarea petrolului şi zăcămintelor. Microbiologia insectelor studiază relaţiile dintre microorganisme şi artropode, care pot avea un rol important ca vectori în patologia umană, animală şi vegetală. Microbiologia industrială s-a dezvoltat pornind de la descoperirea proceselor fermentative de către Louis Pasteur. Ea studiază utilizarea diferitelor microorganisme producătoare de substanţe utile pentru alimentaţie, terapeutică sau industrie. Microbiologia medicală studiază microorganismele patogene pentru om şi animale, patogenitatea şi virulenţa acestora, factorii care condiţionează virulenţa, modul lor de transmitere şi modalităţile de combatere. Microbiologia generală este o ştiinţă biologică fundamentală, care studiază particularităţile organizării structurale şi funcţionale ale celulei bacteriene, biologia şi sistematica bacteriilor, răspândirea lor în natură, relaţiile lor ecologice cu alte microorganisme sau cu macroorganismele, originea şi evoluţia lor, fenomenele de ereditate şi variabilitate microbiană. Este o ştiinţă de sinteză şi se bazează pe date din domeniile aplicative ale microbiologiei. Cunoaşterea principiilor fundamentale ale microbiologiei generale este o necesitate pentru orice biolog, indiferent de domeniul său de activitate.

Istoricul microbiologiei Descoperirea microorganismelor datează din 1676, când olandezul Anton van Leevenhoek a examinat picături de apă din diferite surse naturale, picături de salivă, picături de puroi cu ajutorul unui un aparat optic propriu de mărire a imaginii. Cu ajutorul acestui microscop special, care mărea de 270 de ori, el a observat o lume fascinantă, într-o mişcare perpetuă. În descrierile sale, printre alte organisme, se recunosc şi bacteriile, pe care Leevenhoek le-a denumit animalcule, considerându-le nişte „pui” ale animalelor acvatice mai mari. El nu a sesizat noutatea lumii pe care a văzut-o, de aceea, deşi 24 aprilie 1676 este considerată ziua de naştere a microbiologiei, Leevenhoek nu este considerat întemeietorul microbiologiei ca ştiinţă. Botanistul Carl Linaeus, în lucrarea sa „Systema naturae” (1735), grupează sistematic toate vieţuitoarele cunoscute, introducând microorganismele în categoria „chaos”. Întemeietorul microbiologiei ca ştiinţă este considerat Ferdinand Cohn (1875), cercetător care a intuit caracterele aparte ale microorganismelor, iar lucrările lui Louis Pasteur (1822 - 1895) au avut o importanţă deosebită pentru evoluţia acestei ştiinţe. Pasteur a înfiinţat primele laboratoare de cercetare microbiologică şi a studiat procesele fermentative. A demonstrat că fermentaţiile sunt procese biologice produse de acţiunea unor

microorganisme facultativ anaerobe, fiecare fiind determinată de o categorie specifică de germeni. A studiat bolile fermentaţiilor, cauzate de contaminarea acestora cu organisme străine care le deviază cursul normal şi a pus la punct o metodă de evitare a contaminării fermentaţiilor cu agenţi nedoriţi (pasteurizarea). A înlăturat concepţia generaţiei spontanee care data din antichitate, conform căreia vieţuitoarele ar putea să apară spontan din materie organică. Prin experimentele sale cu baloane de sticlă prevăzute cu un tub în formă de gât de lebădă, a demonstrat că de fapt vieţuitoarele „apărute spontan” erau contaminanţi din aer şi apă. Pasteur a pus la punct teoria originii microbiene a bolilor infecţioase studiind îmbolnăvirea viermilor de mătase şi a deschis era prevenirii bolilor infecţioase prin vaccinarea antibacteriană şi antivirală, practică medicală de o importanţă deosebită, ce a dus la crearea unui domeniu nou, imunologia. Medicul german Robert Koch a avut contribuţii importante la dezvoltarea domeniului bacteriologiei, fiind considerat fondatorul acestei ramuri microbiologice. Este cel care a introdus în practica de laborator folosirea mediilor solide pentru cultivarea tulpinilor bacteriene. A descoperit mai multe specii de bacterii patogene, printre care bacilul tuberculozei şi vibrionul holerei. În urma cercetărilor pe animale de laborator a elaborat principiile generale prin care un anumit germen poate fi considerat agentul etiologic al unei boli (cele 4 postulate ale lui Koch): 1. Microorganismul trebuie să fie găsit cu regularitate în leziunile bolii respective; 2. Microorganismul trebuie să fie izolat de la gazda infectată şi cultivat într-o cultură pură; 3. Inocularea culturii pure obţinute în laborator la un animal sensibil trebuie să reproducă boala; 4. Microorganismul trebuie să se regăsească din nou cu regularitate la noua gazdă în leziunile caracteristice bolii. Microbiologul rus Ilia Ilici Mecinikov (1845 - 1916) a studiat digestia intracelulară a particulelor de carmin la echinodermele marine la Institutul Pasteur de către celule pe care le-a denumit fagocite şi a emis ipoteza că astfel de celule există şi în organismele umane şi animale. Prin descrierea fenomenului de fagocitoză a pus bazele teoriei imunităţii celulare. Biologul rus Dimitri Ivanovski (1864 - 1920) a descoperit în 1892 virusul mozaicului tutunului (VMT), întemeind ştiinţa numită virusologie. Natura particulară a virusurilor a fost intuită în 1897 de către Martinus Willem Beijerinck, microbiolog şi botanist olandez, care le-a denumit „contagium vivum fluidum”. Alexander Fleming a descoperit în 1921 lizozimul şi în 1929 penicilina, antibiotic produs de Penicillium notatum, care a fost ulterior purificată de către savanţii britanici Florey şi Chain (1940). Cei trei cercetători au primit în 1945 Premiul Nobel pentru medicină pentru descoperirea acestui antibiotic. Winogradski este considerat întemeietorul microbiologiei solului. La noi în ţară, realizări de marcă în domeniul microbiologiei au aparţinut lui Victor Babeş (1854 - 1926), care a lucrat la Institutul Pasteur din Paris şi a fost colaborator al lui Robert Koch. El a studiat numeroase boli (lepra, holera, tuberculoza, turbarea, febra tifoidă), descoperind peste 50 de microbi. Împreună cu Victor Cornil a scris în 1885 primul tratat de bacteriologie din lume, intitulat „Les bactéries et leur rôle dans l'anatomie et l'histologie pathologiques des maladies infectieuses”. A descris corpusculii Babeş-Negri în creierul animalelor moarte de turbare, importanţi pentru diagnosticul bolii, precum şi corpusculii Babeş-Ernst din citoplasma unor bacterii Gram pozitive. Ioan Cantacuzino (1863 - 1934), întemeietorul Institutului din Bucureşti care îi poartă azi numele, a fost elev al lui Mecinikov, studiind imunitatea şi fagocitoza la nevertebrate, dar şi numeroase boli ca scarlatina, holera, tuberculoza, difteria, producând numeroase seruri şi vaccinuri pentru prevenirea diferitelor boli infecţioase.

A emis prima lege sanitară din România (1910) şi a avut contribuţii importante la dezvoltarea învăţământului medical românesc. Alţi cercetători români care au avut contribuţii la dezvoltarea microbiologiei ca ştiinţă au fost Constantin Ionescu – Mihăeşti (1883 - 1962), cu realizări în prevenirea infecţiilor poliomielitice, Mihai Ciucă (1883 - 1969), renumit pentru descoperirea fenomenului de lizogenie determinat de bacteriofagi, Dumitru Combiescu (1887 - 1961) care a studiat antraxul, leptospirozele, rickettsiozele, Nicolae Nestorescu (1901 - 1969), continuator al şcolii create de Ioan Cantacuzino, Constantin Levaditi, Ştefan S. Nicolau, cu studii asupra virusurilor hepatitice, herpetice, asupra oncogenezei şi imunologiei virale. Interesul pentru studiul microorganismelor este într-o continuă creştere, de la descoperirea lor până astăzi, deoarece numeroase specii fie sunt benefice pentru activitatea omului, fie produc infecţii la om, animale sau plante. Bacteriile sunt importante şi din punct de vedere teoretic, nu numai practic, pentru studiul proceselor vieţii în condiţii extreme.

Poziţia microorganismelor în lumea vie În sistemul de clasificare a lumii vii propus de Aristotel, erau precizate două regnuri, Plantae (în care se încadrau şi Virophyta, Bacteriophyta şi Fungi) şi Animalia (care cuprindea şi protozoarele). Ulterior Hogg (1860) şi Haeckel (1866) au propus împărţirea în 3 regnuri: Protista, Plantae şi Animalia. Clasificarea protistelor în două categorii (inferioare - procariote şi superioare - microeucariote), a fost propusă de Stanier (1864). Copeland a propus în 1938 sistemul celor 4 regnuri: Monera (bacterii şi cianobacterii), Protista (organismele eucariote inferioare, de regulă unicelulare: microalge, fungi, protozoare), Plantae şi Animalia. În 1969 Whittaker a propus un nou sistem de clasificare, în 5 regnuri: - Monera (organisme unicelulare, cu organizare de tip procariot: bacterii, cianobacterii, actinomicete); - Protista (microorganisme eucariote: alge microscopice, fungi acvatici flagelaţi, protozoare); - Fungi (organisme eucariote imobile, ce formează spori); - Plantae (plante nevasculare şi vasculare); - Animalia (organisme pluricelulare, cu nutriţie de tip ingestiv). Ulterior, Bergey a schimbat numele regnului Monera în cel de Procaryota. Criteriile de clasificare în 5 regnuri se bazau pe trei niveluri de organizare: procariot, eucariot unicelular şi eucariot pluricelular, dar şi pe modalităţile de nutriţie: fotosintetică, absorbtivă, ingestivă. Acest sistem de clasificare evidenţiază heterogenitatea microorganismelor. Rezultatele cercetărilor la nivel molecular au arătat că sistemul de clasificare a lumii vii în 5 regnuri nu este corect din punct de vedere filogenetic, cele două regnuri de microorganisme eucariote (Protista şi Fungi) fiind artificiale. Deoarece o primă divizare a lumii vii trebuie să se facă în procariote şi eucariote, sistemele moderne de clasificare rezervă bacteriilor o poziţie sistematică aparte. Virusurile constituie o categorie aparte de agenţi infecţioşi. Ele sunt entităţi moleculare infecţioase fără organizare celulară şi nu se pot încadra alături de celelalte microorganisme.

CONCEPTUL DE BACTERIE Bacteriile sunt microorganisme procariote unicelulare, care au fost recunoscute ca grup distinct. Stanier a descris conceptul de bacterie, oferind posibilitatea grupării

microorganismelor pe criterii ştiinţifice şi nu printr-un acord convenţional. Conceptul de bacterie trebuie definit în funcţie de organizarea de tip procariot şi numai prin antiteză cu celula eucariotă. Celula procariotă este mai puţin complexă, ea reprezintă unitatea de structură a bacteriilor şi cianobacteriilor. Celula eucariotă, complexă, este unitatea de structură a tuturor celulelor algelor, fungilor, briofitelor, plantelor vasculare şi animalelor. Diferenţa dintre procariot şi eucariot reprezintă cea mai mare discontinuitate evolutivă prezentă în lumea vie, deoarece între cele două tipuri nu se cunosc structuri intermediare. Principalele caractere diferenţiale între celula de tip procariot şi cea de tip eucariot sunt prezentate în tabelul următor. Caracterul Dimensiuni

Procariote Foarte mici, 1-10µ; unele pot fi mai mari, spiralate saude tip filamentos, dar celulele sunt identice în cadrul filamentului

Peretele celular

Prezent constant la bacterii, cu o structură caracteristică; necesar existenţei acestora în condiţii naturale; în compoziţia peretelui intră constant mureina (marker biochimic al celulei bacteriene), iar la unele bacterii se întâlnesc şi acizii teichoici, acidul diaminopimelic.

Membrana plasmatică

Structural asemănătoare cu cea a eucariotelor, cu particularităţi datorate compoziţiei chimice: - permeabilitate selectivă; doar unele substanţe liposolubile, fragmentele mici de ADN, apa, enzimele degradative, unii anioni străbat membrana; - bacteriile dispun de sisteme membranare de transport activ (permeaze de natură proteică, precum şi proteine de legare, cu funcţia de a asigura transportul substanţelor prin membrane) - sterolii lipsesc din compoziţia chimică a membranei (cu excepţia micoplasmelor). În stare de gel permanent, în lipsa membranelor interne şi a curenţilor citoplasmatici menţine intacte structurile intracelulare; schimburile dintre celula bacteriană şi mediul extracelular se fac direct, fără necesitatea unei circulaţii interne a substanţelor. Lipsesc la procariote.

Citoplasma

Organitele

Eucariote Celule mai mari, 10-100 µ; unele sunt microorganisme; cele mai multe sunt unităţi de structură ale organismelor de talie mare Există diferenţe între celulele animale (delimitate doar de membrană celulară, fără perete celular) şi celulele vegetale sau ale fungilor, la care peretele celular este prezent şi are o compoziţie chimică variată (celuloză, polioze, Si). Celulele animale au membrana caracterizată printr-o mare plasticitate, capabilă de endocitoză (fagocitoză sau pinocitoză). Cele vegetale şi fungii au membrana acoperită de peretele celular rigid, care îi anulează proprietăţile speciale. Sterolii sunt prezenţi în mod constant.

Există o permanentă tranziţie reversibilă gel ↔ sol, curenţi citoplasmatici şi structuri membranare intracelulare.

Mitocondriile sunt esenţiale şi

perfect delimitate; cloroplastele sunt prezente la plantele capabile de fotosinteză.

celulare

Structura şi funcţiile materialului genetic

Organizarea materialului genetic, sediul acestuia şi raportul cu citoplasma Procariotele nu prezintă un nucleu propriu-zis; materialul nuclear, sediu al informaţiei genetice bacteriene, se găseşte scufundat în citoplasmă întro zonă numită nucleoplasmă, în contact direct cu citoplasma, neprotejat de o membrană nucleară. Este denumit nucleosom (nucleoid) şi e reprezentat de o moleculă de ADN dublu catenară, circulară, covalent închisă.

Structura moleculară a materialului genetic Informaţia genetică bacteriană e de două feluri: esenţială, absolut necesară existenţei celulei, caracteristică speciei bacteriene în ceea ce priveşte compoziţia în baze azotate G+C (nucleosomul) şi accesorie (plasmidele), reprezentată de unităţi genetice extracromozomale, de dimensiuni mai mici, constituite tot din molecule de ADN dublu catenar, circular, covalent închis. Mecanismul replicării materialului genetic Replicarea este de tip semiconservativ: are loc desfacerea celor două catene ale moleculei de ADN la bifurcaţia de replicare, fiecare catenă separat fiind folosită pentru sinteza unei catene complementare. Fiecare moleculă dublu catenară nou formată are o catenă veche şi una nou sintetizată complementară.

Sediul şi mecanismul traducerii informaţiei genetice Informaţia genetică e tradusă în citoplasmă la nivelul ribozomilor 70S, structuri tipice specializate pentru această funcţie. Informaţia genetică e înscrisă continuu în cadrul moleculei de ADN, prin transcrierea ei rezultă un ARN mesager şi prin traducere proteinele.

Organizarea materialului genetic, sediul acestuia şi raportul cu citoplasma Informaţia genetică e disociată în nucleu şi în organitele celulare (mitocondrii şi cloroplaste). Materialul nuclear e separat de citoplasmă printr-o membrană nucleară dublu stratificată şi este organizat în cromozomi. Informaţia genetică din organite este protejată prin membranele organitelor respective. Structura moleculară a materialului genetic Informaţia genetică din nucleu este reprezentată de un număr constant, caracteristic speciei, de cromozomi, care reprezintă molecule de ADN asociate cu histone, cu o structură caracteristică. Informaţia genetică din organitele celulare este sub formă de molecule de ADN dublu catenar, circular, covalent închis. Mecanismul replicării materialului genetic Informaţia genetică nucleară urmează procesul caracteristic de mitoză, cu fazele caracteristice şi cu apariţia fusului de diviziune. În ciclul celular al eucariotelor prima fază (G1) este lipsită de sinteze, nucleul diploid (2n) este în interfază, faza de sinteză de ADN (S) duce la dublarea informaţiei genetice (4n), urmează o fază de eclipsă (G2) care este 4n şi mitoza care reface structurile 2n. Informaţia genetică din organitele celulare se replică semiconservativ, la fel ca la procariote. Sediul şi mecanismul traducerii informaţiei genetice Informaţia genetică nucleară este tradusă la proteine la nivelul ribozomilor 80S din citoplasmă, iar cea a organitelor este tradusă la nivelul respectiv cu ajutorul ribozomilor 70S. Eucariotele prezintă o structură

discontinuă a informaţiei genetice, alcătuită din secvenţe codificatoare (exoni) şi necodificatoare (introni). Transcrierea duce la formarea unui ARN premesager, netraductibil, care conţine secvenţe exonice şi intronice. Maturarea ARN premesager duce la îndepărtarea din moleculă a secvenţelor intronice şi legarea celor exonice între ele, rezultând un ARNm matur, care va fi tradus la proteine.

Echipamentul enzimatic oxidativ şi de fotosinteză

Tipul de diviziune

Procesele de sexualitate

Mecanismele de trasfer de material genetic

Mecanisme de infectare cu virusuri în condiţii experimentale

Este neîmpachetat în structuri specifice, dispus difuz la nivelul membranei plasmatice şi a diverticulilor rezultaţi din aceasta. La nivelul membranei şi al mezozomilor se găseşte sinergonul respirator (ansamblul reacţiilor chimice care duc la realizarea unei anumite căi metabolice, catalizate de o serie de enzime ce acţionează regulat pentru a îndeplini un anumit proces). - Diviziunea simplă, simetrică: celula creşte progresiv până la un punct critic, apoi se divide formând două celule fiice identice; - Diviziunea asimetrică prin înmugurire; - Diviziuni multiple prin fragmentare la bacteriile filamentoase. Lipseşte aparatul mitotic, repartizarea egală a informaţiei genetice este asigurată de mezozomi. Sunt absente; există însă procese de protosexualitate, care constau în transferul de material genetic de la o celulă donatoare (♂) la o celulă acceptoare (♀). Caracterul de masculinitate este determinat de prezenţa unei plasmide (factor de sex, F), transferul este unidirecţional, celulele nu fuzionează, ci se formează o celulă numită merozigot (zigot parţial). Transferul de material genetic se face intraspecific, interspecific, chiar intergeneric, prin: - conjugare bacteriană - transformare bacteriană - transducţie fagică - sexducţie Datorită existenţei peretelui celular, infectarea bacteriilor cu un bacteriofag specific se face prin injectarea genomului fagic în celula bacteriană, învelişul proteic rămânând la exterior.

Este împachetat în structuri caracteristice: mitocondrii, cloroplaste. Sinergonul respirator şi cel al fotosintezei sunt autonome, localizate în structuri specifice.

Există un aparat mitotic, care asigură repartizarea informaţiei genetice în cadrul mitozei, cu faze caracteristice.

Procesele de sexualitate sunt frecvente, caracterizate prin formarea gameţilor haploizi, precedată de meioză; zigotul care rezultă prin unirea gameţilor este un zigot propriu-zis, diploid (2n).

Prezintă fuziunea gameţilor, care este intraspecifică, urmată de fuziunea nucleară.

Celulele animale se infectează cu virusurile integrale prin endocitoză, formând o vacuolă derivată din membrană. Celulele vegetale se pot infecta cu

virusuri integrale doar după lezarea mecanică a peretelui celular.

Sensibilitatea la diferite substanţe inhibitoare

Capacitatea de a forma organisme multicelulare Capacitatea de diferenţiere celulară Temperatura maximă de creştere

Penicilina inhibă sinteza mureinei din structura peretelui celular bacterian. Bacteriile sunt sensibile. Cloramfenicolul, tetraciclinele, streptomicina acţionează la nivelul ribozomilor 70S. Bacteriile sunt sensibile. Cicloheximida acţionează la nivelul ribozomilor 80S. Bacteriile sunt rezistente.

Penicilina Eucariotele sunt rezistente, deoarece nu au mureină. Cloramfenicolul, tetraciclinele, streptomicina Eucariotele sunt rezistente, deoarece ribozomii lor 70S sunt protejaţi de membranele organitelor în care se găsesc (mitocondrii, cloroplaste). Cicloheximida Eucariotele sunt sensibile. Pot forma agregate multicelulare, dar celulele Uneori celulele eucariote sunt identice între ele. Între celulele unei constituie organisme unicelulare, asociaţii pluricelulare pot avea loc interacţiuni dar de cele mai multe ori simple, nutriţionale, dar celulele îţi păstrează formează organisme individualitatea şi prin diviziune pot reface multicelulare. asociaţia. Procariotele sunt incapabile de diferenţiere Au capacitate mare de celulară, cu excepţia bacteriilor sporogene. diferenţiere, de la structurile Formarea sporilor de rezistenţă reprezintă o sexuale până la celule înalt formă primitivă de diferenţiere. diferenţiate, ca neuronul . Eubacteriile cresc maxim până la 95˚C, Eucariotele cresc maxim până la arhebacteriile până la 110˚C. 60˚C.

Bacteriile reprezintă o lume aparte, cu un cadru propriu de evoluţie, fără legătură cu lumea plantelor, nici măcar cu a celor inferioare.

