UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Protocolo de prácticas de la Escuela – versión 2011
ESCUELA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS, PECUARÍAS Y AMBIENTALES-ECAPMA UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA-UNAD D ISTANCIA-UNAD Tecnología en Saneamiento Ambiental e Ingeniería Ambiental
CURSO DE: 358010 A MICROBIOLOGIA AMBIENTAL Directora de curso: Diana García Vargas.
GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL Adaptado de la autora Echeverry, L.C.
AÑO 2013
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I – ACTIVIDADES PARA EL ESTUDIANTE PRACTICAS DE LABORATORIO 1. IDENTIFICACION DE LA PRÁCTICA Nombre de curso
Microbiología Ambiental 358010 A
Código de curso
Valor de esta actividad Se asignará un valor de 100 puntos. Ver rúbrica. La asignación de puntos a los cuestionarios y al informe de laboratorio depende de la asistencia obligatoria al práctica 100% de las prácticas.
Nombre del director de Diana García Vargas. curso CEAD al que pertenece
Sede Nacional José Celestino Mutis
Contacto del director de
[email protected] Tel.: 3164657609 Skype:dianagarciavargas curso Espacio donde se debe desarrollar la práctica
• •
Laboratorio 409, Sede Nacional JCM Bogotá. CEADs donde se matriculó el estudiante.
Aprender los conceptos básicos de microbiología y sus técnicas de laboratorio para seres unicelulares procariotas (bacterias); seres unicelulares eucariotas (algas, hongos, protozoos) y organismos pluricelulares eucariotas (algas y hongos).
Objetivos de la práctica
Profundizar en microbiología ambiental de acuerdo a la infraestructura de laboratorio de cada CEAD y el trabajo trabajo del tutor práctico. práctico.
Justificación práctica
de
la
Los laboratorios se constituyen en el componente práctico obligatorio, que buscan, mediante procesos heurísticos, afianzar, clarificar y profundizar en los aspectos conceptuales, procedimentales y metodológicos metodológicos del curso.
Competencias desarrollar
El estudiante comprende los elementos conceptuales, procedimentales y a metodológicos que están involucrados en la coloración, tinción, medios de cultivo, siembras, identificación microscópica, macroscópica y bioquímica de microorganismos presentes en el agua, aire, suelo, flora. ECAPMA: Acuerdo 15 del 2011. 24 horas de acompañamiento tutorial en la
Duración de la práctica.
práctica
incluye
programación,
organización,
ejecución,
calificación
y
retroalimentación. Según rúbrica adjunta al final del presente presente protocolo (la misma que está en el
Mecanismo mediante el aula virtual). cual se evaluará la La asistencia presencial es obligatoria al desarrollo de los protocolos de los práctica: laboratorios programados por cada tutor práctico de cada CEAD.
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I – ACTIVIDADES PARA EL ESTUDIANTE PRACTICAS DE LABORATORIO 1. IDENTIFICACION DE LA PRÁCTICA Nombre de curso
Microbiología Ambiental 358010 A
Código de curso
Valor de esta actividad Se asignará un valor de 100 puntos. Ver rúbrica. La asignación de puntos a los cuestionarios y al informe de laboratorio depende de la asistencia obligatoria al práctica 100% de las prácticas.
Nombre del director de Diana García Vargas. curso CEAD al que pertenece
Sede Nacional José Celestino Mutis
Contacto del director de
[email protected] Tel.: 3164657609 Skype:dianagarciavargas curso Espacio donde se debe desarrollar la práctica
• •
Laboratorio 409, Sede Nacional JCM Bogotá. CEADs donde se matriculó el estudiante.
Aprender los conceptos básicos de microbiología y sus técnicas de laboratorio para seres unicelulares procariotas (bacterias); seres unicelulares eucariotas (algas, hongos, protozoos) y organismos pluricelulares eucariotas (algas y hongos).
Objetivos de la práctica
Profundizar en microbiología ambiental de acuerdo a la infraestructura de laboratorio de cada CEAD y el trabajo trabajo del tutor práctico. práctico.
Justificación práctica
de
la
Los laboratorios se constituyen en el componente práctico obligatorio, que buscan, mediante procesos heurísticos, afianzar, clarificar y profundizar en los aspectos conceptuales, procedimentales y metodológicos metodológicos del curso.
