3-Pengujian Susu Segar SNI 01-2782-1998

Standar Nasional Indonesia

SNI 01-2782-

Metoda pengujian susu segar

Berdasarkan usulan dari Departemen Pertanian standar ini disetujui oleh Badan Standardisasi Nasional menjadi Standar Nasional Indonesia dengan nomor : SNI 01-2782-1998/Rev.1992

Penerbitan standar ini dilakukan setelah memperhatikan semua data dan masukan dari berbagai pihak. Kritik dan saran untuk penyempurnaan standar ini, dapat disampaikan kepada :

BADAN STANDARDISASI NASIONAL - BS N Gedung Manggala WanabaktiBlok IV Lantai 4 Badan Standardisasi Nasional - BSN

Jl. Jend. Gatot Subroto, Senayan, Jakarta 10270 Telepon 62 - 21 - 5747043, 5747044 Fax. 62 - 21 - 5747045 E-mail : [email protected]

PUSAT STANDARDISASI DAN AKREDITASI BADAN AGRIBISNIS, DEPARTEMEN PERTANIAN Kantor Pusat Departemen Pertanian Gedung D Jalan Harsono RM No. 3 Ragunan - Pasar Minggu Jakarta 12550 Tlp./Fax. (021) 7815880 Edisi 1999

Metoda pengujian susu segar Pendahuluan

Standar ini merupakan Revisi SNI 01-2782-1992 mengenai Cara Uji Susu Segar untuk menyempurnakan standar serta metoda pengujian susu segar sehingga diperoleh adanya keseragaman dalam keakuratan, ketelitian, spesifisitas dan sensitifitas hasil serta keberulangan yang stabil. Standar ini disusun sebagai hasil pembahasan Rapat-rapat Teknis, Prakonsensus dan terakhir dirumuskan dalam Rapat Konsensus Nasional. Hadir dalam rapat-rapat tersebut wakil-wakil dari lembaga penelitian, perguruan tinggi, produsen, konsumen dan instansi yang terkait lainnya. Sebagai acuanCara Uji Susu Segar ini diambil dari: 1)

AOAC, Official Methods of Analysis (1995)

2) Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food (1992) 3)

Bundesegestzblatt, Jahrgang (1995)

4)

Hasil - hasil penelitianpengujian

Metoda pengujian susu segar

Uji penetapan berat jenis

1

Ruanglingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk mengukur berat jenis (B.J) susu segar.

2

Prinsip

Benda padat yang dicelupkan ke dalam suatu cairan akan mendapatkan tekanan ke atas seberat volume cairan yang dipindahkan. Berat jenis diukur di antara suhu 20 300C kemudian disesuaikan pada :

BJ.

27,50

76 cm Hg.

0

27,5

3

Pereaksi

Tidak diperlukan.

4

Peralatan

a) Satu Laktodensimeter yang ditera pada suhu 27,5oC (harus ditera ulang tiap tahun) b)

Dua buah gelas piala berukuran 500 ml untuk menghomogenkan susu

c)

Satu tabung besar

d)

Termometer.

1 dari 82

5

Prosedur pengujian

5.1

Pengukuran B.J dilakukan minimum3 (tiga) jam setelah pemerahan.

5.2 Homogenkan susu dengan sempurna dituangkan ( dari gelas piala satu ke gelas piala lainnya), kemudian dengan hati-hati dituangkan kedalam tabung tanpa menimbulkan buih. 5.3 Dengan hati- hati laktodensimeterdicelupkan ke dalam susu dalam tabung tadi, biarkan timbuldan tunggu sampai diam. 5.4 Baca skala yang ditunjukkan dan angka yang terbaca menunjukkan angka ke-2 dan ke-3 dibelakang koma, sedangkan desimal ke-4 dikira-kira. Contoh : Bila skala yang terbaca adalah 28, maka angka yang didapat adalah 1,0280 5.5 Lakukan pengukuran sebanyak tiga kali berturut-turut, masing-masing dilakukan setelah membenamkan kembali laktodensimeter. 5.6 Temperatur susu diukur dengan ketelitian 0,5oC dan tandon Hg dari termometer haruslah berada di dalam susu pada waktu pengukuran dilakukan.