CURS 2 MORFOLOGIA BACTERIILOR Forma celulelor bacteriene Forma bacteriilor este controlată genetic şi este în strânsă corelaţie cu peretele celular cu un anumit grad de rigiditate. Deşi într-o cultură pură forma bacteriilor poate varia în funcţie de condiţiile de mediu, forma caracteristică unei specii date este predominantă în populaţia bacteriană respectivă. Forma bacteriilor este un criteriu taxonomic important. Ea se apreciază în următoarele condiţii: - în culturi pure, în condiţii artificiale, de laborator; - în culturi bacteriene tinere, aflate în faza activă de creştere; în culturile îmbătrânite apar forme aberante necaracteristice (filamentoase, ramificate), datorită degenerării celulare; - în culturi aflate în condiţii de cultură corespunzătoare: medii de cultură adecvate, condiţii optime de pH, temperatură, concentraţie a oxigenului; în condiţii improprii de cultivare apar acţiuni nocive, care determină alterări ale formei şi morfologiei bacteriene. Principalele tipuri morfologice bacteriene sunt: - forma sferică (sferoidală), corespunde celulelor izodiametrice numite coci (de la coccus (lat.) = sămânţă); cocii pot fi: o perfect sferici – ex. Staphylococcus aureus o uşor ovoidali – ex. Streptococcus pyogenes o coci lanceolaţi – ex. Streptococcus pneumoniae (iniţial denumit Diplococcus pneumoniae) o coci cu aspect reniform – ex. Neisseria meningitidis - forma sferic – ovalară, intermediară între coci şi bacili, corespunde cocobacililor - ex. Pasteurella pestis - forma cilindrică, alungită, de bastonaş drept sau uşor curbat, corespunde bacililor; aceştia pot avea: o extremităţile rotunjite – ex. Bacillus subtilis o extremităţile drepte – ex. Bacillus anthracis o extremităţi în formă de pişcot sau măciucă – ex. Corynebacterium diphteriae o extremităţi ascuţite (fusiforme) – ex. Fusobacterium fusiforme - forma spiralată, elicoidală, care prezintă câteva subtipuri: o vibrionul, cu formă de virgulă sau semilună – ex. Vibrio cholerae o spirilul, cu mai multe ture de spiră rigide – ex. Spirillum volutans o spirocheta, cu mai multe ture de spiră flexibile – ex. Treponema pallidum - forma filamentoasă, întâlnită la actinomicete (bacterii asemănătoare cu fungii); e constituită din filamente lungi şi ramificate, asemănătoare unor micelii – ex. Actinomyces israeli - forma pătrată este caracteristică unor bacterii incluse în genul Quadra, evidenţiate în unele ape hipersaline din Sinai (Walsby, 1980); aceste bacterii formează placarde de 8-16 pătrate cu latura între 1,5 şi 11µm, cu o grosime inegală.

(după Kayser, Thieme, 2005)

Gruparea bacteriilor Bacteriile sunt organisme unicelulare, care se multiplică de obicei prin diviziune directă. La unele specii, după diviziune are loc separarea completă a celulelor fiice, astfel încât rezultă indivizi izolaţi. La alte specii, după diviziune celulele fiice rămân ataşate una de cealaltă, formând grupări caracteristice speciei bacteriene. Modul de grupare a doi sau mai mulţi indivizi bacterieni depinde de orientarea în spaţiu a planurilor de diviziune succesive. Gruparea cocilor Bacteriile sferice (cocii) se pot întâlni ca indivizi izolaţi (cocul simplu) sau sub forma unor grupări de doi sau mai mulţi coci: - diplococi – diviziunea se face după planuri succesive paralele, celulele rămân grupate câte două – ex. Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis - streptococi – planurile de diviziune succesive multiple sunt paralele, formându-se în final şiraguri de celule de dimensiuni variabile – ex. Streptococcus pyogenes - tetradă - planurile de diviziune succesive sunt perpendiculare unul pe celălalt, rezultând grupări de 4 celule – ex. Micrococcus tetragenes - sarcină - planurile de diviziune succesive sunt perpendiculare unul pe celălalt şi orientate în trei direcţii diferite, rezultând grupări de celule cu o simetrie cubică – ex. Sarcina flava - stafilococi - planurile de diviziune succesive sunt orientate neregulat în spaţiu, astfel încât forma finală a grupării celulare este asemănătoare cu un ciorchine – ex. Staphylococcus aureus Gruparea bacililor Bacteriile alungite (bacilii) se pot întâlni ca indivizi bacterieni izolaţi (bacilul simplu) sau sub forma unor grupări formate în funcţie de orientarea planurilor de diviziune succesive: - diplobacil - diviziunea se face după planuri succesive paralele, celulele rămân grupate câte două – ex. Klebsiella pneumoniae - streptobacil - diviziunea se face după planuri succesive paralele, mai multe celule rămân unite – ex. Bacillul cereus - grupări sub forma literelor V, M ori sub formă de armonică sau palisadă – după diviziune celulele rămân împreună câte două sau mai multe, aşezate una faţă de cealaltă sub un unghi ascuţit sau de 180 grade – ex. Corynebacterium diphteriae ANATOMIA CELULEI BACTERIENE Datorită dimensiunilor mici, organizarea internă a bacteriilor a fost mult timp controversată şi chiar contestată, existând opinia că celulele bacteriene ar fi lipsite de o structură internă sau ar avea una foarte rudimentară. Perfecţionarea tehnicilor de laborator (tehnici citologice, tehnici de microscopie electronică) a făcut posibilă descrierea a numeroase componente ale celulei bacteriene. Constituenţii celulari bacterieni pot fi clasificaţi în două categorii, în funcţie de poziţionarea lor faţă de peretele celular:

-

componente extraparietale: o capsula bacteriană o stratul mucos o flagelii o pilii o fimbriile - componente intraparietale: o membrana citoplasmatică o mezosomii o citoplasma o nucleosomul o plasmidele o ribozomii o vacuolele o incluziile o endosporul Unele structuri sunt esenţiale pentru viaţa celulei şi sunt prezente invariabil la toate celulele bacteriene (membrana citoplasmatică, citoplasma, nucleosomul, ribozomii), altele sunt accesorii şi pot lipsi la unele bacterii (flagelul, plasmidele, endosporul). Alte structuri apar doar în unele perioade de viaţă ale celulei (incluziile, vacuolele, endosporul).

(după Kayser, Thieme, 2005) Peretele celular bacterian Peretele celular reprezintă o structură de înveliş bine definită, în general rigidă (cu excepţia spirochetelor), care delimitează celula bacteriană. Este situat în afara membranei citoplasmatice, de care aderă strâns, reprezentând 20 – 40% din greutatea uscată a celulei bacteriene.

La microscopul fotonic nu poate fi evidenţiat la celulele vii, datorită indicelui mare de refracţie, decât în urma unor coloraţii speciale selective, dar poate fi evidenţiat la microscopul electronic. Grosimea peretelui celular este de 15 – 35nm. În funcţie de prezenţa şi particularităţile de structură ale peretelui celular, în regnul Prokaryotae se disting 4 categorii de bacterii: - Firmacutes (de la firmus (lat.) = tare, cutis = înveliş), care cuprinde bacterii cu perete celular gros, rigid, lipsit de o membrană externă, caracteristic bacteriilor Gram (+); - Gracilicutes (gracilis (lat.) = subţire, fin), care cuprinde bacterii cu perete celular subţire, cu o membrană externă, caracteristic bacteriilor Gram (-); - Mollicutes sau Tenericutes (mollis, tener (lat.) = moale) cuprinde bacteriile din grupul Mycoplasma, lipsite de perete celular, la care membrana citoplasmatică ce conţine steroli devine înveliş extern; - Mendosicutes (mendosus = o structură cu defecte), care cuprinde organismele din grupul Archaea, cu un perete celular atipic, din care lipseşte mureina, având în compoziţia lor chimică pseudomureină, ce le permite să trăiască în condiţii extreme de mediu. Marea majoritate a bacteriilor sunt cuprinse în primele două categorii, Gram (+) şi Gram (-). Structura peretelui celular la bacteriile Gram pozitive La bacteriile Gram pozitive peretele celular este gros (15 – 30 nm), rigid; componenta sa esenţială, care reprezintă 80 – 90% din structura peretelui şi asigură rigiditatea peretelui, este mureina (murus = perete), denumită şi peptidoglican, glicopeptid, mucopeptid, glucozaminopeptid. Stratul de mureină este sensibil la acţiunea enzimei lizozim, care atacă legăturile chimice din structura sa. Mureina este alcătuită din două componente, componenta glicanică (glucidică) şi componenta peptidică. Componenta glicanică este formată din lanţuri paralele polizaharidice alcătuite prin legarea alternativă a două zaharuri aminate: N-acetil-D-glucozamină şi acidul N-acetilmuramic. Componenta peptidică este un tetrapeptid, cu o compoziţie în aminoacizi variabilă în funcţie de specie, care conţine L-alanină, D-alanină, D-glutamină, L-lizină. Tetrapeptidele se prind pe lanţurile glicanice. Tetrapeptidele dintre două lanţuri adiacente se leagă între ele prin legături interpeptidice. Cu cât numărul acestor legături este mai mare, cu atât creşte rigiditatea peretelui celular. Se formează astfel o reţea care înconjoară structurile celulare. La acest nivel sunt localizate două tipuri de enzime ce contribuie la creşterea peretelui celular: murein-hidrolazele, care atacă legăturile chimice ale mureinei şi murein-sintetazele, care realizează noi constituenţi structurali pe care îi inseră în dreptul rupturilor create. Numai bacteriile Gram pozitive prezintă la exteriorul stratului de mureină acizii teichoici (teichos (gr.) = zid), polizaharide specifice, sub forma unor molecule polimerice lungi, flexibile, cu aspect tubular. Din punct de vedere chimic acizii teichoici sunt

polimeri de tipul poliribitol-fosfat şi 1,3 poliglicerol-fosfat, legaţi covalent de stratul de mureină. Structura peretelui celular la bacteriile Gram negative Bacteriile Gram negative prezintă perete celular subţire, cu un strat fin de mureină sensibil la lizozim, de 0,01µ grosime. La aceste bacterii mureina reprezintă doar 2,5 – 10% din greutatea uscată a peretelui. Sacul mureinic este un monostrat molecular, cu structură similară cu cea a bacteriilor Gram pozitive şi nu prezintă acizi teichoici. Componenta peptidică a peretelui bacteriilor Gram negative conţine acid diaminopimelic (derivat al lizinei), punţile transversale interpeptidice reunind gruparea NH2 a acidului diaminopimelic cu gruparea –COOH a D-alaninei de pe alt lanţ glicanic. Stratul de peptidoglicani este aderent la membrana citoplasmatică formând împreună cu aceasta membrana internă. La exterior stratul de peptidoglicani prezintă o membrană externă, cu o grosime de 6 – 20nm, care nu este sensibilă la lizozim, ci la EDTA (etilen-diamino-tetraacetat) 30%. Între cele două membrane se delimitează spaţiul periplasmic, care cuprinde stratul de peptidoglicani. Membrana externă are în compoziţia sa chimică fosfolipide (35%), proteine (15%), lipopolizaharide (50%) şi o structură similară cu cea a membranei citoplasmatice. Fosfolipidele sunt în dublu strat, cu grupările hidrofile către exteriorul membranei şi cele hidrofobe către interiorul acesteia. Proteinele sunt inclavate în acest dublu strat. Unele proteine (numite porine) străbat complet membrana externă, asigurând trecerea unor substanţe din mediu în celule. Lipopolizaharidele (LPS) prezintă trei porţiuni: lipidul A, legat de stratul de fosfolipide; componenta oligozaharidică numită porţiunea centrală R, care este legată covalent de lipidul A şi componenta polizaharidică (antigenul somatic O), variabilă ca structură şi compoziţie chimică, ce determină specificitatea antigenică a celulei bacteriene. În spaţiul periplasmic, situat între membrana internă şi cea externă, se găsesc proteine enzimatice de tipul fosfatazelor, ribonucleazelor şi proteine neenzimatice, implicate în transportul substanţelor prin membrane, numite proteine de legare. Funcţiile peretelui celular bacterian Peretele celular bacterian menţine arhitectura structurală a celulei şi forma acesteia, conferindu-i elasticitate şi plasticitate. Elasticitatea se referă la capacitatea celulei bacteriene de a-şi mări volumul atunci când include o cantitate mai mare de apă şi de a reveni apoi la volumul iniţial. Plasticitatea reprezintă capacitatea celulei de a se deforma sub acţiunea unei presiuni, fără ca structura sa internă să fie alterată. Peretele celular participă la procesele de creştere şi multiplicare bacteriană, la procesul de sporogeneză şi funcţionează ca o barieră de permeabilitate între interiorul şi exteriorul celulei. Acizii teichoici asigură celulelor bacteriene Gram pozitive concentraţii adecvate de ioni metalici în micromediul de la suprafaţa celulei, concentraţii importante pentru activitatea unor sisteme enzimatice membranare. Ei inhibă fagocitoza şi măresc astfel gradul de patogenitate al bacteriilor Gram pozitive patogene. Unii acizi teichoici acţionează ca receptori pentru bacteriofagi.

Membrana externă scade capacitatea de fagocitoză a celulelor gazdă faţă de bacteriile Gram negative patogene, iar prin intermediul porinelor asigură trecerea unor substanţe din mediul extracelular în cel intracelular. Antigenul somatic O conferă celulelor bacteriene specificitate antigenică, compoziţia sa în zaharuri fiind diferită chiar în cadrul aceleiaşi specii bacteriene. Lipopolizaharidele au rol de endotoxină, răspunzătoare de efectele nocive asupra celulelor gazdă.

(după Kayser, Thieme, 2005)

Membrana citoplasmatică Membrana citoplasmatică este o formaţiune structurală ce acoperă de jur împrejur citoplasma bacteriană, separând-o de suprafaţa internă a peretelui celular. Grosimea membranei este de 7 – 10nm. La microscopul electronic apare ca o structură tristratificată, cu două straturi întunecate (electronodense), între care se găseşte un strat mai clar, mai puţin electronodens. Pornind de la imaginea electronomicroscopică a membranei, Robertson a numit această structură „structură în sandwich” sau „unitate de membrană” (unit membrane), considerând în mod eronat că cele două straturi electronodense sunt proteice, iar stratul mijlociu este lipidic. Determinările biochimice ulterioare au infirmat acest model, deoarece proteinele sunt într-o cantitate insuficientă pentru a forma două straturi. Singer şi Nicolson au propus în 1972 modelul mozaicului fluid pentru a descrie structura membranei plasmatice. Conform acestui model, membrana plasmatică are structură bidimensională, cu un strat dublu de fosfolipide în care sunt inclavate proteine („un ocean de fosfolipide pe care plutesc iceberguri de proteine”). În structura membranei se găsesc fosfolipide, proteine şi glucide. Fosfolipidele sunt dispuse într-un dublu strat, cu grupările hidrofobe nepolare faţă în faţă, reprezentate de doi acizi graşi. Extremităţile polare hidrofile, reprezentate de o grupare fosfat, sunt orientate spre mediile apoase externe sau interne ale celulei. Moleculele fosfolipidelor se pot deplasa lateral în acelaşi strat, mişcare numită turnover, sau se pot deplasa de la un monostrat la altul, proces numit tranziţie flip – flop. Proteinele sunt inclavate în dublul strat de fosfolipide. Ele pot fi inserate în structura membranei şi se numesc proteine integrate (transmembranare şi structurale, cele din urmă fiind expuse pe suprafaţa internă sau externă a membranei) sau pot fi proteine neincluse în structura membranei, numite proteine periferice (de suprafaţă), care sunt enzime active către peretele celular sau către citoplasmă. Glucidele sunt slab reprezentate în structura membranei plasmatice, ele fiind sub formă de glicoproteine sau de glicolipide. Membrana plasmatică reprezintă o suprastructură citoplasmatică permanentă, esenţială pentru viaţa celulei, care are rolul de a delimita spaţiul celular. Ea este o barieră între mediul extracelular extrem de variabil şi mediul intracelular relativ constant. Permeabilitatea selectivă a membranei este asigurată printr-o asimetrie structurală şi funcţională, care duce la un comportament diferit spre faţa sa citoplasmatică în raport cu faţa sa dinspre peretele celular. Membrana plasmatică este o structură dinamică, urmare a mobilităţii fosfolipidelor şi a capacităţii de reînnoire a constituenţilor membranei. Este şi o barieră osmotică prin permeabilitatea pentru unele tipuri de molecule şi impermeabilitatea pentru altele. Rolul membranei plasmatice Prin permeabilitatea sa selectivă, membrana plasmatică este asociată cu transportul substanţelor de la exteriorul celulei către interiorul acesteia şi în sens invers. Unele proteine membranare joacă rol de transportori de electroni. La nivelul membranei sunt localizate enzime cu rol în fosforilare (de exemplu ATP-azele), precum şi sinergonul respirator şi al fotosintezei, echivalentul funcţional al mitocondriilor şi al cloroplastelor.

Membrana intervine în biosinteza peretelui celular şi joacă rol de receptor specific pentru substanţele utile celulei bacteriene. Membrana intervine în mobilitatea orientată a bacteriei prin recepţionarea mesajelor chimice din mediu (prin intermediul proteinelor sale cu rol de chemoreceptori), determinate de substanţe repelente sau atractante. La nivelul membranei este localizat şi corpusculul bazal al flagelului, astfel încât membrana este implicată şi în mobilitatea celulei. Membrana plasmatică intervine şi în sinteza şi eliminarea unor exoenzime şi a unor proteine toxice bacteriene (exotoxine), cu rol nociv pentru organismul gazdă. Mezosomii Mezosomii (mezos (gr.) = mijloc, soma (gr.) = corp) sunt structuri derivate din membrana plasmatică, ce au deseori poziţie mediană în celulă. Ei se mai numesc şi corpi de mijloc, plasmalemasomi. Sunt structuri intracitoplasmatice membranare, derivate prin invaginarea membranei, a căror semnificaţie biologică a fost controversată. Au fost descrise trei tipuri morfologice de mezosomi: tubulari, veziculari (sacciformi) şi lamelari. Într-o celulă bacteriană pot exista mai mulţi mezosomi, mai numeroşi, cu structură complexă şi mai bine dezvoltaţi la bacteriile Gram pozitive, mai puţini şi mai greu de observat la bacteriile Gram negative. Structura moleculară a mezosomilor este identică cu cea a membranei plasmatice din care provin, cu o grosime de 7 – 10nm şi un dublu strat fosfolipidic în care sunt inclavate proteine structurale şi cu rol enzimatic. Mezosomii îşi au originea în membrana plasmatică, ce creşte şi se invaginează datorită faptului că peretele celular rigid creşte mai încet decât membrana. Invaginarea membranei plasmatice duce iniţial la formarea unor mezosomi tubulari, apoi la mezosomi veziculari, în final ajungând la aspectul lamelar. Sunt structuri dinamice, care se formează atunci când sunt necesari bacteriei. Semnificaţia biologică a mezosomilor Unii autori consideră mezosomii ca structuri vestigiale, fără semnificaţie biologică esenţială. Alţii consideră că mezosomii au funcţii multiple în celula bacteriană: - Au rol în replicarea şi segregarea genomului bacterian şi în individualizarea celulelor; - Au rol în controlul replicării cromozomului bacterian şi plasmidelor, prin transmiterea semnalului biochimic de iniţiere a replicării materialului genetic; - Fiind derivaţi din membrana plasmatică, reprezintă împreună cu aceasta sediul sinergonului respirator, fiind consideraţi echivalentul funcţional al mitocondriei; participă la reacţii de fosforilare, oxidoreducere, transport de electroni; - La nivelul lor se găsesc enzime degradative, astfel încât pot fi consideraţi echivalentul funcţional al lizozomilor; - Au rol în procesele secretorii ale celulei, contribuind la producerea şi eliberarea unor exoenzime celulare; - Sunt asociaţi cu procesele de biosinteză a învelişurilor celulare (membrană plasmatică, perete celular, sept transversal de diviziune); - Unii autori (Tichy şi colab., 1969) consideră că mezosomii ar reprezenta regiuni specializate de pătrundere în celula bacteriană a fragmentelor de ADN exogen în timpul transformării genetice bacteriene.

Cu toate aceste funcţii multiple, unii cercetători (Nanninga, 1985) contestă existenţa mezosomilor, considerând că ei sunt artefacte (structuri artificiale) care apar în timpul pregătirii materialului celular pentru examinarea la microscopul electronic şi că prin modificări ale tehnicilor folosite s-ar putea induce producerea de mezosomi tubulari, veziculari, lamelari, după bunul plac.

Tipuri morfologice de mezosomi: A – vezicular; B – sacciform turtit; C – formă intermediară; D – multilamelar, complex (după G. Mihăescu, 2000) Citoplasma bacteriană Citoplasma celulelor bacteriene este un sistem coloidal complex, care din punct de vedere fizic corespunde stării de gel şi este formată din proteine, glucide, lipide, apă şi substanţe minerale. Starea de gel permanent are ca rezultat o imobilitate a conţinutului celular în lipsa curenţilor citoplasmatici şi reprezintă o condiţie indispensabilă a nemiscibilităţii nucleosomului cu citoplasma, având în vedere lipsa membranelor intracelulare. Citoplasma bacteriilor nu prezintă organite citoplasmatice diferenţiate şi delimitate de membrane (de tipul mitocondriilor şi cloroplastelor). Aspectul citoplasmei variază în funcţie de vârsta celulei bacteriene şi de condiţiile de cultivare. Astfel, la celulele tinere (din culturi de 24 – 48 ore) şi în condiţii favorabile de mediu, citoplasma aderă strâns de membrana citoplasmatică şi se prezintă ca o masă densă, omogenă, fin granulară, intens colorabilă cu coloranţi de anilină (coloranţi bazici) datorită conţinutului ridicat de acizi nucleici. La celulele îmbătrânite şi în condiţii nefavorabile de mediu, citoplasma îşi pierde treptat afinitatea pentru coloranţii bazici, se îndepărtează de învelişul celular şi capătă un aspect granular, neomogen, cu multiple vacuole.