Competencias desarrollar
El estudiante comprende los elementos conceptuales, procedimentales y a metodológicos que están involucrados en la coloración, tinción, medios de cultivo, siembras, identificación microscópica, macroscópica y bioquímica de microorganismos presentes en el agua, aire, suelo, flora. ECAPMA: Acuerdo 15 del 2011. 24 horas de acompañamiento tutorial en la
Duración de la práctica.
práctica
incluye
programación,
organización,
ejecución,
calificación
y
retroalimentación. Según rúbrica adjunta al final del presente presente protocolo (la misma que está en el
Mecanismo mediante el aula virtual). cual se evaluará la La asistencia presencial es obligatoria al desarrollo de los protocolos de los práctica: laboratorios programados por cada tutor práctico de cada CEAD.
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CONTENIDO
Pág.
PRÁCTICA 00. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
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CUESTIONARIO –PRACTICA 00. RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO LABORATORIO Y MATERIALES MATERIALES DE MICROBIOLOGIA MICROBIOLOGIA 8 CUESTIONARIO – PRACTICA 01.
9
PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA
10
CUESTIONARIO CUESTIONAR IO – PRACTICA 02.
18
PRACTICA 02. TÉCNICAS DE TINCIÓN.
19
PRACTICA 03. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA MICROSCÓPIC A DE HONGOS
25
CUESTIONARIO CUESTIONAR IO – PRACTICA 04.
28
PRACTICA 04. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES Y SELECTIVOS
30
PRACTICA 05. REACCIONES BIOQUIMICAS
32
CUESTIONARIO CUESTIONAR IO – PRACTICA 06.
37
PRACTICA O6. CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
39
PRACTICA 07. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE CIANOBACTERIAS CIANOBACTERIAS
41
CUESTIONARIO CUESTIONAR IO – PRACTICA 08.
45
PRACTICA 08. RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS
46
CUESTIONARIO CUESTIONAR IO – PRACTICA 09.
48
PRACTICA 09. PRUEBAS DE ANTAGONISMO
50
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PRACTICA No.00 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Los laboratorios de microbiología están regidos por normas de seguridad e higiene que deben cumplirse a cabalidad para garantizar la protección contra infecciones de los estudiantes u otro personal que labora en estas instalaciones, así como garantizar la calidad de las técnicas y la confiabilidad de los resultados.
1.1. Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier área del laboratorio: 1.1.1. El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado. 1.1.2. El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de seguridad. 1.1.3. Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico y su nivel de contención. 1.1.4. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contención contención biológica. 1.1.5. Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre que se produzca un derrame. 1.1.6. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las normas específicas para cada tipo de residuo. 1.1.7. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los pasillos como almacén. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a 120 cm para poder evacuar el laboratorio en caso de emergencia. 1.1.8. El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera que, en caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras deberán ser rígidas y resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en su interior y de fácil desinfección. Se etiquetarán o identificarán de forma oportuna y no podrán ser utilizadas para otros fines. Bajo ningún concepto se deben transportar las muestras a mano. 1.1.9. La ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como guantes, gafas, etc.; debe estar disponible en todo momento. La ropa protectora de las áreas con nivel de contención 3 (batas) nunca debe ser usada fuera del área de trabajo y si se quita debe de ser desechada automáticamente automáticamente en una bolsa de material contaminado. Jamás debe volver a ser usada. 1.1.10. Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del área de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se cogerá el teléfono, se tocarán las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc. 1.1.11. Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos. 1.1.12. Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles. 1.1.13. Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de auto-inoculación y de generación de aerosoles. 1.1.14. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Supervisor y al Jefe del Laboratorio y hacerse constar por escrito.
