4232_SNI ISO-TR 13843-2011-Kualitas Air - Pedoman Validasi Metode Mikrobiologi

SNI ISO/TR 13843:2011

Kualitas air – Pedoman validasi metode mikrobiologi (ISO/TR 13843:2000, IDT)

ICS 07.100.20

Badan Standardisasi Nasional

“Hak Cipta Badan Standardisasi Nasional, Copy standar ini dibuat untuk penayangan di website dan tidak untuk di komersialkan”

Standar Nasional Indonesia

Hak cipta dilindungi undang-undang. Dilarang menyalin atau menggandakan sebagian atau seluruh isi dokumen ini dengan cara dan dalam bentuk apapun dan dilarang mendistribusikan dokumen ini baik secara elektronik maupun tercetak tanpa izin tertulis dari BSN BSN Gd. Manggala Wanabakti Blok IV, Lt. 3,4,7,10. Telp. +6221-5747043 Fax. +6221-5747045 Email: [email protected] www.bsn.go.id Diterbitkan di Jakarta

“Hak Cipta Badan Standardisasi Nasional, Copy standar ini dibuat untuk penayangan di website dan tidak untuk di komersialkan”

© BSN 2011

SNI ISO/TR 13843:2011

Daftar isi

Daftar isi....................................................................................................................................i Prakata ....................................................................................................................................ii 1

Ruang lingkup................................................................................................................... 1

2

Istilah dan definisi ............................................................................................................. 1

3

Susunan dokumen............................................................................................................ 9

4

Konsep dasar.................................................................................................................. 10

5

Batasan dan karakteristik dari metode mikrobiologi ....................................................... 14

6

Model variasi matematika ............................................................................................... 17

7

Spesifikasi – Praktek saat ini .......................................................................................... 26

8

Spesifikasi – Pendekatan yang direkomendasikan ........................................................ 27

9

Penentuan dan ekspresi dari karakteristik kinerja .......................................................... 28

10

Prosedur dan tahapan validasi ..................................................................................... 32

11

Rancangan untuk menentukan spesifikasi ................................................................... 35

Lampiran A (normatif) Prosedur statistik dan program komputer ......................................... 37 Lampiran B (informatif) Contoh numerik............................................................................... 41 Lampiran C (informatif) Contoh dari eksperimen pengesahan ............................................. 53 Bibliografi .............................................................................................................................. 54

© BSN 2010

i

SNI ISO/TR 13843:2011

Prakata

SNI ISO/TR 13843:2011 dengan Kualitas air – Pedoman validasi metode mikrobiologi merupakan adopsi identik dari ISO/TR 13843:2000, Water quality -- Guidance on validation of microbiological methods. SNI ISO/TR 13843 ini disusun atas kerjasama Panitia Teknis 65-05 Produk Perikanan dengan Panitia Teknis 13-03 Kualitas Lingkungan dan Manajemen Lingkungan, dan telah dibahas dalam rapat konsensus lingkup panitia teknis 13-03 pada tanggal 27 Oktober 2009 di Jakarta yang dihadiri oleh wakil dari pemangku kepentingan (stakeholder) yaitu produsen, konsumen, pakar, dan pemerintah. SNI ini telah melalui tahap pemungutan suara pada tanggal 28 Januari 2011 sampai dengan 28 Maret 2011 dengan hasil disetujui menjadi SNI. Pengguna harus memperhatikan bahwa Standar Internasional mengalami revisi dan setiap acuan yang diterapkan adalah edisi terakhir. SNI ini disusun sesuai dengan ketentuan yang diberikan dalam: a) Pedoman Standardisasi Nasional (PSN) 03.1:2007, Adopsi Standar Internasional dan Publikasi Internasional lainnya – Bagian 1: Adopsi Standar Internasional menjadi SNI. b) Pedoman Standardisasi Nasional (PSN) 08:2007, Penulisan SNI. Dalam standar ini istilah “ISO” diganti dengan “SNI ISO”, dan istilah “International Standards” diganti dengan “National Standards”. Apabila pengguna menemukan keraguan dalam standar ini maka disarankan untuk melihat standar aslinya yaitu ISO/TR 13843:2000 (E) dan/atau dokumen terkait lain yang menyertainya.

© BSN 2010

ii

SNI ISO/TR 13843:2011

Kualitas air – pedoman dalam validasi metode Mikrobiologi

1

Ruang lingkup

SNI ISO bagian ini menjelaskan validasi metode Mikrobiologi, dengan penekanan khusus pada metoda kuantitatif selektif dimana perkiraan kuantitatif didasarkan pada penghitungan partikel mikroorganisme baik secara langsung, dengan bantuan dari sebuah mikroskop, ataupun tidak secara langsung, berdasarkan pada pertumbuhan (perbanyakan) sel mikroorganisme menjadi koloni atau kekeruhan dalam media cairnya. Prinsip dan prosedur dalam ruang lingkup ini dinyatakan secara umum dengan ada/tidak ada (A/T), angka paling memungkinkan (APM), jumlah koloni dan jumlah penghitungan langsung secara mikroskopis. SNI ISO bagian ini tidak diterapkan untuk validasi metode cepat atau modern yang sebagian besar berdasarkan pada pengukuran produk yang terbentuk atau perubahan yang terjadi dari aktivitas mikroorganisme, tetapi tidak mendeteksi individu partikel sel mikroorganismenya.

2

Istilah dan definisi

Untuk SNI ISO 13843 ini, berlaku istilah dan definisi sebagai berikut. 2.1 akurasi dari pengukuran kedekatan dari suatu hasil uji dengan nilai acuan yang diterima CATATAN Istilah “akurasi”, ketika dipergunakan untuk suatu satuan hasil uji, melibatkan suatu kombinasi dari komponen acak dan suatu kesalahan sistematik atau komponen bias

[ISO 3534-1:1993,3.11] 2.2 ukuran analit kuantitas tertentu yang digunakan dalam pengukuran CATATAN 1

Lihat acuan [5]

CATATAN 2 Dalam mikrobiologi, analit didefinisikan secara ideal sebagai suatu daftar spesies yang telah didefinisikan secara taksonomi, dimana pada umumnya, secara praktis, analit hanya dapat didefinisikan pada taraf yang kurang tepat dibandingkan dengan definisi taksonomi.

2.3 porsi analisis, porsi uji volume dari suspensi partikel sel yang diinokulasi ke dalam suatu unit detektor CATATAN Contoh dari suatu unit detektor adalah cawan agar, membrane filter, tabung reaksi, dan bilik hitung mikroskopis (microscopic grid square).

2.4 rentang penggunaan kisaran dari suatu konsentrasi partikel sel yang secara rutin diukur oleh suatu metode. © BSN 2010

1 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

2.5 karakteristik yang dikategorikan metode numerik yang dinyatakan sebagai frekuensi relatif berdasarkan penggolongan A/T atau +/-. 2.6 CFU, satuan pembentuk koloni CFP, partikel pembentuk koloni CATATAN Istilah ini diperkenalkan pada awalnya untuk menyatakan ide bahwa satu koloni mungkin berasal tidak hanya dari satu sel tetapi dari rangkaian atau kumpulan sel, kelompok spora, sebatang miselium dst. Istilah ini tidak tepat untuk menyetarakan jumlah koloni yang diamati dengan jumlah sel yang hidup yang ditanam di media pertumbuhan. Satuan tumbuh, partikel yang dapat hidup, propagul (2.27) dan kuman (2.13) adalah istilah dengan arti yang serupa tetapi menyatakan ide awal yang lebih baik dan dipakai tidak hanya untuk metoda penghitungan koloni tetapi juga untuk APM dan A/T.

2.7 Koefisien variasi CV simpangan baku (deviasi standar) relatif untuk suatu karakteristik non –negatif, rasio dari simpangan baku untuk rata-rata CATATAN 1

Rasio mungkin dinyatakan sebagai suatu persentase.

CATATAN 2 Istilah “deviasi standar relatif” kadang-kadang digunakan sebagai suatu alternatif untuk “koefisien variasi”, tetapi penggunaan ini tidak direkomendasikan.

[ISO 3534-1:1993, 2.35] CATATAN 3 Dalam Laporan Teknis ini istilah koefisien variasi (CV) digunakan ketika simpangan baku relatif dinyatakan dalam persen (CV % = 100 RSD).

2.8 uji kolaboratif metode atau uji kinerja laboratorium dimana beberapa laboratorium bergabung dalam suatu eksperimen pengujian yang direncanakan dan dikoordinasikan oleh suatu laboratorium penyelenggara. CATATAN Uji kolaboratif sebagian besar terdiri dari dua jenis. Pengujian kalibrasi yang dilakukan antar laboratorium sehingga laboratorium yang berpartisipasi dapat saling membandingkan hasil analisisnya.

Uji kinerja metode menghasilkan penilaian yang tepat (repeatability, reproducibility) dari data yang dikumpulkan ketika beberapa laboratorium yang berpartisipasi menganalisis contoh uji yang sama dengan menggunakan suatu metode yang distandardisasikan dengan ketat.

© BSN 2010

2 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

2.9 penghitungan koloni yang dikonfirmasi (diverifikasi)

x Penghitungan koloni presumtive yang dikoreksi false positive-nya.

x = pc =

k c n

(1)

Keterangan : c

adalah jumlah presumptive

p

adalah tingkat positif yang benar

n

adalah jumlah positif presumptive yang dipisahkan untuk dikonfirmasi;

k

adalah jumlah tetap/yang dikonfirmasikan

2.10 diagram kontrol scattergram dua dimensi untuk memantau kinerja metode dengan nilai kontrol yang diperoleh dari suatu Studi Tipe A CATATAN Dalam diagram kontrol poros horisontal biasanya dalam skala waktu atau skala ordinat dan variabel kontrolnya adalah rata-ratanya atau beberapa ukuran presisi (s, CV, RSD).

2.11 detektor detektor partikel cawan dari matriks yang solid atau suatu tabung cairan berisi suatu media pertumbuhan untuk menghitung atau mendeteksi mikroorganisme yang hidup 2.12 seperangkat deteksi seperangkat detektor kombinasi dari cawan petri dan tabung dimana konsentrasi mikroorganisme dalam suatu contoh uji dapat ditentukan secara kuantitatif. CATATAN Seperangkat deteksi terdiri dari satu set cawan petri atau tabung yang digunakan untuk menentukan satu nilai hasil analisis. CONTOH Cawan petri paralel dari suatu suspensi, cawan petri dari pengenceran cairan yang berurutan, sistem tabung APM 3 x 5, cawan microtitre.

2.13 kuman kesatuan hidup yang mampu untuk menghasilkan pertumbuhan dalam media pertumbuhan Cf. propagul (2.27) 2.14 diagram panduan scattergram dua-dimensi untuk menyajikan data kinerja metode (kuantitas atau presisi) dengan nilai-nilai panduan tentatif (arbitary guide) atau nilai panduan yang diperoleh berdasarkan alasan Type B. CATATAN © BSN 2010

Dalam diagram panduan, poros horisontal biasanya jumlah koloni per detektor. 3 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

2.15 distribusi Poisson heterogen sebaran yang timbul ketika rata-rata dari suatu distribusi Poisson yang berbeda secara acak dari satu kejadian ke kejadian lain. CATATAN 1

lihat acuan [11]

CATATAN 2

lihat juga distribusi binomial negatif (2.19).

2.16 batas deteksi (limit of detection) jumlah partikel x (per bagian analitis) dimana kemungkinan p0 dari suatu hasil negatif sama dengan 5 % CATATAN 1

Peluang dari hasil positif p (+) = 1 – p0.

CATATAN 2

a) Perhitungan dari x melalui distribusi Poisson:

⎛ 1 ⎞ ⎛ 1 ⎞ x = In⎜⎜ ⎟⎟ = In⎜ ⎟ = In(20) = 3.00 ⎝ 0.05 ⎠ ⎝ p0 ⎠ b) Perhitungan dari x melalui distribusi binomial:

(p x=

−u 2 0

u

) = 0.05

−1

2

−u 2

u

2

−1

=

20

−u 2

u

−1

2

2.17 batas penentuan (limit of determination) konsentrasi partikel rata-rata yang paling rendah x per bagian analitis dimana ketidakpastian standar relatif yang diharapkan sama dengan suatu nilai yang ditentukan (RSD) CATATAN

a) Perhitungan dari x melalui distribusi Poisson:

x=

1

(RSD )2

b) Perhitungan dari x melalui distribusi binomial negatif:

x=

1 , diberikan faktor penyebaran yang melebihi = u (RSD )2 − u 2

2.18 linieritas hubungan linier dari sinyal terhadap konsentrasi dari analit Cf. proporsionalitas (2.28)

© BSN 2010

4 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

2.19 distribusi binomial negatif suatu distribusi statistik yang tersebar berlebihan (overdispersed) dari penghitungan CATATAN 1

Variannya dapat dinyatakan sebagai:

σ 2 = μ + u2μ 2

(2)

Keterangan µ adalah rata-rata. CATATAN 2 Dalam SNI ISO bagian ini, faktor penyebaran yang berlebihan (u) diganti untuk eksponen terbalik (1/k) dari rumus standar untuk distribusi binomial negatif.

2.20 penyebaran yang berlebihan variasi dalam keacakan Poisson yang berlebihan. CATATAN Hal ini di deteksi secara kualitatif dengan indeks penyebaran Poisson, dan di ukur secara kuantitatif dengan menilai parameter u (faktor penyebaran yang berlebihan) dari distribusi binomial negatif.

2.21 faktor penyebaran yang berlebihan u merupakan ketidakpastian acak tambahan dari penentuan yang lebih dari distribusi Poisson, diukur sebagai deviasi standar relatif. 2.22 kesalahan tumpang tindih (overlap error) kesalahan bertumpuk (crowding error) pengurangan (depression) sistematis dari jumlah koloni karena beberapa koloni yang bersatu merata (confluence) CATATAN Secara kuantitatif, kesalahan tumpang tindih (overlapping) bergantung pada bagian ruang pertumbuhan yang tersedia bagi pertumbuhan koloni.

2.23 perhitungan paralel jumlah partikel atau jumlah koloni dalam bagian-bagian analitis yang sama yang diambil dari suspensi yang sama 2.24 distribusi poisson sebaran acak sepenuhnya dari jumlah partikel ketika pengambilan contoh uji suatu suspensi yang dicampur secara sempurna CATATAN Peluang P (k) dari pengamatan k dalam suatu bagian uji ketika rata-rata sama dengan µ yang dihitung dari

P(k ) =

μk k!

e− μ

© BSN 2010

(3)

5 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

2.25 presisi kedekatan dari kesesuaian antara hasil uji bebas yang diperoleh menurut kondisi yang ditentukan. CATATAN Presisi tidak berhubungan dengan nilai sebenarnya atau nilai yang ditetapkan. Biasanya dinyatakan sebagai ketidaktepatan dan dihitung sebagai suatu simpangan baku dari hasil uji.

2.26 validasi primer validasi penuh penetapan tentang spesifikasi kinerja suatu metode baru dan/atau percobaan verifikasi sehingga suatu metode memenuhi kriteria kualitas yang diperoleh secara teoritis 2.27 propagul suatu kesatuan yang dapat hidup, sel vegetatif, kelompok sel, spora, kelompok spora, atau bagian dari miselium jamur yang mampu berkembang dalam suatu media pertumbuhan Cf. kuman (2.13) 2.28 proporsionalitas kesesuaian dari jumlah partikel yang diamati dengan volume (atau pengenceran) dari suatu bagian pengenceran yang dilakukan secara seri yang berasal dari suspensi yang sama. CATATAN Proposionalitas dihitung untuk evaluasi statistik sebagai statistik rasio yang kemungkinan log G2 dengan derajat bebas n -1.

2.29 metode kualitatif analisis yang responnya adalah salah satu dari ada atau tidak ada analit dalam suatu jumlah contoh uji tertentu CATATAN

Lihat acuan [10]

2.30 temubalik (recovery) istilah umum untuk jumlah partikel yang dinilai dalam suatu uji bagian atau contoh uji, dengan memahami bahwa ada suatu jumlah partikel yang benar (walaupun tidak diketahui) yang mana jumlahnya 100 % atau kurang yang dapat ditemubalikkan oleh detektor 2.31 akurasi relatif tingkat kesesuaian antara respon yang diperoleh dengan metode acuan dan respon yang diperoleh dengan metode alternatif pada contoh uji yang identik CATATAN

© BSN 2010

Lihat acuan [10]

6 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

2.32 perbedaan relatif d merupakan perbedaan antara dua nilai yang diukur dibagi dengan rata-ratanya

d=

x A − x B 2( x A − x B ) = x x A + xB

(4)

d % = 100 d CATATAN

Untuk tujuan praktis hasil nilai yang sama didapat dari perhitungan d = ln ( x A ) − ln ( x B )

2.33 temubalik relatif rasio (A/B) dari jumlah koloni yang diperoleh dengan dua metode yang diuji pada bagian uji yang sama dengan suspensi yang sama, dimana B adalah acuannya (ketika dapat digunakan). 2.34 standar deviasi relatif RSD Pendugaan simpangan baku suatu populasi dari suatu contoh uji untuk hasil n yang dibagi dengan rata-rata contoh uji itu

RSD =

s x

(5)

Cf. Koefisien varian (2.7) 2.35 keberulangan (repeatability) kedekatan dari kesesuaian antara hasil dari pengukuran yang dilakukan untuk suatu ukuran yang sama dalam kondisi pengukuran yang sama. CATATAN 1

Lihat panduan pada pernyataan ketidakpastian dalam pengukuran [6].

CATATAN 2 Keberulangan dapat dihitung sebagai r = 2,8sr dimana sr adalah standar deviasi keberulangan.

2.36 reproduksibilitas (reproducibility) kedekatan dari kesesuaian antara hasil pengukuran yang dilakukan untuk suatu ukuran yang sama dalam kondisi pengukuran yang berbeda. CATATAN 1

Lihat panduan pada pernyataan ketidakpastian dalam pengukuran [6].

CATATAN 2

Reproduksibilitas dihitung sebagai R = 2,8 sR.