În citoplasmă se găsesc: materialul nucleosomal, mezosomii, ribozomii, incluziile şi vacuolele. Ribozomii sunt responsabili de structura granulară a citoplasmei, prezentând două topografii diferite: cei care participă la sinteza proteinelor celulare şi a constituenţilor citoplasmatici sunt dispuşi omogen în masa citoplasmei, iar cei care contribuie la sinteza proteinelor care vor fi secretate sau excretate la exteriorul celulei sunt grupaţi pe faţa internă a membranei plasmatice. Citoplasma este foarte bogată în ARN, în special ARN ribozomal (ARNr, 80%), ARN de transfer (ARNt, 10 – 20%) şi ARN mesager (ARNm, 2%), ceea ce explică bazofilia ei intensă la celulele tinere, cu sinteze proteice intense. Celulele îmbătrânite se colorează mai puţin intens, deoarece sinteza de ARN ribozomal încetează şi cel existent este folosit ca sursă de azot şi fosfor. Nucleosomul bacterian Materialul genetic bacterian este reprezentat de două tipuri de structuri: nucleosomul, numit şi nucleoid, material nuclear, echivalent nuclear, genofor, care corespunde din punct de vedere funcţional cromozomului, şi plasmidele, care poartă gene accesorii. Nucleosomul bacterian reprezintă o formă primitivă de organizare a nucleului, lipsită de membrană nucleară, inclavată direct în citoplasmă, în mod obişnuit în mijlocul celulei bacteriene, într-o zonă numită nucleoplasmă. Zona nucleoplasmei este mai clară, în raport cu citoplasma propriu-zisă, care este mai densă. Studiul microscopic al nucleoidului întâmpină dificultăţi legate de bazofilia intensă a citoplasmei, foarte bogată în ARN, care nu permite diferenţierea cu coloranţi bazici a materialului genetic, constituit din ADN, la fel de bazofil. Dacă celula bacteriană este supusă unui tratament cu dezoxiribonuclează şi apoi unei coloraţii cu coloranţi bazici, în mijlocul celulei se observă o zonă clară, incoloră, în care a fost localizat nucleoidul. Evidenţierea microscopică a nucleoidului se poate face prin coloraţii selective, care constau în îndepărtarea ARN citoplasmatic prin hidroliză acidă (tehnica Robinow - Feulgen) sau enzimatică (cu ribonuclează, tehnica Boivin), urmată de colorarea cu coloranţi bazici de anilină. După hidroliza ARN, materialul nuclear apare sub diferite forme: sferică, ovalară, de halteră, de bastonaş, reprezentând 5 – 16% din volumul celulei. La microscopul electronic nucleoidul apare în zona centrală a celulei, mai puţin electronodens decât citoplasma bacteriană, în contrast cu celula eucariotă la care nucleul este mai electronodens decât citoplasma. Celula procariotă are un contrast invers al structurilor sale în raport cu celula eucariotă, deoarece ADN nu este asociat cu proteine, iar citoplasma bacteriană are o densitate foarte mare. Pe secţiuni ultrafine regiunea nucleosomală apare ocupată de fibrile fine, cu diametrul de 2,5nm, uneori aranjate în şiruri ondulate, paralele. Extras prin metode speciale din celula bacteriană, sub forma unui corpuscul dens şi compact, nucleosomul s-a dovedit a fi alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN, dublu catenară, circulară, covalent închisă, cu o lungime de aproximativ 1400µm şi diametrul de 2,5nm. Circularitatea moleculei de ADN este o condiţie esenţială a existenţei sale în celula bacteriană, în contact direct cu citoplasma în care se găsesc cantităţi mare de exonucleaze, care ar ataca moleculele lineare la extremităţile lor.

Nucleosomul bacterian este cea mai mare moleculă biologică şi prin lungimea sa depăşeşte de 1000 de ori lungimea celulei bacteriene. În structura dublu catenară a nucleoidului intervin modificări topologice care constau într-un proces de împachetare prin suprarăsucire (supraspiralizare), ocupând astfel un volum de 1500 de ori mai mic. Pentru a ocupa un volum atât de mic, molecula de ADN se împachetează după norme extrem de riguroase, astfel încât în orice moment cele 3000 – 5000 de gene pe care le conţine să fie accesibile sistemelor celulare de transcriere şi traducere. Stonington şi Pettijohn au elaborat în 1971 un model de împachetare a ADN în celula bacteriană. Ei au demonstrat că ADN-ul poate fi extras din celula bacteriană prin metode blânde sub forma unei mase dense, compacte, care corespunde stării “împachetate” a nucleosomului. Din această masă compactă ei au izolat ADN, ARN şi proteine. Moleculele de ARN (ARNm, ARNt) şi proteinele au un rol esenţial în menţinerea stării compacte a nucleosomului., materialul genetic fiind reprezentat doar de ADN. Dacă nucleosomul extras din celulă este tratat cu ARN-ază, acesta se derulează într-o moleculă dublu catenară de ADN depliată, circulară, închisă, numită formă relaxată, cu diametrul de 350µm. Modelul de împachetare prin pliere şi supraspiralizare explică mecanismul molecular al drumului invers, de la structura relaxată a nucleosomului la forma sa compactă. După părerea celor doi autori, forma relaxată a moleculei de ADN, cu diametrul de 350µm, ar suferi mai întâi un proces de pliere (folding) în 40 – 60 bucle, rezultând o structură cu un diametru de 30µm. La baza fiecărei bucle se găsesc molecule de natură proteică (ARN – polimerază) şi ARN ribosomal sau mesager. Aceste bucle reprezintă domenii de supraîncolăcire prin răsucirea dublului helix spre stânga, rezultând o structură cu diametrul de 2 - 3µm. Domeniile cromozomului bacterian sunt topografic independente. Supraspiralizarea, realizată în cadrul fiecărui domeniu de pliere, este o stare fizică, în care molecula de ADN se pliază prin răsucire în jurul axei sale.

-

Supraspiralizarea este urmarea acţiunii topoizomerazelor, care sunt de două tipuri: helicaze, cu rol de suprarăsucire a moleculei dublu catenare de ADN (topoizomeraza II, AND - giraza); derulaze, cu rol de a produce dezrăsucirea ADN - ului şi aducerea lui într-o formă relaxată (topoizomeraza I).

În urma acţiunii helicazelor, structura ADN devine tridimensională, prin plierea zonelor suprarăsucite superior şi inferior faţă de un plan orizontal, ajungându-se la forma condensată care a fost izolată iniţial din celula bacteriană.

În mod normal, bacteriile aflate în repaus conţin un singur cromozom (sunt haploide). Apariţia unor celule multinucleate, cu 2 – 4 cromozomi, în culture tinere, pe medii ce conferă condiţii optime de creştere, este rezultatul nesincronizării între diviziunea celulară şi replicarea ADN – ului. Situaţia de celulă multinucleată este temporară. Funcţiile materialului genetic nucleosomal Nucleosomul conţine informaţia genetică esenţială necesară existenţei celulelor bacteriene în mediul lor natural. Informaţia genetică din nucleoidul bacterian este cuprinsă în aproximativ 3000 – 4000 gene (determinanţi genetici). Acestea asigură formarea structurilor celulare bacteriene, metabolismul energetic şi biosintetic, reglarea activităţilor celulare, replicarea celulei bacteriene, potenţialul de evoluţie a celulei. Pe medii neobişnuite, celulele bacteriene prezintă, pe lângă nucleosom, o informaţie genetică accesorie, reprezentată de plasmide. Acestea sunt molecule de ADN dublu catenar, circular, covalent închis, numite şi minicromozomi, reprezentând 1 – 2% din mărimea cromozomului bacterian, cu un număr mic de gene.

CURS 3 Ribozomii Ribozomii sunt particule nucleoproteice intracitoplasmatice, de formă aproximativ sferică şi cu un diametru de 20nm; pot fi caracterizaţi prin constanta lor de sedimentare la ultracentrifugare în gradient de concentraţie (concentraţie de sucroză de 5 – 25%). Ribozomii eucariotelor sunt de tip 80S, iar ribozomii procariotelor sunt de tip 70S. Ribozomii sunt structuri dinamice, care au capacitatea de a disocia în cele două subunităţi componente, care se reasociază când ribozomii sunt funcţionali. Asocierea şi disocierea componentelor ribozomale sunt corelate cu variaţiile concentraţiei ionilor de magneziu: asocierea este favorizată de creşterea concentraţiei ionilor de magneziu, iar disocierea e corelată cu scăderea acestei concentraţii. Numărul ribozomilor în celula bacteriană este corelat cu activitatea ei fiziologică, fiind mic în celulele aflate în repaus şi mare în celulele fiziologic active. El variază între 15000 – 100000/celulă. Unii ribozomi se găsesc liberi în citoplasmă şi determină structura granulară a acesteia, mai ales la celulele tinere. Alţii se găsesc pe faţa internă a membranei citoplasmatice, la nivelul lor având loc sinteza proteinelor care vor fi eliminate la exteriorul celulei. Ribozomii bacterieni 70S au două subunităţi: o subunitate mare, 50S, care are formă de fotoliu şi o subunitate mică, 30S, care are formă de halteră asimetrică, aşezată orizontal pe braţele şi spătarul fotoliului. Ribozomii 70S conţin în total 55 molecule de proteine şi 3 molecule de ARN ribosomal. Subunitatea mare are greutatea moleculară de 16000000 Da, cu 34 molecule diferite de proteine, notate de la L1 la L34 (de la large = mare) şi două molecule de ARNr, una foarte mare, 23S, alta mică, 5S. Subunitatea mică are greutatea moleculară de 900000 Da, cu 21 molecule proteice, notate de la S1 la S21 (de la small = mic) şi o moleculă de ARNr, cu o constantă de sedimentare 16S.

Subunitatea mare are formă de fotoliu, iar subunitatea mică are aspect de halteră asimetrică, rezemată orizontal pe braţele şi spătarul fotoliului. Între cele două subunităţi, mai precis între scobitura fotoliului şi gâtul halterei, rămâne un canal lung şi îngust, prin care trece ARN mesager, purtătorul informaţiei genetice necesare sintezei proteinelor. O celulă de Escherichia coli în plină creştere sintetizează aproximativ 500 ribozomi/minut, acest proces implicând sinteza coordonată a moleculelor proteice şi a ARNr, precum şi asamblarea lor funcţională. Celulele bacteriene au o capacitate de a sintetiza ribozomi într-un ritm accelerat, o capacitate de biosinteză proteică rapidă şi eficientă, astfel încât se pot multiplica rapid, pentru a supravieţui în natură. Ribozomii sunt constituenţi esenţiali ai sistemului de traducere a informaţiei genetice, reprezentând adevărate fabrici de proteine. La nivelul lor se desfăşoară un ansamblu de reacţii care formează ciclul ribozomal, ce determină iniţierea, creşterea şi terminalizarea lanţului polipeptidic, în care ribozomii interacţionează cu ARN mesager pentru a lega specific moleculele de aminoacizi aduşi cu ajutorul ARN de transfer, asigurând formarea proteinelor. Ribozomii se asociază în polisomi (poliribozomi), grupări funcţionale formate din 4 – 50 unităţi ribozomale. Dimensiunile poliribozomilor variază în funcţie de lungimea ARNm. Polisomii se deplasează în lungul moleculei de ARNm şi permit sinteza concomitentă a mai multor molecule proteice pe aceeaşi moleculă de ARNm. Rolul ribozomilor în sinteza proteică În faza de creştere logaritmică a culturii bacteriene, la temperatura optimă, cromozomul bacterian este transcris cu o rată de 60 nucleotide/secundă. La procariote ribozomii au relaţii spaţiale strânse cu ADN, deoarece transcrierea şi traducerea informaţiei sunt două procese intim coordonate, care se desfăşoară aproape concomitent. După ce a citit integral informaţia ARNm, ribozomul se desprinde, eliberând în acelaşi timp polipeptidul sintetizat. Polisomul este ataşat fizic de cromozomul bacterian pentru o perioadă scurtă de timp. Transcrierea moleculei de ARNm durează circa un minut. Rata traducerii este corelată cu rata transcrierii. Pe medii nutritive bogate, ribozomii celulelor bacteriene (ataşaţi de suprafaţa internă a membranei citoplasmatice) sintetizează exoproteine, care sunt eliminate la exterior. Unele proteine de acest fel nu apar niciodată în citoplasma celulelor bacteriene, sugerând că ele sunt eliminate pe măsură ce sunt sintetizate. Ele sunt molecule relativ mici, lipsite de rigiditate.

Incluziile bacteriene Incluziile bacteriene sunt formaţiuni structurale inerte, care apar în citoplasma bacteriilor aflate la sfârşitul perioadei de creştere activă, de regulă în condiţii de abundenţă a surselor nutritive şi în prezenţa unui dezechilibru între carbon şi azot. Ele reprezintă rezerve intracelulare pentru microorganisme, care dispar după trecerea celulelor respective în medii sărace în nutrienţi. Mărimea, forma, conţinutul şi numărul incluziilor diferă. Ele pot fi: - incluzii anorganice simple (sulf coloidal, carbonat de calciu); - polimeri anorganici (incluzii de polimetafosfat care constituie volutina); - polimeri organici polizaharidici (amidon, glicogen), lipidici (polibetahidroxibutirat) sau proteici (incluziile parasporale de la Bacillus thuringiensis). După criterii structurale, se disting incluzii delimitate de membrane (de exemplu cele de polibetahidroxibutirat) sau nedelimitate de membrane (de exemplu cele de glicogen, de volutină). La microscopul optic apar ca structuri granulare, de formă neregulată, refringente, cu dimensiuni între 50 – 100nm. Granulele de volutină (corpusculii Babeş Ernst) sunt polimeri de polifosfaţi care au fost evidenţiate la Spirillum volutans şi care se formează în condiţiile deficitului oricăruia dintre nutrienţi. Ele reprezintă o rezervă de fosfor şi de energie intracelulară. Incluziile de sulf anorganic sunt structuri refringente, localizate intracitoplasmatic sau la nivelul unor pliuri ale membranei citoplasmatice. Se întâlnesc la bacteriile sulfuroase purpurii (Chromatiaceae) care folosesc în fotosinteză H2S ca donor de electroni şi la bacteriile filamentoase autotrofe nefotosintetizante (Beggiatoa), care oxidează H2S. După epuizarea H2S din mediu, sulful depozitat în celule este oxidat la sulfat. O categorie aparte de incluzii e reprezentată de magnetosomi, incluzii ce conţin magnetită (Fe3O4), răspunzătoare de fenomenele de orientare descrise la bacterii sub influenţa câmpurilor magnetice slabe sau a câmpului magnetic al pământului (magnetotaxie). Bacteriile magnetotactice au fost izolate din sedimentele marine şi de apă dulce, ca de exemplu Aquaspirillum magnetotacticum, singura obţinută în cultură pură. Aceste bacterii au o importanţă deosebită în studiile asupra câmpului magnetic al pământului. Incluziile proteice parasporale se sintetizează odată cu formarea sporilor. Vacuolele bacteriene Sunt formaţiuni sferice cu diametrul de aproximativ 0,3 – 0,5µm, mai puţin refringente decât citoplasma. În funcţie de mediul de cultură numărul lor într-o celulă este între 6 şi 20. Vacuolele conţin substanţe dizolvate în apă şi sunt delimitate de un înveliş lipoproteic unistratificat, cu grosimea de 3nm, numit tonoplast. Unii autori consideră că vacuolele se formează ca urmare a pătrunderii unei cantităţi mari de apă în celulă. În apa aflată în exces se dizolvă produşi de metabolism hidrosolubili, iar lipidele şi proteinele acumulate în jurul picăturilor de apă formează tonoplastul. Rolul vacuolelor ar fi acela de reglatori ai presiunii osmotice în raport cu mediul extern, precum şi de depozite de substanţe de rezervă în perioada premergătoare formării incluziilor.

Un tip special de vacuole este reprezentat de veziculele gazoase, numite aerosomi. Ele sunt întâlnite la bacteriile acvatice fotosintetizante imobile, ca de exemplu cianobacterii şi bacterii fotosintetizante verzi şi roşii. Sunt structuri refringente cu aspect ovalar, compartimentate, membranele fiind constituite din proteine hidrofobe. Aerosomii conferă bacteriilor o densitate mai mică decât a apei şi permit deplasarea celor acvatice imobile într-o coloană verticală de apă în zone favorabile fotosintezei. De asemenea, joacă un rol protector pentru bacterii, dispersând lumina şi apărând structurile fotosensibile de acţiunea nocivă a ultravioletelor. Aerosomii sunt numeroşi la cianobacteriile care cresc cu o rată mare şi produc fenomenul de „înflorire a apelor”. Endosporul bacterian Anatomia bacteriilor permite adaptarea lor la habitate diverse. Dintre toate structurile microorganismelor, endosporul este cel mai performant din punct de vedere al rezistenţei la condiţiile ostile de mediu, care facilitează supravieţuirea. Sporul bacterian este o formă primitivă de diferenţiere celulară, care constă în formarea în celula vegetativă a unui nou tip de celulă, cu ultrastructură, compoziţie chimică şi enzimatică diferită. Există cel puţin 10 tipuri diferite de spori, caracteristice anumitor grupuri sistematice de bacterii, cu particularităţi structurale şi biologice. Cea mai comună formă de spor este endosporul, care poate fi considerat sporul tipic. El este frecvent întâlnit la bacteriile Gram pozitive cilindrice (de exemplu la genurile Bacillus, Clostridium) şi în mod excepţional la bacterii sferice (Sporosarcina). Endosporul are formă sferică sau ovalară, cu dimensiuni între 0,5 - 1µm pentru axul mic şi între 1 – 1,5µm (3µm) pentru axul longitudinal. Are o refringenţă deosebită şi e foarte greu colorabil datorită învelişurilor impermeabile pentru coloranţi. Se poate colora însă după permeabilizarea învelişurilor prin tehnici speciale energice. În funcţie de aşezarea în celula bacteriană, sporul poate fi terminal, subterminal sau ecuatorial (central), iar în funcţie de diametrul său comparativ cu cel al celulei în care se formează, sporul poate fi nedeformant (terminal, subterminal, central) sau deformant (terminal, ecuatorial).

1. 2. 3. 4.

Spor central nedeformant Spor terminal nedeformant, cu cristale proteice parasporale Spor terminal deformant Spor central deformant

Spori de Clostridium difficile În general sporii sunt unici în celula bacteriană, dar există şi excepţii, când în celule se formează câte doi spori (celule bisporulate) sau chiar mai mulţi (celule polisporulate). Ultrastructura endosporului Sporul este alcătuit dintr-o porţiune centrală, ce reprezintă protoplastul sporal, format din: perete sporal, citoplasmă granulară denumită sporoplasmă, în care se găsesc ribozomii şi materialul nuclear inclus în nucleoplasmă. Protoplastul sporal este înconjurat de o zonă transparentă, mai puţin densă, numită cortex, alcătuită din peptidoglican modificat, acoperit de un înveliş sporal lamelar cu 3 straturi suprapuse: la interior este situată intina bistratificată, urmează un strat mijlociu şi apoi exina multistratificată. La unele bacterii există în jurul sporului un exosporium, uneori multistratificat, ancorat de spor prin filamente suspensoare. Unii spori au la una dintre extremităţi un smoc de apendici sporali, de aproximativ două – trei ori mai lungi decât sporul, cu aspect tubular şi cu striaţii orizontale sau în formă de pană. Rolul acestor apendici ar fi acela de a facilita dispersarea sporilor în natură, precum şi nutriţia sporului în cursul sporogenezei sau germinării, prin preluarea nutrienţilor din mediu.

Compoziţia chimică a sporului Sporul conţine toate categoriile de molecule necesare reluării creşterii celulei bacteriene. Lipsesc componentele celulare instabile (ARNm şi nucleozidtrifosfaţi), dar există precursorii lor mai stabili (nucleozid mono- şi difosfaţi). În spor nu se realizează deci sinteze proteice. Sporii conţin proteine structurale specifice, codificate de gene care sunt active numai în spori, numite gene sporale. De asemenea, conţin enzime noi, în general proteaze, lipsindu-le enzimele importante în metabolismul celulelor bacteriene (ca de exemplu cele ale ciclului Krebs). Le lipsesc şi sistemele transportatoare de electroni, care în celula vegetativă sunt localizate la nivelul membranei. Enzimele sporale au o greutate moleculară mult mai mică decât enzimele celulare. Unele dintre ele provin din enzimele celulei vegetative prin digestia proteolitică a acestora, realizată de proteaze codificate de enzimele sporale. Ele reprezintă doar situsul activ al enzimelor celulare, sunt mai termorezistente şi sunt stabilizate prin legături intramoleculare. Sporii conţin o cantitate mare de ioni de calciu şi magneziu, în raport cu celula vegetativă. Ionii de calciu sunt legaţi cu o cantitate echivalentă de acid dipicolinic, ce reprezintă între 10 - 15% din greutatea uscată a sporului. Acidul dipicolinic este implicat în termorezistenţa crescută a sporilor. Concentraţia de ATP este foarte scăzută în spori. Iniţial s-a considerat că sporul se formează prin deshidratarea celulei vegetative, ceea ce ar explica lipsa metabolismului la spor. Cercetările ulterioare au evidenţiat că deosebirile dintre spor şi celula vegetativă nu sunt de ordin cantitativ, ci calitativ, referindu-se la starea apei. Apa liberă din spor este în cantitate foarte redusă, între 3 – 10%, iar restul de 90 – 97% este în stare legată de constituenţii celulari. Apa legată nu este implicată în procese metabolice. Sporul este în stare vie, dar este o viaţă latentă (criptobioză), fără metabolism sau cu un metabolism extrem de redus, nedecelabil. În celula vegetativă 70% din apă este în stare liberă, implicată în diverse procese metabolice. Particularităţile de structură şi compoziţie chimică a sporilor determină termorezistenţa acestora, deosebita rezistenţă la substanţele chimice (antiseptice, dezinfectanţi), rezistenţa la radiaţii. Sporogeneza este procesul de formare a sporilor, care se desfăşoară în 6 – 7 stadii succesive şi durează aproximativ 8 ore. Este declanşată de lipsa unui nutrient esenţial pentru celula bacteriană (sursa de azot, sursa de carbon). Apar modificări ultrastructurale, biochimice şi biologice, în sensul creşterii rezistenţei la factorii nefavorabili de mediu. Procesul este complex şi din punct de vedere genetic, implicând participarea a cel puţin 50 de gene, constând în blocarea activităţii genelor funcţionale în celula vegetativă şi activarea genelor sporale. Germinarea sporilor este procesul de conversie a sporului în celula vegetativă şi are loc atunci când sporul întâlneşte condiţii favorabile de mediu. Se realizează printr-o serie de etape succesive, care în general reproduc în ordine inversă fenomenul de sporogeneză. Sporul se hidratează, apa legată trecând în stare liberă, volumul sporului se măreşte, are loc gelificarea învelişurilor sporale, după care celula vegetativă părăseşte învelişul sporal.