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1.1.15. Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático con material adecuado y cada trabajador será instruido para manejarlo debidamente. 1.1.16. En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel contaminado contaminado es de muy difícil esterilización. 1.1.17. No deberán usarse lentes de contacto. 1.1.18. El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido. 1.1.19. Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos esta formalmente prohibido en el área de trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento almacenamiento de comida o bebida. 1.1.20. El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se usará un jabón antiséptico y el secado se realizará con papel. 1.1.21. Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, serán comunicados al responsable de la Sección correspondiente, así como al Supervisor de Bioseguridad que lo registrará haciendo constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser convenientemente vendados y después es imprescindib i mprescindible le ponerse guantes. 1.2. Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupo de riesgo 1.2.1. Grupo de riesgo 1 (riego individual o poblacional escaso o nulo) 1.2.2. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales 1.2.3. Grupo de riesgo 2 (riego individual moderado, riesgo poblacional bajo) 1.2.4. Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado. 1.2.5. Grupo de riesgo 3 (riego individual elevado, riesgo poblacional bajo) 1.2.6. Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. 1.2.7. Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado) Agentes patógenos que suele provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, dicta o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Tipos de laboratorios: Nivel de bioseguridad 1 Nivel de bioseguridad 2 Nivel de bioseguridad 3 Nivel de bioseguridad 4
Laboratorio básico Laboratorio básico Laboratorio de contención Laboratorio de contención máxima
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1.3. Código de prácticas en laboratorios básicos 1.3.1. Acceso: el símbolo y signo internacional de peligro biológico (Figura 1) debe colocarse en las puertas de loa locales donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o superior. 1.3.2. Protección personal: se debe usar todo el tiempo batas o uniformes especiales para el trabajo en el laboratorio. Usar guantes protectores apropiados con materiales potencialmente infecciosos. 1.3.3. Procedimientos: es estrictamente prohibido pipetear con la boca. Colocarse material y/o etiquetas en la boca. Se mantendrá un registro de accidente e incidentes que ocurren en el laboratorio. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse antes de ser descartados. 1.3.4. Zona de trabajo del laboratorio: se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo. Las superficies de trabajo deben permanecer descontaminadas. Las ventanas que puedan abrirse deben estar equipadas de rejillas para evitar el ingreso de artrópodos. 1.3.5. Diseño e instalaciones del laboratorio: inicialmente se debe prestar especial atención a los problemas que puedan causar problemas en la bioseguridad, Entre ellos están: la formación de aerosoles, el trabajo con grandes cantidades o altas concentraciones de microorganismos, el exceso de personal o material, la infestación por roedores o artrópodos, la entrada de personas no autorizadas y el circuito de trabajo. 1.4. Normas de trabajo en el laboratorio de microbiología 1.4.1. Desinfectar el área de trabajo 1.4.2. Prender el mechero antes de comenzar a trabajar 1.4.3. Al utilizar el asa bacteriológica, debe calentarse en toda su extensión el alambre a la llama del mechero hasta que se ponga roja. Este proceso debe hacerse antes y después del uso. 1.4.4. Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapón en la mano derecha sostenido entre el dedo meñique y la palma de la mano, cerca de la llama del mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el dedo índice y el pulgar. El correcto manejo de los tubos evitara contaminaciones cruzadas en los cultivos. 1.4.5. Flamear la boca de los tubos después de quitarles el tapón y antes de volverlo a colocar para evitar la formación de aerosoles o la contaminación del contenido del tubo. 1.4.6. Destapar las cajas de petri manteniendo la base y la tapa simultáneamente en la mano izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero. 1.4.7. Los escobillones o baja lenguas deben quemarse en la llama del mechero, se deja enfriar y se descarta. 1.4.8. Todo el material que se use en microbiología de estar estéril. 1.4.9. El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora. Las cajas de Petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las superficies de los cultivos.
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FIGURA 1. Señal de advertencia de peligro biológico para las puertas del laboratorio.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS BENSON, HAROLD J. Microbiological applications: Laboratory Manual in General Microbiology. McGraw – Hill. U.S.A. 1998. COLLINS, C. H. and M LYNE, PATRICIA. Traducción del ingles por José María Tarazona Vilas. Métodos microbiológicos. Editorial ACRIBIA, S. A. ZARAGOZA (España). 1989. OMS – Organización Mundial de la Salud. Manual de bioseguridad en el laboratorio. Ginebra. 2005.