© BSN 2010

7 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Keterangan : sR adalah deviasi standar reproduksibilitas yang tersusun dari standar deviasi sL dan deviasi standard keterulangan sr antar laboratorium:

s R = s L2 + sr2

(6)

2.37 ketangguhan (robustness) kekurangpekaan dari suatu metode analitis terhadap perubahan yang kecil dalam prosedur CATATAN 1

Lihat acuan [23]

CATATAN 2 Untuk menguji ketangguhan, disarankan untuk menjalankan metode dengan kesalahan yang disengaja (abuse) namun terkontrol.

2.38 validasi sekunder dilakukan dengan percobaan untuk menunjukan bahwa fungsi metode baku sesuai dengan spesifikasi pihak pengguna. 2.39 selektivitas nyata F Perbandingan jumlah koloni target terhadap jumlah total koloni pada volume contoh uji yang sama

F = lg(t / n )

(7)

Keterangan : t adalah konsentrasi yang nyata dari jenis target presumtif yang dinilai dengan menghitung koloni; n adalah konsentrasi dari jumlah total koloni

2.40 sensitivitas bagian dari jumlah total biakan positif atau koloni yang tepat sesuai dengan persyaratan dalam suatu pemeriksaan berdasarkan dugaan. 2.41 spesifisitas bagian dari jumlah total biakan negatif atau koloni yang tepat sesuai dengan persyaratan dalam suatu pemeriksaan berdasarkan dugaan. 2.42 standar ketidakpastian ketidakpastian dari hasil suatu ukuran yang ditunjukkan sebagai standar deviasi. CATATAN

Lihat acuan [5]

2.43 evaluasi tipe A (dari ketidakpastian ) metode evaluasi ketidakpastian dengan analisis statistik dari observasi yang berseri.

© BSN 2010

8 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

CONTOH

Pengamatan seperti : standar deviasi, simpangan baku relatif.

CATATAN 1

Lihat acuan 5 dan 6.

CATATAN 2 Keberulangan dan reproduksibilitas sering dinilai dengan menyelenggarakan uji metode kolaboratif dimana beberapa laboratorium menganalisis contoh uji yang sama yang diberikan oleh penyelenggara pusat.

2.44 evaluasi tipe B (dari ketidakpastian ) metode evaluasi ketidakpastian dengan menggunakan cara selain analisis statistik dari seri observasi seperti distribusi probabilitas yang diasumsikan berdasarkan pada pengalaman atau informasi lain CATATAN

Lihat acuan [5] dan [6].

2.45 ketidakpastian (dari pengukuran) parameter, yang dihubungkan dengan hasil suatu pengukuran yang mengkarakterisasi penyebaran nilai yang dapat mempengaruhi ukuran. CATATAN

Lihat acuan [6]

2.46 ketidakpastian (dari hitungan) standar deviasi relatif dari hasil hitungan yang diulang dari koloni atau partikel pada cawan petri atau bidang pengukuran yang sama menurut kondisi yang ditentukan CONTOH kondisi yang ditentukan seperti orang yang sama atau orang yang berbeda dalam satu laboratorium atau laboratorium yang berbeda.

2.47 rentang validasi kisaran dari jumlah rata-rata partikel setiap bagian analitis untuk kepatuhan dari spesifikasi validasi (terutama linearitas) yang telah diterima. CATATAN dipercaya”.

3

Biasanya dinyatakan sebagai rentang dari penghitungan jumlah koloni “yang dapat

Susunan dokumen

Bagian pertama (ketentuan 4 sampai 8) dari Laporan Teknis ini berisi bahan informatif mengenai prinsip dasar, karakteristik, dan batasan dari metode Mikrobiologi, dan juga pada aspek umum validasi. Bagian kedua (ketentuan 9 sampai 11) adalah dokumen validasi aktual, berisi spesifikasi dan prosedur-prosedur yang direkomendasi untuk analisis penentuan. Konsep dan prinsip baik lama dan baru tidak sepenuhnya ditetapkan pada Laporan Teknis ini. Tiga lampiran dilampirkan. Lampiran A memperinci formula/rumus statistik yang sebagian besar relevan dengan dokumen ini, lampiran B berisi contoh-contoh numerik dan lampiran C memberikan rencana terperinci untuk dua percobaan valildasi.

© BSN 2010

9 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Uji statistik dalam pengertian ini bukan menjadi pemikiran utama. Perhitungan matematis digunakan sebagian besar untuk memberikan rangkuman yang tepat tentang data dan distribusi statistik untuk mendapatkan nilai panduan. Suatu tabel dari distribusi χ2 adalah panduan yang paling sering digunakan. Dua program BASIC diberikan pada lampiran A yang dapat di-copy dengan mudah ke dalam komputer atau kalkulator yang dapat diprogram untuk membantu dalam perhitungan dasar yang paling sering dibutuhkan.

4

Konsep Dasar

4.1

Umum

Selama statistik partikel diperhatikan, penghitungan mikroskopik mengikuti hukum yang sama seperti penghitungan yang dapat ditumbuhkan (viable), tetapi keduanya, dengan pengecualian metode mikrokoloni, terbebas dari masalah biologis yang berhubungan dengan pertumbuhan. Pewarnaan yang berbeda, komplek yang dilabel spesifik, atau pereaksi lain yang digunakan untuk menunjukan target analisis, tidak merubah prinsip pengukuran. Prinsip-prinsip validasi yang sama seperti metode selektif bagi pertumbuhan suatu koloni dapat juga digunakan. Penghitungan plak bakteriofag pada prinsipnya sama seperti pada penghitungan koloni bakteri. 4.2 4.2.1

Validasi Umum

Validasi adalah suatu proses memberikan bukti bahwa suatu metode mampu untuk menjalankan tujuan yang dimaksudkan untuk mendeteksi atau mengukur suatu mikroorganisme atau kelompok mikroorganisme yang spesifik dengan akurasi dan presisi yang memadai. Metode jumlah total tidak mempunyai suatu kelompok target yang dapat ditetapkan dan hanya dapat divalidasikan dalam hubungannya dengan metode lain atau terhadap presisi sesuai teori. Validasi digolongkan sebagai primer atau sekunder sesuai tujuan. 4.2.2

Validasi primer

Validasi primer adalah suatu proses eksplorasi yang bertujuan untuk menetapkan batas operasional dan karakter kinerja suatu metode baru, dimodifikasi atau yang belum cukup dikarakterisasi. Validasi ini menghasilkan data numerik dan gambaran spesifik kinerja dan menyertakan suatu gambaran yang rinci dan jelas dari suatu target yang diinginkan (koloni, tabung atau plak yang positif). Validasi primer dilakukan dengan menggunakan skema uji yang dirancang secara khusus. Suatu laboratorium yang mengembangkan metoda sendiri (in house) atau memodifikasi metoda yang telah ada, sebaiknya melaksanakan langkah-langkah validasi primer. Penting sekali untuk diperhatikan bahwa para teknisi yang terlibat dalam validasi primer harus mempunyai pengalaman yang komprehensif dengan metode mikrobiologi yang lain.

© BSN 2010

10 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

4.2.3

Validasi sekunder

Validasi sekunder (juga disebut verifikasi) dilakukan ketika suatu laboratorium memulai untuk menerapkan suatu metode yang dikembangkan di tempat lain. Validasi sekunder memfokuskan pada pengumpulan bukti sehingga laboratorium mampu untuk memenuhi spesifikasi yang ditetapkan dalam validasi primer. Saat ini spesifikasi tidak tersedia untuk sebagian besar dari metode. Hasil dari jaminan kualitas eksternal (lihat 4.2.8) mungkin harus digunakan sebagai langkah pertama ke arah validasi sekunder yang sempurna. Secara khusus, validasi sekunder menggunakan format yang dipilih dan disederhanakan dari prosedur yang sama seperti dalam validasi primer, tetapi dapat diperluas dalam waktu yang lebih lama. Contoh uji yang asli (natural) adalah bahan uji yang optimal dan pekerjaan validasinya hanya membahas prosedur dalam batasan operasional yang ditentukan dalam validasi primer. 4.2.4

Pengendalian mutu (AQC= Analytical Quality Control)

Penggunaan dari metode yang valid dalam batasan spesifik yang dapat diandalkan tidak secara otomatis menjamin hasil yang valid. Pengendalian mutu penting dilakukan dalam analisis rutin sehari-hari untuk menjamin penggunaan metoda dengan benar dan berhasil. Pengendalian mutu adalah suatu proses berkelanjutan. Komponen utamanya adalah diagram panduan yang pembatasannya diturunkan dari spesifikasi metode (dari validasi primer) atau dari pertimbangan teoritis. Metode dari pengendalian mutu adalah perluasan dari proses analitis rutin, seperti replikasi pada tingkat yang berbeda, atau penghitungan sederhana yang tidak biasa dilakukan pada data rutin. Sebagai tambahan, juga digunakan bahan acuan, interkalibrasi dan contoh uji yang ditambahkan (spiked sample). Pengendalian mutu dibutuhkan dalam validasi primer dan sekunder. Hanya hasil yang valid dalam pengertian pengendalian mutu yang harus digunakan sebagai kriteria validasi dan karakteristik kinerja. Kelompok kerja nasional dan internasional telah menghasilkan banyak dokumen pengendalian mutu metode mikrobiologi (misalnya, acuan [1, 2, 3, 4, 7, 8, 20, 21, 24, 26]). Buku pedoman standar juga berisi bagian tentang subjek tersebut. Walaupun sangat penting untuk validasi, metode pengendalian mutu tidak diperinci dalam Laporan Teknik ini. Selanjutnya diasumsikan bahwa laboratorium mempunyai pengendalian mutu yang sesuai dan sistem jaminan kualitas internal dan eksternal yang berlaku. 4.2.5

Metode yang setara (equivalent)

Adalah penting untuk menggunakan dua metode secara paralel pada contoh uji yang sama ketika mengembangkan suatu metode yang dikembangkan dan sudah digunakan sendiri (inhouse), dan juga ketika mengumpulkan informasi untuk membenarkan penggunaan dari suatu metode alternatif. Kinerja metode berisi banyak aspek. Tidak ada uji tunggal dari kesetaraan metode, tidak juga ada kriteria numerik untuk itu. Satu metode mungkin lebih unggul dalam hal spesifisitasnya namun lebih rendah temubaliknya. Semua informasi kolektif tentang ketangguhan, presisi, dan spesifisitas yang diperoleh selama uji validasi dapat digunakan untuk perbandingan metode (contoh B.2, B.3, B.4 dalam lampiran B). Metode itu hanya perlu diuji secara paralel untuk perbandingan temubalik-nya. © BSN 2010

11 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Metode terbaik adalah yang menghasilkan temubalik paling tinggi dari target mikroorganisme, jika tidak maka konfirmasi perlu dilakukan untuk penggunaan rutin. Suatu metode akan lebih disukai jika menghasilkan temubalik yang sedikit lebih rendah tetapi tidak memerlukan konfirmasi. Suatu metode dinyatakan tidak valid jika dalam validasi primernya memiliki frekuensi false negative dan false positive yang tinggi dan tidak dapat dikoreksi dengan menentukan target koloni yang lebih tepat. 4.2.6

Bahan uji

Pendapat populer menyatakan bahwa validasi sebaiknya mensimulasi kegiatan rutin sebanyak mungkin. Contoh uji alami dengan konsentrasi microorganisme alami sebaiknya digunakan sebagai bahan uji utama. Ada pengecualian untuk beberapa keadaan. Bahan buatan (bahan acuan yang disertifikasi [CRM] dan spiked sample) digunakan dalam sistem jaminan mutu internal dan eksternal untuk menjamin profisiensi dasar dari laboratorium yang berpartisipasi dalam validasi metode. Spiking mungkin berguna dan bahkan perlu dalam validasi sekunder apabila sulit untuk mendapatkan contoh uji alami yang mengandung mikroorganisme target. Personil laboratorium akan dapat terbiasa dengan karakter target tersebut. Contoh uji negatif (blanko) sebaiknya dibatasi pada penjaminan mutu internal. Penyertaan blanko tersebut diantara contoh uji yang digunakan untuk kesetaraan metode, mungkin akan mengarah pada kesan yang tidak tepat dari suatu korelasi yang baik diantara dua metode. Jika diketahui di awal bahwa contoh uji alami tidak mengandung mikroorganisme target, maka contoh uji tersebut lebih cocok digunakan dalam seleksi menguji false positif dalam kegiatan validasi yang sesungguhnya. Rentang konsentrasi optimal untuk validasi metode Mikrobiologi adalah lebih sempit dibanding dengan rentang dalam penggunaannya. Konsentrasi yang tinggi tidak diperlukan. Contoh uji seperti itu menyerupai kultur biakan murni dan tidak dapat digunakan dalam pengukuran kinerja suatu metode atau pengujian laboratorium. Contoh uji dengan kandungan bakteri yang sangat rendah, diperlukan untuk keperluan analisis masalah kesehatan publik, tetapi tidak sesuai untuk perbandingan metode dan kegiatan validasi lainnya karena alasan statistik. Permasalahan ini sebagian besar dapat dihindari, karena metode mikrobiologi pada umumnya tidak sensitif terhadap konsentrasi di ujung skala terendah. Setiap individu kuman bereaksi dengan media , hampir tidak dipengaruhi oleh partikel-partikel lainnya dalam contoh uji. Jika suatu metoda memiliki temubalik yang rendah dibandingkan dengan yang lain, faktanya lebih mudah ditemukan dengan duapuluh atau tiga puluh partikel koloni yang tumbuh per cawan petri dibandingkan dengan atau atau beberapa saja. Metode yang dianalisis valid pada konsentrasi yang cukup untuk validasi, lebih dipercaya digunakan pada konsentrasi analit yang rendah. 4.2.7

Contoh uji- Keterwakilan (Representativeness) dan kecukupan (sufficiency)

Teori statistik memberikan solusi untuk menghitung jumlah contoh uji yang diperlukan untuk pengujian berbeda atau perkiraan situasi yang berbeda [3, 13]. Untuk dapat menggunakan teori tersebut maka perlu ditetapkan besarnya pengaruh dan kekuatan terhadap sistem deteksinya. Perkiraan ketidakpastian (presisi) dari suatu penentuan sebaiknya tersedia dan sampling sebaiknya dilakukan secara acak. © BSN 2010

12 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Banyak atau semua persyaratan diatas sulit untuk dipenuhi di awal perencanaan dan pelaksaaan pengujian kinerja metode mikrobiologi. Teknik statistik, jika digunakan menyeluruh akan memberikan panduan umum. Jumlah dan variasi contoh uji yang diuji seharusnya cukup meyakinkan. Tanpa bantuan statistik, tidak ada cara pasti untuk memutuskan. Dalam beberapa kejadian, contoh uji pertama yang dipelajari mungkin memberikan jawaban bahwa metode itu tidak cukup baik. Biasanya, selalu dibutuhkan lebih banyak contoh uji. Mungkin memerlukan seribu contoh uji untuk membuktikan bahwa dua metode A/T tidak setara. Bila contoh uji terlalu sedikit akan membuang waktu saja. 4.2.8

Jaminan mutu eksternal dan uji kolaboratif lainnya

Partisipasi dari beberapa laboratorium di dalam analisis suatu bahan “homogen” adalah dianggap penting, baik untuk kinerja metode dan kinerja laboratorium. (Setelah diketahui outliers dan dikeluarkan, sisa data dapat memberikan informasi yang penting pada kinerja metode dan profisiensi). Uji kolaboratif telah dikembangkan menjadi suatu cara yang secara luas digunakan untuk menguji karakteristik presisi dari metode kimia [34]. Namun agak prematur untuk merekomendasikan hal yang sama sepenuhnya pada mikrobiologi. Diasumsikan bahwa semua laboratorium yang berpartisipasi memiliki pengalaman beberapa tahun dan kemampuan menggunakan metode yang diuji. Saat ini ada kecenderungan bahwa eksperimen kolaboratif telah menjadi pengujian profisiensi laboratorium dan kegiatan pelatihan. Sejumlah metode Mikrobiologi telah digunakan selama beberapa dekade (misalnya, agar Endo untuk coliforms, mFC untuk coliforms thermotolerant, agar m-Enterococcus untuk enterococci intentinal) oleh ratusan laboratorium. Metode ini secara teoritis akan lebih sesuai digunakan dalam pengujian kolaboratif kinerja metoda Ketika membuat tes profisiensi kolaboratif untuk organisme target spesifik dengan menggunakan media selektif, contoh uji sebaiknya di-spiked dengan kultur murni atau campuran dari berbagai mikroorganisme. Alternatifnya menggunakan bahan acuan tersertifikasi. Ini adalah suatu kondisi yang dibuat dan disederhanakan. Hal ini dapat mengurangi kesulitan yang sering dialami oleh berbagai laboratorium dalam menggunakan metode untuk analisis contoh uji alami. Selama karakteristik kinerja terinci dari suatu metode mikrobiologi belum dinyatakan secara kuantitatif, tipe dari skema jaminan mutu eksternal (EQA) ini mungkin merupakan cara yang paling memuaskan untuk metoda validasi sekunder (verifikasi). 4.3 4.3.1

Detektor Umum

Secara umum medium pertumbuhan dan tempatnya adalah suatu detektor (2.11). Dua jenis detektor, padat dan cair, digunakan pada berbagai metode Mikrobiologi yang berbeda. Jenis detektor ini berhubungan erat dengan prinsip deteksi dan penghitungan yang berbeda: detektor cair dengan A/T dan APM, sementara detektor padat dengan penghitungan koloni. Semua bentuk validasi dalam mikrobiologi memfokuskan pada kinerja detektor.

© BSN 2010

13 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Seperangkat tabung (APM) atau satu seri dari cawan agar yang digunakan untuk analisis disebut sebagai seperangkat deteksi atau seperangkat detektor (2,12). Setiap tabung APM adalah satu detektor A/T. CONTOH Setiap sumur (well) dari suatu cawan mikrotitre adalah sebuah detektor A/T. Seluruh cawan ketika digunakan sebagai suatu sistem APM adalah seperangkat deteksi.