Semnificaţia biologică a sporilor Sporogeneza este o formă primitivă de diferenţiere celulară, dar şi o modalitate de adaptare a celulei la condiţii de mediu nefavorabile. Mecanismele criptobiozei nu sunt cunoscute. Unul dintre ele ar putea fi starea specială a enzimelor, care sunt inactivate în mod reversibil. Endosporul este şi o formă de conservare viabilităţii celulelor şi deci a speciei, nefiind o formă de multiplicare. Are rol în diseminarea celulelor bacteriene în natură, deoarece pot fi răspândiţi la distanţe foarte mari şi au o longevitate deosebită. Sporogeneza poate fi asociată cu unele procese biologice importante. Componentele extraparietale Capsula bacteriană Capsula bacteriană reprezintă o structură accesorie, care acoperă de jur împrejur celula bacteriană. Este alcătuită dintr-un material macromolecular, gelatinos, vâscos, inegal dezvoltat de la o specie bacteriană la alta. Se întâlnesc mai multe forme de capsulă: 1. Microcapsula este forma cea mai simplă, reprezentată de o peliculă fină, cu o grosime mai mică de 0,2µm, care acoperă de jur împrejur peretele celulei bacteriene. 2. Macrocapsula este o structură organizată, aderentă de celulă, cu o grosime mai mare de 0,2µm, demonstrabilă prin metode citologice. 3. Stratul mucos este o masă amorfă neorganizată, ale cărei componente vâscoase se dispun fără o semnificaţie anatomică în jurul celulei bacteriene, cu o grosime mult mai mare de 0,2µm. 4. Zoogleea (zoon = animal; glee = substanţă vâscoasă) constă din acelaşi material ca şi stratul mucos, dar cuprinde mai multe celule bacteriene, formând o asociaţie bacteriană mucilaginoasă. La unele bacterii din mediul natural se întâlneşte un glicocalix adevărat, care are caracter adaptativ şi conferă celulei un avantaj selectiv, dispărând dacă bacteria este trecută pe medii artificiale. Acesta este constituit dintr-o reţea de filamente polizaharidice şi glicoproteice, legate de lipopolizaharidele membranei externe la bacteriile Gram negative sau de mureina bacteriilor Gram pozitive. Formează o structură pericelulară dezordonată, ca o pâslă, prin care celulele se ancorează de diferite substraturi.

Flagelul bacterian Flagelii sunt structuri extracelulare, care reprezintă organite de motilitate, cu o structură rudimentară în raport cu flagelul eucariotelor. Flagelii se mai numesc şi undulipode (undula = undă mică, podos = picior). Au originea în celula bacteriană, străbat învelişurile celulare şi prezintă un filament extracelular. Acest filament are o grosime constantă pe toată lungimea lui, egală cu 20nm. Lungimea flagelului este variabilă, de la 4 - 5µm până la 15µm, ajungând uneori până la 70µm, flagelii fiind mult mai lungi decât celula bacteriană. Flagelii nu se pot observa direct la microscop, prezenţa lor poate fi dedusă pe baza mobilităţii accentuate a bacteriilor, care se deplasează în câmpul microscopic la întâmplare, în diferite direcţii. În funcţie de prezenţa sau absenţa flagelilor, numărul şi gruparea lor, au fost descrise mai multe tipuri de bacterii: - bacterii atriche (fără flagel) - bacterii monotriche (cu un singur flagel) - A - bacterii amfitriche (cu doi flageli, situaţi de obicei apical) - C - bacterii lofotriche (cu un smoc de flageli la unul din poli) - B - bacterii peritriche (cu flageli de jur împrejurul celulei) - D Flagelul poate fi situat polar sau subpolar, smocul de flageli poate fi dispus ecuatorial.

Ultrastructura flagelului bacterian Flagelul este format din trei componente: o porţiune bazală rotatorie, situată în învelişurile celulei bacteriene; o porţiune în formă de cârlig, care se continuă extracelular cu flagelul propriu-zis, cu un diametru constant de 20nm. Porţiunea bazală are caracter de motor rotativ şi prezintă o structură diferită la bacteriile Gram pozitive faţă de cele Gram negative. La bacteriile Gram pozitive porţiunea bazală e simplă, formată din două discuri unite între ele printr-un ax central, precum butonii unei manşete. La bacteriile Gram negative porţiunea bazală este formată din mai multe discuri unite printr-un ax central: - discul M, la nivelul membranei plasmatice, este un disc mobil, cu funcţie de rotor (cu aproximativ 4000 rotaţii/minut), reprezintă partea rotatorie a flagelului; - discul S, situat în regiunea supramembranară, în spaţiul periplasmatic, cu rol de stator, imobil;

-

discul P, imobil, legat de lanţul de peptidoglicani, în spaţiul periplasmatic; discul L, situate la nivelul lipopolizaharidelor membranei externe a peretelui celular. În jurul discurilor M şi S există o pereche de proteine Mot, care acţionează ca un motor al flagelului, determinând rotaţia filamentului şi proteinele Fli, care funcţionează ca un comutator al motorului, determinând sensul de rotaţie al acestuia în funcţie de semnalele primate din interiorul celulei. Cârligul are caracter de articulaţie flexibilă universală, putându-se roti împreună cu filamentul cu 360˚. Filamentul extracelular este flagelul propriu-zis, situat la exteriorul celulei, cu mişcări de bici, nu ondulatorii. El are un diametru constant pe toată lungimea sa. Mişcarea rotatorie se transmite spre cârlig datorită discurilor fixe. La o bacterie cu un singur flagel situat polar, acesta se învârte în sens antiorar şi propulsează bacteria înainte. La bacteriile peritriche flagelii se grupează către extremitatea opusă direcţiei de înaintare. Prin rotirea flagelului în sens orar, bacteria se rostogoleşte si îşi schimbă direcţia de deplasare (flagelii dispuşi peritrich se răsfiră). Motorul rotativ conţine 15 proteine diferite. Filamentul este alcătuit dintr-o proteină majoră, flagelina, reprezentată de câteva mii de molecule de acelaşi tip, cu greutate moleculară de 40.000 – 65.000 Da. Moleculele de flagelină sunt grupate în 11 şiruri de filamente dispuse după o simetrie helicoidală, conferind flagelului o structură tubulară.

Semnificaţia biologică a flagelului Prezenţa flagelilor asigură deplasarea activă a bacteriilor în medii lichide. S-a demonstrat că în medii neutre din punct de vedere chimic bacteriile se deplasează la întâmplare: o secundă în linie dreaptă, apoi o rostogolire în 0,1 secunde cu schimbarea direcţiei de deplasare, urmată de o nouă deplasare în linie dreaptă timp de o secundă. Viteza de deplasare a bacteriilor este mai mare decât a macroorganismelor, raportată la dimensiunile proprii. Bacteriile flagelate se deplasează cu 20-80µm pe secundă, ceea ce reprezintă o viteză de 40 lungimi/secundă. Mişcarea orientată preferenţial a bacteriilor este numită taxie. Ea se poate realiza în funcţie de substanţele chimice din mediu (chimiotaxie), de lumină (fototaxie), de concentraţia de oxigen (aerotaxie), de temperatură (termotaxie).

Substanţele chimiotactic pozitive (atractante) determină deplasarea bacteriilor împotriva gradientului de concentraţie, din zone în care concentraţia substanţelor respective este mică, spre zone în care ea este mare. Substanţele atractante sunt în general substanţe utile bacteriilor (aminoacizi, zaharuri, ioni de calciu şi magneziu). În prezenţa atractanţilor se măreşte deplasarea bacteriilor în linie dreaptă şi se micşorează numărul de rostogoliri. Substanţele chimiotactic negative (repelente) determină o deplasare a bacteriilor în sensul gradientului de concentraţie, spre zone în care concentraţia substanţelor respective este mică. Ele sunt reprezentate de substanţe nocive pentru bacterii (produse de excreţie, alcooli, acizi graşi, ioni ai metalelor grele). În prezenţa repelenţilor se micşorează deplasarea bacteriilor în linie dreaptă şi se măreşte frecvenţa rostogolirilor. Din punct de vedere ecologic, mobilitatea bacteriilor este foarte importantă în natură, deoarece asigură supravieţuirea bacteriilor. Ea le oferă bacteriilor posibilitatea de a se deplasa spre regiuni în care condiţiile de existenţă sunt favorabile. Pilii Pilii sunt apendici fi1amentoşi neflagelari, a căror sinteză este codificată de gene localizate pe plasmide. Aceste plasmide se numesc "plasmide de sex" sau conjugoni. Celulele purtătoare de pili au capacitatea de a dona material genetic celulelor lipsite de pili. Numărul pililor este de aproximativ 1 - 10/celulă, au lungimea de aproximativ 20µm, iar diametrul de 6 15nm la exterior şi 2,5nm la interior. Pilii sunt alcătuiţi din molecule identice de pilină, care se sintetizează în celulă, este transferată în lumenul pilului şi este asamblată după o simetrie helicală la extremitatea liberă a pilului. Celulele care poseda pili sunt considerate celule "mascule". Pilii pot fi îndepărtaţi mecanic prin agitare. Capacitatea de sinteză a pilinei se pierde odată cu pierderea plasmidei de sex şi este redobândită odată cu recâştigarea plasmidei. Rolul pililor Prezenţa pililor este asociată cu procesul de conjugare bacteriană, fiind implicaţi în transferul de material genetic de la celula donoare la celula receptoare. Rolul pililor în conjugare este argumentat de faptul că pierderea pililor este însoţită de pierderea capacităţii de conjugare a bacteriilor. Fimbriile Fimbriile sunt structuri de tipul apendicelor filamentoase drepte şi rigide, mai scurte şi mai subţiri decât flagelii. Sinteza componentelor fimbriilor este codificată de gene situate pe cromozomul bacterian. Fimbriile pot fi până la 1000/celulă. Lungimea lor este variabilă (1 - 20µm), iar diametrul este cuprins între 3 - 15/µm. Dacă sunt numeroase, au o dispoziţie pericelulară. Fimbriile sunt alcătuite din molecule de fimbrilină aşezate după o simetrie helicală, determinând o structură tubulară. O bacterie posedă câteva tipuri de fimbrii, în funcţie de grosime, lungime, specificitate antigenică. Fimbriile sunt comune la bacteriile enterice şi nu se întâlnesc la bacteriile Gram pozitive. Semnificaţia biologică a fimbriilor Semnificaţia biologică a fimbriilor nu este încă bine precizată. Ele sunt considerate structuri adaptative, cu rolul de a mări suprafaţa de contact a bacteriei cu mediul înconjurător, fiind utilizate pentru absorbţia nutrienţilor. Fimbriile favorizează asocierile dintre celule, formându-se astfel pelicule fine (filme) de bacterii la suprafaţa apei, asigurând condiţii bune de aerare pentru bacteriile aerobe şi condiţii de luminozitate pentru cele fotosintetizante.

CURS 4 CREŞTEREA ŞI MULTIPLICAREA BACTERIILOR Ca rezultat al metabolismului de sinteză, bacteriile cresc prin formarea de noi constituenţi celulari, după care se multiplică. Creşterea şi multiplicarea bacteriană prezintă anumite particularităţi, ca urmare a intensităţii deosebite a metabolismului bacterian şi a reglării lui perfecte. Studiul creşterii şi multiplicării bacteriene este important din punct de vedere teoretic, pentru a explica dinamica, mecanismul şi factorii care influenţează aceste procese, dar şi din punct de vedere practic, pentru utilizarea eficientă a bacteriilor în biotehnologie (pentru obţinerea de biomasă, produşi de fermentaţie, produşi secundari de metabolism). Creşterea bacteriilor Creşterea bacteriilor reprezintă mărirea coordonată a tuturor constituenţilor celulari. Ea este rezultatul sintezei specifice şi echilibrate, pornind de la substanţele nutritive din mediu, a unor compuşi de bază, care sunt ulterior asamblaţi pentru a forma copii fidele ale constituenţilor celulari. Specificitatea creşterii este determinată de intervenţia unor mecanisme de control genetic. Procesul creşterii depinde de natura şi concentraţia substanţelor nutritive din mediu, precum şi de aprovizionarea continuă a celulei cu energia necesară reacţiilor de sinteză. Mărirea masei totale a celulei bacteriene nu reflectă întotdeauna creşterea normală a celulei, deoarece ea poate rezulta prin sinteza şi acumularea de substanţe de rezervă, care nu sunt specifice creşterii sau prin sporirea accentuată a conţinutului în apă. Creşterea celulei bacteriene se realizează prin adăugarea de constituenţi noi la peretele celular rigid, care are loc în moduri diferite: - polar; - bipolar; - ecuatorial, în zona septului de diviziune; - intercalar, prin intususcepţiune, în zone specifice de creştere; - prin depunere pe suprafaţa internă a peretelui celular. Creşterea bacteriilor se realizează prin depunerea de substanţe noi uni-, bi- sau tridimensional. De obicei creşterea bacteriilor cilindrice se face în sensul axului longitudinal, iar celulele sferice cresc în sensul celor trei dimensiuni. Creşterea bacteriilor nu se face la infinit, ci doar până la un moment critic, în care creşterea este întreruptă şi este urmată de diviziunea celulară. Mecanismul întreruperii procesului de creştere nu este pe deplin cunoscut. Se admite ipoteza că activitatea normală a celulei bacteriene este urmarea unui raport echilibrat între volumul celulei bacteriene (care reflectă masa celulară ce consumă nutrienţii şi produce cataboliţi) şi suprafaţa celulei (aria prin care se realizează schimburile cu mediul extracelular, care constau în absorbţia nutrienţilor şi eliminarea unor produşi de catabolism). În cursul creşterii celulei, acest raport echilibrat se modifică în sensul diminuării suprafeţei (care creşte cu o rată pătratică, în timp ce volumul creşte cu o rată cubică), astfel încât aportul de substanţe nutritive devine insuficient şi inadecvat necesităţilor metabolice ale celulei. Se ajunge astfel la momentul critic, ce declanşează diviziunea celulară, care restabileşte raportul echilibrat între suprafaţa şi volumul celulei bacteriene.

Multiplicarea bacteriilor Multiplicarea bacteriilor se realizează prin patru mecanisme: diviziune directă (simplă), înmugurire, fragmentare şi prin producerea de spori. Diviziunea directă (izomorfă) Este forma cea mai răspândită şi cea mai bine cunoscută de multiplicare a bacteriilor. Ea constă în scindarea celulei mamă, ajunsă la punctul critic de creştere, în două celule fiice surori, cel mai adesea identice. La bacteriile cilindrice şi spiralate diviziunea se face într-un plan transversal, perpendicular pe axul longitudinal al celulei, şi numai excepţional, la unii spirili, se realizează după un plan longitudinal. Cocii se divid după unul, două sau trei planuri, perpendiculare unul pe celălalt, făcând posibilă gruparea celulelor în diplococi, tetradă, sarcină. În general, diviziunea evoluează în trei etape distincte: - formarea unei membrane ce separă protoplaştii ce vor forma celulele fiice; - sinteza peretelui celular pe suprafaţa membranei respective sau formarea unui sept transversal prin creşterea spre interior a peretelui celular periferic; - separarea celulelor rezultate în urma diviziunii. Exceptând situaţiile anormale, (care se finalizează cu formarea unor minicelule sferice, lipsite de ADN, ca urmare a localizării anormale a situsului de diviziune), bacteriile fără nucleu apar extrem de rar. Acest fapt sugerează existenţa unei legături obligatorii între replicarea ADN-ului şi diviziunea celulei, precum şi existenţa unui mecanism de control, care permite ca diviziunea să aibă loc doar atunci când în celula mamă există doi nuclei noi, care vor fi separaţi în cele două celule fiice.

În procesul de diviziune celulară are loc întâi replicarea ADN-ului, apoi formarea septului de diviziune. Această corelaţie a fost studiată la Escherichia coli, la care timpul de apariţie a unei noi generaţii este de 45 minute. - timpul 0 – informaţia genetică este reprezentată de un singur cromozom bacterian; - timpul 18 min. – ADN-ul cromozomal este parţial replicat; - timpul 20 min. – începe migrarea celor doi cromozomi obţinuţi prin replicare către extremităţile celulei; - timpul 25 min. – segregarea informaţiei genetice a avut deja loc, cresc membrana plasmatică şi peretele celular în spaţiul dintre cele două molecule de ADN; - timpul 30 min. – începe formarea septului transversal de diviziune; - 35 – 38 min. – cele două celule fiice, fiecare cu câte un nucleosom propriu, sunt în situaţia de a se separa; - timpul 45 min. – are loc separarea celor două celule fiice nou formate. Cercetările ulterioare ale corelaţiei dintre replicarea ADN-ului bacterian şi ritmul de diviziune au scos în evidenţă particularităţi ale acestui fenomen. Acestea se referă la acumularea unei proteine iniţiator, capabilă să declanşeze ciclul de replicare a cromozomului, într-un ritm care depinde de condiţiile de mediu, dar şi la faptul că în general timpul de replicare a cromozomului este fix, la Escherichia coli durând 20 minute. Dinamica procesului de multiplicare bacteriană în culturi Culturile bacteriene sunt de două tipuri: continue şi discontinue. Culturile continue sunt cele în care mediul de cultură este reînnoit permanent cu o anumită rată, o parte din masa bacteriană formată fiind îndepărtată în acelaşi timp din cultură, cu aceeaşi rată. Aceste culturi se realizează în aparate speciale şi asigură o concentraţe constantă de celule în cultură (după principiul turbidostatului) şi o concentraţie constantă a substanţelor chimice din mediu (după principiul chemostatului). Culturile discontinue sunt cele obţinute într-un mediu de cultură neînnoit, în vase închise. Se pot realiza în două variante: culturi asincrone şi culturi sincrone. Culturile sincrone sunt cele în care majoritatea bacteriilor se multiplică în acelaşi timp. Culturile asincrone sunt cele în care bacteriile se multiplică în momente diferite. Culturile obţinute în laborator în mod curent sunt culturi discontinue asincrone. Acestea prezintă următoarele particularităţi:  mediul de cultură nu este reînnoit pe timpul cultivării, fiind într-un volum fix pe întreaga durată a obţinerii culturii;  compoziţia chimică a mediului se schimbă pe parcursul formării culturii (substanţele nutritive sunt consumate, se acumulează produşi de catabolism, se modifică pH-ul, );  numărul de celule viabile este variabil, la început crescând progresiv, ulterior scăzând datorită îmbătrânirii şi morţii celulelor;  ritmul de diviziune este inegal, la început, când populaţia bacteriană este tânără şi condiţiile de mediu sunt optime, fiind mai mare, ulterior scăzând;  vârsta celulelor bacteriene este diferită;  numărul de generaţii este limitat, datorită condiţiilor de mediu fixe.

Procesul multiplicării bacteriilor în culturi discontinue asincrone evoluează în câteva faze succesive: -

faza de lag (de latenţă, de creştere bacteriană 0) este cuprinsă între momentul iniţierii culturii şi începerea multiplicării bacteriene; numele ei vine de la to lag (engl.) = a întârzia; numărul celulelor bacteriene din inoculul iniţial rămâne relativ neschimbat; deşi considerată fază de latenţă, este în realitate o fază activă, în care celulele se pregătesc pentru multiplicarea ce va urma (îşi refac structurile şi sistemele enzimatice necesare, cresc în dimensiuni, prezintă un metabolism intens). Această fază are o durată diferită în funcţie de vârsta inoculului folosit: dacă inoculul provine dintr-o cultură tânără, faza de latenţă este scurtă; dacă inoculul provine dintr-o cultură mai veche sau aflată în condiţii de mediu total diferite de mediul cel nou, faza de latenţă este de mai lungă durată, celulele fiind într-o fază activă de adaptare la noile condiţii de cultivare.

-

faza de accelerare constă în iniţierea multiplicării bacteriene într-un ritm progresiv, care determină şi numele fazei; faza de creştere logaritmică (exponenţială) este faza în care multiplicarea se realizează cu un ritm constant şi maxim, populaţia bacteriană practic dublându-se la fiecare diviziune; celulele au o mărime uniformă, mai mare decât a celulelor normale, caracteristice speciei, cu citoplasmă omogenă, bogată în ARN, cu sinteze proteice intense, fără materiale de rezervă. Acest stadiu corespunde celulelor bacteriene tinere, potrivite pentru cercetarea de laborator; faza de încetinire este aceea în care ritmul de multiplicare este încetinit, datorită condiţiilor de mediu. Unul dintre factorii nutritivi esenţiali din mediul de cultură devine limitant, fiind epuizat treptat şi devenind insuficient;

-

-

-

faza staţionară a creşterii este caracterizată printr-un număr de celule viabile maxim şi constant pentru o perioadă de timp care depinde de specia bacteriană; se consideră că în timp ce unele celule bacteriene mor, dispariţia lor este compensată de multiplicarea lentă a altor celule, astfel încât, în ansamblu, numărul de celule viabile este acelaşi. Această fază corespunde celulelor bacteriene mature, cu morfologie considerată normală, tipică unei specii date; celulele din această fază se folosesc pentru coloraţii. Spre sfârşitul fazei staţionare încep să apară primele incluzii bacteriene, vacuole şi chiar spori;

-

faza de început al declinului este aceea în care numărul celulelor viabile începe să scadă ca rezultat al morţii unora dintre celule; ulterior scade şi densitatea celulară, deoarece intervin procese de autoliză, produse de enzime proteolitice endogene;

-

faza de declin şi moarte celulară este faza în care se intensifică reducerea numărului de celule viabile şi fenomenele de autoliză bacteriană; este foarte variabilă ca durată, de la 24 – 48 ore până la săptămâni şi chiar luni de zile; celulele bacteriene au o morfologie alterată, apar forme filamentoase, spiralate, ramificate, necaracteristice speciei; celulele au afinitate pentru coloranţii acizi, conţin substanţe de rezervă, se întâlnesc mulţi spori.

Viteza de multiplicare a celulelor bacteriene se măsoară prin durata unei generaţii şi se numeşte timp de generaţie. El este intervalul de timp scurs între două diviziuni succesive. În general, acest timp este mai mic la bacterii decât la macroorganisme, existând bacterii care se multiplică foarte rapid (Bacillus subtilis – 9-10 minute), altele mai puţin rapid (Lactobacillus – 100 minute), iar altele foarte lent (Mycobacterium tuberculosis – 1600 minute). Deşi au un potenţial imens de multiplicare, bacteriile nu şi-l realizează în practică, întrucât intervin factori de mediu nefavorabili, ce limitează acumularea unui număr imens de celule bacteriene. De exemplu, în condiţii aerobe obişnuite de cultură în laborator, numărul maxim de celule care se acumulează este de 200 milioane de celule/ml mediu. În condiţii de agitare, care favorizează aerarea şi contactul celulelor cu nutrienţii, se poate atinge un număr de 5 miliarde celule/ml. Un coc cu o greutate de 5x10-13 g, cu un timp de generaţie de 20 minute, poate determina după 132 de diviziuni formarea unei mase celulare cu greutatea de 6x1027g. Multiplicarea prin înmugurire Înmugurirea reprezintă o modalitate particulară de reproducere, care constă în separarea a două celule asimetrice, ca rezultat al formării de către celula mamă a unei protuberanţe locale mai mici decât ea. Aceasta creează un spaţiu nou, în care vor migra constituenţii noii celule sau în care constituenţii vor fi sintetizaţi de novo (din nou).