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CUESTIONARIO No. 00 DE RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO Y MATERIALES DE MICROBIOLOGIA 1. ¿Qué características debe reunir el vidrio utilizado para la fabricación del material de cristalería para los laboratorios y por qué? 2. Explique brevemente las ventajas y desventajas del uso de materiales de vidrio y de plástico, respectivamente, en los laboratorios de microbiología. 3. Describa, ilustre y clasifique los siguientes materiales, indicando el uso que se les da en el laboratorio de microbiología (Sea breve, se le sugiere elaborar un cuadro): a) Portaobjetos b) Cubreobjetos c) Cajas de Petri d) Pipetas graduadas (terminales y no terminales) e) Pipetas Pasteur f) Tubos de ensayo (tipos) g) Matraces (tipos) h) Probetas (tipos) i) Tubos de Durham j) Asas de inoculación (tipos) k) Mecheros (tipos) l) Estufas bacteriológicas (tipos) m) Baño bacteriológico n) Horno Pasteur o) Autoclave p) Jarra de anaerobiosis q) Centrífuga r) Nefelómetro de Mac Farland s) Membranas Millipore t) Cuenta colonias 4. Ilustre un Microscopio óptico de campo claro con los nombres de todas sus partes. 5. Enliste detalladamente todas las medidas que se requiere tomar en cuenta para el manejo correcto y cuidados del microscopio compuesto. 6. Enliste detalladamente todos los pasos que se requiere seguir para enfocar imágenes en un microscopio compuesto. 7. Defina los siguientes términos en microscopía: Límite de resolución, poder de resolución y poder de amplificación, indicando la fórmula mediante la que se calculan cada uno. 8. Mencione los tipos de microscopio electrónico que existen actualmente y cuáles son las diferencias y ventajas que usted considera más importantes entre estos y el microscopio óptico cuando se trabaja en un laboratorio de microbiología. 9. ¿Cuál es la utilidad del asa recta y redonda? 10. ¿Qué se entiende por resiembra o pase bacteriano? 8
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CUESTIONARIO – PRACTICA 01. 1. ¿Qué se entiende por resiembra o pase bacteriano? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ________________________________________ 2. ¿Cuál es la utilidad del asa recta y del asa curva? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ 3. ¿Cómo se esteriliza un medio de cultivo en microbiología? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ 4. ¿Cuáles son las condiciones de esterilización en seco, que equipo se usa y para que materiales está destinada? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ 5. ¿Cómo se esterilizan elementos con filo como cuchillas, tijeras, entre otros? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ 6. ¿Qué utilidad tiene la esterilización en frío? _____________________________________________________________________________ _________________________________________________________
7. ¿Qué es la tindalización? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________ 9
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PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA – Parte A La inoculación de medios de cultivo para la recuperación, mantenimiento y/o aislamiento de microorganismos, es un procedimiento fundamental e importante. Debe tenerse cuidado con las técnicas de siembra microbiana para evitar en lo posible la contaminación por otros microorganismos diferentes al deseado.
MATERIALES 1. Muestra contaminada con microorganismos 2. Agua peptonada al 0,1% estéril 3. Agar nutritivo en caja de Petri 4. Asa redonda 5. Gradilla 6. Mechero 7. Incubadora 8. Vinipel 9. Marcador de vidrio
PROCEDIMIENTO 1. Desinfectar el área de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo. 2. Coger parte de la muestra y colocarla en el tubo de ensayo que contiene el agua peptonada. Homogenizar. 3. Dejar 20 – 30 minutos en incubación los tubos. 4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un circulo de papel (8 cm) para ponerlo debajo de la caja de Petri (Figura 1) 5. Finalizado el tiempo de incubación tomar el asa redonda y esterilizarla por calor hasta que está esté roja, dejar enfriar cerca al mechero. 6. Abrir el tubo con la muestra y tomar una asada. 7. Cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Teniendo cuidado de que el asa no toque nada y de no pasarla por encima del mechero, pero siempre estar cerca de este 8. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento. 9. Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y envolverla en papel vinipel. 10. Colocar el tubo y la caja a incubar a 37°C. La caja debe estar boca abajo siempre. 11. Desinfectar el área de trabajo, apagar el mechero y entregar el material
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Figura 1. Técnica de aislamiento de colonias
Este procedimiento se denomina
aislamiento de bacterias ,
debido a que las bacterias
presentes en una muestra se distribuyen sobre la superficie de un agar, y cada célula se reproduce independientemente hasta formar un conglomerado de bacterias observables a simple vista (colonia bacteriana). De esta manera es posible observar sobre la superficie del medio, colonias de diferentes características en cuanto a forma, superficie, borde, forma, color, aspecto y elevación, lo que indica microscópicamente presencia de diferentes tipos microbianos en la muestra. Así se puede estudiar e identificar independientemente cada especie.
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RESULTADOS – PARTE A Fecha: __________________________
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PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA – Parte B Figura 2. Técnica de aislamiento de colonias por el método de rejilla.
Figura 3. Técnica de aislamiento de colonias por el método francés.
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Figura 4. Morfología colonial
Figura 5. Siembra en medio líquido
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Figura 6. Siembra en medio semisólido con superficie plana
Figura 7. Siembra en medio sólido con superficie inclinada
Similar a la obtención de unidades formadoras de colonias (UFC) en una caja de Petri se puede evaluar el crecimiento en un medio líquido o en un medio sólido. Figura 8. Crecimiento en medio líquido
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Figura 9. Patrón de crecimiento en medio sólido
REFERENCIAS ESCOBAR de RICO, M. Fundamentos de microbiología. Editorial CEJA. 1999. CARMONA P, G. L. Manual de laboratorio microbiología general. Corporación universitaria LaSallista. 2001.