4.3.2

Perbandingan detektor

Untuk sebagian besar metode penghitungan koloni, suatu media cair dengan komposisi kimia yang sama tetapi tanpa matrik padat (agar, membran filter) dapat digunakan. Pengaruh lingkungan padatan dapat dievaluasi dengan membandingkan jumlah koloni dengan perkiraan APM. Hal ini menunjukan bahwa reaksi deteksi target sama pada kedua tipe detektor dan jumlah dari tabung APM cukup besar untuk menyatakan presisi. Sensivitas dari detektor A/T dapat juga dievaluasi dengan perbandingan media cair-padat yang serupa. 4.4

Karakteristik Kinerja

Karakteristik kinerja harus dapat dihitung dan diuji untuk digunakan dalam validasi. Istilah karakteristik kinerja dalam Laporan Teknik ini sebagian besar mengikuti penggunaan chemometric. Definisi semula dari istilah itu tidak selalu sesuai metode mikrobiologi, karena telah dimodifikasi dan disesuaikan berdasarkan kebutuhannya. Karakteristik kinerja yang tercantum dalam Laporan Teknik ini berhubungan dengan ruang lingkup (daftar situasi dan jenis contoh uji dimana metode dapat digunakan), presisi, linearitas, temubalik, batas kerja yang berkenaan dengan jumlah koloni tertinggi dan terendah yang dapat direkomendasikan per cawan, selektivitas, spesifisitas dan ketangguhan (ruggedness). Definisi dari istilah ini semua dan yang lainnya dapat ditemukan pada klausa definisi 2. 4.5

Spesifikasi

Spesifikasi adalah pernyataan numerik atau kualitatif dari karakteristik kinerja atau dari batas kerja yang diturunkan darinya. Validasi primer sebaiknya memperhatikan hal berikut : a)

identifikasi morfologi dari target (presumptif)

b)

pernyataan mengenai kondisi inkubasi (suhu, waktu, atmosfir gas, kelembaban) dan karakteristik media (pH, stabilitas);

c)

pernyataan mengenai batas kerja yang dapat dipercaya dalam hal jumlah plak dan koloni per detektor (cawan, membran filter) jika mungkin;

d)

Pernyataan ketidakpastian dalam batas yang ditetapkan yang dapat dipercaya;

e)

Ruang lingkup dan batasan.

5 5.1

Batasan dan karakteristik dari metode mikrobiologi Temubalik analit

Analit mikrobiologi terdiri dari partikel hidup yang utuh, dengan berbagai cara disebut satuan pembentuk koloni (CFU), partikel pembentuk koloni (CFP), kuman, profagul, dll (lihat klausa 2). Jumlah koloni yang diamati adalah suatu perkiraan dari jumlah partikel yang hidup. © BSN 2010

14 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Kegunaan pengujian kinerja dibatasi oleh ketidakmungkinan untuk mengetahui jumlah sebenarnya analit dalam suatu contoh uji atau bagian analitis. Detektor tidak mampu untuk mengetahui jumlah kuman secara tepat. Viabilitas didefinisikan dengan pertumbuhan, yaitu dengan metode itu sendiri. Temubalik mutlak tidak dapat ditentukan dan ketertelusuran (traceability) adalah tidak mungkin. Karena viabilitas bisa muncul berbeda pada detektor yang berbeda dan atau riwayat contoh uji yang berbeda. Temubalik relatif (yang menyertakan metoda dan acuan yang baru) adalah suatu karakteristik kinerja praktis walaupun nilai sebenarnya tidak diketahui. 5.2

Varian contoh uji

Dalam lingkungan dan bahkan dalam contoh uji laboratorium, sebaran partikel tidak homogen. Varian sampling dari lingkungan bukan merupakan karakteristik dari metode. Tetapi varian sub sampling dari suatu contoh uji laboratorium dapat dipertimbangkan sebagai karakteristik dari metode. Tidak mungkin secara praktis melakukan pencampuran sempurna tanpa kehilangan beberapa sel hidup. Varian contoh uji tetap dapat menyebabkan masalah dalam validasi. Kinerja terutama presisi dan batas kerja atas, perlu ditentukan terpisah untuk matrik yang berbeda. 5.3

Distribusi dan sebaran berlebihan (overdispersion) dari partikel

Variasi acak yang disebabkan oleh distribusi partikel yang tidak homogen diantara dua contoh uji yang paralel, bahkan dalam suspensi yang tercampur sempurna, adalah merupakan karakteristik dari metode mikrobiologi. [31]. Variasi acak dasar tidak dapat dihindari dan tidak berkaitan dengan ketrampilan teknis atau peralatan. Hal ini mengikuti hukum matematika yang dikenal dengan distribusi Poisson [28], maka dapat dihitung. Ketidaksempurnaan teknis dan banyak hal lainnya menyebabkan adanya variasi tambahan. Penentuan paralel bahkan lebih bervariasi daripada yang dijelaskan oleh distribusi Poisson. Situasi ini disebut sebaran yang berlebihan ”overdispersion” [2.20]. Banyak argumen yang mendukung distribusi binomial negatif (2.19) sebagai suatu model sebaran yang berlebihan dalam mikrobiologi [11, 14, 15]. 5.4

Interaksi dalam detektor

Banyak kesulitan yang timbul dari interaksi faktor biotik dan abiotik di dalam detektor. Detektor cair memiliki kelemahan dalam hal kemungkinan berbagai mikroflora yang tumbuh bersama dalam tabung yang sama. Detektor koloni memiliki kelemahan dalam hal kelebihan pertumbuhan dan tertutupnya koloni target oleh kotoran dan pertumbuhan dari non target. Pengamatan hasil menjadi sulit, tidak dapat diandalkan atau tidak memungkinkan. 5.5

Ketangguhan

Metode Mikrobiologi tidak tangguh. Baik analit maupun pengotor adalah hidup. Hal ini menyebabkan timbulnya fenomena yang tidak diharapkan pada detektor. Para mikrobiologis sebaiknya dapat mengenal dan mengerti hal ini. Pengaruh matriks, tekanan inkubasi, kualitas dan asal campuran substrat, komposisi dari mikroorganisme dalam contoh uji dan pelatihan teknisi dapat mempengaruhi hasil.

© BSN 2010

15 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Sumber dari kurang tangguhnya metode mikrobiologi ada pada lima prinsip utama : contoh uji (sifat fisikokimia dan populasi mikroorganisme), kompetensi personil, penyiapan contoh uji, kondisi inkubasi, dan media deteksi. Dari semua ini, tiga terakhir sebaiknya distandardisasi. Validasi primer sebaiknya menetapkan batasan umum agar metode yang diharapkan menunjukkan kinerja yang baik. Rancangan statistik yang efisien untuk pengujian ketangguhan yang dikembangkan oleh AOAC [34] juga dapat digunakan dalam mikrobiologi. Dengan mempertimbangkan sifat hidup alami analit, kebebasan memilih dalam hal waktu reaksi (waktu inkubasi) dan suhu inkubasi, menyebabkan sering terjadi hal tak terduga. Penghitungan koloni lebih sensitif terhadap waktu dari yang diasumsikan secara umum. Sebagai contoh dalam standar internasional di beberapa negara yang berbeda sering kali menerapkan ketangguhan dalam batas yang tidak mungkin dilakukan. CONTOH Deskripsi metode deteksi dan penghitungan coliform memperbolehkan inkubasi selama 18 jam sampai 24 jam pada 36°C ± 1°C . Hal ini menyatakan stabilitas hasil yang dipengaruhi oleh variasi waktu dan temperatur inkubasi, kemungkinan lebih dari yang sebenarnya.

Ketika temperatur menjadi salah satu dari faktor selektif (misalnya 44°C untuk termotoleran coliform), bahkan posisi dari cawan dalam inkubator atau tumpukan cawan dapat mempunyai pengaruh yang kuat pada hasil analisis. Ini telah diakui pada beberapa standar dengan menentukan tumpukan tertinggi yang diperbolehkan (misalnya enam cawan). Penghilangan pengaruh penumpukan memerlukan inkubasi satu lapisan saja, yang dianggap tidak dapat dilaksanakan. Fitur ketangguhan penting lainnya yang jarang diperhatikan adalah penyimpanan contoh uji sebelum analisis. Dipercaya valid secara umum bahwa contoh uji toleran terhadap penyimpanan dalam refrigerator, misalnya sampai 24 jam [9]. Cekaman dingin (cold-stress) selama penyimpanan dalam refrigerator mungkin tidak penting dalam penghitungan jumlah koloni tetapi hal ini dapat menimbulkan kesalahan dalam metoda terutama metoda yang sangat selektif. Shock panas dan cekaman lainnya tidak umum tetapi sangat spesifik terhadap suatu metode. 5.6

Kesalahan bias (Spurious errors)

Salah satu fitur khas dari sebagian besar metode penghitungan koloni mikrobiologi, adalah kecenderungan terjadinya permasalahan yang tidak diduga, terutama pada teknik cawan petri tunggal. Teknik lainnya yang berbeda (penanaman di cawan, sebar permukaan, filtrasi membran) tidak memiliki kecenderungan seperti diatas. Permasalahannya karena adanya satu koloni yang mengganggu, kelembaban, perbedaan suhu, padatan dan pengotor, kontaminan dan lainnya. Kejadian seperti ini tidak menggambarkan kinerja metode secara umum dan tidak masuk pertimbangan dalam validasi dan tidak dapat diprediksi dalam model matematika. Ketika sangat sering terjadi, maka metode jadi diragukan. Tetapi metode kultur cair kurang terpengaruh. Secara ilmiah kesalahan bias terjadi pada metode mikrobiologi sehingga sebaiknya disertakan dalam perkiraan ketidakpastian kinerja. Maka metode tersebut harus divalidasi pada saat digunakan. Salah satu hal yang perlu diperhatikan dalam Laporan teknis ini adalah bahwa kesalahan bias harus menjadi hal penting yang perlu diperhatikan dalam kegiatan harian jaminan mutu (AQC). Walaupun deteksi kesalahan bias sangat tergantung pada keahlian para teknisi, harus diupayakan untuk dapat mengenal dan menghilangkannya. Jika kesalahan bias sering ditemukan dapat menyebabkan kegagalan analisis, maka metode yang digunakan jelas tidak sesuai dengan tujuannya. © BSN 2010

16 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

5.7

Diagram pedoman dan kontrol

Prosedur analisis adalah proses dan hasil pengukuran atau penentuannya dianggap sebagai produknya. Maka ide dasar diagram kontrol yang berasal dalam suatu proses industri, akan dapat diterapkan dalam suatu proses analisis. Diagram kontrol ini akan membantu deteksi apakah terjadi perubahan yang mendadak atau laten pada proses jaminan mutu. Ketika permasalahannya tidak dapat lagi dikontrol, maka prosesnya dapat dihentikan dan diperbaiki. Kemungkinan mengontrol proses sangat terbatas. Yang paling umum dilakukan adalah menggunakan contoh uji acuan untuk menguji konsistensi temubalik (tidak adanya bias sistematik) dan analisis ganda untuk menguji presisi (keterulangan dan atau reproduksibilitas). Pemikiran ini sesuai untuk analisis kimia secara otomatis, tetapi tidak untuk analisis mikrobiologi. Hal ini mengasumsikan bahwa proses (seperti prosedur analisis) kinerjanya baik diawal, kemudian memburuk dengan cepat atau bertahap dan akhirnya menghasilkan kesalahan analisis. Sebenarnya sulit untuk menunjukkan kapan suatu metoda berada dalam kontrol atau tidak dapat dikontrol. Hasil analisis yang buruk mungkin tidak berhubungan dengan hasil lainnya dalam waktu yang bersamaan. Plot grafis sangat berguna dan menjadi alat praktis tidak hanya dalam jaminan mutu (AQC) tetapi juga dalam konteks validasi tertentu. Maka untuk alasan tersebut di atas, penggunaan dalam mikrobiologi sebaiknya terbatas untuk memberikan panduan dalam praktek analisis. Jangan digunakan untuk menyalahkan seluruh analisis atau hasilnya. Disarankan untuk istilah diagram kontrol sebaiknya dibatasi untuk mengontrol situasi yang jelas, seperti memantau suhu inkubasi. Istilah diagram panduan lebih cocok ketika mengillustrasikan kinerja metode mikrobiologi secara grafis. Walaupun demikian beberapa nilai panduan dapat dipilih untuk membantu pengambilan keputusan.

6

Model variasi matematika

6.1 6.1.1

Variasi dasar yang tidak dapat dihindarkan – distribusi Poisson Umum

Peluang variasi jumlah partikel dalam suatu analisis yang paralel pada rentang kondisi optimum dari detektor mikrobiologi adalah seimbang jika suspensinya tercampur dengan baik (acak lengkap) dan tidak ada ketidakpastian teknis dari pengukurannya. Ini menciptakan suatu dilema khas mikrobiologi. Metode-metode penghitungan koloni, dalam sebagian besar aspek biologi dan teknis, kinerja terbaiknya terjadi ketika jumlah partikelnya sedikit namun presisi statistik tidak memadai.

© BSN 2010

17 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

6.1.2

Presisi dari detektor jumlah koloni

Presisi biasanya dinytakan dengan istilah deviasi standar. Statistik dasar dari variasi penghitungan koloni koloni dapat dimodelkan secara matematika dengan distribusi Poisson. Varian (s2) dari distribusi Poisson adalah sama secara numerik dengan rata-rata (m) (persamaan dari rata-rata dan varian tidak membuktikan bahwa data mengikuti distribusi Poisson). Simpangan baku relatif (RSD) berbanding terbalik dengan rata-rata atau sevara umum dengan jumlah total (c) dari suatu set deteksi. ada dalam hubungan terbalik untuk jumlah rata-rata atau lebih secara umum terhadap jumlah total (c) dari satuan deteksi:

RSD =

s c 1 = = c c c

(1)

CONTOH Suatu analisis dengan teknik cawan tunggal dari contoh uji suspensi yang tercampur dengan sempurna menghasilkan 48 koloni, maka secara teoritis akan mempunyai presisi relatif (RSD) dari 1 / 48 = ± 0.14 (CV = 14 %). Jika hasil 48 koloni tersebut berasal dari tiga cawan yang paralel, semisal 12 + 16 + 20 = 48, simpangan baku relatif dari rata-rata 48/3 = 16 akan jadi sama.

Ketergantungan dari presisi relatif (CV, koefisien variasi) pada jumlah karakter (c) ditunjukkan pada gambar 1.

Gambar 1 - Koefisien dari variasi jumlah koloni dalam suatu suspensi campuran dengan sempurna mengikuti hukum distribusi Poisson. Grafik itu menunjukkan mengapa jumlah koloni seperti 20, 25 atau 30 secara tradisional telah dianggap jumlah terendah yang dapat diandalkan. Model Poisson dapat digunakan untuk memperkirakan statistik ketidakpastian secara teoritis untuk penghitungan koloni dan sebaliknya dapat digunakan untuk membuat keputusan pada batas minimum berdasarkan presisi statistiknya. Ketidak pastian acak meningkatkan dengan cepat ketika jumlah koloni berkurang (Gambar 1). Dalam rentang hitungan di bawah sekitar sepuluh, biasanya terjadi apad analisis demi kepentingan kesehatan masyarakat, pengukuran-pengukuran tunggal tidak akan tepat sehingga tidak dapat dikarakterisasikan sebagai lebih baik daripada semikuantitatif.

© BSN 2010

18 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Rentang jumlah 1 sampai 10 berkaitan dengan rentang yang menentukan karakter presisi dari 3 x 5 tabung APM yang umum. Menggolongkan penghitungan koloni kurang dari 10 sebagai semikuantitatif adalah sesuai dengan pendapat para pakar statistik bahwa desain 3 x 3 dan 3 x 5 lebih dianggap sebagai test-test mengukut tingkatan besaran daripada perkiraan kuantitas. (Tabung perkiraan APM 3 x 5 mempunyai rentang kepercayaan 95 % 95 % pada sekitar ± 0,5 unit logaritmik (12). 6.1.3

Presisi dari detektor APM

Presisi dalam metode APM tergantung pada jumlah hasil penghirungannya sendiri, tetapi didalam beberapa cara yang lebih sulit dibandingkan dengan penhitungan koloni. Simpangan baku dari log APM adalah satu kurva bergelombang. Itu mempunyai banyak batas minimum sebagai tingkatan pengenceran dalam set deteksi. Sebagai suatu contoh, berikut ini adalah simpangan baku logaritmik dihitung untuk tabung 3 x 10 APM detektor yang dibuat dengan bantuan program komputer [19] (Gambar 2).