Bacteriile care înmuguresc prezintă o mare diversitate taxonomică şi sunt mai puţin cunoscute. Ele pot fi fototrofe sau chemotrofe; cele mai studiate aparţin genurilor de bacterii prostecate: Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas etc., dar aparţin şi genurilor de bacterii care nu sunt prostecate: Nitrobacter, Pasteuria etc. Formarea unei celule noi de către o bacterie poate fi cu adevărat un proces de înmugurire dacă se îndeplinesc 3 criterii fundamentale: 1) criteriul morfologic: celula nouă trebuie să fie mult mai mică decât celula mamă şi să rămână temporar ca atare (mică) şi după separare; 2) criteriul de dezvoltare: înmugurirea reprezintă un caz particular de creştere a peretelui celulei parentale prin slăbirea lui localizată, urmată de o creştere numai într-o zonă foarte limitată. În cazul înmuguririi, învelişurile celulare sunt integral sintetizate de novo, astfel că nici un constituent parental din peretele celular nu e încorporat în mugure. Diferenţa dintre diviziunea directă (a) şi înmugurire (b): celula mamă a) → → → →→ Materialul peretelui celular e distribuit egal celor două celule fiice. b) → → 3) criteriul funcţional: mugurele trebuie să reprezinte singurul mod de formare a unei celule noi la specia respectivă. Apariţia mugurilor poate fi localizată unipolar sau bipolar. 3) Multiplicarea prin fragmentare E o formă de reproducere vegetativă, observată la multe actinomicete, cum sunt cele din genul Nocardia, Actinomyces. În prima parte a ciclului celular are loc o creştere activă a masei celulare, sub forma unui miceliu, fără creşterea numărului de celule viabile. Ulterior, în faza staţionară a creşterii, în care masa celulară rămâne constantă, miceliul e supus unei fragmentări multiple, cu formarea unor septuri transversale, obţinându-se structuri cilindrice. Primul sept transversal apare aproape de mijlocul hifei şi progresează secvenţial de-a lungul filamentului spre extremităţi. Urmează apoi eliberarea unor celule cilindrice, scurte, egale, cu extremităţile tăiate drept şi care vor începe să crească şi să dea naştere unui miceliu. 4) Multiplicarea prin spori Actinomicetele care au un miceliu nesegmentat se reproduc de obicei prin formare de exospori (spori de dispersare, de propagare). Fenomenul a fost mai bine studiat la Streptomyces coelicolor. Sporii sunt de tip asexuat, dispuşi de regulă pe hifele aeriene, în lanţuri de diferite lungimi, sau în vezicule sporale numite sporangi. Unele hife prezintă o teacă externă fibroasă, care le înveleşte începând cu extremitatea liberă, pe toată lungimea lor. Învelişul celular este format din peretele hifei, acoperit de teaca fibroasă. În anumite puncte ale peretelui hifei începe formarea septumului sporal prin depunerea în hifa aeriană a unui disc inelar cu grosime dublă. Prin creşterea acestui disc paralel cu peretele hifei începe formarea peretelui viitorului spor. Sporii se rotunjesc, se separă, se maturează, vezicula sporală se rupe şi eliberează sporii formaţi.

METABOLISMUL BACTERIAN Metabolismul reprezintă totalitatea reacţiilor biochimice prin intermediul cărora microorganismele preiau din mediu energie şi nutrienţi, pe care îi folosesc în activităţile lor fundamentale. Aceşti nutrienţi reprezintă elemente esenţiale pentru viaţa celulei şi se numesc elemente biogene. Substanţele pot fi folosite ca atare sau sub o formă mai mult sau mai puţin complexă. Caracteristic pentru metabolismul bacterian este reglarea lui perfectă, supusă legii economiei şi optimalităţii. Aceste principii asigură desfăşurarea perfect reglată, corelată a activităţii celulare, astfel încât beneficiul pentru celula bacteriană să fie maxim. Substanţele din mediu sunt folosite în 4 scopuri fundamentale: - producerea de energie; - sinteza de constituenţi celulari; - creşterea celulei şi desfăşurarea normală a activităţilor ei fiziologice; - producerea de metaboliţi, unii dintre ei utili pentru om. Metabolismul bacterian se realizează printr-o serie de căi metabolice, reprezentate de secvenţe de reacţii chimice catalizate de enzime. Sunt două direcţii fundamentale de evoluţie a acestor căi: • degradarea substanţelor nutritive preluate din mediu, cu eliberare treptată de energie (deoarece o eliberare bruscă de energie este dăunătoare celulei bacteriene, ducând la distrugerea ei); • folosirea energiei eliberate în procesele de biosinteză a constituenţilor celulari (cale diametral opusă celei dintâi); excesul de energie se acumulează în legăturile macroergice ale moleculelor de ATP, ce reprezintă “acumulatorul universal de energie”. Se cunosc 4 tipuri de căi metabolice: căile catabolice (catabolismul), căile anabolice (anabolismul), căile amfibolice şi căile anaplerotice. a) Căile catabolice reprezintă ansamblul căilor biochimice prin care se realizează degradarea nutrienţilor preluaţi din mediu, cu eliberare de energie. Reacţiile catabolice se desfăşoară în trei faze succesive: 1) macromoleculele nutrienţilor sunt degradate până la subunităţile lor de construcţie (ex. proteinele până la aminoacizi), cu eliberarea aproximativ a 1% din energia nutrienţilor, care se pierde sub formă de căldură; 2) moleculele rezultate în prima fază sunt degradate în continuare, cu formarea unui număr limitat de molecule mai mici, ce reprezintă compuşi intermediari ai căii centrale; numărul acestor compuşi intermediari este diferit în funcţie de bacterie, putând ajunge la maxim 12; în această etapă se eliberează aproximativ 1/3 din energia existentă în compuşii respectivi; 3) cea de a treia fază este diferită în funcţie de natura reacţiilor metabolice; în aerobioză reacţiile evoluează cu metabolizarea completă a compuşilor intermediari până la CO2 şi H2O, cu eliberare masivă de energie, care este apoi înmagazinată în ATP; în anaerobioză reacţiile evoluează după modelul reacţiilor fermentative, caz în care eliberarea de energie este redusă. b) Căile anabolice se desfăşoară în sensul utilizării compuşilor intermediari ai căii centrale în vederea sintezei de constituenţi proprii celulei bacteriene, proces care

evoluează în faze succesive. În cursul proceselor de anabolism se sintetizează macromolecule de depozit, adică polimeri uniformi, formaţi prin legarea unor monomeri în lanţuri de diferite dimensiuni (într-o primă fază monomeri, într-o a doua fază, numită diataxie, subunităţile constituite în prima fază fiind aşezate într-o ordine riguroasă, dictată exact de informaţia genetică din genom). c) Căile amfibolice sunt reprezentate de căile metabolice centrale, care îndeplinesc în acelaşi timp două funcţii: de eliberare de energie şi de furnizare a unor precursori necesari biosintezei. Căile catabolice şi cele anabolice se desfăşoară simultan în celula bacteriană. Caracterul amfibolic este reprezentat de faptul că la anumite nivele energia eliberată este utilizată la biosinteze, iar la alte nivele intermediare se menţine calea catabolică ce duce la degradarea compuşilor intermediari. d) Căile anaplerotice sunt cunoscute sub denumirea de căi auxiliare sau de reaprovizionare, deoarece compuşii intermediari ai căilor centrale sunt în permanenţă îndepărtaţi din celulă, pe de o parte în cursul degradării progresive enzimatice, cu eliberare de energie, în catabolism, iar pe de altă parte prin utilizarea lor în diferite biosinteze ce au loc în celulă. Pentru buna funcţionare a acestor căi metabolice este necesară o reaprovizionare permanentă cu intermediarii respectivi. În urma epuizării materialului de la care s-a pornit, calea metabolică este frecvent reaprovizionată cu diferite substanţe provenite din alte căi metabolice, catalizate enzimatic, ce se desfăşoară simultan în celula bacteriană. Căile metabolice auxiliare asigură astfel completarea deficitului căilor metabolice principale, prin aprovizionarea cu diverşi compuşi şi permit funcţionarea îndelungată a acestora. Particularităţi ale metabolismului bacterian Dacă iniţial se considera greşit că bacteriile, având o structură simplă, au doar un metabolism rudimentar, cercetările moderne au demonstrat caracterul remarcabil de asemănător al căilor centrale ale metabolismului la toate formele de viaţă. Microorganismele îşi realizează activităţile metabolice prin mecanisme similare cu cele implicate în metabolismul organismelor superioare. Natura şi diversitatea nutrienţilor folosiţi în metabolismul bacterian Microorganismele prezintă o capacitate unică de degradare a unor substanţe complexe din mediu şi de a sintetiza anumiţi metaboliţi, unii folositori omului. Luate ca grup, bacteriile sunt cele mai omnivore organisme din natură. Îşi pot realiza metabolismul folosind numeroase şi diverse surse de substanţe nutritive, începând cu azotul molecular şi sulful, până la cele mai complexe substanţe organice (se pot dezvolta pe diferite soluţii de acizi: oxalic, formic, sulfuric, pe substraturi cu fenoli, proteine, ţiţei; pot degrada asfaltul, masele plastice, cauciucul, lemnul, parafinele, chiar şi unele substanţe antibiotice). Aceste particularităţi explică faptul că, deşi în natură au fost depuse numeroase produse de uzură şi de excreţie, cadavre, reziduuri, acestea nu s-au acumulat, pentru că au fost descompuse de către microorganisme şi reintroduse în circuitul elementelor biogene. În acelaşi timp, există unele microorganisme care pot utiliza doar un număr limitat de nutrienţi (microorganismele celulozolitice au nevoie absolută de prezenţa celulozei în mediul nutritiv; nitratbacteriile au nevoie de nitriţi în mediu, iar unele bacterii patogene au nevoie de sânge în mediul de cultură). Plasticitatea metabolismului microorganismelor

Bacteriile au capacitatea de a folosi alternativ diferite surse de azot şi de carbon, în funcţie de condiţiile de mediu. Se adaptează, deci, la tipul şi cantitatea de nutrienţi existenţi în mediu. S-a demonstrat că multe bacterii considerate ca autotrofe (capabile să folosească substanţele anorganice din mediu) pot utiliza uneori substanţele organice cu complexitate diferită din mediu. Unele microorganisme heterotrofe (organotrofe) au capacitatea de a se adapta la utilizarea compuşilor anorganici din mediu, atunci când substanţele organice lipsesc. Diversitatea mecanismelor enzimatice şi a produşilor de metabolism Diversitatea căilor metabolice se manifestă în metabolismul bacterian prin existenţa unor căi alternative care pot fi folosite pentru un anumit compus. În funcţie de condiţiile de mediu şi cele intracelulare, celula bacteriană poate opta pentru una dintre căile prin care un anumit substrat poate fi degradat (de exemplu glucoza poate fi degradată prin trei căi metabolice diferite). Intensitatea deosebită a metabolismului bacterian Metabolismul bacterian se caracterizează printr-o intensitate excepţională în raport cu activităţile omoloage de la organismele superioare. Astfel, activitatea respiratorie a unui gram de bacterii aerobe (greutate uscată) este de câteva sute de ori mai intensă decât cea a omului. Potenţialul metabolic al microorganismelor din cei 25 cm superficiali ai solului de pe o suprafaţă de un hectar este echivalent cu acela pentru câteva zeci de mii de oameni. Un gram de bacterii lactice hidrolizează circa 15000 g lactoză/oră. Pentru a atinge un asemenea nivel de activitate metabolică, organismul uman ar avea nevoie de mai multe mii de tone de alimente pe oră. Metabolismul bacterian deosebit de intens este corelat cu o multiplicare rapidă a microorganismelor, cu producerea unei mari cantităţi de biomasă. În acest sens, un exemplu dat de UNESCO se referă la această capacitate extraordinară de sinteză a bacteriilor: la bovine un organism de 500 kg fabrică în condiţii normale în 24 ore aproximativ 1/2 kg de proteine; în condiţii de mediu favorabile, 500 kg de masă bacteriană sintetizează în 24 ore 5–50 tone de proteine. Aceste date sunt numai teoretice, pentru că în diferite condiţii concrete de mediu se împiedică realizarea acestui uriaş potenţial de replicare. Metabolismul bacterian deosebit de intens, unic în lumea vie, este urmarea faptului că celula bacteriană prezintă o suprafaţă foarte mare raportată la volumul şi greutatea ei, favorizând schimbul intens de substanţe între celule şi mediu. După Luria şi Stanier, ar exista o regulă conform căreia în natură viteza metabolismului ar fi invers proporţională cu mărimea organismului.

Transportul substanţelor prin membrana celulei bacteriene Membrana plasmatică reprezintă o barieră care asigură transportul selectiv al substanţelor de la exteriorul la interiorul celulei bacteriene şi invers. Este denumită şi “barieră osmotică de permeabilitate”. Principalele mecanisme de transport prin membrana plasmatică bacteriană sunt: 1) difuzia pasivă este un tip de transport nespecific, reprezintă o trecere lentă a substanţelor de la exteriorul la interiorul celulei bacteriene şi invers, fără consum de energie. Trecerea este determinată de concentraţie, se realizează de la o concentraţie mare la o concentraţie mică; difuzia se opreşte când concentraţia se egalizează. Prin difuzie pasivă sunt transportate: apa, O2, CO2, acizii graşi, substanţele liposolubile. 2) mecanisme de transport cu participarea unui transportor specific (carrier) – transportorul specific este situat în membrana plasmatică şi este o proteină cu greutate moleculară între 30000 – 50000 daltoni, cu rolul de a fixa o anumită substanţă şi de a o transporta, traversând membrana plasmatică. Sunt 3 tipuri de astfel de mecanisme: a) difuzia facilitată se desfăşoară fără consum de energie şi este determinată de gradientul de concentraţie, dar se realizează cu ajutorul unei proteine transportor (carrier). Trecerea se realizează de la o concentraţie mare la o concentraţie mică, până se produce un echilibru al concentraţiilor de o parte şi de cealaltă a membranei. Proteina transportor are rolul de a mări viteza de difuzie a substanţei în raport cu difuzia pasivă. b) transportul activ este un proces specific, care se realizează cu consum de energie. Se poate realiza împotriva gradientului de concentraţie, de la o concentraţie mică la o concentraţie mare. Astfel se produce o acumulare de substanţă în celula bacteriană, care poate depăşi de câteva mii de ori cantitatea din mediul extern. Proteina transportor prezintă un situs de legare specific pentru substanţele respective. c) translocarea în grup se realizează cu consum de energie şi cu participarea sistemului enzimatic fosfo-transferazic; substanţa transportată suferă o modificare chimică la trecerea prin membrană, astfel că substanţa din interiorul celulei diferă de cea iniţială ce exista în mediu; prin acest mecanism se pot transporta: adenina, hexozele (glucoză, fructoză). Tipuri de respiraţie microbiană După comportarea faţă de oxigenul atmosferic, se pot descrie 4 tipuri de microorganisme: • microorganisme strict aerobe, care au ca tip de respiraţie celulară respiraţia aerobă; pentru a se dezvolta, aceste microorganisme au nevoie de oxigen molecular, folosindu-l ca acceptor final de electroni; Ex.: Bacillus subtilis, Azotobacter sp., Mycobacterium tuberculosis, microalgele, majoritatea protozoarelor

•

•

•

microorganisme strict anaerobe, care nu se pot dezvolta în prezenţa oxigenului; ele au nevoie de condiţii de anaerobioză şi ca tip de respiraţie celulară au fermentaţia sau respiraţia anaerobă; Ex.: Clostridium tetani, Lactobacillus sp., Desulfovibrio sp. microorganisme anaerobe, facultativ aerobe, care au în general un metabolism de tip anaerob, dar pot trăi şi în prezenţa oxigenului molecular, caz în care prezintă un metabolism aerob; tipul de respiraţie celulară este diferit, în funcţie de prezenţa sau absenţa oxigenului (respiraţie anaerobă sau aerobă); Ex.: Escherichia coli, Streptoccoccus sp., Staphylococcus sp., Saccharomyces cerevisiae microorganisme microaerofile, care au nevoie de o cantitate de oxigen mai mică decât în atmosferă pentru a se dezvolta, concentraţiile mari de oxigen fiind nocive pentru ele; tipul de respiraţie celulară este o respiraţie cu tendinţă spre fermentaţie. Ex.: Leptospira sp., Spirochaeta sp., Thiospirillum sp.

Tipuri de nutriţie la microorganisme Criteriile după care se poate caracteriza nutriţia microorganismelor sunt:  natura sursei de carbon şi azot şi capacitatea de sinteză a metaboliţilor esenţiali, în funcţie de care microorganismele pot avea nutriţie: * autotrofă * heterotrofă  sursa de energie, în funcţie de care microorganismele pot avea nutriţie: * fototrofă * chemotrofă. Autotrofia este capacitatea de sinteză a tuturor metaboliţilor esenţiali pornind de la substanţe anorganice simple ca sursă de carbon şi azot (CO2, NH3, NO3-, NO2-). Heterotrofia este capacitatea de a sintetiza metaboliţi esenţiali pornind de la substanţe organice preformate. Bacteriile heterotrofe se pot dezvolta doar în prezenţa unor substanţe organice, care joacă rol de sursă de carbon şi azot. Fototrofia este capacitatea de a sintetiza metaboliţii esenţiali cu ajutorul energiei luminoase; este caracteristică microorganismelor fotosintetizante (fototrofe), capabile de fotosinteză. După natura donatorilor de protoni sau electroni, microorganismele fototrofe se împart în: - microorganisme fotolitotrofe – care folosesc ca donor de protoni sau electroni substanţe anorganice oxidabile (H2O, H2S, S, H2); se numesc şi fotoautotrofe; - microorganisme fotoorganotrofe – care folosesc ca donor de protoni sau electroni substanţe organice oxidabile; se numesc şi fotoheterotrofe; Chemotrofia este capacitatea de a sintetiza metaboliţii esenţiali cu ajutorul energiei chimice înmagazinată în legăturile chimice ale substanţelor. Sursa de energie este reprezentată în acest caz de energia chimică eliberată din reacţiile de oxido-reducere. Microorganismele chemotrofe se numesc şi chemosintetizante, sunt capabile de chemosinteză. După natura donatorilor de protoni sau electroni, microorganismele chemotrofe se împart în: - microorganisme chemolitotrofe – care folosesc ca donor de protoni sau electroni substanţe anorganice oxidabile; se numesc şi chemoautotrofe; - microorganisme chemoorganotrofe – care folosesc ca donor de protoni sau electroni substanţe organice oxidabile; se numesc şi chemoheterotrofe.

Pe baza acestor clasificări, nutriţia microorganismelor poate fi: Nr. cr.

Tip de nutriţie

Sursă de energie

1

Fotolitoautotrofă

Radiaţia luminoasă

2

Fotoorganoheterotrofă Chemolitoautotrofă

Radiaţia luminoasă Oxidarea substanţelor anorganice Oxidarea substanţelor organice

3 4

Chemoorganoheterotrofă

Sursă de carbon şi azot Subst. anorg. (CO2,NH3) Substanţe organice Subst. anorg. (CO2,NH3) Substanţe organice

Donator de protoni sau electroni Substanţe anorganice (H2O,H2S,S,H2) Substanţe organice Substanţe anorganice (NH3,H2S,S,H2) Substanţe organice

Exemple Cianobacterii Bacterii sulfuroase roşii şi verzi Bacterii sulfuroase roşii Bacterii nitrificatoare Bacterii sulfoxidante Hidrogenbacterii Majoritatea microorganismelor (bacterii, drojdii, mucegaiuri, protozoare)

CURS 5 VIRUSURILE Virusurile reprezintă o categorie specifică de agenţi infecţioşi, fundamental diferiţi, structural şi funcţional, de oricare dintre organismele cunoscute. Din cauza dificultăţilor de observare, cultivare şi studiere, foarte multă vreme au fost analizate prin prisma unor caractere evidente: filtrabilitatea, dimensiunile foarte mici, parazitismul obligatoriu intracelular, inactivarea prin căldură. Aceste caractere s-au dovedit a nu fi definitorii în raport cu alţi agenţi infecţioşi, fapt care explică încadrarea greşită şi absurdă a bacteriilor mici filtrabile, parazite obligatorii intracelular, ca intermediari între bacteriile adevărate şi virusuri. Primele date referitoare la natura şi caracterele specifice ale unor boli virale sunt foarte vechi, fiind consemnate în China antică (anul 2500 î.e.n., despre variola umană) sau în lucrările lui Aristotel (despre turbare). Anul 1796 marchează momentul primelor vaccinări antivariolice efectuate de către medicul englez Eduard Jenner în Anglia. Metoda vaccinării copiilor cu puroi recoltat din leziunile bovinelor s-a extins în Asia, unde variola producea epidemii foarte grave. Ulterior această metodă a fost abandonată în favoarea scarificării, deoarece se puteau transmite concomitent şi alţi agenţi patogeni, care determinau boli grave la om. În perioada 1881 -1885 Louis Pasteur a pus la punct un vaccin antirabic eficient, care, administrat la timp la persoanele muşcate de animale turbate, împiedică apariţia bolii, care este letală. În 1886 Mayer a demonstrat transmisibilitatea mozaicului tutunului prin frecarea plantelor sănătoase cu plante bolnave şi inactivarea principiului infecţios prin tratament cu alcool sau prin încălzire la 80°C. El a considerat că boala este produsă de un "ferment organizat". În 1892 Ivanovski confirmă infectivitatea sucului acelular extras din plantele de tutun bolnave, demonstrând multiplicarea agentului infecţios în plantele sănătoase, care ulterior au manifestat simptomele bolii. El consideră agentul patogen ca fiind un agent viu, ultrafiltrabil, de tipul bacteriilor foarte mici. În 1898 Beijerink confirmă multiplicarea şi transmisibilitatea în serie a agentului patogen al mozaicului tutunului, dar şi rezistenţa sa îndelungată în frunzele uscate de tutun şi difuzibilitatea lui în agar. El ajunge la concluzia că agentul patogen nu este nici microorganism, nici toxină, ci o substanţă moleculară specială solubilă, capabilă să se multiplice în celulele gazdă dacă este încorporată în citoplasma acestora. El îl numeşte "contagium vivum fluidum". Toate aceste date, reconsiderate astăzi, au dus la concluzia că Beijerink este descoperitorul virusurilor, deoarece el este primul care a intuit natura lor deosebită de a celorlalţi agenţi patogeni. Recunoaşterea ştiinţifică a virusurilor ca entităţi particulare se datorează lui Andre Lwoff, care în 1953 şi în 1981 a încercat să stabilească ansamblul caracterelor originale ale lumii virusurilor, descriind deosebirea dintre virus şi non-virus. Concluzia a fost că virusurile aparţin unui grup de agenţi infecţioşi ce posedă în comun un număr important de trăsături specifice, marcând diferenţe absolute, care sunt absente la toate entităţile aparţinând grupului Procariota.