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RESULTADOS – PARTE B Fecha: __________________________
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CUESTIONARIO – PRACTICA 02. 1. ¿Qué se entiende por maduración de un colorante? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ________________________________________ 2. ¿En qué momento se deben filtrar los colorantes y por qué? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ 3. ¿Por qué razón los colorantes deben guardarse en frascos de color ambar? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ 4. ¿Cuáles son los colorantes más utilizados en microbiología y por qué? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ 5. ¿Describa una coloración para teñir el núcleo bacteriano? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ 6. ¿Qué utilidad tiene la tinción con sudan III? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _______________________________________________
7. ¿Mencione 5 razones de la selectividad de las bacterias por los colorantes de Gram? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 18
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PRACTICA 02. TÉCNICAS DE TINCIÓN. MATERIALES 1. Láminas 2. Laminillas 3. Agua destilada estéril 4. Asas bacteriológicas redonda y asa recta 5. Mechero 6. Azul de metileno 7. Cristal violeta 8. Lugol 9. Alcohol cetona 10. Fucsina básica o safranina 11. Tinta china 12. Microscopio óptico 13. Colonias aisladas de bacterias para observación de bacterias 14. Guantes de látex
PROCEDIMIENTO 1. Coloración simple a. En una lámina portaobjetos limpia, colocar una gota del agua destilada estéril (trabajo con muestra sólida) o una gota del cultivo bacteriano (trabajo con muestra liquida) sobre la misma y con ayuda del asa redonda estéril extender la gota de suspensión a un área no superior a dos centímetros cuadrados. b. Dejar que la preparación se seque al aire. Fijar con calor, pasando tres veces seguidas a través de la llama del mechero. c. Dejar enfriar la lámina. Lo anterior se conoce como la realización de un frotis y se hace para coloraciones donde la muestra debe ser fijada y luego si iniciar las coloraciones respectivas. d. Colocar la preparación sobre una rejilla encima del vertedero. e. Cubrir la suspensión con algún colorante dado por el profesor, así: i. Cristal violeta: 1 minuto ii. Azul de metileno: 5 minutos iii. Fucsina: 1 minuto f. Terminado el tiempo de coloración según el colorante empleado, eliminar el colorante lavando con agua suavemente. g. Dejar secar y colocar la preparación en la platina del microscopio y observar con el objetivo de menor aumento inicialmente hasta llegar al objetivo de 100X (ver figura 1).
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Figura 1. Observación de imágenes en el microscopio óptico.
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2. Coloración compuesta a. Realizar un frotis de la muestra seleccionada b. Colocar en la rejilla para coloración y cubrir el frotis con cristal violeta esperando que transcurra 1 minuto. Lavar con agua el colorante. c. El segundo colorante es el lugol, el cual se deja por 1 minuto sobre el frotis d. Realizar la decoloración con la mezcla alcohol-acetona, por 25 segundos. Lavar inmediatamente con agua. e. Finalmente adicionar el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30 segundos. Lavar con agua. f. Escurrir el exceso de agua, dejar secar y montar al microscopio para hacer las observaciones respectivas.
Figura 2. Tinción de Gram
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Figura 3. Morfología bacteriana.
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3. Coloraciones especiales. a. Coloración de Glicocálix con Rojo Congo Emulsionar la muestra con una (1) gota de rojo congo y dejar secar la lámina a temperatura ambiente. Al estar seca la lámina sumergirla en HCl 1N con ayuda de una pinza y teniendo cuidado de no tocar o salpicar el ácido sobre la piel. Luego lavar con agua teniendo cuidado de no hacerlo sobre la tinción. Poner azul de metileno sobre la tinción inicial por tres (3) minutos y terminado este tiempo lavar la lámina con agua. Montar al microscopio la lámina cuando este seca y hacer las observaciones respectivas. b. Coloración de Glicocálix con Tinta China
En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china y un poco del cultivo bacteriano a estudiar. Todo se debe mesclar suavemente y sin extender. Seguidamente colocar un cubreobjetos sobre la suspensión y presionar suavemente evitando la formación de burbujas. Observar inmediatamente al microscopio y desechar el material en un recipiente con antiséptico.
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RESULTADOS Fecha: __________________________
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PRACTICA 03. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS La célula fúngica es similar a cualquier organismo eucarionte, aunque existen diferencias subcelulares entre la célula de un hongo inferior a la de uno superior. Cuando se estudian los hongos se pueden observan dos grandes grupos: los algodonosos, que se conocen con el nombre de mohos y otros que forman colonias húmedas y se conocen como levaduras.