Gambar 2 - Simpangan baku logaritmik dari 3 x 10 tabung APM Jumlah tabung positif pada susunan yang utuh diplot di absis. Kurva yang bergelombang memperlihatkan simpangan baku yang sebenarnya. Garis lurus horisontal adalah perkiraan Cochran's [12]. Cochran [12] mengusulkan suatu simpangan baku tetap untuk keseluruhan rentang APM. Perkiraan ini ditunjukan oleh garis horizontal didalam gambar 2. Di sini terlihat bahwa penyimpangan yang pasti, terjadi pada set tabung APM yang negatif. Sesuai dengan rumus Cochran's [12], presisi penilaian APM dalam skala logaritmik tergantung secara sederhana terhadap jumlah tabung (n) dan terhadap faktor pengenceran (f) antara pengenceran yang berurutan. Tetapan (konstanta) 0,58 dipilih "dengan mata" untuk pengenceran sepuluh kalilipat untuk memberikan gambaran yang sesuai dalam gambar 2. Jika faktor pengenceran antara pengenceran yang berurutan faktor kurang dari sepuluh, kemudian tetapan 0,55 dapat digunakan [12]. SD atau lg APM = 0,58 © BSN 2010

lg f n

(2)

19 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

95 % batas kepercayaan di banyak tabel APM didasarkan pada perkiraan Cochran didalam persamaan (2), tetapi akan digantikan dengan lebih tepat batas-batas "yang benar-benar" didalam tabel yang baru-baru ini diterbitkan. Simpangan baku dari nilai APM sekarang ini dengan mudah diperoleh dengan suatu program komputer yang sesuai, misalnya. [19]. Disamping sifatnya pendekatan, Rumus Cochran bermanfaat didalam perencanaan dan perbandingan metoda eksperimental (lihat contoh di bawah). CONTOH Diassumsikan suatu perkiraan berdasarkan pada sistem pendeteksian APM untuk sumur 3 x 32 dalam suatu cawan microtitre 96-sumur.,Dengan faktor pengenceran f = 3, maka simpangan baku log APM sesuai dengan rumus Cochran adalah:

SD lg APM = 0,58

lg f 0,55 0,0149 = 0,0672 n

(3)

Dengan jumlah paralel tabung yang tinggi dan dengan faktor-faktor pengenceran kurang dari 10, sistem APM menjadi sama atau lebih baik dari pada metoda penghitungan koloni karena kondisi pertumbuhan yang lebih baik, penafsiran yang lebih mudah dan kurangnya kesalahan tumpang tindih. 6.1.4

Batas dari pendeteksian — Model Poisson

Pada konsentrasi partikel yang sangat rendah semua metoda mikrobiologi, termasuk APM dan penghitungan jumlah koloni, secara essensial menjadi sebuah metoda A/T. Perlu diperhatikan terutama dalam bidang kesehatan atau jaminan produk, dimana hasil penghitungan yang dibawah tiga atau empat sebagai hasil deteksi yang positif dari suatau keberadaan. Jika batas dari pendeteksian ditetapkan sebagai kemungkinan penilaian suatu hasil positif, maka akan tidak terbaca dalam grafik pada gambar 1. Peluang dari suatu hasil positif p(+) ketika distribusi Poisson berlaku dapat dihitung dari

p (+ ) = 1 − e − m

4

Keterangan : e

adalah dasar dari logaritma alami;

m adalah rata-rata jumlah partikel setiap bagian analisis. CONTOH Salah satu dari definisi populer untuk batas dari pendeteksian adalah konsentrasi di mana peluang pendeteksian keberadaan dari suatu analit setara dengan 95 % [p(+) = 0,95] Jika p(+) adalah dijadikan 0,95, kemudian e-m = 1 - 0,95 = 0,05. Penyelesaian persamaan untuk m menghasilkan In(0,05) =3,0. Jadi pada rata-rata jumlah 3, peluang untuk dari pendeteksian suatu partikel dalam bagian pengujian setara dengan 0,95 (dengan ketentuan bahwa distribusi Poisson berlaku).

© BSN 2010

20 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

6.2

Penyebaran yang berlebihan - Model binomial negatif

6.2.1

Umum

Upaya pembuatan suspensi dasar, inokulasi dan penghitungan kolini tidak sepenuhnya lepas dari ketidakpastian. Setiap tahapan teknis menambah ketidakpastian pada total variabilitas dari pengukuran. Pengukuran secara paralel yang melibatkan semua prosedur analisis tidak dapat diharapkan untuk mengikuti distribusi Poisson. Penyebaran yang berlebihan, semisal variasi yang lebih besar daripada acak lengkap (dalam pengertian Poisson) diantara pengukuran paralel akan dapat diamati.. Penyebaran yang berlebihan adalah status normal dari analisis pengukuran mikrobiologi dan distribusi Poisson adalah satu perkecualian. Penyebab umum dari penyebaran yang berlebihan, terlepas dari bias kesalahan, telah mempengaruhi secara sebanding dengan rata-rata atau jumlah sebenarnya dari koloni hasil penghitungan koloninyang dideteksi dalam set deteksi. Argumentasi lain mengapa pada penyebaran yang berlebihan dari penghitungan mikrobiologi mengikuti pola ini telah dijelaskan seperti pada refernsi 11.14]. Sebagai dasar ketidakpastian karena penyebaran partikel dalam suspensi yang mengikuti distribusi Poisson, total varian s2 mungkin dapat ditulis sebagai

s2 = c +u2 c2

(5)

Keterangan : u

adalah atas faktor penyebaran yang berlebihan, simpangan baku relatif dari tambahan ketidakpastian;

c

adalah jumlah koloni di keseluruhan susunan pendeteksian.

Bagian pertama dari varian (c) karena proses Poisson, sisanya (u2c2) karena pengaruh komdinasi semua faktor penyebaran berlebihan. Distribusi statistik seperti model varian ini disebut dengan suatu distribusi binomial nenatif (juga dikenal sebagai distribusi Poisson campuran atau heterologus). Sebagai akibatnya, simpangan baku relatif mungkin dapat dinyatakan sebagai :

RSD =

1 + u2 c

© BSN 2010

(6)

21 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Gambar 3 memperlihatkan efek dari tingkat perbedaan dari penyebaran yang berlebihan di terhadap total relatif presisi (koefisien variasi).

CATATAN Ketergantungan koefisien dari variasi (CV) terhadap jumlah (c) dari partikel yang dihitung dan variasi tambahan . GariskKurva lebih rendah: model Poisson dengan tanpa penyebaran yang berlebihan. Garis kurva yang lebih atas adalah binomial negatif dengan 15 % dan 30 % penyebaran yang berlebihan (u = 0,15 dan 0,30)

Gambar 3 - Efek dari penyebaran yang berlebihan terhadap CV Jumlah koloni diperlukan untuk mencapai suatu total presisi relatif adalah relatif lebih tinggi dalam kondisi penyebaran berlebihan dibandingkan didalam kasus acak Poisson. Hal ini dapat dihitung dengan cara memecahkan persamaan (6) untuk jumlah koloni c:

c=

1

(7)

RSD 2 − u 2

CONTOH Untuk mencapai simpangan baku relatif RSD = 0,2 ketika penyebaran yang berlebihan adalah u 0,15 memerlukan, sesuai dengan persamaan (7), jumlah koloni c = 1/(0,22 - 0,152) = 1/(0,04 0,0225) = 57, Presisi yang sama dicapai dalam suatu situasi acak secara penuh (Poisson) dengan jumlah koloni c = 1/0,22 = 1/0,04 = 25 CATATAN Jelas bahwa total presisi lebih rendah dari penyebaran yang berlebihan yang tidak dapat dicapai di dalam satu penentuan tunggal. Prosedur keseluruhan harus diulangi jika presisi yang lebih baik diperlukan. Dengan n penentuan paralel, total simpangan baku relatif mungkin dapat secara kasar diperkirakan dari

RSD =

1

∑c

+

u2 n

(8)

Keterangan :

∑c

adalah jumlah total koloni direkam;

u n

adalah konstanta pada overdispersion; adalah jumlah dari penentuan paralel.

© BSN 2010

22 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

6.2.2

Limit pendeteksian - Model binomial negatif

Batas pendeteksian, jika didefinisikan dalam kaitannya dengan probabilitas dari suatu hasil positif dapat dihitung dari probabilitas negatif. Mengutip Anscombe [11] tetapi mengubah simbol yang digunakan dalam laporan teknis, probabilitas hasil negatif (probabilitas nol) diberikan dengan rumus:

(

p0 = 1+ u 2 c

)

−1 / u 2

(9)

Menyelesaikan persamaan untuk c memberikan batas pendeteksian ketika peluang negatif dan faktor penyebaran yang berlebihan diberikan. −u 2 p0 − 1 (10) c= u2 Sebagaimana bukti dari Gambar 2, batas pendeteksian adalah sedikit dipengaruhi oleh penyebaran yang berlebihan (lihat contoh di bawah). CONTOH Jumlah koloni rata-rata diperlukan dalam rangka untuk mencapai peluang 95 % dari suatu hasil positif dalam kondisi penyebaran berlebihan tergantung pada faktor penyebaran yang berlebihan. Bila mengasumsikan faktor penyebaran yang berlebihan u = 0.30. Penggantian langsung dari peluang hasil negatif P0 = 1 p(+) = 1 - 0,95;= 005; didalam persamaan. (10) menghasilkan

(

)

c = 0,05 − u −1 / u 2 = (0,05-0,09- 1/0,09 = 3,44. Penilaian yang sesuai dengan distribusi Poisson (tidak 2

ada pada /pada penyebaran yang berlebihan) akan jadi c=In (1/0,05) = 3,00 (lihat contoh m 6.2 4).

6.2.3

Mengukur penyebaran yang berlebihan

Terdapat tiga cara utama untuk memperkirakan parameter u [20]. Metoda Anscombe I [11] effisien pada rentang nilai rata-rata dan faktor-faktor penyebaran yang diperlukan dalam validasi metode-metode penghitungan koloni. Ini mencakup penyelesaian persamaan (5) untuk menentukan u. Untuk bisa menggunakan metoda Anscombe I, suatu substansial seri (yang disukai lebih dari 30) dari observasi independen pada suatu contoh tunggal yang harus tersedia untuk menjadi dasar penilaian handal dari varian (s2) dan rata-rata (m) pada Persamaan (5) yang menghasilkan, ketika menggantikan m untuk c

u2 =

s2 − m m2

(11)

Untuk jadi efisien, observasi harus dibatasi pada jumlah koloni di dalam rentang kerja optimal. Rata-rata harus tidak pernah lebih kecil daripada 30. Hal ini dapat diterapkan terutama untuk memperkirakan u dalam experimen tunggal. CONTOH Untuk mendemonstrasikan kelayakan dari pada kalkulasi penyebaran yang berlebihan, suatu eksperimen dibuat untuk dengan bebas memperkenalkan penyebaran yang berlebihan dalam suatu penghitungan paralel 24 membran filtrasi yang dibuat dari suspensi kultur murni Enterococcus faecium, dimana 8 cawan petri diinokulasi oleh 8 ml, 10 ml dan 12 ml suspensi bakteri tersebut. Ini memperkenalkan suatu ketidaktepatan volume yang menyebabkan suatu jumlah perkiraan kasar penyebaran berlebih dari penghitungan 24 membran filter tersebut.

© BSN 2010

23 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Volume dihitung dari 8 ml x 8 ml, 8 ml x 10 ml, dan 8 ml x 12 ml mempunyai suatu rata-rata µ = 10 dan simpangan baku o= 1,633. Ketidakpastian standar relatif sehubungan dengan penyebaran yang berlebihan harus oleh karena itu adalah u = s / m = 0,163 3 (CV = 16,33 %), jika volume persis seperti dinyatakan. 24 jumlah koloni yang diamati mempunyai suatu rata-rata m = 379,29 dan varian s2 = 4 586,54. Sesuai dengan persamaan (11), u2 = (4586,54 - 379,29)/379,292 = 0,0292. Karenanya, pada koefisien penyebaran yang berlebihan u = √0,029 2 = 0,1710 adalah dosis yang cukup untuk nilai yang diharapkan, mempertimbangkan bahwa itu hal ini juga meliputi hitungan dan ketidakpastian volume yang diabaikan didalam yang diharapkan u = 0,1633 (Seluruh 8 ml, 10 ml dan 12 ml ukuran yang dipercaya tepat.) Penilaian ketidakpastian yang dihitung diatas yang tidak secara umum sah, karena didasarkan hanya pada suatu contoh. Solusi kedua adalah juga didasarkan pada persamaan (5) tetapi mempertimbangkan beberapa contoh uji. Membagi persamaan dengan c menghasilkan

Y=

s2 =1+ u 2c c

(12)

Kapanpun penentuan paralel tersedia, penilaian dari varian dan rata-rata dapat dihitung. Menghitung perbandingan Y = s 2 / c dari masing-masing susunan yang menyediakan sejumlah besar pasangan (Y,c). Keserongan (slope) dari garis regresi disesuai dengan titik yang memberikan perkirakan dari u2 . Penyebaran acak tak bisa diacuhkan dan patut dipertimbangkan jika penilaian dari rata-rata serta varian adalah didasarkan pada contoh uji yang sedikit (jumlah yang sedikit dari analisis parelel) (lihat contoh B.7). Keuntungan dari pendekatan ini adalah bahwa penilaian dari penyebaran yang berlebihan pada seleksi jumlah contoh uji yang besar dan berbeda sehingga dapat digunakan dalam skala umum. CATATAN Alasan di atas terpakai baik ketika mean (m) adalah jumlah koloni (partikel) yang tidak ditransformasi per set deteksidan set-set deteksi tersusun identik dalam semua analisis yang paralel.

6.2.4

Kelebihan pada tingkat detektor

Penghitungan secara parallel dari suatu suspensi tunggal mungkin juga variasi lebih dari yang distribusi Poisson perbolehkan. Ini merupakan observasi klasik [16]. Pada level ini yang hanya menjadi kasus penyebab dispersi berlebihan adalah kesalahan pemipetan, penghitungan ketidakpastian dan kesalahan bias (“kecelakaan”). Dispersi berlebihan adalah suatu alat pengukuran yang handal yang dapat dideteksi dengan dispersi indeks X 2 ,G 2 (lihat contoh B.6 dalam lampiran B). . 6.3 Statistik dan batas praktis

(

)

6.3.1

Umum

Batas kerja bawah dalam metode mikrobiologi adalah masalah perluasan definisi. Batas atas adalah persyaratan ruang yang menjamin terjadinya interaksi koloni mikroorganisme. Pertikel mikroorganisme tumbuh bermultiplikasi jutaan kali untuk dapat dilihat sebagai suatu koloni dengan mata telanjang.

© BSN 2010

24 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

6.3.2

Batas bawah

Ketika analisa dilakukan satu kali (satu cawan) maka batas bawah statistiknya dapat dinyatakan sebagai batas handal bawah dari penghitungan per cawan. Kehandalan didefinisikan oleh pilihan presisi. Batas bawah sebaiknya dipilih dekat dengan angka 20 koloni per set deteksi. Pada jumlah koloni yang kooefisien variasinya dalam kondisi random acak (Poisson) didapatkan ca ± 25% (6.1.4). Jika dispersi berlebih diketahui angkanya, penghitungan batas bawah dapat didasarkan pada model binomial negatif (6.2.2) 6.3.3

Batas atas

Analisis A/T tidak memiliki batas atas. Seperti pada jumlah kuman dalam peningkatan bagian analisis peluang deteksi keberadaannya mendekati keyakinan. Dengan metode APM, partikel batas atas dapat melebihi ketika semua tabung pengenceran positif. Kesalahan ini tidak menggambarkan batas atas pada metode itu sendiri, hanya kesalahan pengenceran saja. Batas atas tidak dapat dihitung untuk alasan secara statistik karena presisi tidak bergantung pada satu cara langsung yang sederhana dalam jumlah partikel yang dimasukan dalam set deteksi. Ini adalah karakteriswtik prosedur APM yang presisinya dapat ditingkatkan dengan merubah konfigurasi set deteksi. (lihat 6.1). Dengan metode penghitungan koloni, teori ketelitian dapat menunjukan jumlah target koloni yang tetap dalam observasi deteksi. Prakteknya, metode penghitungan koloni mempunyai batas atas per deteksi yang bervariasi sesuai dengan kondisi test. Deteksi penghitungan koloni (cawan agar, membrane filter) menjadi tersumbat “sumbatan” atau jenuh untuk beberapa alasan, salah satunya adalah jumlah koloni-koloni target adalah hanya satu. Banyak kasus dan sehingga banyak cara untuk memenetukan batas atas. Salah satu kemungkinannya adlah menetukan jumlah koloni per cawan ketika jumlah ketidakpastian (termasuk kesalahan sistematik) meningkat kembali ke level seperti pada batas bawah. [30]. Pertimbangan lain adalah terjadinya pertumbuhan koloni yang sangat padat dan tumpang tindih oleh pertumbuhan non target. Fenomena seperti ini dapat secara kuantitatif diperbaiki dengan metode seleksi atau lebih ilmiah untuk menjelaskan ‘penutupan’ ini, i.e. bagian ruang yang tersedia yang ditumbuhi oleh koloni. Bahkan kultur murni pun mempunyai batas atas tergantung pada ‘penutupan’ target pertumbuhan koloni yang tidak sesuai. Beberapa fenomena dapat dilakukan dengan metode kuantitatif secara selektif , atau metode lain yang lebih mendekati, contohnya pemisahan pada koloni tersangka. Biakan murni mempunyai batas atas yanga dapat dipercaya [25]. Aspek ketiga adalah kehilangan proporsinya (tidak linier) yang terjadi pada pertumbuhan yang padat pada cawan. 6.4

Uji umum untuk keacakan – deteksi dari penyebaran berlebihan

Deviasi dari pengambilan secara acak (presentase kelebihan – atau penyebaran yang rendah) dapat dideteksi secara efektif dengan satu dari dua tingkatan terbaik dari uji fit, viz. Indeks dispersi bakteri X 2 , D 2 , atau log-rasio kemungkinan statistic ( G 2 ). Perhitungan dari presentase indeks dapat dilihat pada lampiran A.

(

© BSN 2010

)

25 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Dalam hal ini (cawan secara parallel) dimana sebaran berlebihan tidak mempunyai alasan teknis yang dapat diterima, kesesuaian dengan distribusi Poisson dapat digunakan sebagai suatu metode test kinerja analis [16a,33]. Karena kesederhanaannya, karakteristik ini sangat berguna sebagai alat AQC.