Nr. crt. 1 2

3

4

DEFINIREA CONCEPTULUI DE VIRUS Caracterele discriminatorii ale virusurilor şi bacteriilor Caracterul VIRUSURI PROCARIOTE Tipul de organizare

organizare acelulară

Unitatea de virionul structură şi funcţie Stări posibile de virionul - particula virală matură, existenţă completă, infecţioasă, formă în care virusul se găseşte la sfârşitul procesului de replicare în celula gazdă şi este eliberat în mediul exterior virusul vegetativ - genomul viral aflat liber în celula gazdă, pregătit de replicare provirusul - genomul viral integrat în genomul celulei gazdă virionul cuprinde: Structura - constituenţi esenţiali internă - genomul viral - capsida virală - constituenţi accesorii: peplosul Genomul şi capsida alcătuiesc împreună nucleocapsida, caracteristică virusurilor nude, neacoperite. Genomul e reprezentat de o moleculă de acid nucleic, fie ADN, fie ARN, cu o greutate moleculară diferită de la un virus la altul. Molecula de acid nucleic este monocatenară sau bicatenară, lineară sau circulară, dispusă helical, împachetată pentru a forma o structură compactă. Genomul viral poartă informaţia genetică necesară pentru propria replicare şi pentru devierea metabolismului celulei gazdă în sensul sintezei de constituenţi virali. Acidul nucleic viral determină infecţiozitatea virusurilor. Capsida este învelişul proteic ce acoperă şi protejează genomul viral. Este alcătuită din unităţi morfologice de natură proteică, numite capsomere. Peplosul este un înveliş extern prezent la virusurile acoperite, cu nivel complex de organizare, cu rolul de a păstra stabilitatea nucleocapsidei şi de a favoriza fixarea virionului pe celula gazdă. E alcătuit dintr-un dublu strat lipidic, în care sunt implantate formaţiuni de natură glicoproteică, numite spicule. Spiculele pot fi prismatice alungite (de exemplu hemaglutininele) sau în formă de ciupercă (de exemplu neuraminidazele).

organizare celulară de tip procariot celula bacteriană

celula bacteriană vegetativă, capabilă de creştere şi replicare sporul bacterian, formă facultativă de rezistenţă celula bacteriană cuprinde: - perete celular - membrană - citoplasmă - nucleoid - ribozomi - vacuole - incluzii - spori - capsulă - flageli

5

Simetria la nivel molecular

6

Compoziţia chimică - acizii nucleici - fie ADN (la dezoxiribovirusuri) - fie ARN (la ribovirusuri) - proteinele

- glucidele şi lipidele

- echipamentul enzimatic

simetrie constantă a aranjării moleculelor proteice în capsidă: - helicală - icosaedrică - binară (mixtă)

- virusurile mici au în structura capsidei un număr fix de molecule proteice de acelaşi fel; virusurile complexe au în capsidă mai multe tipuri diferite de molecule proteice, dar numărul este limitat şi fix; rolul proteinelor virale este structural şi în mod excepţional enzimatic; O consecinţă a numărului fix de proteine este dispunerea lor simetrică în capsidă, într-un mod unic. - virusurile nu au glucide şi lipide, cu excepţia unor proteine glicolizate; uneori sunt prezente în învelişul extern, provenind de la celula gazdă în care s-au replicat, deoarece peplosul nu este codificat de genomul viral - virusurile sunt lipsite de echipament enzimatic, neputând să îşi sintetizeze constituenţii, să producă energie şi să utilizeze resursele mediului; nu se pot cultiva pe medii acelulare; Uneori virusurile prezintă enzime cu rol în replicarea genomului viral, în favorizarea pătrunderii virusului în celulă sau a eliberării din celula gazdă.

lipseşte o simetrie moleculară

- ADN în genomul bacterian - ARN în citoplasmă (ribozomal, de transfer, mesager) - bacteriile au un potenţial de aprox. 3-4 mii de proteine diferite, cu rol structural sau enzimatic. Numărul lor este variabil, randamentul sintezei de proteine fiind inegal, funcţie de importanţa proteinei respective pentru celula bacteriană. - glucidele şi lipidele sunt prezente în mod constant în structura bacteriilor

- bacteriile au în mod constant un echipament enzimatic cu grad diferit de complexitate, în funcţie de nutriţia bacteriilor; este mai complex la bacteriile autotrofe, se simplifică la cele heterotrofe şi la bacteriile parazite obligatoriu intracelular

7

Proprietăţile biologice

Virusurile nu au capacitatea de a produce energie cu potenţial înalt (ATP), nu fac sinteza independentă a constituenţilor proprii, nu au capacitatea de a creşte şi de a se divide. Se reproduc obligatoriu în celula gazdă vie, pornind exclusiv de la genomul viral.

8

Virusurile utilizează sistemele enzimatice, ARN de transfer şi ribozomii gazdei.

9

Utilizarea sistemelor structurale şi biochimice ale gazdei în cursul parazitismului intracelular Parazitismul absolut

10

Multiplicarea virusurilor

Pentru virusuri este constant şi obligatoriu. În celulele infectate cu virusuri, metabolismul celular suferă modificări esenţiale, fiind deviat în sensul sintezei constituenţilor virali, pornind de la informaţia genetică străină, adusă de genomul viral în celulă. Procesele de sinteză celulară continuă cel puţin un timp, deoarece metaboliţii esenţiali celulari sunt necesari în sinteza de constituenţi virali. Competiţia dintre virus şi celula gazdă are loc la nivelul diataxiei (producerea de constituenţi): diataxia celulară este blocată sau diminuată sub acţiunea unor constituenţi proteici virali din capsidă sau peplos, iar diataxia virală este activă. Multiplicarea virusurilor se realizează prin replicare virală (replicarea informaţiei genetice virale, sinteza componentelor virale, asamblarea particulelor).

Bacteriile au un metabolism energetic propriu, chiar şi când sunt parazite intracelular; au capacitatea de a sintetiza proprii constituenţi, de a creşte până la un punct critic urmat de diviziune. Multiplicarea bacteriilor e independentă, pornind de la ansamblul integrat al constituenţilor celulari. Bacteriile nu utilizează sistemele enzimatice ale gazdei, ci pe cele proprii. La bacterii parazitismul nu este absolut.

Bacteriile se multiplică prin diviziune directă, fragmentare, înmugurire, prin spori.

MORFOLOGIA VIRUSURILOR Descrierea morfologică şi dimensiunile unui virus se raportează la virion, particulă virală matură, unitate integrată de structură şi funcţie. Din punct de vedere morfologic se disting mai multe tipuri de virioni: - virioni de formă cilindrică alungită, adică de bastonaş rigid (VMT) sau flexibil (bacteriofagii filamentoşi) - virioni de formă sferică (izodiametrică, de exemplu virusul poliomielitei din Familia Picornaviridae) sau sferoidală (virusurile gripale, adenovirusurile, herpesvirusurile) - virioni de formă paralelipipedică (poxvirusurile) - virioni cu formă de cartuş (virusul rabic, din Familia Rhabdoviridae) - virioni în formă de cireaşă cu coadă sau mormoloc (bacteriofagii T par). Dimensiunile virusurilor sunt submicroscopice. Cele mai mari au dimensiuni apropiate de cele ale bacteriilor foarte mici, 240 - 300 μm, iar cele mai mici au dimensiuni apropiate de cele ale ribozomilor, de 25 - 30 μm. Bacteriofagii cei mai mari ating 200 μm.

MODELUL GENERAL DE STRUCTURĂ VIRALĂ Virionii posedă doi constituenţi esenţiali şi definitorii: genomul şi capsida, care alcătuiesc împreună nucleocapsida virusurilor nude, fără înveliş extern (poliovirusul, reovirusurile, adenovirusurile). Genomul viral este reprezentat de o moleculă de acid nucleic, ADN sau ARN:  ADN, pentru dezoxiribovirusuri (adenovirusurile, poxvirusurile, herpesvirusurile, papovavirusurile);  ARN, pentru ribovirusuri (virusurile gripale, paragripale, virusul rujeolic, virusul rabic, poliovirusul, VMT). Majoritatea virusurilor infecţioase pentru om, animale şi plante sunt ribovirusuri. În virion genomul ribovirusurilor este asociat cu nucleoproteine şi cu proteine de replicare, dar se disociază de nucleopreoteine când ajunge în citoplasma celulei gazdă. Majoritatea ribovirusurilor au ca genom o moleculă de ARN monocatenar de polaritate pozitivă, care funcţionează ca ARNm şi este tradus în proteine fără o transcriere prealabilă sau negativă, care nu este tradus direct, ci este transcris mai întâi în ARNm. Numai reovirusurile au genom ARN dublu catenar. Genomul dezoxiribovirusurilor este complexat cu proteine atât în starea împachetată în virion, cât şi ca genom liber în citoplasma celulei gazdă. La virusurile infecţioase pentru celulele animale informaţia genetică are caracter discontinuu, ca şi a gazdelor lor. Structura genomului este variată: o monocatenară sau dublu catenară o lineară sau circulară o genom segmentat, în aceeaşi capsidă sau capside diferite. Genomul viral dublu catenar poate fi linear sau circular închis, cu diferite grade de supraspiralizare şi de condensare. Unele virusuri au informaţia genetică sub formă de segmente multiple încapsidate într-o capsidă comună sau în capside diferite, caz în care infecţia se poate produce numai când în organismul gazdă pătrund toate capsidele ce poartă informaţia genetică necesară replicării virale. Avantajul genomului segmentat constă în aceea că mesajele genetice mai mici sunt mai uşor replicate şi transmise în celula eucariotă animală sau vegetală, putând fi traduse simultan, facilitând procesul de replicare virală. Segmentarea genomului viral reprezintă un avantaj pentru supravieţuirea virusurilor în natură, fiind o adaptare la celula eucariotă animală sau vegetală. Una dintre particularităţile virusurilor este aceea că fac economie de informaţie genetică. Această economie este necesară datorită dimensiunilor mici ale virusurilor şi se realizează pe mai multe căi: la virusurile mici capsida virală este formată dintr-un singur tip de proteine dispuse simetric, a căror sinteză este asigurată de o genă sau de puţine gene; virusurile pot utiliza unele proteine din celula gazdă pentru efectuarea unor funcţii virale; virusurile cu un genom defectiv (care nu au în structura genomului lor genele necesare pentru codificarea proteinelor din capsidă) utilizează informaţie genetică furnizată de alte virusuri (virusuri helper), asociate cu cele defective, care suplinesc deficienţele virusului principal, determinând o sinteză în exces de capsomere. Unele polipeptide capsidale îndeplinesc în acelaşi timp funcţii structurale şi funcţii de reglare în procesul de replicare virală. Aceeaşi informaţie genică poate fi folosită în mai multe

cadre de citire (citire defazată, care are o altă semnificaţie genică) în procesul de translaţie, cu producerea a două sau mai multe polipeptide sub controlul aceluiaşi determinant genetic. Genomul viral conţine informaţia genetică necesară desfăşurării ciclului de replicare în celula gazdă sensibilă: pentru replicarea genomului, pentru devierea metabolismului celulei gazdă în sensul de constituenţi virali, pentru sinteza proteinelor structurale şi de reglare, pentru asamblarea şi eliberarea din celula gazdă a virionilor nou formaţi. Genomul viral asigură potenţialul de variabilitate a virusurilor şi infecţiozitatea acestora. Capsida virală este un înveliş proteic, cu o structură diferenţiată în funcţie de tipul de virus. Unitatea structurală a capsidei este capsomera, care este alcătuită dintr-un lanţ polipeptidic sau un agregat de catene polipeptidice identice sau diferite. Capsomerele sunt cele mai mici unităţi structurale vizibile la microscopul electronic. În funcţie de dispunerea capsomerelor, virusurile prezintă trei tipuri de simetrie: helicală (helicoidală), icosaedrică, mixtă (binară). La virusurile cu simetrie helicală capsomerele sunt formate dintr-un singur polipeptid (sunt monomere), reprezentând atât unitatea morfologică, cât şi unitatea structurală a capsidei. La virusurile cu simetrie icosaedrică, capsomerele sunt alcătuite din mai multe tipuri de proteine (sunt oligomere), ele reprezentând numai unitatea morfologică a capsidei, alcătuită din mai multe unităţi structurale. Capsomerele pot fi pentoni (conţin 5 subunităţi de structură, sunt pentamere) sau hexoni (conţin 6 unităţi de structură, sunt hexamere). Rolul capsidei virale este acela de a proteja materialul genetic viral de degradarea produsă de nucleazele celulare, de a contribui la fixarea şi pătrunderea virusului în celula gazdă, de a determina spectrul de gazdă a virusului prin specificitatea interacţiunii capsidei virale cu receptorii specifici complementari prezenţi pe suprafaţa celulei gazdă. Capsida virală conţine determinanţi antigenici responsabili de producerea răspunsului imun în organismele infectate. Învelişul extern (peplosul) este derivat din membrana celulară când virusul părăseşte prin înmugurire celula gazdă în care s-a replicat. Este o structură accesorie, caracteristică virusurilor "acoperite". În structura peplosului intră un dublu strat fosfolipidic provenit din membrana celulară, în care sunt implantate proteine proprii celulei gazdă şi proteine specific virale, codificate de genomul viral. Lipidele din învelişul extern sunt diferite, în funcţie de celulele în care s-a replicat virusul. La nivelul peplosului se găsesc formaţiuni de natură glicoproteică, numite spicule, de formă prismatică sau de buton, care sunt codificate de genomul viral. Proteina din componenţa spiculelor este de natură cert virală, glicolizarea fiind efectuată de celula gazdă în timpul parcurgerii drumului intracelular de la locul de sinteză până la suprafaţa celulei de către proteina virală. Semnificaţia biologică a capsidei şi a peplosului Capsida virală este o structură ce protejează genomul viral şi participă la infectarea celulei gazdă. Învelişul extern consolidează funcţiile capsidei, asigurând stabilitatea nucleocapsidei, iar spiculele favorizează faza de adsorbţie a virusurilor pe celula gazdă şi pătrunderea acestora în celulă.

În componenţa virusurilor intră 3 tipuri de proteine: ♦ proteinele capsidale, cu greutate moleculară de 12 - 110 kdal; la cele mai multe virusuri ele sunt identice, la altele sunt diferite; ♦ proteine interne, situate în interiorul nucleocapsidei virale, alcătuind împreună cu acidul nucleic viral corpul central (nucleoidul viral); rolul lor este de a menţine genomul viral în formă condensată; ♦ proteine cu rol enzimatic, prezente la unele virusuri animale; existenţa acestor enzime nu infirmă faptul că virusurile nu au echipament enzimatic de biosinteză, ele având rol în replicarea genomului viral. Exemple:  ARN-polimeraza poxvirusurilor şi a virusului gripal este o transcriptază ce sintetizează ARN pe matriţă de ADN;  ARN-polimerază ARN - dependentă realizează sinteza de ARN pe matriţă de ARN;  neuraminidaza virusului gripal, localizată la nivelul spiculelor din învelişul extern, degradează mucoproteinele şi receptorii celulari de la nivelul căilor respiratorii ale animalelor, favorizând infecţia virală;  reverstranscriptaza este o ADN polimerază ARN - dependentă prezentă la virusurile ARN oncogene (HIV, retrovirusuri). MULTIPLICAREA VIRUSURILOR Multiplicarea virusurilor (replicarea virală) are loc exclusiv în celula gazdă vie, care le furnizează materialul de construcţie (aminoacizi, baze nucleice, polizaharide) şi dispozitivul celular de biosinteză (ribozomi, sisteme generatoare de energie, ARNt). Această comportare corespunde parazitismului absolut pe care virusurile îl exercită asupra celulei gazdă. Virusul invadant introduce în celula gazdă informaţia specifică a genomului său şi deviază metabolismul celulei, pe care îl foloseşte pentru propriile biosinteze. Replicarea virusurilor este rezultatul activităţilor celulei infectate, care urmează programul genetic adus de virus. Replicarea decurge într-o serie de etape succesive: Adsorbţia şi fixarea reversibilă a virusurilor pe celulă este o consecinţă a ciocnirilor întâmplătoare între virusuri şi celulă, proces nespecific, reversibil. Este determinată de atracţia ionică, eficienţa procesului fiind dependentă de numărul de virioni din suspensia virală. Fixarea ireversibilă a virusurilor pe celulă este un proces ireversibil, datorat diferitelor grade de specificitate a fixării virusului pe celula gazdă; este determinat de complementaritatea geometrică şi electrostatică între structurile de pe suprafaţa virusurilor şi receptorii specifici de virus de pe suprafaţa celulelor, care recunosc aceste structuri. Cea mai mare specificitate de fixare există între bacteriofag şi bacterie, cea mai mică între virusul vegetal şi celula vegetală (aceasta nu are receptori pentru virus). Virusurile animale prezintă citotropism pentru anumite tipuri de celule, pe care le infectează.

Pătrunderea virusurilor în celulă se face diferit: virusurile animale pătrund integral prin endocitoză (viropexie) sau fuziune; virusurile vegetale pătrund prind leziunile mecanice ale peretelui celular; bacteriofagii îşi injectează genomul în interiorul celulei bacteriene. Endocitoza este un proces similar pinocitozei. Decapsidarea şi eclipsa reprezintă eliberarea genomului viral de învelişul proteic, pentru ca acesta să se poată replica. Capsomerele sunt dezintegrate şi trec în rezerva celulară, iar genomul viral eliberat de capsidă reprezintă virusul vegetativ. În această fază virusul nu se poate evidenţia la microscopul electronic. Migrarea intracelulară până la locul de replicare se poate face direct (transmembranar) sau indirect prin structuri canaliculare preformate. La virusurile care se replică în nucleu, această fază durează mai mult decât la cele care se replică direct în citoplasmă. Sinteza proteinelor timpurii se realizează pornind de la genomurile virale infectante (iniţiale), sub controlul genelor precoce din genomul viral. Ele sunt proteine de reglare, enzimatice (cu rol în replicarea genomului) şi proteine de matrice (care delimitează matricea în care va avea loc replicarea acidului nucleic viral şi morfogeneza virală). Replicarea genomului viral este o etapă complexă, în funcţie de structura genomului viral. În urma acestei faze rezultă mii de genomuri virale progene. Sinteza proteinelor tardive se realizează pornind de la genomurile progene, nu de la cele parentale; ele sunt proteine structurale, de reglare, de morfogeneză (eşafodaj) şi proteine care facilitează eliberarea virusurilor din celulă. Se sintetizează în număr mare, deoarece vor constitui viitoarele virusuri mature. Morfogeneza virală se realizează prin autoasamblarea componentelor virale sau prin depunerea simetrică a acestora pe suprafaţa unor proteine de morfogeneză. Eliberarea virusurilor din celulă este lentă sau explozivă. Eliberarea explozivă este caracteristică în special celulelor bacteriene infectate cu bacteriofagi şi duce la liza celulelor în momentul eliberării virusurilor progene. Eliberarea prin înmugurire (lentă) este caracteristică virusurilor învelite, celula gazdă fiind menţinută în stare viabilă până se eliberează toţi virionii formaţi. Se pot forma 5 - 6 muguri în acelaşi timp. Învelişul extern viral poartă constituenţi ai membranei celulare, membrana refăcându-se după desprinderea virusurilor cu peplos.

CURS 6 ECOLOGIA MICROORGANISMELOR. MICROORGANISMELE ÎN HABITATELE LOR NATURALE Cele mai multe cunoştinţe referitoare la activitatea microorganismelor în natură au fost deduse din studierea lor în condiţii de laborator. Ulterior au fost efectuate studii în mediile naturale cu metode progresiv perfecţionate. Înţelegerea proceselor realizate de microorganisme în natură implică efectuarea de studii asupra microorganismelor aparţinând unei singure specii (efectul acesteia asupra mediului înconjurător, dar şi impactul mediului asupra lor), dar şi asupra populaţiilor, comunităţilor sau sistemelor de microorganisme (complexul de microorganisme şi asocierea speciilor cu componentele abiotice ale mediului). Solul ca mediu natural pentru microorganisme Solul este considerat ca un complex de substanţe (surse de nutrienţi şi energie pentru unele organisme), descris ca un sistem dinamic cu trei faze: solidă, lichidă şi gazoasă. El este rezultatul dezagregării rocilor sub acţiunea factorilor fizici, chimici şi biologici. Faza solidă a solului, care reprezintă aproximativ 1/2 din volumul acestuia, e alcătuit din: - substanţe minerale: roci vulcanice (granit, bazalt), roci sedimentare (gresie, marnă, şisturi argiloase, calcare), roci metamorfice (şisturi cristaline); - substanţe organice: resturi organice neanimate, provenite din litieră, lemn, rădăcini, organisme şi microorganisme, dar şi fragmente aflate în diferite grade de descompunere. Diferitele substanţe cu rol de nutrienţi se găsesc în stare solubilă, insolubilă sau sunt adsorbite pe diferite substraturi. Faza lichidă e reprezentată de apa din porii solului şi de pe suprafaţa particulelor de sol, care conţine diferite substanţe organice sau minerale dizolvate ori în suspensie (soluţia solului). Faza gazoasă corespunde aerului prezent în porii liberi din sol şi are faţă de aerul atmosferic mai mult CO2 şi mai puţin O2. Factorii de mediu care influenţează numărul, activitatea şi natura microorganismelor din sol sunt: - apa şi umiditatea asigurată de aceasta; solurile foarte uscate şi cele foarte umede limitează dezvoltarea microorganismelor. Bacteriile devin inactive când solul argilos conţine mai puţin de 12% apă. Fungii sunt mai rezistenţi la uscăciune (de aceea unele boli fungice sunt limitate la anumite regiuni); - aerarea nu este uniformă în sol, de aceea solul este o colecţie de microhabitate aerobe şi anaerobe;

-

-

temperatura este variabilă în straturile de la suprafaţa solului, datorită razelor solare, prezentând variaţii diurne şi sezoniere; pH-ul solului este cuprins între 4,8 – 8,5 şi este influenţat de activitatea microorganismelor din sol (de exemplu degradarea litierei poate determina un pH acid); adâncimea solului influenţează densitatea microorganismelor prin variaţia concentraţiei de O2, CO2, a nutrienţilor, a umidităţii. Frecvenţa microorganismelor în sol scade cu adâncimea, cele mai multe se găsesc în stratul de suprafaţă.