MATERIALES 1. Cultivo de hongos 2. Láminas portaobjetos 3. Laminillas 4. Azul de lactofenol 5. Microscópio
PROCEDIMIENTO Colocar en el centro de la lámina portaobjeto una gota de azul de lactofenol, luego tomar con el asa micológica previamente esteril parte del hongo y resuspenderlo en la gota del colorante. Colocar luego una laminilla encima de esta preparación y esperar 3 minutos. Finalizado este tiempo montar al microscópio y observar en 10X y 40X.
CONSOLIDACIÓN DE CONCEPTOS 1. Dibuje: Hifa septada
Hifa cenocítica
Artroconidios
Conidios
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Esporangiosforo
Blastoconidia
Cuerpo fructífero de un Aspergillus y nombre sus partes
Cuerpo fructífero de un Penicillium y nombre sus partes
Cuerpo fructífero y macroconidias de un Fusarium y nombre sus partes
Cuerpo fructífero y nacroconidias de una Alternaria y nombre sus partes
Cuerpo fructífero de un Rhizopus y de un Mucor y nombre sus partes
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OBSERVACIONES HECHAS EN EL LABORATORIO
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CUESTIONARIO – PRACTICA 04. 1. ¿Cuál es la diferencia entre adaptación evolutiva y adaptación fisiológica de los microorganismos, con respecto a la ubicuidad? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________
Escriba que significan los siguientes términos. Aptación:____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Abaptación:__________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Exaptación:__________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
2. ¿Cómo se realiza el control de calidad a los medios de cultivo, a parte del método ecométrico? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________
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3. ¿Cuál es la utilidad microbiológica de los medios: simples, enriquecidos, diferencial, de prueba, para recuento, bioquímico y de mantenimiento? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _______________________________________
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PRACTICA 04. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES Y SELECTIVOS Los medios de cultivo permiten estudiar los microorganismos en un ambiente artificial el cual debe ser semejante a su medio natural, que incluya nutrientes (proteínas, péptidos y aminoácidos), energía (carbohidratos), metales y minerales esenciales (Ca, Mg, Fe, trazas de metales: PO3, SO4), agentes tampón (fosfatos, acetatos), indicadores de pH (rojo de fenol, púrpura de bromocresol, rojo neutro), agentes selectivos (productos químicos, antibacterianos) y agentes gelificantes (normalmente agar pero algunas veces se usa gelatina, carragenatos, alginatos, silica gel). De acuerdo a la composición y a la combinación de los anteriores ingredientes mencionados los medios de cultivo se pueden clasificar en: líquidos, semisólidos, sólidos, simples enriquecidos, selectivos, diferenciales, bioquímicos y de mantenimiento.
MATERIALES 1. Agar EMB (selectivo para enterobacterias patógenas) 2. Agar Baird Parker (selectivo para estafilococos) 3. Agar Salmonella – Shigella 4. Agar selectivo de Bacillus cereus 5. Muestra de lixiviados de basura
PROCEDIMIENTO Sembrar la muestra en cada caja de Petri por medio del método ecométrico y determinar el índice de crecimiento absoluto (ICA).
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RESULTADOS Fecha: __________________________
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PRACTICA 05. REACCIONES BIOQUIMICAS Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. FECHA: _____________________
PRUEBA DEL CITRATO ANTES
DESPUÉS
PRUEB
PRUEBA DEL TRIPLE AZUCAR HIERRO ANTES
DESPUÉS
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PRUEBA DE SULFUROS-INDOL-MOTILIDAD ANTES
DESPUÉS
PRUEBA DE OXIDACION ANTES
DESPUES
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PRUEBA DE FERMENTACIÓN ANTES
DESPUÉS
PRUEBA DE UREA ANTES
DESPUÉS
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PRUEBA DE ROJO DE METILO ANTES
DESPUÉS
PRUEBA DE VOGUES PROSKAWER ANTES
DESPUÉS
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COLORACION DE GRAM
V.B. PROFESOR: ______________
IDENTIFICACION CON TABLA Posible microorganismos identificado:
____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________ ANEXO Tabla de identificación bioquímica
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CUESTIONARIO – PRACTICA 06. 1. Defina: Neutrófilo:_____________________________________________________________ _________________________________________________________________ Acidófilos:_____________________________________________________________ _________________________________________________________________ Alcalinófilo:____________________________________________________________ _________________________________________________________________ Sacarófilos:_____________________________________________________________ ________________________________________________________________ halófilos osmosis:_______________________________________________________________ ________________________________________________________________ presión osmótica:______________________________________________________________ ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________ plasmólisis:_____________________________________________________________ ________________________________________________________________ lisis:__________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________ 2. ¿Todos los microorganismos osmófilos son halófilos? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________
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3. ¿Los microorganismos xerófilos pueden ser simultáneamente sacarolíticos? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ 4. ¿Cómo actúa la luz ultra violeta sobre las bacterias para inhibir o eliminar su desarrollo, explique desde el punto molecular y metabólico? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________ ____________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________
5. ¿Qué tiene de especial H. salinarium? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _______
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PRACTICA O6. CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO Los factores físicos y químicos tienen un efecto notable sobre la vida de los microorganismos en su medio ambiente natural. Algunos estimulan su desarrollo en tanto que otros lo retardan o lo impiden. El conocimiento del efecto de esos parámetros medio ambientales no solo permitió estudiar los microorganismos bajo condiciones controladas de laboratorio para favorecer su crecimiento sino que posibilitó aprender la forma de controlarlos.