7

Spesifikasi – Praktek saat ini

Salah satu contoh bagaimana prosedur standar yang terbaik menyatakan karakteristik kinerja metode, dapat ditemukan dalam bagaimana ‘Standard Methods for the Analysis of water and Wastewater’ (Metode Standar Analisa Air dan Air limbah) [8] mengintruksikan para pemakai menggunakan metodenya. Pada bagian yang berbeda dari prosedur membran filter untuk total coliform, para pengguna akan mendapatkan pernyataan yang berkaitan dengan spesifikasi: a) Ruang lingkup Ruang lingkup metode ini dapat dilihat dari tabel yang merekomendasikan volume contoh uji untuk tipe air yang berbeda. Tabel ini memuat semua jenis air minum, air untuk rekreasi dan juga air limbah. b) Ketahanan Inkubasi dan sensitivitas-waktu Peraturan utama diberikan sebagai berikut: "Inkubasikan selama 20 jam sampai 22 jam pada (35 ± 0,5)°C." Pada bagian lain dari perkecualian dokumen untuk peraturan utama disajikan. “Contoh uji air yang didisinfeksi mungkin menyertakan organisma yang ditekan yang tumbuh relatif lambat dan menghasilkan maksimum kilapan dalam 22 jam sampai 24 jam. Mikroorganisme dari sumber-sumber yang tidak terganggu bisa menghasilkan kilap pada 16 jam sampai 18 jam, dan kilapan selanjutnya memudar setelah 24 jam sampai 30 jam. c) Batas kerja yang dapat dipercaya Batas kerja yang dapat dipercaya dapat diduga dari : "Menghitung jumlah, menggunakan membran filter dengan 20 sampai 80 koloni...". Ini diikuti dengan reservasi lebih lanjut sehingga menghubungkan batas kerja dengan selektivitas: "...dan lebih daripada 200 koloni dari semua jenis setiap membran. "Beberapa alasan untuk hal tersebut ditemukan pada bagian lain dari dokumen itu: "Ukuran contoh uji akan ditentukan oleh kepadatan bakteri yang diharapkan, yang mana dalam contoh uji air minum akan dibatasi hanya dengan tingkat kekeruhan atau dengan tingkat pertumbuhan noncoliform pada media". d) Identifikasi dan definisi Target Semua bakteri yang menghasilkan sebuah koloni merah dengan suatu kemilau metalik di dalam 24 jam inkubasi pada 35°C pada suatu media jenis Endo dianggap anggotaanggota dari kelompok coliform. Kemilau mungkin mencakup keseluruhan koloni atau mungkin nampak hanya dalam suatu area tengah atau pada keliling/batas luar." Ada pertimbangan lebih lanjut: "Media jenis Endo adakalanya mungkin menghasilkan koloni tidak normal berwarna merah gelap tanpa suatu kemilau metalik. Verifikasi dari berbagai jenis koloni khusus (kemilau) dan tidak normal (tidak-kemilau) akan mendeteksi false negative dan memberikan pengalaman dalam pengenalan koloni."

© BSN 2010

26 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

e) Keterbatasan dan spesifikasi lain Dokumen standar juga menawarkan rekomendasi dan membuat usulan pentgingnya kontrol kualitas media dan peralatan analisis.

8

Spesifikasi – Pendekatan yang direkomendasikan

Secara umum, standar saat ini menyediakan sedikit bantuan untuk laboratorium yang menyakinkan bahwa mereka menerapkan metode yang baik dan memperoleh hasil yang valid. Apa yang nampaknya kekurangan adalah suatu presentasi ringkas dari apa yang laboratorium perlu lakukan untuk memverifikasi bahwa metode itu juga bekerja dengan baik di tangan mereka serta bagaimana cara untuk mengenali kinerja yang baik dari pencapaian yang tidak baik. Suatu bagian dari spesifikasi harus ditambahkan pada semua standar yang tertulis. Format untuk metode penghitungan jumlah koloni mungkin sebaiknya mencakup hal berikut: a) Sensitivitas: dengan sedikit pengecualian (kasus menyebutkan) lebih dari 90% dari yang positif ditetapkan dari uji presumptif. b) Selektivitas: pada umumnya lebih baik dari pada – 1 (lihat definisi selektivitas). Hasil tidak valid jika selektivitas kurang dari 2. c) Penghitungan ketidakpastian: simpangan baku relatif dari penghitungan duplo (ulangan) hitungan di dalam sebuah laboratorium pada umumnya kurang dari uZ = 0,05. Penghitungan ketidakpastian individual (satu orang) secara normal di bawah uZ= ± 0,03. d) Penghitungan cawan paralel : Variasi ada di dalam distribusi Poisson. (Jika tidak, tingkat penyebaran yang berlebihan harus diberikan.) e) Variasi intra-contoh uji mempunyai suatu koefisien ketidakpastian dengan penambahan kurang dari uX = ± 0,10 pada contoh uji air. Pada contoh uji benda padat, ketidakpastian yang ditambahkan harus tetap di bawah 0,15. f)

Proporsionalitas (linearitas) detektor tergantung pada selektivitas. Hal Itu cukup dengan batasan jumlah koloni yang diberikan di bawah ini: Selektivitas 0 -0,5 sampai -1 -1 sampai -2 Dibawah -2

Batas atas linearitas (koloni target per cawan) 500 (kultur murni) 200 sampai 100 100 sampai 25 Hanya pendeteksian A/T

Dengan pertumbuhan koloni yang berlebihan, batas atas fungsional mungkin dicapai lebih cepat. Tanpa tergantung dari nilai selektivitas, jumlah tidak valid jika lebih dari 1/3 ruang yang tersedia ditempati oleh pertumbuhan (target dan non-target). Hal di atas hanyalah satu contoh bagaimana spesifikasi yang nyata dari kinerja metode ditampilkan. Spesifikasi seperti itu dapat diuji dengan rancangan yang sesuai. Nilai numerik diberikan sebagai ilustrasi. Nilai tersebut tidak untuk dipahami sebagai nilai baku sekarang ini. © BSN 2010

27 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Jika informasi antara temubalik relatif dibandingkan dengan suatu acuan baku tersedia, hal itu juga harus diberikan. Jika data reproduksibilitas dari uji kinerja metode kolaboratif tersedia, maka harus ditambahkan sebagai informasi lebih lanjut. Sebagai tambahan, syarat pengujian, gambaran target dan tempat penyimpanan contoh uji harus ditetapkan.

9

Penentuan dan ekspresi dari karakteristik kinerja

9.1

Umum

Karakteristik kinerja berdasar pada frekuensi dari jenis kategori kualitatif disebut secara katagoris pada pembahasan berikut ini. Dalam hubungannya dengan metode selektif, karakteristik kinerja ditentukan dengan verifikasi presumptif baik pada kultur yang positif maupun yang negatif. 9.2 9.2.1

Karakteristik Kategori yang berhubungan dengan kekhususan dan selektivitas Umum

Tinjauan kualitatif yang paling komprehensif dari kinerja metode didapat dengan mempelajari contoh uji alami. Contoh uji tersebut sebaiknya mencakup ruang lingkup yang lengkap dari metode, termasuk contoh uji yang berbeda, keadaan terkontaminasi dan musim yang berbeda. Suatu koloni atau suatu plak setara dengan satu uji A/T atau satu tabung dalam satu seri APM. Di dalam validasi primer kedua, kultur presumptif baik yang positif maupun yang negatif harus diverifikasi. Cara yang paling hemat biaya dan yang menarik secara biologis dari pengujian metode kultur cair (keduanya baik A/T dan APM) adalah menggunakan desain APM. Tabung-tabung dalam pengenceran yang memberikan hasil positif maupun negatif diseleksi untuk proses verifikasi. Tabung-tabung tersebut adalah pengenceran dimana tabung positif dihasilkan dari pertumbuhan satu sel atau sel yang sangat sedikit. Karakteristik kinerja yang berhubungan dengan selektivitas dan kekhususan bisa didefinisikan secara numerik (17). Karakteristik kinerja berhubungan dengan proporsi relatif dari koloni atau tabung yang diasumsikan positif atau negatif atas dasar pengaruh pertama (presumptif) yang kemudian dibandingkan dengan 'kebenaran" setelah verifikasi. Setelah uji verifikasi n dibuat, hasilnya dibagi ke dalam empat kategori: a) Jumlah positif presumptif ditemukan positif (positif sebenarnya); b) Jumlah negatif presumptif ditemukan positif (negatif palsu); c) Jumlah positif presumptif ditemukan negatif (positif palsu); d) Jumlah negatif presumptif ditemukan negatif (negatif sebenarnya).

© BSN 2010

28 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Frekuensi ini dapat dinyatakan dalam tabel 2 x 2:

Perhitungan yang dikonfirmasi

+ -

Penghitungan Presumptif + a b c d a+c b+d

a+b c+d n

Karakteristik kinerja yang dihitung dari pengamatan ini ditetapkan sebagai berikut: 1.

Sensitivitas = a/(a + b), bagian dari total positif yang ditetapkan dengan benar pada penghitungan presumptif;

2.

Kekhususan = d/(c + b), bagian dari total negatif yang ditetapkan dengan benar pada penghitungan presumptif;

3.

Tingkat positif yang salah = c/(a + c), bagian dari positif yang diamati yang ditetapkan dengan salah;

4.

Tingkat negatif yang salah = b/(b + d), bagian dari negatif yang diamati yang ditetapkan dengan salah; Jumlah total uji adalah a + b + c + d = n.

5.

Efisiensi E adalah suatu parameter tunggal umum, yang koloni atau tabung yang ditetapkan dengan benar:

memberikan bagian dari

E = (a + d)/n. Koloni tersebut harus diambil secara acak dari semua koloni (target dan non-target) yang dianggap sebagai suatu keseluruhan. Dengan kultur cair, semua positif dan negatif mungkin diuji pada proporsi aktualnya. Sehubungan dengan pengaruh yang kuat dari operator dan populasi mikroorganisme, tidak suatu pun dari karakteristik kinerja yang dirinci di atas dapat mempunyai suatu nilai tetap metode-spesifik. Validasi kedua hanya perlu memperhatikan hasil positif yang salah (false positif), kecuali jika tingkat sensitivitaslebih rendah dibandingkan dengan yang dispesifikasikan dan terjadi berulang. 9.2.2

Selektivitas

Selektivitas dari suatu metode mikrobiologi ditetapkan dalam Laporan Teknis ini sebagai logaritma dari bagian koloni target presumptif (positif presumptif) terhadap total:

F = lg[(a + c ) / n] Selektivitas dapat menjadi rendah dalam beberapa jenis contoh uji atau selama musim tertentu sehingga suatu penghitungan target y ang dapat dipercaya tidak dapat diperoleh. Selektivitas sangat mempengaruhi rentang kerja atas.

© BSN 2010

29 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Selektivitas "presumptif" yang ditentukan di atas merupakan suatu alat yang diseleksi demi kenyamanan. Jika sumber-sumber daya tersedia, selektivitas riil yang didasarkan pada penghitungan yang diverifikasi dari positif yang benar, secara ilmiah lebih baik. Batasan ekonomis mungkin membatasi penggunaannya untuk perbandingan akhir diantara metode. Selektivitas yang nyata bervariasi sekali karena pengaruh musiman dan penyebab lain yang merubah kelimpahan relatif dari target dan latar belakang populasi . Ini bukan suatu konstan metode-spesifik. Meskipun demikian, selektivitas memberikan informasi tentang kinerja metode dan mungkin membantu memilih diantara alternatif. Berbagai macam kasus sebaiknya dipelajari. Karena tidak tersedia kriteria keputusan, tidak ada dasar untuk memutuskan jumlah spesifik yang cukup. Sebaiknya dikumpulkan cukup data untuk menyakinkannya. 9.3 9.3.1

Batas kerja Batas bawah untuk pendeteksian dan penentuan

Batas kerja bawah merupakan suatu persoalan definisi dalam semua metode (lihat ketentuan 6). Nilainya, batas harus dinyatakan sebagai jumlah cukup untuk koloni atau partikel yang paling rendah pada setiap rangkaian pendeteksian atau cawan paralel. 9.3.2

Batas atas

Setiap metode, sebenarnya setiap individual analisis/penentuan, mempunyai suatu batas atas yang dapat dipercaya. Ini bukan angka tetap yang jelas, tetapi agak berada di daerah kabur dari jumlah koloni ketika jumlah penghitungan per cawan menjadi terlalu tidak meyakinkan untuk suatu penentuan yang valid. Batas kerja atas dari suatu detektor koloni disyaratkan sebagai berikut. a)

Penyebaran berlebihan dari jumlah koloni paralel mungkin menjadi lebih nyata dan lebih sering. Situasi itu dapat dikenal dengan pertolongan dari indeks penyebaran Poisson (Contoh B.3).

b)

Jumlah koloni dari pengenceran yang berbeda (volume) tidak cocok. Proporsionalitas (linearitas) hilang. Proporsionalitas dapat diuji dengan metode yang didasarkan pada indeks G2 (lampiran A, dan contoh B.4).

Uji proporsionalitas (linearitas) lebih efektif dari keduanya. Kedua fitur dapat diselidiki dengan penggunaan suatu uji proporsionalitas tunggal yang dirancang secara khusus (lampiran C) [27, 33] atau dengan mengumpulkan data pada elemen-elemen di atas dari uji terpisah. 9.4

Rentang Kerja dari Prosedur APM

Batas praktis atas dan bawah dari prosedur APM merupakan kasus ekstrem ketika hanya satu tabung dalam set pendeteksian yang positif atau negatif. Oleh karena itu rentang aplikasi yang nyata dari suatu set pendeteksian 3 x 5 adalah 0,2 sampai 160 partikel per volume unit (bagian analitis) dari seri pertama (paling sedikit diencerkan), tanpa tergantung dengan media nutrien atau populasi target.

© BSN 2010

30 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

9.5 9.5.1

Presisi Umum

Setiap pengukuran analitis sebaiknya disertai dengan suatu perkiraan presisi, meskipun tidak mungkin untuk menentukan secara eksperimen presisi dari setiap penentuan individual. Oleh karena itu, ada kepentingan yang sungguh-sungguh dalam mendapatkan pernyataan presisi valid yang umum untuk metode yang berbeda. Idealnya, validasi primer sebaiknya memberikan suatu perkiraan umum dimana presisi dari pengukuran dapat didasarkan. Hal ini hanya mungkin dalam mikrobiologi dengan dua cara. Orang harus mengasumsikan keacakan total, dan sebagai akibatnya validitas dari distribusi Poisson, atau menentukan suatu tetapan umum dari penyebaran berlebihan dengan eksperimen. Perkiraan presisi dapat diperoleh dengan dua cara yang berbeda yang dinamai Tipe A dan Tipe B (lihat ketentuan 2) [5, 6]. 9.5.2

Perkiraan presisi Tipe A

Perkiraan Tipe A berasal dari kalkulasi statistik berdasarkan pada penentuan paralel. Tipe ini dinyatakan sebagai simpangan baku (ketidakpastian standar) atau simpangan baku relatif. Perkiraan Tipe A yang paling umum diperoleh dari uji kinerja metode kolaboratif sesuai dengan prinsip-prinsip yang terutama yang dikembangkan oleh AOAC [18]. Perkiraan Tipe A dari pengukuran mikrobiologi sejauh ini telah dihitung dan dinyatakan sebagai simpangan baku pada skala logaritmik. Perkiraan seperti itu belum menunjukkan kegunaannya pada standar mikrobiologi. Seperti diskusi pada ketentuan 6, presisi dari penentuan mikrobiologi tidak tetap bahkan dalam skala logaritmik, tetapi tergantung pada jumlah koloni. Itu merupakan satu alasan mengapa perkiraanumum Tipe A selalu mendekati dan cenderung untuk menjadi besar. 9.5.3

Perkiraan presisi Tipe B

Perkiraan Tipe B didasarkan pada distribusi probabilitas yang diasumsikan atau informasi lain. Distribusi Poisson telah dianggap suatu model statistik yang sesuai pada suspensi acak dengan sempurna dalam mikrobiologi. Pernyataan presisi yang didasarkan pada distribusi Poisson cukup umum dalam standar mikrobiologi. CONTOH Metode Standar Amerika meliputi pernyataan ketidakpastian Tipe B berikut ini: "Untuk hasil dengan hitungan, c, lebih besar dari 20 organisme, hitung kira-kira 95% batas kepercayaan menggunakan persamaan distribusi normal berikut: Batas atas

= c +2 c

Batas bawah

=c-2 c

Simpangan baku dalam hal ini jelas didasarkan pada asumsi dari persamaan dari varian dan rata-rata (Poisson). © BSN 2010

31 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Untuk alasan yang didiskusikan dalam ketentuan 6, model Poisson sangat diidealkan dan menghasilkan perkiraan ketidakpastian minimal. Hal itu mempunyai keuntungan yang berbeda sehingga suatu perkiraan individual dapat dihubungkan ke setiap penentuan. 9.5.4

Model campuran

Suatu model penyebaran berlebihan yang didasarkan pada distribusi binomial negatif menggabungkan elemen Poisson teoritis dengan suatu konstan penyebaran berlebihan empiris (lihat 6.2.3). Penentuan dari faktor penyebaran berlebihan merupakan suatu tujuan realistis untuk validasi primer. Metode untuk menentukannya dibicarakan pada (6.2.3). Nilai ketidakpastian sebaiknya diberikan untuk aplikasi yang berbeda dari suatu metode jika itu bervariasi dari situasi ke situasi. Hal itu mungkin tergantung pada matriks yang akan dipelajari dan dinyatakan sebagai simpangan baku relatif. 9.5.5

Presisi dari APM

Perkiraan APM mengandalkan pada asumsi dari keacakan lengkap dari distribusi partikel dalam set pendeteksian. Dengan jumlah partikel rendah yang terlibat, kepercayaan ini tidak dengan mudah ditantang dengan pengujian eksperimental. Presisi dari perkiraan APM ditentukan dengan jumlah dari tabung paralel per pengenceran dan dengan koefisien pengenceran. Suatu pendekatan rumus, mengasumsikan suatu ketidakpastian tetap lebih dari rentang jangkauan, diberikan pada [12]. Batas kepercayaan 95 % untuk kombinasi standar dari tabung dipublikasikan pada tabel APM (lihat juga 6.1).