Microbiota din sol Solul constituie un habitat favorabil dezvoltării microorganismelor (bacterii, fungi, alge, protozoare), care se găsesc aici în număr mare. Multe dintre microorganismele din sol nu sunt fiziologic active la un moment dat, datorită faptului că substanţele nutritive din sol sunt limitate. Microorganismele din sol intervin în aproape toate reacţiile chimice care au loc la acest nivel, jucând un rol activ în fertilitatea solului, ca rezultat al implicării lor în ciclul nutrienţilor necesari pentru creşterea plantelor. Unele microorganisme din sol sunt responsabile de descompunerea materiei organice ajunse în sol şi în reciclarea nutrienţilor. Fungii din micorize cresc disponibilitatea nutrienţilor minerali pentru plante. Bacteriile fixatoare de azot măresc cantitatea de nutrienţi din sol. Astfel de microorganisme pot fi utilizate ca biofertilizatori. Alte microorganisme sintetizează şi eliberează în sol substanţe de tipul vitaminelor, care îmbunătăţesc sănătatea plantelor şi productivitatea; aceste microorganisme sunt considerate fitostimulatori. Există în sol şi microorganisme dăunătoare pentru plante, pe care le infectează prin rădăcini. Faţă de aceşti agenţi patogeni, microorganismele autohtone (considerate biopesticide) au de obicei acţiune antagonistă, care se manifestă prin competiţia pentru nutrienţi, prin producerea de substanţe inhibitoare ca metaboliţi secundari sau enzime extracelulare, sau prin sinteza de substanţe care stimulează mecanismele de apărare naturală ale plantei şi măresc rezistenţa la patogeni. Microorganismele din sol sunt capabile să supravieţuiască unor condiţii extrem de variabile de temperatură, umiditate, pH, resurse nutritive şi de energie, de concentraţii de sare şi de oxigen. Ele au un rol complex în formarea structurii solului, condiţionat în esenţă de capacitatea lor de a produce polizaharide sau alte materiale aderente, contribuind la în stabilizarea structurii solului. Habitatul microorganismelor este reprezentat de porii solului. Aceştia pot fi pori fini (cu diametrul mai mic de 0,2µm), care reţin apa inaccesibilă plantelor, pori mijlocii (cu un diametru între 0,2 – 10µm), care înmagazinează apa disponibilă organismelor vii sau pori mari (cu diametrul mai mare de 50µm), care au un rol esenţial în aeroreglare. Micropopulaţiile din sol sunt alcătuite din bacterii (eubacterii, actinomicete, cianobacterii), microfungi, alge şi protozoare. Winogradski (1949) a propus împărţirea microorganismelor din sol în două categorii:

-

microorganisme autohtone (permanente, constante, indigene), care sunt numeroase şi caracteristice unui anumit tip de sol. Ele cresc lent, fiind perfect adaptate la viaţa din solul lipsit de procese de fermentaţie sau putrefacţie a materiei organice. Nu prezintă fluctuaţii numerice semnificative şi nu depind de surse exogene de nutrienţi. - microorganisme zimogene (temporare sau de fermentaţie), care au o activitate periodică, intermitentă, cu faze de activitate şi de repaus. Ele nu sunt capabile să degradeze substanţe complexe din sol, dezvoltându-se pe substanţe organice uşor utilizabile, provenite de la exterior. În mod obişnuit sunt puţin numeroase, dezvoltându-se luxuriant dacă se adăugă substanţe organice exogene, după epuizarea cărora numărul lor scade brusc. Cele două categorii de microorganisme nu pot fi însă cert separate. Unii cercetători susţin că microorganismele zimogene provin de la exterior odată cu resturile organice ajunse în sol, în timp ce alţii susţin că ele ar fi microorganisme heterotrofe autohtone, care sunt permanent prezente în sol în stare latentă. Aceştia din urmă consideră că microorganisme alohtone sunt numai cele patogene pentru plante, animale şi om, care ajung în sol odată cu ţesuturile animale sau vegetale infectate şi care nu găsesc aici decât condiţii de supravieţuire temporară, nu de multiplicare. Bacteriile sunt cele mai mici, mai numeroase şi mai diverse microorganisme din sol (ca formă, modalitate de nutriţie, condiţii de supravieţuire). Predomină bacteriile Gram negative. Bacteriile prezintă un pleomorfism accentuat faţă de morfologia descrisă drept clasică. Valorile medii determinate prin diverse metode ar fi de 10 6–109 celule/g sol uscat prin tehnica de cultivare a celulelor viabile, ajungând până la 1010 celule prin determinarea numărului total de celule (vii şi moarte). De cele mai multe ori, bacteriile se găsesc sub formă de microcolonii pe diferite resturi vegetale, adsorbite pe argile şi pe humus. Tehnicile de apreciere a numărului de bacterii din sol prin cultivare în laborator reflectă în general numai 1 – 10% din situaţia reală, deoarece nici un mediu de cultură nu poate satisface enorma diversitate a exigenţelor lor nutriţionale (Mihăescu, 2000). În sol se găsesc bacterii implicate în circulaţia carbonului, azotului (Nitrosomonas, Nitrobacter, Azotobacter, Rhizobium), fosforului (Bacillus megaterium), sulfului (Thiobacillus thiooxidans, Desulfovibrio), fierului (Gallionella, Siderocapsa), bacterii implicate în formarea şi degradarea humusului, în solubilizarea compuşilor organici şi anorganici, inaccesibili plantelor. La acestea se adaugă microorganisme heterotrofe, relativ constante în toate solurile: Acinetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Cellulomonas, Chromobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Sarcina, Staphylococcus, Streptococcus, Xanthomonas. Bacteriile din sol participă la procesele de mineralizare, esenţiale pentru nutriţia plantelor şi asigurarea fertilităţii solului. Prin polizaharidele extracelulare participă la agregarea particulelor de sol şi la formarea humusului.

Actinomicetele sunt în număr de 105 – 108 celule/g sol şi sunt prezente în sol de regulă sub formă de spori, fiind mai numeroase în straturile de la suprafaţa solului. Sunt filamentoase, nu se dezvoltă dacă pH-ul scade sub 5,0; preferă solurile bogate în substanţe organice. Actinomicetele se caracterizează printr-o rezistenţă deosebită la uscăciune. Se dezvoltă lent, heterotrof, utilizând surse de carbon simple sau complexe (glucide, acizi organici, polizaharide, hidrocarburi alifatice, aminoacizii, peptonele). Degradează celuloza (Streptomyces violaceus, Streptomyces cellulosae), lignina, chitina, parafinele, fenolii. Cele mai frecvente specii aparţin genurilor: Actinomyces, Actinoplanes, Nocardia, Streptomyces. Actinomicetele au rol în mineralizarea compuşilor rezistenţi la acţiunea bacteriilor şi fungilor (chitina), contribuie la formarea humusului şi produc o gamă largă de substanţe antibiotice (streptomicină, kanamicină, micostatină), contribuind într-o mare măsură la echilibrul microbian al solului. Unele dintre ele sunt fitopatogene. Cianobacteriile se dezvoltă în stratul superior, iluminat al solului. Se pot dezvolta şi la întuneric, chemoorganotrof, transformând compuşi organici simpli, esenţiali pentru fertilitatea solului. Dintre cianobacterii, mai frecvent întâlnite în sol sunt cele din genurile: Anabaena, Calothrix, Chrococcus, Nodularia, Nostoc, Oscillatoria, Phormidium, Plectonema, Scytonema. Fungii reprezintă o parte importantă din biomasa microbiană din sol, datorită creşterii hifale, dar numărul lor este mai mic decât cel al bacteriilor. Se apreciază că numărul unităţilor fungice variază între 20.000 şi 1.000.000/g de sol. După unii autori, fungii din sol aparţin la peste 600 de specii, din clasele Phycomycetes, Ascomycetes, Fungi Imperfecti; foarte frecvenţi sunt cei din genurile: Mucor, Rhizopus, Pythium, Chaetomium, Morchella, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Penicillium. Ciupercile sunt microorganisme cu metabolism predominant aerob, adaptate să trăiască pe substraturi cu un conţinut relativ mare de substanţă bogată în energie şi conţinut redus de azot mineral. Sunt microorganisme libere sau asociate cu rădăcinile plantelor. Degradează o gamă largă de substanţe organice (proteine, celuloză, lignină), printr-un proces mai lent decât cel bacterian, desfăşurat în mai multe etape. Când nutrienţii lipsesc, trec în stare de latenţă. Preferă mediile neutre sau acide. Unele ciuperci sintetizează antibiotice active asupra bacteriilor, ciupercilor, chiar şi substanţe toxice sau cancerigene. Alte ciuperci sunt patogene pentru plante. Algele sunt abundente în habitatele umede şi iluminate de la suprafaţa solului şi până la adâncimea de câţiva centimetri. Activitatea lor e puţin semnificativă pentru transformările biochimice din sol. Algele verzi sunt mai frecvente în solurile acide (Chlorella, Chlamydomonas, Pleurococcus, Ulothrix). Unele specii sunt specifice pentru sol (de exemplu Chlorococcus humicola). Dezvoltarea intensă a algelor pe suprafaţa solului umed îl îmbogăţeşte în materie organică rezultată prin fotosinteză. Protozoarele din microbiota permanentă sunt prezente mai ales la suprafaţa solului umed şi în stratul superficial (până la 15 cm). Numărul lor variază între 10.000 – 3.000.000/g sol, dar ca biomasă sunt mai importante decât bacteriile. Pot prezenta fluctuaţii mari de la o zi la alta, în funcţie de temperatură, umiditate, disponibilitatea nutrienţilor. Unele protozoare utilizează compuşi organici solubili, altele au nutriţie de tip animal, ingerând materie organică complexă (bacterii, alge sau chiar protozoare). Cele mai răspândite protozoare din sol fac parte din clasa Sarcodina (Acanthamoeba, Amoeba, Nuclearia), clasa Flagellata (fitomastigofore şi zoomastigofore) şi din clasa Ciliata (Balantidium, Colpidium, Oxytricha, Vorticella). Protozoarele au rol în menţinerea echilibrului biologic al solului, corelat cu capacitatea lor de a ingera şi distruge o serie de bacterii.

Zona de interacţiune între rădăcinile plantelor şi sol este reprezentată de rizosferă. Rizosfera este definită cu ambiguitate, drept regiunea din sol care conţine rădăcinile unei plante şi microorganismele care le însoţesc. Rizosfera se poate extinde cu 2 cm de la suprafaţa rădăcinii în teritoriul bogat în nutrienţi (aminoacizi, glucide, vitamine) pentru care competiţionează microorganismele permanente din sol. Limitele rizosferei depind de cantitatea de substanţe exudate din rădăcini, de proprietăţile fizice şi chimice ale solului, care influenţează numărul şi natura microorganismelor. Rizosfera este o regiune periradiculară care conţine un gradient de microorganisme şi de activităţi mai importante în solul adiacent sistemului radicular, diminuând progresiv pe măsură ce distanţa faţă de acesta creşte. În rizosferă are loc o intensă activitate microbiană, care influenţează creşterea plantelor. Frecvent bacteriile de pe rădăcinile plantelor sunt asociate cu hifele fungilor. Rădăcinile plantelor eliberează un exudat cu o compoziţie complexă, cu efect stimulator, descris sub denumirea de efect de rizosferă. Cele mai frecvente substanţe din exudat sunt glucidele (glucoză, fructoză, xiloză, maltoză, rafinoză, arabinoză, zaharoză), aminoacizii (alanină, acid aspartic, glicocol, leucină, valină, serină, fenilalanină, cisteină, metionină, lizină, triptofan, treonină), acizii organici (acetic, propionic, butiric, oxalic, citric, tartric, fumaric, glicolic, malic, succinic), vitaminele (biotină, tiamină, niacină, acid pantotenic, piridoxină, mezoinositol), factorii de creştere (auxine). Prezenţa microorganismelor stimulează producerea de exudate. Rizosfera stimulează multiplicarea bacteriilor şi fungilor. Bacteriile din rizosferă sunt reprezentate predominant de bacili Gram negativi şi de un număr mic de coci, bacili şi bacterii pleomorfe Gram pozitive. Numărul bacteriilor din rizosferă este estimat la 5x106 – 1x109 celule/g sol. Microorganismele exercită asupra plantelor numeroase efecte, unele benefice, altele negative. Diferitele grupe de microorganisme din sol produc variate procese biochimice, care au o influenţă directă asupra productivităţii şi dezvoltării plantelor. Microorganismele facilitează absorbţia nutrienţilor din sol, mai ales atunci când aceştia sunt factori limitanţi pentru creştere. Desfăşoară permanent o acţiune de reciclare şi solubilizare a nutrienţilor minerali. În ceea ce priveşte activitatea biochimică a bacteriilor din sol, pot fi descrise următoarele procese biochimice: - descompunerea aerobă şi anaerobă a celulozei, de către bacterii celulozolitice; - descompunerea aerobă şi anaerobă a substanţelor proteice şi a altor compuşi organici azotoşi este realizată de bacterii şi ciuperci din sol; se realizează de către bacteriile nitrificatoare (nitribacterii şi nitratbacterii); - reducerea azotaţilor la azot molecular este realizată de către bacterii denitrificatoare şi are un efect negativ asupra plantelor, deoarece azotul asimilabil se transformă în azot atmosferic inaccesibil plantelor; pentru evitarea acestui proces solul trebuie bine lucrat; - fixarea azotului atmosferic este produsă de bacteriile fixatoare de azot,care folosesc drept sursă de carbon substanţe organice fără azot, fixând azotul din atmosferă şi utilizându-l pentru sinteza diferitelor componente celulare. O parte din azotul fixat este eliberat în mediul ambiant, iar o parte este mineralizată, după moartea bacteriilor, de către bacteriile de putrefacţie şi

trece într-o formă accesibilă plantelor superioare. Rolul bacteriilor fixatoare de azot în bilanţul compuşilor azotoşi este deosebit de mare. Bacteriile fixatoare de azot pot fi bacterii libere (Azotobacter, Clostridium) sau simbiotice (Rhizobium). - formarea şi descompunerea substanţelor humice din sol se realizează în urma activităţii vitale a diferitelor microorganisme din sol (bacterii, actinomicete, ciuperci), care determină nu numai structura solului, ci şi rezervele humice din sol. - transformările compuşilor sulfului şi fosforului sunt realizate în general de bacterii, care descompun proteinele eliberând sulf sub formă de hidrogen sulfurat şi fosfor sub formă de acid fosforic. Aceşti compuşi pot fi oxidaţi de sulfobacterii şi de tiobacterii, transformând hidrogenul sulfurat toxic în sulfaţi accesibili plantelor. - oxidarea hidrocarburilor se realizează sub acţiunea microorganismelor până la CO2 şi apă; - metabolizarea polizaharidelor se realizează sub acţiunea a numeroase enzime; bacteriile secretă la exterior enzime care scindează polizaharidele în molecule mai mici, metabolizate apoi intracelular (amidonul sub acţiunea amilazelor extracelulare este transformat în maltoză, iar aceasta, sub acţiunea maltazei, în glucoză). Enzimele capabile să descompună mono şi oligozaharidele sunt frecvente în lumea microbiană, mai rar se întâlnesc enzimele capabile să descompună polizaharidele. De exemplu, amidonul este descompus de către o microbiotă nespecifică, în care bacteriile anaerobe din genul Clostridium sunt foarte active. Interacţiunile nutriţionale cele mai cunoscute dintre plante şi microorganisme sunt cele de tipul simbiozelor (simbioze fixatoare de azot şi micorize). Fungii din micorize exercită un efect benefic asupra plantelor prin stimularea creşterii şi ramificării rădăcinilor, creşterea rezistenţei la infecţii, explorarea unui volum mai mare de sol prin dezvoltarea hifelor. Microorganismele pot exercita efecte negative asupra plantelor atunci când intră în competiţie cu acestea pentru factorii nutritivi minerali sau pentru oxigen, când intensifică activitatea unor agenţi patogeni sau produc substanţe fitotoxice. Rolul microorganismelor este determinat nu atât de greutatea lor, cât de suprafaţa lor activă, care vine în contact cu solul. Noţiuni de microbiologia apelor Mediile acvatice naturale se clasifică în funcţie de natura habitatelor caracteristice şi în funcţie de concentraţia în săruri. În funcţie de natura habitatelor caracteristice, apele se împart în: - ape de suprafaţă (medii adecvate pentru numeroase microorganisme):  ape dulci  stagnante (lentice): bălţi, lacuri, mlaştini  curgătoare (lotice): izvoare, râuri, fluvii  ape marine şi oceane - ape subterane (freatice sau acvifere).

În funcţie de concentraţia în săruri, apele naturale se împart în: - ape dulci (0 – 1g/l) - ape salmastre (1 – 25 g/l) - ape sărate (25 – 50 g/l) - ape foarte sărate (peste 50 g/l). În apele deschise şi la distanţă de sol sau sedimente, densitatea microorganismelor este rareori semnificativă pentru o contribuţie eficientă în ecosistem. Cele mai multe bacterii nu trăiesc libere în apele naturale, ci sunt legate de plancton, de detritusuri sau sunt agregate. În apele marine microorganismele sunt răspândite pe suprafeţe mari datorită curenţilor orizontali şi verticali şi prin amestecul apelor de suprafaţă produs de vânt. Microorganismele din apele dulci au mai multe caractere comune cu cele din sol decât cu cele din apele marine. Apele curgătoare transportă frecvent microorganisme din sol la distanţe mari. Ajunse în mediul marin, acestea nu supravieţuiesc, deoarece factorii de mediu le sunt nefavorabili (salinitatea, temperatura, presiunea, diluţia nutrienţilor). Apele freatice sunt lipsite de obicei de microorganisme, deoarece acestea sunt reţinute în straturile superioare ale solului. Factorii care influenţează prezenţa microorganismelor în mediile acvatice sunt: 1. Lumina reprezintă un factor esenţial pentru asigurarea vieţii în ecosistemele acvatice. În funcţie de gradul de turbiditate a apei, lumina poate fi utilă pentru fotosinteză numai pe o adâncime de câţiva metri, iar în largul oceanelor pe o adâncime până la 200m. Zonele mai puţin iluminate sunt populate de bacterii fototrofe anaerobe purpurii şi verzi, care fac fotosinteză anoxigenică, utilizând H2S şi diferiţi compuşi organici ca donori de H2 şi cantităţi foarte mici de lumină. Microorganismele fototrofe mobile îşi pot regla poziţia în coloana de apă, datorită fenomenelor de fototaxie. Lumina foarte intensă poate produce efecte inhibitorii sau distructive asupra microorganismelor din straturile superficiale ale apelor, care ar explica numărul redus de bacterii la suprafaţa apelor oceanice clare. Microorganismele care conţin pigmenţi carotenoizi sunt protejate de efectele nocive ale radiaţiilor. 2. Temperatura este răspunzătoare de încetinirea activităţilor metabolice. La suprafaţa apei mării ea se apropie de 28˚C la tropice şi de punctul de îngheţ la poli. În funcţie de nivelul termic s-a realizat o zonare ecologică a apelor: psihrosfera e reprezentată de regiunile cu temperaturi sub 10˚C, iar termosfera cuprinde regiunile mai calde. Mediul marin este populat cu microorganisme psihrofile, care cresc lent pe medii nutritive la 0 - 5˚C, dar se dezvoltă mai repede la 20 - 25˚C. 3. Presiunea hidrostatică creşte linear cu adâncimea (1atm la fiecare 10m) şi influenţează natura microorganismelor şi procesele biologice din mediul marin, proprietăţile fizico – chimice ale apei (gradul de ionizare, pH-ul şi vâscozitatea), structura terţiară şi cuaternară a proteinelor, morfologia bacteriilor, solubilitatea şi viteza de transport a nutrienţilor prin membranele celulare. Microorgansmele alohtone nu se pot dezvolta sub 200m. Bacteriile din marile abisuri (de la 500m adâncime) nu cresc la presiuni mai mici de 350atm. Barofilele sunt frecvente în habitatele bogate în nutrienţi (dejecţii ale animalelor marine, carcasele lor în curs de descompunere), mărind rata de descompunere a substanţelor organice din adâncuri, a căror mineralizare este completată de microorganismele oligotrofe.

4.

Turbiditatea apei este determinată de materia vie şi nevie aflată în suspensie şi care duce la formarea sedimentelor. Ea condiţionează adâncimea până la care radiaţiile solare pot asigura procesul de fotosinteză. 5. Curenţii determină importante efecte ecologice ale apelor, producând amestecul unor mase importante de apă, amestecul nutrienţilor şi o redistribuire a microbiotei. 6. Gazele dizolvate în apele naturale sunt în concentraţii mici şi sunt reprezentate de CO2, O2, N2 şi uneori de H2S, H2, CO. Dioxidul de carbon îşi are originea în atmosferă şi în respiraţia organismelor acvatice, este necesar pentru fotosinteză, variaţiile sale fiind corelate cu valorile pH ale apelor naturale. Se poate găsi în stare liberă, sub formă de carbonat şi bicarbonat. Oxigenul provine din atmosferă şi este produs prin fotosinteza oxigenică a algelor şi cianobacteriilor. Concentraţia sa este mare în apele curgătoare, scade cu adâncimea şi în apele lente şi stagnante. În lacurile adânci şi în mări concentraţia sa se corelează invers cu cea a CO2. 7. Salinitatea diferenţiază net apele dulci de cele marine şi oceanice şi influenţează natura microorganismelor care le pot popula. Puţine microorganisme sunt comune ambelor tipuri de ape. Concentraţii extreme de săruri se găsesc în Marea Moartă (în special sub formă de NaC şi MgCl). Salinitatea apelor oceanelor este relativ constantă. Aproximativ 99% din sărurile dizolvate sunt formate prin combinarea a 10–12 ioni anorganici (Cl-, Na+, Mg2+, K+, SO42-, HCO3-, CO32-), la care se adaugă Fe, Mn, Cu, Zn, Mb. Microorganismele din apele dulci sunt halofobe, care transferate în mediul marin mor într-o perioadă scurtă de timp; cele halotolerante supravieţuiesc în mediul marin, dar cresc mai lent decât în mediul lor natural; microorganismele halofile, autohtone în mediul salin, nu se dezvoltă în apele dulci, preferând o salinitate de 2,5 – 4%. Majoritatea microorganismelor halofile nu au nevoie de o presiune osmotică crescută a mediului, ci unele au nevoie absolută de Na+, iar altele de Cl-. Devierea de la salinitatea optimă are consecinţe negative asupra bacteriilor, producând modificări morfologice sau fiziologice (celulele cocoide şi cele bacilare devin filamentoase, durata unei generaţii este prelungită). Halofilia este frecvent întâlnită la alge, cianobacterii şi la bacteriile care fac fotosinteză anoxigenică. Bacteriile chemoheterotrofe marine autohtone sunt reprezentate de genuri ca: Vibrio, Alteromonas, Alcaligenes, Pseudomonas. Durata unei generaţii în cazul bacteriilor oligotrofe este de 4 – 8 ore. Incapacitatea lor de a se dezvolta pe medii bogate în nutrienţi s-ar datora probabil producerii unor metaboliţi toxici. Microbiota apelor curgătoare În izvoare microbiota este foarte redusă, formată din microorganisme provenite din apele freatice sau din straturile de sol „spălate” în trecerea spre suprafaţă. Sunt prezente în special bacterii Gram negative (Pseudomonas) şi forme prostectae (Caulobacter). Izvoarele termale, acide sau sărate, au temperaturi de peste 50˚C, care permit dezvoltarea numai a microorganismelor procariote.