MATERIALES Cultivo de un microorganismo Gram -
positivo Cultivo de un microorganismo Gram - negativo. Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes pH’s. Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes concentraciones de NaCl. Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri Caldo nutritivo Pipetas estériles de 1 y 2 mL Estufa Vaso de precipitado de 500 mL Incubadora
PROCEDIMIENTO 1. ACCIÓN DE LA TEMPERATURA Suspender una colonia del microorganismo seleccionado en el caldo nutritivo y dejarlo por media hora para un desarrollo de los microorganismos en el medio de cultivo. Luego tomar 0.1 mL del medio y sembrarlo sobre el medio sólido del agar nutritivo. Llevar el caldo nutritivo donde se inoculo el microorganismo a la estufa y ponerlo a ebullición por el tiempo dado por el profesor y sembrar como al inicio. Llevar las dos cajas de Petri e incubarlas a 37 oC.
2. ACCION DEL pH Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estrías en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. Realizar este procedimiento con todas los medios de diferentes pH.
3. ACCIÓN DE LA PRESIÓN OSMÓTICA Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estrías en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. 39
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4. ACCIÓN DE LA LUZ ULTRAVIOLETA Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estrías en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. Seguidamente tapar la mitad de la caja con papel de aluminio y colocar sobre la otra parte de la caja la luz ultravioleta por 5 y/o 10 minutos, tapar la caja y llevar a incubar.
RESULTADOS Fecha: __________________________
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PRACTICA 07. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE CIANOBACTERIAS Cyanobacteria (del griego ciano = azul) es el nombre de un filo del reino Bacteria (único del dominio del mismo nombre) que comprende a las cianobacterias y, en algún sentido, a sus descendientes por endosimbiosis, los plastos. Las cianobacterias se caracterizan por ser los únicos procariotas que llevan a cabo fotosíntesis oxigénica, por ello también se les denomina oxyphotobacteria.
MATERIALES 1. Agua con cianobacterias 2. Láminas portaobjetos 3. Laminillas 4. Microscopio
PROCEDIMIENTO Colocar en el centro de la lámina portaobjeto una gota del agua que trajo como muestra y colocar luego una laminilla encima de esta preparación y esperar 2 minutos. Finalizado este tiempo montar al microscópio y observar en 10X, 40X y 100X.
CONSOLIDACIÓN DE CONCEPTOS 1. Explique qué función tiene el carboxisoma en las cianobacterias ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________ 2. Explique qué función tiene las vesículas gasíferas en las cianobacterias _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _________________________________________________________________
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3. ¿Qué son los tilacoides?, ¿Cuál es su función y donde se ubican en las cianobacterias? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ________________ 4. Dibuje:
Cianobacteria formadora de filamentos simples
Heterocisto
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Anabaena sp
Nostoc sp
Volvox sp
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OBSERVACIONES HECHAS EN EL LABORATORIO
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CUESTIONARIO – PRACTICA 08. 1. Defina el grupo denominado “aerobios mesófilos” ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ________________________________________ 2. ¿Cuál es la diferencia entre un microorganismo emergente y uno reemergente? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ________________________________________ 3. Mencione mínimo cuatro grupos de microorganismos utilizados como bioindicadores en suelos ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ________________________________________ 4. Explique otro método que le permita determinar el número de microorganismos presentes en una muestra de suelos _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ ______________
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PRACTICA 08. RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS Microorganismo aerobio mesófilo son todas las bacterias, levaduras y hongos capaces de desarrollarse en condiciones de aerobiosis a 30°C. Es un parámetro que sirve para estimar la flora total, pero sin especificar tipos de microorganismos. Es uno de los indicadores más útiles del estado microbiológico de un alimento, agua, suelo entre otros. Tiene un valor limitado como indicador de la presencia de patógenos o sus toxinas. Altos recuentos microbianos se consideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos.