10

Prosedur dan tahapan validasi

10.1

Umum

Validasi selalu berjalan bertahapan. Penyelidikan kinerja metode yang aktual harus didahului dengan suatu pencarian rentang kerja yang dapat dipercaya dimana kinerja metode adalah relevan. Penemuan perbandingan apapun diantara dua metode harus dibatasi pada kasuskasus dimana kedua metode tersebut dapat dipercaya. 10.2 10.2.1

Validasi Primer Identifikasi Target

Studi kultur murni selama pengembangan awal dari suatu metode, memberikan gambaran dasar dari koloni target atau tabung A/T. Jelas, lebih dari satu keturunan (strain) kultur murni dari target harus diuji. Validitas dari gambaran dasar harus dibuktikan dengan menggunakan metode yang diusulkan atas contoh uji alami yag pilihan secara representatif (lihat 4.2.6). Koloni target presumptif, plak atau kultur diuji dengan mengisolasi kultur dan membuat uji konfirmasi yang sesuai. Koloni non-target presumptif atau tabung-tabung negatif diuji dengan cara yang sama. Nilai numerik dari sensitivitas, selektivitas, tingkat kesalahan positif dan kesalahan negatif dan efisiensi, dihitung. © BSN 2010

32 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Gambaran target dikembangkan jika perlu. 10.2.2

Menghitung Ketidakpastian dan sensitivitas waktu

Setelah morfologi target didefinisikan dengan baik, metode digunakan secara tentatif pada suatu koleksi contoh uji alami. Basis kehandalan dari penghitungan dipelajari dengan menghitung ulang koloni dari cawan yang sama dalam jangka waktu yang pendek. Jika lebih dari satu orang di laboratorium bekerja dengan metode itu maka semuanya harus terlibat. Hasil perhitungan dari sensitivitas waktu sangat baik dipelajari dari hubungan pada hitungan cawan yang sama pada dua titik waktu : pada permulaan dan pada akhir dari asumsi kisaran toleransi waktu inkubasi. Pengaruhnya dievaluasi dengan menggunakan ketidakpastian dari menghitung ulang sebagai dasar perbandingan. Latihan akan menghasilkan perkiraan numerik individu atau kolektif dari ketidakpastian hitungan, yang dinyatakan sebagai simpangan baku relative (contoh B.1 dan B.2). Perhitungan simpangan baku dari hasil orang yang berbeda adalah lebih informatif daripada yang dihitung dari hitungan rangkap oleh satu orang. (Satu orang jika dihitung rangkap, bisa salah, bisa sangat tepat) perbedaan sistematik antar orang-orang juga dapat dideteksi dan dievaluasi. Pengamatan pada penghitungan ketidakpastian dan sensivitas waktu akan memberikan indikasi pertama dari masalah potensial dengan digunakannya secara luas dari metode tersebut. 10.2.3

Fitur ketangguhan lainnya

Jika ada keraguan tentang pengaruh temperatur inkubasi, kelembaban atau atmosfer gas, hal tersebut dapat dipelajari dengan uji khusus yang melibatkan inkubasi secara paralel dari sub contoh uji dibawah kondisi alternatif Direkomendasikan bahwa keputusan pada kasus ini didasarkan pada uji statistik jadi bukan hanya perkiraan saja. Rancangan percobaan didasarkan pada rancangan faktorial dari analisis varian biasanya paling sesuai. Faktor yang tidak diuji secara khusus dianggap tidak efektif atau dibawah kontrol. 10.2.4

Batas kerja atas

Setelah ditetapkan kondisi-kondisi “lingkungan” dan karakteristik target, langkah selanjutnya adalah menyelidiki batasan kuantitatif yang dimasalahkan pada detektor. Hal ini dapat dilakukan dengan suatu jenis eksperimen tunggal: suatu rangkaian pengenceran atau volume yang diratakan dengan baik, secara paralel [21,25]. Pelatihan ini memberikan data untuk menaksir batas atas berdasarkan proporsionalitas dan kemampuan ulang (lampiran C).

© BSN 2010

33 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

10.2.5

Presisi

Laboratorium yang bertanggung jawab untuk memperkenalkan suatu metode baru selayaknya juga bertanggung jawab untuk memberikan nilai awal dari perkiraan presisinya. Ini semua harus mencakup penilaian dari perhitungan ketidakpastian dan kemampuan ulang serta penilaian reproduksibilitas dengan pengulangan yang berbeda (cawan paralel, seri pengenceran paralel, matriks). Laboratorium lain membutuhkan informasi ini untuk validasi sekunder dari metode untuk menetapkan sistem dari pengendalian mutu analitis. Jika tidak ditemukan dasar yang cukup untuk menghitung suatu perkiraan tipe B dari asumsi atau distribusi statistik yang diketahui dan informasi lain, percobaan contoh uji yang terbagi dan contoh uji paralel dibuat untuk memperoleh perkiraan yang tepat dari tipe A. Studi kinerja metode kolaboratif [18] yang melibatkan beberapa laboratorium adalah tidak sesuai untuk validasi dari metode baru karena mereka beranggapan bahwa setiap peserta mempunyai pengalaman yang mantap dengan metode tersebut. Nantinya ini akan menjadi mungkin. 10.2.6 Temubalik sebenarnya dan relatif Temubalik absolut (nilai sebenarnya) dari analit mikrobiologi adalah tidak dapat diukur, hal ini adalah suatu masalah dalam validasi primer dari suatu metode baru tersebut. Temubalik yang sebenarnya dapat diperkirakan dengan uji pada kultur murni atau menggunakan contoh uji spike menggunakan suatu metode non-selektif sebagai acuan. Beberapa bahan acuan yang bersertifikat juga tersedia untuk tujuan ini. Untuk mengamati temubalik relatif, contoh uji alami dipelajari dengan metode yang diusulkan dan suatu metode acuan secara paralel. Temubalik yang rendah dibandingkan dengan temubalik pada metode standar adalah suatu alasan yang kuat untuk meragukan metode itu. Agar dapat dipercaya perbandingan harus didasarkan pada jumlah koloni yang dikonfirmasikan. 10.2.7

Spesifikasi

Karakteristik kinerja numerik yang diamati sebaiknya ditulis pada suatu bagian dari spesifikasi dalam protokol metode yang sesuai dengan 7 c). 10.3

Validasi sekunder

Sejumlah contoh uji alami sebaiknya diperoleh. Contoh uji yang terbagi atau seri pengenceran dengan pengulangan dikaji dengan cawan yang paralel. Penghitungan secara duplo dilakukan untuk menghitung pencapaian kinerja yang diharapkan. Sejumlah presumtif positif (sedikitnya 100) sebaiknya diisolasikan dan diuji. Karakteristik kinerja kategoris dihitung dan diperbandingkan dengan nilai-nilai yang sudah ditentukan , jika tersedia.

© BSN 2010

34 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

11 11.1

Rancangan untuk menentukan spesifikasi Model umum untuk spesifikasi kuantitatif dasar

Suatu rancangan percobaan yang didasarkan pada rancang yang baik pada suatu seri pengenceran atau volume dengan ulangan cawan dan hitungan memberikan data untuk menentukan batas kerja atas dan beberapa spesifikasi kuantitatif lainnya (contoh B1, lampiran C). Rancangan yang sesuai adalah suatu versi yang disederhanakan [27] dari suatu rencana yang digunakan sebagai suatu uji kinerja analis [33]. Suatu contoh uji cair dengan hati-hati dicampur atau suatu suspensi dari suatu bahan padat yang dicairkan terlebih dulu supaya memberikan kerapatan yang diharapkan dari suatu jumlah koloni per cawan yang sedikit agak melebihi batas atas yang diasumsikan dari kinerja detector. Suatu seri dari enam atau tujuh berikutnya dengan tahap pengenceran 1 : 2 dilanjutkan dari suspensi awal. Tiga cawan secara paralel ditanami dari masing-masing pengenceran. Cawan dari pengenceran rata-rata lebih dari 20 koloni per cawane yang telah diberi kode dibaca secara random oleh satu orang. Jika semua atau suatu sub susunan cawan yang dipilih secara acak dibaca oleh orang kedua, hasilnya akan memberikan data hitungan ketidakpastian yang sama baiknya. Dengan banyak metode, penampilan khusus dari koloni target mungkin berubah selama waktu yang diperlukan untuk melakukan perhitungan duplo dari suatu seri cawan secara ekstensif. Jumlah yang disetujui /tidak setuju seharusnya diuji secara terpisah. CATATAN Seri geometrik didasarkan pada tahap pengenceran 1:2 adalah agak kasar. Jumlah koloni pada tahap awalnya menurun drastis . Metode dengan suatu batas kerja atas yang rendah tidak dapat dievaluasi secara efisien. Suatu perbandingan pengenceran yang lebih kecil dari 1:2 direkomendasikan pada kasus seperti itu.

Metode saringan membran memudahkan variasi dari volume contoh uji, memungkinkan lebih banyak variasi yang lebih sesuai. Sebagai contoh dalam hal ini adalah suatu seri aritmatik dengan perbandingan volume 1:2:3:4:5:6:7 dapat dipraktekkan. Hal ini mempunyai keuntungan tambahan bahwa semua porsi tes berasal dari suspensi tunggal. Data dianalisis secara proporsional, penyebaran berlebihan dari paralel dan ketidakpastian hitungan, dengan asumsi acak sempurna pada setiap tahapan sebagai dasar evaluasi. Desain unit (contoh B.1, lampiran C) hanya melibatkan satu contoh uji. Suatu rencana yang serupa harus diulang dengan banyak contoh uji (minimum sepuluh) untuk mampu menyamaratakan hasilnya. Perhitungan statistik didasarkan pada prosedur terperinci pada lampiran A, dengan contoh praktis B.3 dan B.4 pada lampiran B. 11.2

Presisi dari seluruh prosedur analitis

Rencana yang digambarkan pada 11.1 tidak menunjukkan presisi dari seluruh prosedur analitis. Untuk menentukan presisi dari penentuan, pengujian dengan contoh uji yang dibagi atau dibutuhkan seri ulangan pengenceran (contoh B2, lampiran C).

© BSN 2010

35 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Sebaiknya diperoleh contoh uji alami dengan medium atau analit dengan jumlah tinggi. Setelah prosedur pencampuran yang standar, ditetapkan ulangannya. Cawan yang paralel direkomendasikan walaupun tidak selalu diperlukan. Sedikitnya tiga puluh contoh uji mencakup seluruh ruang lingkup yang dibutuhkan untuk memenuhi kecukupan yang memadai. Jumlah dari penentuan paralel (seri pengenceran) per contoh uji sebaiknya paling sedikit dua. Lima atau enam penentuan paralel memberikan hasil yang lebih dapat dipercaya. Walaupun direkomendasikan, jumlah paralel tidak perlu sama untuk setiap contoh uji. Hasilnya digunakan untuk menghitung konstanta penyebaran berlebihan (6.2.3) dengan cara yang digambarkan untuk cawan paralel dalam contoh B.7. 11.3

Karakteristik kategori

Karakteristik yang terkait dengan selektivitas, sensivitas, spesifitas, dll (9.2) dapat dipelajari hubungannya dengan uji yang digambarkan pada 11.2 kecuali waktu kerja menjadi suatu faktor pembatas Cawan dengan jumlah yang rendah, yaitu secara teknik dan biologis dapat dipercaya, jumlah koloni dipilih. Semua koloni dari jenis target dan non target dihitung. Dalam validasi primer, koloni-koloni dari kedua jenis dipisahkan secara acak untuk diverifikasi. Jumlah harus “tidak kecil” artinya sekurang-kurangnya 20 atau 30 dari dua jenis per contoh uji, jika tersedia. Dua jenis koloni tidak perlu dari pengenceran yang sama selektivitas tidak memungkinkan. Ketika selektivitas adalah tinggi (koloni target lebih dari 90%) hal itu mungkin tidak perlu untuk mengisolasi koloni-koloni presumtif negatif. Dalam validasi kedua, hanya koloni-koloni presumtif positif perlu diisolasi dan diverifikasi. 11.4

Data tidak terencana

Hasil dari bermacam pengamatan paralel yang dikumpulkan dalam waktu lama tanpa rancangan khusus dapat digunakan sebagai informasi tambahan untuk mendukung atau mengembangkan batas kerja yang tinggi atau spesifikasi penyebaran berlebihan.

© BSN 2010

36 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Lampiran A (normatif)

Prosedur statistik dan program komputer

A.1

Ketidakpastian penghitungan

Ketidakpastian penghitungan diperkirakan dengan membaca cawan pertumbuhan yang sama lebih dari satu kali. Dari hasil ini, simpangan baku atau simpangan baku relatif dapat dihitung. CATATAN Akronim tiga huruf seperti RSD bisa membingungkan dalam rumus matematika, , huruf u digunakan secara konsisten sebagai simbol untuk simpangan baku relatif.

Diasumsikan suatu cawan (tidak diketahui) berjumlah x koloni karakteristik dan ditandai dengan x1 , x 2 ,......, x n jumlah yang diamati dalam cawan oleh orang yang sama berulang kali atau oleh orang yang berbeda. Menghitung ketidakpastian uz dinyatakan sebagai simpangan baku relatif:

uz =

s( x ) x

dimana

s(x ) =

∑ (x

− x)

2

i

n −1

dalam hal penghitungan duplikat, cara yang sama dapat dihitung dari

uZ =

2 x1 − x2 x1 + x2

Sejumlah besar kasus (cawan) dengan sedikitnya 20 koloni masing–masing diambil secara acak lebih dari waktunya, tidak dipilih seperti biasanya. Rata-rata kuadratnya diambil sebagai perkiraan penghitungan relatif rata-rata ketidakpastian.

uZ =

2 u Z21 + u Z2 2 .... + ....u Zn n

Untuk penilaian yang dapat dipercaya, n harus ada paling sedikit 30. Tergantung pada orang yang berpartisipasi, berikut istilah yang digunakan: -

Keberulangan individu (atau pribadi) ; ringkasan hasil dari satu orang yang membaca cawan yang sama sebanyak dua kali (atau lebih)

© BSN 2010

37 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

-

Keberulangan dalam laboratorium: nilai rata-rata bobot (kuadrat) dari keberulangan individu dari personil laboratorium; suatu ringkasan tentang hasil hitungan yang diduplikasi atau disalin dari seluruh personal.

-

Reproduksibilitas dalam laboratorium: rata-rata (kuadratik) dari hasil beberapa orang dari laboratorium yang sama pada pembacaan cawan yang sama.

-

Reproduksibilitas diantara laboratorium: hasil rata-rata (kuadratik) dari orang di laboratorium yang berbeda yang membaca cawan yang sama.

Lihat contoh B.1, B.2, dan B.3 A.2

Uji umum dari proporsionalitas (linearitas)

Misalkan n adalah jumlah koloni dari c1, c2, …….cn yang didapat dari studi suspensi tes yang sama dalam volume atau pengeceran yang berhubungan dengan jumlah R1, R2…..Rn. Perkiraan kemungkinan log dari proporsionalitas (linearitas) dari jumlah, dapat dihitung dari

⎡ ⎛ ∑ c ⎞⎤ c c c ⎟ G n2 −1 = 2 ⎢c1 In 1 + c 2 In 2 + ..... + c n In n − (∑ c )xIn⎜ ⎜ ∑ R ⎟⎥ R R R ⎢⎣ 1 2 n ⎝ ⎠⎥⎦ Suatu program BASIC untuk menghitung G 2 dilampirkan. Suatu nilai panduan yang diperoleh dengan merujuk ke tabel χ 2 dengan derajat kebebasan n - 1. Nilai yang melebihi nilai pada tabel menunjukkan permulaan dari proporsionalitas pada tingkat probabilitas yang dipilih. CATATAN rumus ini dapat digunakan untuk menguji persesuaian cawan paralel juga memberikan =Rn = 1) untuk setiap volume relatif. Hasilnya biasanya angka yang sama (misalnya R1,=R2= hampir sama seperti indeks penyebaran Poisson yang diberikan pada A.3.

Suatu program BASIC untuk menghitung kemungkinan log umum indeks rasio G2 sesuai dengan A.2. Lihat contoh B.5. 10

print “LIKELIHOOD RATIO INDEX G^2”

20

INPUT “NUMBER OF TERMS, n = “N

30

C=0: R=0:T=0:D=0

40

FOR I= 1 TO N

50

PRINT “I=“;I

60

INPUT “COLONY COUNT =“;C

70

INPUT “RELATIVE VOLUME =”;R

80

IF C=0 THEN W=0: GO TO 100

90

W=C”LOG (C/R)

100

S=S+W

110

T=T+R

120

D=D+C

130

NEXT I

140

Y =2”(S-D*LOG(D/T)

© BSN 2010

38 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

150

Y =(INT(1000*Y+0.5))/1000

160

PRINT

170

PRINT “INDEX G^2=”;Y

180

PRINT

190

PRINT

200

INPUT “ANOTHER SET?(Y/N)”;A$

210

IF A$=”Y” OR A$=”Y”GO TO 20 ELSE 220

220

END

CATATAN Pada versi BASIC ini LOG berarti logaritma dasar. Pada versi lain symbol LN mungkin diperlukan pada baris yang bernomor 90 sampai 140.

A.3

Indeks Penyebaran Poisson

Jumlah koloni paralel c1, c2, …….cn dari bagian yang sama untuk suspensi campuran penuh dapat diuji untuk keacakan dengan menghitung indeks penyebaran Poisson:

n∑ ci2 − (∑ ci )

2

X

2 n −1

=

∑c

=

i

n∑ ci2

∑c

− ∑ ci

i

CATATAN 1

Simbol D , χ dan T1 sering juga digunakan X

CATATAN 2

Rumus umum

2

2

2

G 2 pada A.2 malahan dapat digunakan

Penyebaran yang berlebihan (over dispersion) dapat dideteksi dengan menunjuk pada tabel distribusi χ 2 dengan derajat kebebasan n-1 Pisahkan X 2 yang angka pentingnya kecil, terutama sekali jika jumlah cawan paralel (n) adalah kecil. Hal itu direkomendasikan bahwa jumlah besar (sedikitnya 100) dari susunan cawan paralel yang dipelajari lebih dari periode yang panjang. Contoh uji harus merupakan sumber dan alasan yang berbeda. Nilai X 2 dan derajat kebebasan adalah (aditif) bahan tambahan. Persetujuan umum tentang beberapa susunan paralel dapat diuji dengan membandingkan jumlah dari nilai X 2 dengan nilai teoritis χ 2 dengan derajat kebebasan yang sesuai dengan jumlah derajat kebebasan. Tes tersebut sangat kuat. Ketika sekitar 100 individu nilai X 2 tersedia, mereka dapat dikelompokkan dalam kelas frekuensi, dengan batasan kelas yang dibaca dari tabel χ 2 yang sesuai. Frekuensi yang diamati dapat dibandingkan dengan frekuensi yang diharapkan sesuai dengan distribusi teoritis. Membandingkan distribusi frekuensi dari dua metode dengan cara ini lebih informatif dibanding jumlahnya saja (lihat Contoh B.6). Suatu program BASIC untuk menghitung indeks penyebaran Poisson X 2 diberikan pada A.3.