Izvoarele minerale care conţin, de exemplu, compuşi ai Fe, sunt populate de ferobacterii (Gallionella). Râurile prezintă un număr mare de factori variabili (viteza de curgere, debitul, adâncimea, conţinutul mineral). Cursul superior este mai pur şi mai clar, cu grad ridicat de oxigenare, rapid, cu temperatură şi grad de productivitate reduse. În cursul mijlociu încep să se manifeste influenţe antropogene. Cursul inferior este lent, cu turbiditate crescută, depunere de sedomente, putând fi poluat cu pesticide, ape uzate, îngrăşăminte, metale grele, compuşi toxici. După gradul de poluare apele pot fi: oligosaprobe (cu conţinut redus de substanţă organică şi concentraţie mare de oxigen), mezosaprobe (cu grad mediu de poluare şi diminuarea concentraţiei de oxigen), polisaprobe (cu grad mare de poluare şi concentraţie redusă de oxigen). Microbiota râurilor este heterogenă, în funcţie de condiţiile locale. Microorganismele alohtone provenite din sol şi din diferite surse de contaminare se adaugă celor autohtone. Cele alohtone nu supravieţuiesc deoarece nu se pot adapta la condiţiile oligotrofe şi sunt sensibile la acţiunea radiaţiilor UV şi a bacteriofagilor. Lacurile sunt: oligotrofe, eutrofe (mai puţin adânci şi eutrofe -bogate în nutrienţiconţinând un număr mare de organisme saprobionte; microorganismele aerobe sunt treptat înlocuite cu cele anaerobe, bacterii sulfat reducătoare şi sulfuroase incolore), distrofice (ape cu o cantitate mare de substanţe organice dizolvate şi fragmente de ţesuturi vegetale). Lacurile cu apă dulce au o microbiotă heterogenă: eubacterii, actinomicete, cianobacterii, microfungi, microalge, protozoare. Lacurile cu apă sărată sunt populate de un număr redus de bacterii halotolerante şi în special halofile, care conţin frecvent vacuole cu gaze ce le permit deplasarea pe verticală şi pigmenţi carotenoizi cu rol protector faţă de intensitatea mare a luminii solare. Mediul marin este unic prin suprafaţa şi volumul foarte mari, salinitatea relativ mare, temperatura scăzută şi un gradient de presiune în raport cu adâncimea. Microbiota marină este alcătuită din: - microorganisme autohtone, permanente, adaptate la condiţiile mediului marin; - microorganisme alohtone, temporare, care contaminează mările provenind din sol, afluenţi, ambarcaţiuni, fiind frecvente în zonele litorale şi supravieţuind scurtă vreme; - microorganisme ubicvitare, care sunt comune solului şi mediului marin (de exemplu Welchia perfringens). Bacteriile marine nu se dezvoltă sau se dezvoltă slab în absenţa NaCl, sunt oligotrofe, psihrofile, cu excepţia celor din apele de suprafaţă. În funcţie de habitat sunt barofobe, barotolerante sau barofile, sunt frecvent cromogene. Majoritatea sunt Gram negative, mobile, aerobe, facultativ anaerobe, iar cele din adâncul sedimentelor sunt obligat anaerobe. Pot fi fototrofe, chemoautotrofe sau heterotrofe. Se încadrează în grupele funcţionale de bacterii nitrificatoare şi denitrificatoare, sulf-oxidante şi sulfat-reducătoare, ferobacterii, bacterii proteolitice, chitinolitice, celulozolitice, uneori patogene pentru organismele marine. Se întâlnesc frecvent bacterii din genurile: Alcaligenes, Alteromonas, Corynebacterium, Flavobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Sarcina, Spirillum, Vibrio, Streptomyces.

Cianobacteriile marine sunt răspândite ubicvitar, foarte multe fiind halotolerante. Unele dintre ele produc înfloriri în zonele eutrofizate (Anabaena flosaquae, Nodularia spumigena). Fungii marini sunt reprezentaţi de specii autohtone halofile sau de specii terestre ori limnetice halotolerante. Levurile sunt reprezentate de aproximativ 200 de specii (Candida, Saccharomyces, Torulopsis). Algele marine sunt producătorii primari, esenţiali pentru viaţa din mediul marin. Formează fitoplanctonul, majoritatea sunt fotoautotrofe, dar unele cresc şi heterotrof la întuneric. Sunt clorofite, diatomee, dinoflagelate, rodoficee, euglenofite. Protozoarele marine sunt flagelate, rizopode, ciliate, componente ale zooplanctonului, cele autohtone cu un grad ridicat de halofilie. Microorganismele din adâncuri se caracterizează prin ritmul lent al metabolismului, datorită disponibiulităţii reduse a nutrienţilor, presiunea hidrostatică mare şi temperatura scăzută a mediului. Microbiota organismului animal Colonizarea organismului animal cu diferite specii de microorganisme începe la naştere, procesul fiind benefic atât pentru microorganisme, cât şi pentru gazdă. Fătul este steril în uter, dar se infectează în cursul naşterii de la mamă şi de la orice sursă din mediu la care este expus. În cursul procesului de colonizare, multe microorganisme contaminante mor, deoarece nu se pot adapta. La sugarul hrănit la sân primele bacterii din sistemul digestiv sunt cele din genul Lactobacillus, urmate după 1 – 2 zile de cele din genul Bifidobacterium, care devine predominant numeric. Ulterior se instalează alte specii facultativ aerobe (Escherichia coli, Streptococcus faecalis). Modificarea microbiotei este importantă când se trece la alimentaţia solidă, apărând în intestinul gros bacterii strict anaerobe, numărul celor facultativ anaerobe scăzând progresiv. Mecanismele colonizării sunt puţin cunoscute; microorganismele trebuie să învingă sistemele de eliminare, fluxul unidirecţional al lichidelor pe suprafaţa epiteliilor, peristaltismul intestinal, sistemele imunitare locale şi variaţia pH-ului, precum şi competiţia cu alte microorganisme. Microbiota normală a tractului respirator este reprezentată de un număr mic de microorganisme. La nivelul căilor respiratorii superioare (nazofaringe) se întâlnesc în special Staphylococcus aureus şi specii coagulază–negative (Corynebacterium, Peptostreptococcus, Fusobacterium). În nazofaringe predomină specii de Streptococcus (α-hemolitici) şi Neisseria. Colonizarea cu N. meningitidis atinge un procent de până la 95% la adulţii tineri din aglomerările umane. În orofaringe predomină cocii Gram pozitivi şi Gram negativi, cei anaerobi depăşindu-i pe cei aerobi în proporţie de 100/1. Căile respiratorii inferioare sunt sterile. Microbiota tractului digestiv depinde de diferitele zone ale acestuia, care prezintă habitate caracteristice. În salivă şi pe suprafaţa limbii se întâlnesc streptococi din grupul viridans (Streptococcus salivarius). Suprafaţa dinţilor este colonizată cu S. sanguinis, S. mutans, iar mucoasa orală cu S. vestibularis. S. pyogenes, care produce faringita streptococică, poate coloniza temporar persoanele sănătoase.

La nivelul orofaringelui se găsesc şi alţi coci Gram pozitivi (Peptostreptococcus), coci Gram negativi anaerobi, bacili Gram pozitivi (Corynebacterium, Lactobacillus), bacili Gram negativi anaerobi (Fusobacterium, Bacteroides, Haemophilus influenzae, H. parainfluenzae). Din grupul fungilor, Candida albicans se găseşte aproape la toţi indivizii. Protozoarele din orofaringe sunt reprezentate de Entamoeba gingivalis şi Trichomonas tenax, dar nu produc boli. Ecosistemul gastrointestinal este complex, deschis, integrat şi format din mai multe habitate pentru microorganisme. Fiecare habitat este colonizat de mai multe specii de microorganisme autohtone. Stomacul este considerat steril, deoarece este un habitat ostil dezvoltării microorganismelor. El poate conţine însă microorganisme ingerate odată cu alimentele şi apa (la animalele coprofage acest fenomen este foarte accentuat). Bacteriile care pot fi prezente sunt acidotolerante: Lactobacillus, Streptococcus, Helicobacter pylori, ultimul fiind cauza ulcerului gastric şi asociat cu malignitatea gastrică. În intestinul subţire microbiota este limitată, predominând anaerobii (Lactobacillus, Streptococcus, Candida albicans, Bacteroides, Clostridium). În porţiunea terminală (ileon) pot fi găsite bacterii provenite din colon, mai ales dacă are loc o obstrucţie a tractului intestinal. În intestinul gros microbiota este reprezentată de câteva sute de specii bacteriene intolerante la O2, dintre care puţine au fost cultivate in vitro şi identificate. Microorganismele alohtone devin semnificative dacă depăşesc 106 celule/g de conţinut intestinal şi provin din alimentele ingerate sau din etajele superioare ale tractului digestiv. La om, numărul speciilor strict anaerobe este de peste 1011 celule/g, în care predomină Bacteroides fragilis, Bifidobacterium, Enterococcus, iar coliformii sunt numai în proporţie de 0,1 – 1%. În colonul normal nu se găsesc protozoare. Bacteriile coliforme din colon pot produce infecţii urogenitale. Microbiota normală a intestinului realizează fermentaţia bolului intestinal, grăbeşte tranzitul digestiv, are funcţie de barieră antiinfecţioasă, uneori furnizează vitamine din grupul B. Tractul urogenital este steril cu excepţia uretrei şi a vaginului. Microorganismele pot migra ascendent prin uretră, dar de obicei sunt rapid eliminate de anticorpii din secreţii şi de fluxul urinar descendent. Uretra feminină este colonizată de lactobacili, streptococi şi stafilococi coagulază – negativi. Microorganisme de origine fecală pot infecta uretra şi dacă ajung în vezica urinară proliferează şi determină infecţii urinare (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis, Candida albicans). Microbiota vaginală este abundentă şi diversificată. Predomină lactobacilii, deoarece sunt acidotoleranţi. Alţi anaerobi vaginali sunt: Bifidobacterium, Peptostreptococcus, iar dintre aerobi: Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Mycoplasma, Candida. Microbiota pielii este reprezentată de un număr mic de microorganisme comparativ cu alte habitate oferite de organismul animal. Unele sunt rezidente pe suprafaţa pielii, altele sunt tranzitorii, provenind din mediul extern, altele sunt endogene. Pe suprafaţa pielii bacteriile anaerobe sunt mai numeroase decât cele aerobe, predominând bacteriile în raport cu levurile, în special cele Gram pozitive: Staphylococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Propionibacterium.

Bacteriile Gram negative sunt sensibile la acţiunea detergenţilor, de aceea colonizează tranzitoriu suprafaţa pielii. Microorganismele proliferează în mediul umed, de aceea pielea feţei, aria perirectală sau perigenitală au o microbiotă mai complexă. Microbiota din rumen este reprezentată de o comunitate microbiană complexă, alcătuită din bacterii specifice anaerobe, protozoare ciliate şi flagelate, puţini fungi anaerobi. Bacteriile pot fi libere, imobile sau mobile, ori aderente la celulele mucoasei ruminale prin intermediul fimbriilor, glicocalixului sau polizaharidelor extracelulare. Activitatea bacteriilor este de degradare a materialului vegetal, fără a avea o eficienţă prea mare. Se întâlnesc: Bacteroides amylogenes, B. ruminicola, Clostridium locheadii, Ruminococcus albus.

CURS 7 INTERACŢIUNILE DINTRE POPULAŢIILE DE MICROORGANISME Majoritatea habitatelor naturale sunt populate de asociaţii heterogene de microorganisme, numărul speciilor fiind dependent de complexitatea şi diversitatea chimică a substanţelor nutritive. Interacţiunile dintre microorganisme se pot clasifica pe baza mai multor criterii: - după localizare şi modul de existenţă în raport cu altele - după rezultatul asocierii - după gradul de dependenţă a asociaţiei, care poate fi accidentală, facultativă sau obligatorie. Unele interacţiuni sunt pozitive (benefice), altele sunt negative, unele sunt benefice pentru un partener şi dăunătoare pentru celălalt, iar altele sunt indiferente. Interacţiunile posibile între populaţiile a două specii de microorganisme (G. Zarnea, 1994, adaptat după Odum, 1971) Tipuri de interacţiune

Specia

Natura generală a interacţiunii

Neutralism

A 0

B 0

Comensalism

+

0

Protocooperare

+

+

Mutualism

+

+

Competiţie prin interferenţă directă Competiţie prin utilizarea nutrienţilor

-

-

-

-

Amensalism

0

0

Parazitism

+

-

Prădare

1.

Nici una din populaţiile asociaţiei nu este afectată Populaţia A beneficiază, cea asociată B nu este afectată Interacţiune neobligatorie, bilateral benefică Interacţiune obligatorie, bilateral benefică Fiecare dintre cele două specii o poate inhiba direct pe cealaltă Fiecare dintre cele două specii o poateafecta pe cealaltă prin consumarea unui nutrient puţin abundent Populaţia A este inhibată, cealaltă este neafectată Populaţia A, cu dimensiuni mai mici, parazitează populaţia B Populaţia prădătoare A atacă populaţia gazdă B

Neutralismul este o asociere lipsită de influenţe reciproce, considerată puţin probabilă în mediile naturale. Este favorizat de mediile cu condiţii restrictive, care permit creşterea microorganismelor cu o rată minimă, care nu intră în competiţie pentru nutrienţi.

2. Interacţiuni pozitive Interacţiunile pozitive sunt relaţii de tip cooperant, care măresc rata de creştere a microorganismelor asociate şi se produc chiar şi între celulele aceleiaşi specii. Ele sunt foarte importante în mediile naturale. a. Comensalismul defineşte creşterea asociată a două specii de microorganisme, aflate într-o relaţie în care una profită de asociere, iar cealaltă este indiferentă (nici nu profită, nici nu este afectată negativ). Se disting două categorii de microorganisme comensale: - ectocomensale – situate pe suprafaţa altor microorganisme, plante sau animale, fixate de obicei prin structuri specializate (fimbrii, iar la Caulobacter crampon); - endocomensale, prezente în tubul digestiv al animalelor. b. Protocooperarea este o relaţie de mutualism neobligatoriu şi nespecific, în care cei doi parteneri beneficiază reciproc. De exemplu, Azotobacter fixează N2 utilizând substanţe organice simple pe care le furnizeazăă alte microorganisme, care hidrolizează substanţele complexe. c. Sinergismul este o formă de protocooperare între două sau mai multe tipuri de microorganisme prezente într-un mediu, ce pot avea activităţi foarte diferite, calitativ sau cantitativ faţă de activităţile însumate ale aceloraşi specii cultivate separat în mediul respectiv. De exemplu, E. coli şi Streptococcus faecalis produc putresceina din arginină, numai dacă sunt cultivate împreună, nu şi dacă sunt cultivate separat. d. Mutualismul este o asociaţie reciproc benefică, cu diferite grade de asociere. De exemplu, Lactobacillus arabinosa 17-5 necesită fenilalanina pentru creştere, iar Streptococcus faecalis R necesită acid folic. Nu cresc pe un mediu minimal după cultivare separată, dar cultivate împreună dau culturi abundente. Fiecare specie sintetizează şi eliberează în mediu factorul de creştere, solubil şi dializabil, necesar celeilalte specii. Relaţiile mutuale caracterizează asociaţiile dintrte bacterii şi alge în mediul marin (bacteriile produc vitamina B12 necesară algelor, algele realizează fotosinteza). 3. Interacţiuni negative Interacţiunile negative sunt prezente în special la densităţi populaţionale mari de microorganisme şi afectează viteza de creştere a uneia dintre cele două populaţii, datorită competiţiei pentru un substrat nutritiv, producerii de compuşi toxici, cu efect nociv pentru cealaltă specie, acumulării de produşi de metabolism cu efect inhibitor pentru cealaltă specie. a. Competiţia este rezultatul diversităţii microorganismelor, iar dezvoltarea lor depinde de fondul comun de resurse din mediu. Ea defineşte efectul negativ al unui organism asupra altuia, ca rezultat al epuizării unei surse nutritive din mediu. Competiţia poate fi: - interspecifică, de exemplu bacteriile din mediile naturale sunt mai bine adaptate decât cele alohtone; - intraspecifică, între tulpinile aceleiaşi specii. În relaţia de competiţie, influenţele advrse se realizează indirect. Competiţia între două specii de microorganisme diferite fiziologic, cu rate diferite de multiplicare, dar care necesită aceeaşi sursă de energie, duce la excluderea unuia dintre competitori.

Competiţia avantajează microorganismul cu o rată mai mare de creştere, care decurge din eficienţa superioară de utilizare a nutrienţilor limitanţi, cu o capacitate mai mare de a stoca substanţe de rezervă şi de a sintetiza factori de creştere. Factorii abiotici influenţează competiţia. b. Amensalismul este o interacţiune întâlnită în comunităţile cu densităţi populaţionale mari, fiind caracterizat prin producerea de către o specie de microorganisme a unor substanţe solubile organice sau anorganice, care afectează negativ creşterea altor microorganisme asociate din mediu. Amensalismul are un caracter unidirecţional; producerea de cizi organici sau anorganici modifică mediul natural, făcându-l inaccesibil microorganismelor sensibile. De exemplu, bacteriile sulf-oxidante din apele de drenaj din mică produc H2SO4, care scade valorile pH-ului şi microorganismele acidosensibile nu se mai pot dezvolta. c. Parazitismul corespunde relaţiei în care un organism se hrăneşte cu celulele, ţesuturile sau lichidele altui organism, care poate suferi prejudicii mai mult sau mai puţin severe. Relaţia parazit – gazdă variază, întâlnindu-se: - ectoparazitism - parazitism intracelular obligat parazitism absolut (virusuri – celulă gazdă). În unele cazuri interacţiunea are un grad înalt de specificitate, alteori paraziţii au un spectru larg de gazde. d. Prădarea este o interrelaţie în care un organism mai viguros (prădătorul) atacă un alt organism (prada), provocându-i moartea, rapidă în cazul prăzii unicelulare, ori distrugerea parţială sau totală în cazul prăzii multicelulare, urmată de utilizarea constituenţilor lor ca material nutritiv. Simbioza Simbioza defineşte viaţa împreună a unor organisme diferite, indiferent dacă asocierea lor are efect benefic sau dăunător asupra unuia sau ambilor parteneri. Ea este o coabitare de lungă durată, în cursul căreia două sau mai multe specii diferite trăiesc în relaţii spaţiale directe, beneficiind reciproc din interacţiunile lor. În funcţie de localizarea microorganismelor simbionte se disting: - ectosimbioze; - endosimbioze. În funcţie de gradul de dependenţă se disting: - simbioze facultative (între Ehizobium şi plantele leguminoase, care pot exista şi inependent); - simbioze ecologic obligate (bacteriile şi protozoarele din rumenul rumegătoarelor, care asigură degradarea celulozei până la compuşi accesibili gazdei); - simbioze efectiv obligate sau ereditare (unele nevertebrate marine care au nevoie absolută de alge endosimbionte).

În funcţie de natura relaţiei se disting: - simbioze mutualiste, în care adaptarea ambelor organisme este superioară fiind împreună decât atunci când trăiesc separat; - simbioze parazitare, când unul dintre parteneri este mai adaptat în asociaţie decât separat. Insectele şi acarienii sunt adesea asociaţi cu diferite microorganisme: bacterii, fungi, protozoare. Gradul de asociere este diferit, de la contaminanţi temporari din mediu până la asocieri ectosimbiotice constante localizate în structuri specializate. Capacitatea insectelor xilofage de a se dezvolta pe substratul lemnos (cu mare deficit de proteine şi vitamine) este condiţionată de asocierea lor cu levuri şi mucegaiuri. Interacţiunea Rhizobium – plante leguminoase implică existenţa unor fenomene de compatibilitate între cei doi parteneri, iar incompatibilitatea limitează infecţia. Polizaharidele bacteriene sunt foarte importante pentru iniţierea procesului de infecţie, mutantele necapsulate nu produc deformarea perilor radiculari. Deşi celulele de Rhizobium interacţionează cu toţi perii radiculari, numai aproximativ 25% dintre ei sunt deformaţi efectiv, printr-un proces de stimulare locală a creşterii. Celulele de Rhizobium sunt atrase prin chimiotactism pozitiv în rizosferă de flavonoidele capabile să inducă exprimarea genelor nod. În prezenţa exudatului radicular şi a flavonoidului luteolină, Rhizobium sintetizează şi excretă un factor extracelular, produs al genelor nod. Cianobacteria Anabaena azollae fixatoare de azot este răspândită la toate speciile de ferigi acvatice din genul Azolla. Asociaţia este mutual benefică, cianobiontul este protejat, fixează azotul atmosferic şi îl cedează gazdei. Planta furnizează sursa de carbon, probabil maltoza. Micorizele reprezintă sociaţii simbiotice între radicelele plantelor şi fungii specifici. Sunt foarte larg răspândite în natură, prezenţa unor plante neinfectate reprezentând mai degrabă excepţii. Micorizele pot fi: - ectomicorize; - endomicorize; - ectoendomicorize; - micorize peritrofe.