MATERIALES 1. 2 cajas de Petri estériles 2. 4 tubos de ensayo con agua peptonada al 0.1% estériles 3. 4 Pipetas de 1 mL o una pipeta automática (100 – 1000 µL) 4. 1 frasco de dilución con 90 mL de agua peptonada al 0.1% 5. 50 mL de agar nutritivo previamente preparado y atemperado a 45 - 48°C 6. Marcador de vidrio 7. Incubadora a 35°C 8. Contador de colonias 9. Balanza
PROCEDIMIENTO 1. Hacer diluciones del alimento de acuerdo al tipo de producto. • Si es un alimento crudo deben realizarse diluciones altas • En alimentos procesados se hacen diluciones bajas 2. Sembrar en profundidad por duplicado 1 mL de cada una de las diluciones seleccionadas 3. Adicionar de 15 – 20 mL del agar nutritivo a la temperatura adecuada 4. Mezclar inmediatamente el inóculo con el medio, con movimientos circulares de la placa a favor y en contra de las manecillas del reloj, como en ángulo recto. Debe evitarse que el medio impregne la tapa.
5. Dejar solidificar, adicionar una capa sellante de 5 mL sobre la caja y dejar solidificar nuevamente.
6. Una vez solidificado el agar, se vierten las placas e introducen en la incubadora (35°C durante 72 horas) .7. Sacar de la incubadora y realizar el recuento
8. Lectura: se deben contar las cajas cuyo número de colonias esté comprendido entre 300 y 300. Es conveniente ir marcando las colonias para evitar volver a contarlas. Hallar la media. El número contado se multiplica por el factor de dilución y los resultados se expresarán en unidades formadoras de colonia (UFC) por mL o g, dependiendo del tipo de alimento de partida. 9. Siempre se informan dos números enteros y el resto en exponente
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REFERENCIA ICMSF. Microorganismos de los alimentos 1: su significado y métodos de enumeración. Segunda edición. Editorial ACRIBIA S. A. Zaragoza (España). 2000.
RESULTADOS Fecha: __________________________
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CUESTIONARIO – PRACTICA 09 1) Defina: a) Comensalismo : ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________ b) Protocooperación ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________ c) Simbiosis ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________ d) Amensalismo ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________ e) Predación _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ __________________________________________
f) Parasitismo ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________
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2) Para las anteriores definiciones escriba una relación microbiana que describa lo que usted escribió. ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________
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PRACTICA 09. PRUEBAS DE ANTAGONISMO La composición de la microflora y de la microfauna de un ecosistema está regulada por las interacciones de los microorganismos de una comunidad entre sí y de los mismos con el medio no biótico de lo cual surge un equilibrio dinámico. Si dos o mas especies que coexisten en un lugar no se afectan mutuamente la relación es neutralismo. Cuando algo de esto se modifica, las especies comienzan a interactuar y las relaciones que se presentan pueden ser: comensalismo, protocooperación, simbiosis, amensalismo, predación, parasitismo. La evaluación de estas relaciones in vitro permiten aislar y seleccionar microorganismos con capacidad de biocontroladores.
MATERIALES 1) 3 Cajas con Agar Nutritivo 2) Asas bacteriológicas y micológicas 3) Marcador de vidrio 4) Hongos 5) Bacterias 6) Incubadora a 37oC y 25oC PROCEDIMIENTO 1) Técnica por enfrentamiento Se toma la caja de Petri con el medio de cultivo nutritivo y se divide en la parte trasera por la mitad con un marcador de vidrio y se señala la mitad de cada una de las mitades previamente divididas. Se marca cual microorganismo va a inocular en cada lado y finalmente por punción sembrar los microorganismos. Incubar a 37 oC si uso bacterias ó a 25oC si uso hongos.
Microorganismo 1
Microorganismo 2
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Método de Igarashi Se toma una caja de petri y se divide en 4/4 y sembrar por siembra masiva con un asa redonda, en un espacio de tres (3) centímetros un microorganismo seleccionado y finalmente siembre en el centro por punción otro microorganismo que usted crea tenga características de biocontrolador.
MICROORGANISMO 1 en estrías MICROORGANISMO 2 en el centro.
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