© BSN 2010

39 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Lihat juga contoh B.6. 10

PRINT “DISPERSION INDEX X^2

20

INPUT “NUMBER OF PARALLELS,n=”;n

30

S1=0: S2 = 0

40

FOR I=”;I

60

INPUT “COLONY COUNT=”;C

70

S1=S1+C

80

S2=S2+C^2

90

NEXT I

100

X =(N”S2-S1^2)/S1

110

X2=(NT(1000*X+0.5))/1000

120

PRINT

130

PRINT “INDEX X^2=”X2

140

PRINT

150

INPUT “ANOTHER SET?(Y/N)”A$

160

IF A$=”Y” OR A$=”y” GOTO 20 ELSE 170

170

END

© BSN 2010

40 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Lampiran B (informatif)

Contoh numerik

B.1

Umum

Contoh B.1, B.2 dan B.3 adalah tentang keberulangan dan reproduksibilitas, yaitu hasil dari membaca cawan yang sama oleh satu atau lebih orang. Contoh B.4 berhubungan dengan ketangguhan hasil berkenaan dengan waktu inkubasi. Contoh B.5 menggambarkan suatu analisis linearitas. Contoh 6 menunjukkan cara untuk menggunakan informasi yang terkandung dalam cawan parallel dan contoh B.7 menggambarkan hitungan dari penyebaran yang berkelebihan yang tetap dari data tes paralel. Contoh yang disajikan pada B1 sampai B3 menggambarkan perhitungan yang direkomendasikan ketika hasil hitungan duplikat atau replika tersedia. Hasil seperti itu didasarkan pada membaca cawan yang sama berulang kali menurut kondisi yang sama, yaitu didalam suatu jarak waktu yang lebih pendek dibanding dengan asumsi toleransi yang diperbolehkan untuk metode tersebut. Dalam praktek waktu rata-rata ini adalah interval maksimum 1 jam. Tergantung pada orang-orang yang berpartisipasi, perhitungan formal yang sama (lihat A1) menghasilkan perkiraan dari pencakupan berbeda. Cawan perhitungan yang diulang sebaiknya diseleksi secara acak, dengan mengabaikan cawan yang mengandung kurang dari 20 koloni. Bila tidak, cawan tersebut sebaiknya merepresentasikan rentang rangkaian aplikasi keseluruhan dari metode tersebut. Untuk suatu penilaian umum yang layak dapat dipercaya, sedikitnya 30 kasus yang harus tersedia. Keterulangan antar laboratorium dapat dipelajari dengan baik dengan mengumpulkan analis dalam suatu sesi umum daripada mengirimkan dan mengedarkan cawan petrinya. CATATAN Dalam penghitungan mikrobiologi yang paling mudah, sebagai penghitungan koloni dari suatu kultur murni dalam medium reguler untuk membran filter, hasil penghitungan jumlah dapat diharapkan masuk dalam keterulangan dengan simpangan baku lebih baik daripada 2 % (RSD < 0.02). Hal ini berlaku hampir sama ketika penghitungan diulang oleh satu orang atau oleh orang yang berbeda dari laboratorium yang berbeda sampai beberapa ratus koloni per pawan. Ketika koloni target harus diidentifikasi dalam suatu populasi campuran berdasarkan perbedaan warna, ukuran, bentuk, tekstur atau reaksi dengan media pertumbuhan, tugas penghitungan menjadi lebih sulit. Satu orang analis dapat sering mengulang jumlah yang cukup akurat tetapi deviasi antara analis yang berbeda menjadi besar. Berapa besar suatu ketidaktentuan dapat ditoleransikan dalam suatu metode yang valid belum diputuskan. Simpangan baku relatif lebih besar dripada 0.1 (lima sampai sepuluh kali RSD dari hitungan kultur murni) adalah suatu tanda tertentu dari suatu masalah atau kesulitan.

© BSN 2010

41 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

B.2

Contoh B.1 – Keberulangan penghitungan personal

B.2.1

Umum

Dalam contoh data riil berikut pada jumlah total koloni pada media non-selektif, keterulangan simpangan baku relatif adalah biasanya lebih besar daripada “ideal” (RSD < 0.02) seperti yang ditunjuk diatas. Orang A dan B, bekerja pada laboratorium yang sama secara independen, membaca cawan yang berbeda dua kali dalam suatu jangka waktu singkat. Jumlah duplikat ditunjukkan dengan x1 dan x 2 . B.2.2

Perhitungan

Rata-rata ( m ) dan simpangan baku ( s ) dari masing-masing pasangan dihitung pertama kali. Dari mereka nilai-nilai RSD = s / m diperoleh (kolom yang kedua dari belakang). Cawan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

x1

x2

m

s

129 417 73 49 86 37 112 204 66 306

122 377 80 52 81 39 115 214 71 299

125,5 397,0 76,5 50,5 87,5 38,0 113,5 209,0 68,5 302,5

4,95 28,28 4,95 2,12 3,54 1,41 2,12 7,07 3,54 4,95

RSD 0,0394 0,0712 0,0647 0,0420 0,0423 0,0372 0,0187 0,0338 0,0516 0,0164

Orang A A A A B B B B B B

Penilaian kemampuan dapat mengulang rata-rata perseorangan diperoleh sebagai berikut: Orang A:

RSD A =

0,0394 2 + 0,0712 2 + 0,0647 2 + 0,0420 2 = 0,056 4

Orang B:

RSD B =

0,04232 + ...... + 0,0164 2 = 0,036 6

Untuk memperoleh keterulangan simpangan baku relatif yang disertakan dalam kelompok pada laboratorium dimana A dan B adalah teknisi, rata-rata kuadrat dari semua sepuluh nilai dapat dihitung dengan cara yang sama.

RSD c =

0,0394 2 + 0,0712 2 + ...... + 0,0164 2 = 0,046 10

© BSN 2010

42 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Suatu penilaian yang tidak disertakan dalam kelompok bias lebih sesuai. Hal itu dapat diperoleh dengan mengambil rata-rata kuadrat dari rata-rata perseorangan:

RSDc =

RSD A2 + RSDB2 = 2

0,056 2 + 0,036 2 = 0,047 2

B.3 Contoh B2 – Penilaian kemampuan dapat mengulang yang dikelompokkan : Analisis tentang varian Nilai rata-rata untuk satu orang atau laboratorium sebagai suatu keseluruhan dapat juga diperoleh dengan satu cara analisis varian. Jumlah koloni x1 dan x 2 dalam Contoh B.1 dikonversikan ke nilai - In mereka dan kemudian varian diantara dan didalam dianalisis. Analisis varian dari semua keterulangan hasil ditunjukkan dibawah ini: db

JK

KT

Antar-cawan

9

10,4817

1,1646

Didalam cawan

10

0,0190

0,0019

Keterangan: db = derajat bebas JK = jumlah kuadrat KT = Kuadrat Tengah (varian)

Varian cawan KT merupakan keterulangan hasil yang disertakan dalam kelompok. Simpangan baku relatif untuk keterulangan adalah akar kuadrat dari kuadrat rata-rata didalam cawan (karena simpangan baku dalam skala In dengan kasar sesuai dengan simpangan baku relatif dalam skala aritmatik).

RSD c = 0,0019 = 0,044 Nilainya sangat hampir sama seperti dalam Contoh B.1. Jika nilai tinggi (lebih daripada 0.1) mungkin perlu untuk melihat kembali pada tabel untuk menguji nilai individual RSD untuk mencari alasan. Satu nilai yang kebetulan besar mungkin bertanggung jawab, atau mungkin ada suatu kecenderungan pada jumlah rata-rata koloni. Hal ini dapat digambarkan dengan sangat baik secara grafik dengan memplot nilai RSD terhadap jumlah koloni. Keterulangan personal atau intra laboratorium dibutuhkan sebagai suatu nilai dasar ketika memperkirakan suatu fitur ketangguhan seperti sensivitas waktu atau reproduksibilitas penghitungan Nilai ideal dari 0,02 sering terlalu optimistik.

© BSN 2010

43 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

B.4

Contoh B.3 – Reproduksibilitas penghitungan diantara laboratorium

Dua orang (A1, A2) dari laboratorium A dan tiga (B1, B2, B3) dari laboratorium B yang digabungkan dalam suatu sesi penjumlahan koloni yang disusun oleh laboratorium B. Cawan agar standar diambil dari penentuan rutin dan dibaca oleh setiap peserta. Cawan dengan kurang lebih 30 koloni dihilangkan. Hasil dari enam cawan ditunjukkan dalam daftar dibawah Cawan 1

A1 33

A2 26

B1 33

B2 34

B3 33

Rata-rata 31,8

RSD 0,1029

2

160

156

166

176

174

166,4

0,0520

3

142

128

142

146

139

139,4

0,0491

4

78

97

81

81

83

84,0

0,0891

5

89

94

81

94

92

90,0

0,0603

6

38

44

38

42

40

40,4

0,0645

Enam cawan yang jauh sangat sedikit untuk suatu penilaian umum yang dapat dipercaya, tetapi menggambarkan perhitungan. Rata-rata kuadratik dari simpangan baku relatif adalah:

RSD c =

0,1029 2 + 0,0520 2 + 0,04912 + 0,08912 + 0,06032 + 0,0645 2 = 0,0724 6

Dibandingkan dengan kemampuan menghasilkan kembali hitungan dalam satu laboratorium (Contoh B.1 dan B.2) nilai diperoleh dalam percobaan kolaboratif ini hampir dua kali nilai itu. Analisis dari varian mungkin digunakan dalam pencarian perbedaan sistematik diantara orang atau diantara laboratorium. B.5

Contoh B.4 – Ketangguhan : sensivitas waktu dari penghitungan koloni

Ketergantungan dari jumlah koloni pada inkubasi dapat secara mudah diuji dengan menghitung dua kali cawan yang sama : pada dua waktu inkubasi yang berbeda yang diperbolehkan oleh metode itu. Dalam analisis coliform total dengan metode membran filtrasi (MF) sesuai dengan ISO, membran filter akan diinkubasikan selama 18 jam sampai 24 jam pada suatu temperatur yang ditetapkan. Untuk menguji validitas dari batas yang diberikan, lima contoh uji air diuji dengan metode MF. Cawan membran filter dengan jumlah koloni “yang dapat dipercaya” dihitung setelah 18 jam dan 24 jam. Hasilnya didaftar dibawah: Contoh uji 1 2 3 4 5 © BSN 2010

Jumlah 18 jam 90 44 70 8 29

Jumlah 24 jam 93 88 69 49 69 44 dari 56

Perubahan % +3 + 100 -2 + 613 + 238

SNI ISO/TR 13843:2011

Dalam hanya dua contoh uji (1 dan 3), perbedaan antara 18 jam dan 24 jam jumlah sesuai dengan kemampuan dapat mengulang yang normal dari hitungan (CV = 3% sampai 4%) digambarkan oleh contoh B.2 dan B.3. Biasanya tidak ada yang perlu terhadap hasil tes/uji dari percobaan secara statistik seperti itu. Pada dasarnya, satu pengecualian yang jelas adalah cukup untuk menolak hipotesis dari ketangguhan. Dalam contoh ini, setiap satu dari contoh uji 2, 4 dan 5 menunjukkan bahwa perubahan jumlah yang sangat banyak dalam rangkaian yang dapat diterima yang diasumsikan. Hasil dari contoh ini akan ditafsirkan sehingga baik spesifikasi untuk toleransi waktu inkubasi atau ruang lingkup dari metode dipertimbangkan kembali. B.6 Contoh B.5 – Analisis dari suatu uji proporsional : batas atas dari kinerja detektor B.6.1

Umum

Suatu contoh uji natural diencerkan sebelumnya ke tingkat yang sesuai untuk suatu seri pengenceran dari enam langkah berurutan untuk 1:2, disiapkan sesuai dengan rencana yang disajikan pada lampiran C. Tiga cawan paralel dibuat dari masing-masing pengenceran dengan menggunakan teknik sebar permukaan. Koloni dihitung setelah inkubasi dua hari.

Pengenceran -1

2 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6

B.6.2

Jumlah Si

Volume relatif VR,i

Si/ VR,i

162 148 97 68 24 17

487 385 322 184 89 41

32 16 8 4 2 1

15,22 24,06 40,25 46,00 44,50 41,00

Total :

1508

63

Jumlah Paralel 121 109 111 56 36 11

204 128 114 60 29 13

Rasio

Uji proporsionalitas umum

Untuk menguji proporsionalitas umum (“linearitas”) dari jumlah koloni dan volume contoh uji, itu cukup untuk menghitung indeks rasio kemungkinan log (G2) untuk persetujuan jumlah dari jumlah koloni paralel dengan volume relatif respektif. Jumlah harus setuju dengan rangkaian geometrik 32/16/8/4/2/1. Uji statistik mempunyai 6 -1 = 5 derajat bebas Sesuai dengan rumus (lampiran A, aitem A.2):

G52 = [487 In(487/32) + 385 In (385/16) + 322In (322/8) + 184 In (184/4 + 89 In (89/2) + 41In (41/1) - 1508 In (1508/63) ] = 292,526 © BSN 2010

45 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Nilai dari indeks diperbandingkan dengan distribusi χ2 dengan lima tingkat kebebasan. Nilai yang dihitung melebihi nilai teoritis untuk 0.1% (20,515), yang mana berarti bahwa linearitas umum dari hasil yang sangat jelek. (Kesimpulan adalah jelas bahwa dalam hal ini bahkan tanpa perhitungan,dan dapat dicapai dengan benar-benar melihat pada jumlah dalam tabel itu). Secara jelas rasio 2 : 1 antara pelemahan suksesif tidak disadari dalam jumlah koloni. Kesimpulannya, oleh karena itu, bahwa sistem detektor tidak linear dalam contoh uji ini dalam jumlah rangkaian koloni dari 41/3 = 14 sampai 483/3 = 161 koloni per cawan. Dari inspeksi jumlah, atau bahkan lebih secara jelas dari jumlah per volume relatif (S1/V1), yang dapat disimpulkan bahwa jumlah koloni yang tinggi menyimpang sebagian besar dari harapan. Detektor telah menjadi disfungsional bahkan dibawah 160 koloni per cawan. Dengan uji proporsionalitas yang serupa yang dilakukan pada contoh uji yang berbeda, sejumlah nilai yang dipasangkan dapat diperoleh: jumlah rata-rata yang paling tinggi diuji (161 dalam hal ini) dan nilai indeks penyebaran yang diobservasi (G2 = 292,526 dalam hal ini). Merencanakan nilai indeks pada diagram pedoman membantu menentukan jumlah koloni yang paling tinggi dimana proporsionalitas dari metode tersebut cukup. Suatu contoh uji dari 14 contoh uji diuji dengan cara ini ditunjukkan pada gambar B.1. Suatu nilai garis pedoman yang berubah-ubah untuk 15,09 (probabilitas 1%) dipilih dan ditunjukkan dengan sebuah garis horisontal. Titik diatas garis termasuk rangkaian dengan proporsionalitas yang jelek. Poros horisontal (cmaks) memberikan jumlah rata-rata per cawan dari pelemahan yang paling rendah yang termasuk dalam uji proporsionalitas. Garis horisontal dan miring memotong pada jumlah koloni rata-rata dimana probabilitas dari proporsionalitas “memadai” menjadi kurang daripada 1%.

Gambar B.1 – Linearitas dari seri penghitungan dari enam pengenceran biner yang bertahap dari 14 contoh uji. Linearitas yang diukur berkenaan dengan G2.cmax= jumlah koloni rata-rata per cawan dari pengenceran dengan jumlah koloni tertinggi. Akhirnya tidak selalu sejelas contoh ini. Suatu analisis yang lebih terperinci dari data mungkin dibutuhkan untuk menjelaskan ketiadaan proporsionalitas. © BSN 2010

46 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

CATATAN 1 Penggunaan dari pemberian alasan diatas mengisyaratkan bahwa semua seri yang termasuk dalam studi proporsionalitas mempunyai jumlah yang sama untuk pengenceran yang dapat dihitung (tingkat kebebasan). Jika hal itu akan terjadi bahwa semua seri tidak mempunyai jumlah yang sama pengenceran pengenceran yang dapat dihitung, ukuran proporsionalitas lainnya I = G2/(n-1) akan digunakan. Nilai panduan menjadi agak lebih tidak jelas dalam contoh ini karena I = χ2/( υ ) bukan suatu yang tetap tetapi tergantung pada tingkat kebebasan ( υ ).

CATATAN 2 I = χ2/( υ ) digunakan untuk disebut rasio Lexis, untuk menghormati Lexis ekonom Jerman. Hal itu seringkali ditunjukkan dengan simbol L.

Untuk menguji pada perincian yang lebih besar dimana kehilangan linearitas berlangsung, indeks total G52 = 292,526 dapat dibagi lagi dalam perbandingan orthogonal dengan bekerja naik atau turun tabel dan membentuk perbedaan secara berturut-turut untuk setiap jumlah individu, dengan semua jumlah dibawah yang diambil bersama-sama. B.7 B.7.1

Contoh B.6 – Data cawan paralel Umum

Data pada jumlah cawan paralel dengan mudah dikumpulkan. Mereka berguna untuk validasi metode karena perbedaan teknis antara cawan paralel terdiri dari hampir tidak ada lainnya daripada kesalahan volume dalam pemipetan. Kecuali kalau beberapa adalah kesalahan secara radikal dengan teknik pemipetan, ketidakpastian volume secara praktis menghilang diantara partikel acak yang menyebar (6.1). Persesuaian statistik (keacakan) dari suatu susunan cawan paralel dapat diukur dengan menghitung indeks Poisson dari penyebaran sesuai dengan A.3 atau indeks rasio kemungkinan log sesuai dengan A.2. Jika pertentangan yang kuat dengan keacakan Poisson diobservasi, sebabnya hampir pasti sesuatu lainnya daripada ketidakakurasian pemipetan. Dengan cara ini analisis dari data cawan paralel dapat menjalankan tujuan dari validasi metode. Suatu nilai indeks individu dapat digunakan untuk menilai reliabilitas statistik dari susunan cawan paralel khusus itu. Suatu nilai indeks yang tinggi terlalu sering, dibandingkan dengan distribusi χ2, yang mungkin menunjukkan bahwa rata-rata dari susunan itu tidak reliabel. Dalam cara ini indeks penyebaran Poisson adalah suatu alat AQC yang penting. Lebih secara penting, nilai-nilai indeks yang dikumpulkan dari suatu jumlah yang besar contoh uji-contoh uji yang berbeda yang dapat digunakan untuk panduan pada aspek-aspek dari kinerja metode. Data pada dua metode memberikan suatu kesempatan untuk membandingkan reliabilitas relatif mereka, dan validasi kedua yang akan beruntung dari suatu perbandingan dengan spesifikasi yang berkembang selama validasi primer. B.7.2

Distribusi frekuensi dari indeks Poisson

Tabel berikut menunjukkan beberapa baris pertama dari data pada jumlah paralel (B1, B2) dari enam puluh contoh uji. Mereka menggambarkan suatu rangkaian besar dari konsentrasi partikel. Indeks penyebaran Poisson (X2) dihitung untuk setiap susunan paralel sesuai dengan A.3.

© BSN 2010

47 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Suspensi 1 2 3 4 5

B1 256 228 89 27 143

X2 3,792 17,979 1,832 0,071 0,721

B2 302 146 108 29 129

Sebagai contoh, untuk pasangan hasil pertama nilai X2 diperoleh dari perhitungan:

X2 =

2(256 2 + 302 2 ) − (256 + 302) = 3,792 256 + 302

Indeks tersebut mempunyai suatu distribusi statistik teoritis. Distribusi yang diobservasi dari indeks-indeks dapat dibandingkan dengan harapan teoritis dengan mencatat frekuensi nilai indeks dari ukuran yang berbeda. Batas-batas kelas yang diperoleh dari poin persentase distribusi χ2. Untuk melakukan itu, poin persentase dari distribusi χ2 dengan tingkat kebebasan yang sesuai (satu lebih kecil daripada jumlah paralel) yang harus dikonsultasikan. Dalam hal ini tabel untuk satu derajat kebebasan yang dibutuhkan. P

0,95

0,90

0,80

0,70

0,60

0,50

0,40

0,30

0,20

0,10

0,05

χ2

0,004 0,016 0,064 0,148 0,256 0,455 0,722 1,07

1,62

2,71

3,84

Cara yang paling sederhana untuk menggunakan tabel adalah membangun batas-batas kelas untuk suatu distribusi yang tetap/genap untuk frekuensi yang diharapkan. Sebagai contoh, dari semua nilai indeks, 20% diharapkan untuk turun dengan kesempatan pada setiap lima kelas dengan batas-batas berikut : Kelas 1

0 sampai 0,064

Kelas 2

0,064 sampai 0,256

Kelas 3

0,256 sampai 0,722

Kelas 4

0,722 sampai 1,62

Kelas 5

> 1,62

Frekuensi yang diharapkan pada masing-masing kelas tergantung pada jumlah kelas yang dipelajari. Dengan 60 kasus (contoh dibawah), harapan akan jadi 12 observasi turun pada setiap kelas. Lainnya daripada distribusi genap/tetap dapat dibangun dengan suatu cara yang serupa. Suatu konstruksi yang berbeda ditunjukkan pada contoh dibawah. Data dibagi dalam enam kelas, dengan 5%, 15%, 30%, 30%, 15%, dan 5% kasus yang diharapkan pada kelas masing-masing. Data itu ditunjukkan pada kasus contoh diatas untuk satu metode khusus (metode A). metode lainnya (metode B) diuji secara serempak pada suspensi yang sama dengan cara yang sama secara tepat. Indeks-indeks penyebaran dari cawan paralel dengan metode itu dihitung dan dikumpulkan juga pada kelas-kelas frekuensi. Hasil disajikan pada Tabel B.1. © BSN 2010

48 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Tabel B.1 – Perbandingan dari frekuensi indeks penyebaran yang diobservasi dari dua metode dengan harapan teoritis Kelas frekuensi

Batas kelas atas

Frekuensi yang diharapkan

1

0,004

2

Frekuensi yang diobservasi

3

Metode A 1

Metode B 2

0,064

9

3

7

3

0,455

18

10

10

4

1,64

18

15

22

5

3,84

9

10

10

6

>3,84

3

21

9

Total

60

60

60

Dengan jelas penentuan paralel dari metode B lebih dekat kepada harapan teoritis. Penyesuaian dapat diuji dengan uji kesesuaian dan kebaikan dalam persesuaian kasus dengan distribusi Poisson yang telah ditunjukkan pada spesifikasi. Jika metode A dan B adalah ekuivalen sebaliknya, observasi dengan jelas menyokong pilihan dari metode B. Suatu pemeriksaan yang lebih terperinci dari nilai indeks mungkin menyatakan alasan untuk jumlah yang berlebihan dari nilai yang sangat tinggi dengan metode A. Jika ditemukan yang berhubungan dengan jumlah koloni, itu dapat digunakan sebagai informasi tambahan tentang batas atas kerja dari metode itu. B.8 Contoh B.7 – perhitungan dari komponen µ penyebaran berlebihan dari data jumlah paralel Kapanpun observasi paralel dalam bentuk data jumlah yang tidak dirubah ada tersedia, prinsip itu digambarkan pada 6.2.3 [persamaan (12)] dapat digunakan untuk menilai komponen tambahan (penyebaran berlebihan) dari prosedur analitis. Contoh berikut didasarkan pada suatu uji kinerja metode multicentre. Lebih dari 50 laboratorium yang berpartisipasi. Hasil dari dua belas laboratorium diambil untuk menggambarkan penghitungan. Setiap laboratorium mempelajari suatu contoh uji milik mereka. Hal itu hanya disetujui sebelumnya sehingga contoh uji harus menggambarkan jenis bahan yang sama (air pembuangan kota). Semua menggunakan prosedur analitis yang sama kecuali bahwa setiap laboratorium mempunyai kebebasan yang lengkap/sempurna untuk bagaimana mereka mencampur dan mencairkan contoh uji yang mereka telah ambil. Sebagai suatu akibat, hasil dari laboratorium yang berbeda mempunyai jumlah koloni ratarata yang berbeda secara luas pada pengenceran yang mereka telah ada tersedia untuk menghitung. Rancangan percobaan ini terdiri dari empat rangkaian pengenceran yang dibuat dari suspensi contoh uji homogen. Satu cawan setiap pengenceran dibuat. Laboratorium diinstruksikan untuk memilih pengenceran yang sama pada semua empat rangkaian untuk menghitung. © BSN 2010

49 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Tabel B.2 – Hasil dari laboratorium yang berbeda Hasil paralel C2 C3 233 218

C4 254

c

Varian

VTM

1

C1 198

225,8

560,2

2,48

2

155

145

150

131

145,3

106,9

0,75

3

58

53

64

66

60,3

34,9

0,58

4

37

42

38

31

37,0

20,7

0,56

5

124

106

92

117

109,8

194,9

1,78

6

28

17

11

20

19,0

50,0

2,63

7

167

238

213

206

206,0

864,7

4,20

8

10

12

13

8

10,8

4,9

0,46

9

66

84

94

71

78,8

160,9

2,04

10

8

13

7

5

8,3

11,6

1,40

11

204

186

225

216

207,8

284,2

1,37

12

162

141

166

199

167,0

575,3

3,45

Laboratorium

c = jumlah rata-rata per cawan VTM = varian untuk rasio rata-rata (rasio Lexis).

Menurut prinsip yang diberikan pada 6.2.3, garis regresi dari VTM (=Y) pada c diharapkan untuk mempunyai bentuk: Y = 1 + u2c Kemiringan garis hingga memberikan suatu penilaian untuk penyebaran berlebihan kuadrat yang tetap. Rata-rata dan varian didasarkan pada suatu jumlah kecil (empat) dari paralel. Sebaran acak yang dapat dipertimbangkan adalah untuk diharapkan pada penilaian rasio mereka. Fakta ini adalah bukti yang secara jelas ketika hasil dari penelitian ini direncanakan (Gambar B.2).

© BSN 2010

50 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Gambar B.2 – Ketergantungan dari varian untuk rasio rata-rata pada jumlah koloni rata-rata pada suatu percobaan dengan contoh uji air pembuangan Setiap titik menggambarkan satu contoh uji yang dipelajari oleh suatu laboratorium yang berbeda. Rata-rata dan varian didasarkan pada jumlah koloni yang tidak dirubah pada empat penentuan parallel dari suatu suspensi tes. Karena dari sebaran yang besar, keraguan yang dapat dianggap tetap apakah garis regresi secara akurat menggambarkan hubungan yang benar. Lebih banyak data yang akan dibutuhkan untuk menilai kemiringan dengan suatu tingkat kepercayaan yang tinggi. Kalkulasi itu dapat namun diteruskan untuk menggambarkan metode itu. Garis regresi kuadrat terkecil (The least squares regression line) disesuaikan pada titik data yang mempunyai persamaan: Y = 0,99 + 0,00766c Konstanta (0,99) terjadi sangat dekat nilai yang diharapkan 1,0. Kemiringan memberikan nilai penyebaran data berlebihan kuadrat u2 = 0.00766. Variasi yang lebih sebagai nilai simpangan baku relatif oleh karena itu u = 0.088. Kemiringan tidak signifikan secara statistik. Hal itu tidak menunjukkan dengan meyakinkan bahwa ada sumber variasi sebagai tambahan untuk distribusi Poisson. Tidak sebaiknya untuk meneruskan lebih jauh dalam penafsiran. Hasilnya bagaimanapun cukup menarik sehingga orang mungkin menyimpulkannya cukup baik/bermanfaat usaha untuk mengumpulkan data yang serupa untuk mampu menilai kemiringan dengan kepercayaan yang lebih tinggi. CATATAN Tergantung pada rencana percobaan apa komponen-komponen dari ketidakpastian kandungan konstanta penyebaran berlebihan. Faktor utama yang mungkin telah menyebabkan variasi tambahan dalam rencana percobaan khususnya ini adalah : - mungkin kekurangan campuran sempurna dari contoh uji itu - kesalahan acak volumetrik dalam dillusi - ketidak pastian hitungan perseorangan

© BSN 2010

51 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Nilai konstanta 0,088 berarti bahwa komponen - komponen yang ditambah hanya sekitar ± 9 %. Heterogenitas contoh uji, ketidakpastian volumetric kumulatif dan kemampuan dapat mengulang hitungan perseorangan yang mungkin dikombinasikan ditafsirkan untuk tetap di dalam batas-batas yang dapat diterima. Dalam rencana ini, dimana setiap laboratorium yang menggunakan sebuah contoh uji dari milik mereka, tidak ada yang dapat dipelajari tentang kecakapan relatif dari laboratorium yang berbeda. Semua perbedaan dalam penemuan relatif, penafsiran dari penampilan koloni dan fungsi dari media bahan gizi yang telah hilang. Untuk memasukkan faktor-faktor ini, semua laboratorium sudah akan mempelajari suatu contoh uji yang identik dan prosedurprosedur identik yang diikuti. Jika hasil parallel telah jadi jumlah parallel dari botol dillusi akhir yang sama, kemudian faktor penyebaran berlebihan tidak akan memasukkan ketidakserbasamaan bahan dan ketidakpastian dillusi. Hanya sumber-sumber tambahan yang tetap akan dipipetkan dan dihitung.

© BSN 2010

52 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Lampiran C (informatif)

Contoh dari eksperimen pengesahan

C.1

Jumlah cawan dan cawan penyebaran (diulang untuk contoh uji yang berbeda)

C.2

Filtrasi membran (diulang untuk contoh uji yang berbeda)

CATATAN Data apapun pada jumlah yang ditiru atau cawan paralel yang ada tersedia dapat digunakan untuk studi dari perincian khusus validasi. Sensivitas dan selektivitas harus dibuktikan sebelum penggunaan dari rancangan ini.

© BSN 2010

53 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

Bibliografi

FAO Manual of Food Quality Control 12. Quality assurance in the food control microbiological laboratory.(FAO Food and Nutrition Paper 14/12. Rome, 1991. 154 pp.) Report on Public Health and Medical Subjects No. 71. Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. The Microbiology of Water. Part 1 — Drinking Water. HMSO, 1994. ISO 3534-1:1993, Statistics — Vocabulary and symbols — Part 1: Probability and general statistical terms, and ISO 5725 (all parts), Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. ISO 9998:1991,Water quality — Practices for evaluating and controlling microbiological colony count media used in water quality tests. Quantifying uncertainty in analytical measurement. 1995. Eurachem. ISBN 0-948926-08-2 Guide to the expression of uncertainty in measurement. (GUM), 1995. International Organization for Standardization, Geneva. ISBN 92-67-10188-9 Handbook for Microbiological Laboratories. Introduction to Internal Quality Control of Analytical Work. Nordic Committee on Food Analysis (NMKL), Report No. 5, 1989. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 18th ed. 1992. APHA, AWWA, WEF. [9] ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological. prEN 275-061:1997 E. Microbiology of food and animal feeding stuffs — Protocol for the validation of alternative methods. ANSCOMBE, F.J. Sampling theory of the negative binomial and logarithmic series distributions. Biometrika, 37, 1950, pp. 358-382. COCHRAN, W.G. Estimation of bacterial densities by means of the "Most Probable Number". Biometrics, 6, 1950, pp. 39-52. COCHRAN, W.G. Sampling Techniques, 3rd edn. John Wiley & Sons, New York, 1977. EL-SHAARAWI, A.H., ESTERBY, S.R. and Dutka, B.J. Bacterial density in water determined by Poisson or negative binomial distributions. Appl. Environ. Microbiol., 41, 1981, pp. 107116. FISHER, R.A. The negative binomial distribution. Ann. Eugenics, 11, 1941, pp. 182-187. [ FISHER, R.A., THORNTON, G.G. and MACKENZIE, W.A. The accuracy of the cawaning method of estimating the density of bacterial populations. Ann. Appl. Biol., 9, 1922, pp. 325359. HAVELAAR, A.H., HEISTERKAMP, S.H., HOEKSTRA, J.A. and MOOIJMAN, K.A. Performance characteristics of methods for the bacteriological examination of water.Water Sci. Technol., 27, No. 3-4, 1993, pp. 1-13. © BSN 2010

54 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

HORWITZ, W. 1988. Protocol for the design, conduct and interpretation of collaborative studies. Pure & Appl. Chem., 60, pp. 855-864. HURLEY, M.A. and ROSCOE, M.E. Automated statistical analysis of microbiological enumeration by dilution series. J. Appl. Bacter., 55, 1983, pp. 159-164. JARVIS, B. Statistical aspects of the microbiological analysis of foods. Progr. Ind. Microbiol., 21, 1989, p. 179. LIGHTFOOT, N.F. and MAIER, E.A. (eds.). Microbiological analysis of food and water. Guidelines for quality assurance. Elsevier, Amsterdam, 1998, 266 p. LIGHTFOOT, N.F., TILLETT, H.E., BOYD, P. and EATON, S. Duplicate split samples for internal quality control in routine water microbiology. Lett. Appl. Microbiol., 19, 1994, pp. 321324. MASSART, D.L., VANDEGINSTE, B.G.M., DEMING, S.N., MICHOTTE, Y. and KAUFMAN, L. Chemomertics: a textbook. Data handling in science and technology. Vol. 2. Elsevier, Amsterdam, 1988, 488 p. MCCLURE, F.D. Design and analysis of qualitative collaborative studies: minimum collaborative program. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 73, 1990, pp. 953-960. MOSSEL, D.A.A., BONANTS-VAN LAARHOVEN, T.M.G., LIGTENBERG-MERKUS, A.M.T. and WERDLER, M.E.B. Quality assurance of selective culture media for bacteria, moulds and yeasts: an attempt at standardization at the international level. J. Appl. Bacteriol., 54, 1983, pp. 313-327. NIEMELÄ, S.I. Quantitative estimation of bacterial colonies on membrane filters. Ann. Acad. Sci. Fenn., Ser. A. IV Biologica, 1965. NIEMELÄ, S.I. A semi-empirical precision control criterion for duplicate microbial colony counts. Lett. Appl. Microbiol., 22, 1996, pp. 315-319. NIEMELÄ, S.I. Performance characteristics of microbiological water analytical methods. European Training Courses on Water Quality Measurements. Course A: Monitoring and Measurements of Lake Recipients.Helsinki, Finland 25-29 August 1997. STUDENT. On the error of counting with a haemacytometer. Biometrika, 5, 1907, pp. 351360. TILLETT, H.E., LIGHTFOOT, N.F. and EATON, S. External quality assessment in water microbiology: statistical analysis of performance. J. Appl. Bacteriol., 74, 1993, pp. 497-502. TILLET, H. E. and LIGHTFOOT, N.F. Quality control in environmental microbiology compared with chemistry: What is homogeneous and what is random?Water Sci. Technol., 13, 1995, pp. 471-477. TOMASIEWICZ, D.M., HOTCHKISS, D.K., REINBOLD, G.W., READ, R.B. Jr. and HARTMAN, P.A. The most suitable number of colonies on cawanes for counting. J. Food Protect., 43, 1980, pp. 282-286.

© BSN 2010

55 dari 56

SNI ISO/TR 13843:2011

WEISS, H. and DAHMS, S. Statistically based analyst performance assessment for microbiological analysis. Chapter 37 in: Analytical Quality Assurance and Good Laboratory Practice in Dairy Laboratories.International Dairy Federation Special Issue No. 9302, 1993. ISBN 92 9098 010 2. YOUDEN, W.J. and STEINER, E.H. Statistical Manual of the AOAC. Association of Official Analytical Chemists. Arlington, VA, USA, 1975, ISBN 0-935584-15-3.

© BSN 2010

56 dari 56