6

Hasil Uji

Untuk laktodensimeter yang ditera pada 27,50C, bila temperatur susu adalah 29oC sedangkan skala rata-rata adalah 28 maka yang dicatat adalah : 6.1

0

BJ.

29 C

76 cm Hg = 1,0280

0

27,5 C 6.2 Untuk setiap kelebihan atau kekurangan suhu sebesar 10C dilakukan penyesuaian berat jenis sebesar koefisien muai susu setiap derajat Celcius yakni 0,0002

BJ.

27,50

76 cm Hg

=

0

27,5

= 2 dari 82

1,0280 + (29 - 27,5) x 0,0002

= =

1,0280 + 0,0003 1,0283.

6.3. Bila laktodensimeter yang digunakan ditera pada0C, 15maka perhitungan harus disesuaikan sebagai berikut:

BJ.

27,50

76 cm Hg

=

1,0280

0

15 BJ. 0,0002

27,50

76 cm Hg

=

1,0280

+ (29-27,5) x

0

15

BJ.

27,50

=

1,0280 + 0,003

=

1,0283

76 cm Hg

=

BJ air pada 150C 1,0283 x 0 BJ air pada27,5 C

76 cm Hg

=

1,0280

0

27,5 BJ. 0,0002

27,50

+ (29-27,5) x

0

15

6.4

=

1,0280 + 0,003

=

1,0283

Tabel 1 memperlihatkanberat jenis dan volume air pada beberapa suhu.

3 dari 82

Tabel 1 Berat jenis dan volume air pada beberapa suhu Suhu

BJ

Volume

Suhu

(0C)

BJ

Volume

(0C)

4

1,000000

1,0000

25

0,997069

1,0029

15

0,999126

1,0009

26

0,996808

1,0032

17,5

0,998710

1,0013

27

0,996538

1,0035

20

0,998229

1,0018

27,5

0,9966538

1,0036

21

0,998017

1,0020

28

0,996258

1,0038

22

0,997795

1,0022

29

0,995969

1,0040

23

0,997663

1,0024

30

0,995672

1,0043

24

0,997321

1,0027

4 dari 82

Pengukuran kadar lemak dengan metoda Gerber

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda pemeriksaan rutin penentuan kadar lemak susu penuh, susu yang sebagian lemaknya diambil, susu yang tidak dihomogenisasi dan susu yang dihomogenisasi menggunakan metoda Gerber.

2

Definisi

Metoda Gerber adalah prosedur empiris untuk menentukan nilai kadar lemak susu dalam satuan gram lemak per 100 ml susu.

3

Prinsip

Asam sulfat pekat merombak dan melarutkan kasein dan protein lainnya, sehingga menyebabkan hilangnya bentuk dispersi lemak. Pemisahan lemak dipercepat dengan penambahan amil alkohol yang akan mencairkan lemak dengan panas yang ditimbulkannya. Dengan sentrifugasi akan menyebabkan lemak terkumpul dibagian skala dari butirometer.

4

Pereaksi

a)

Asam sulfat (H2SO 4) 90 - 91% (BJ pada 200 C = 1.818 + 0,003 g/ml)

Penampakan: tidak berwarna atau lebih terang dari warna kuning pucat serta tidak mengandung endapan. b)

Amil alkohol (BJ pada 200 C = 0,811 + 0,002 g/ml)

Penampakan: jernih dan tidak berwarna. 5

Peralatan

a)

Butirometeryang dilengkapi sumbatnya.

b)

Penangas air (650C + 20C).

c)

Sentrifus(1100 + 50 rpm). 5 dari 82

d)

Pipet otomat 1 ml + 0,05 ml (amil alkohol).

e) Pipet otomat 10 ml (asam sulfat pekat), dapat juga digunakan pipet biasa yang dilengkapi bola karet (untuk penghisap) pada ujungnya. f)

Pipet khusus 10,75 ml.

6

Prosedur

6.1 Metoda ini berlaku untuk 3 jenis susu: susu penuh, susu yang sebagian lemaknya diambil dan susu yang tidak dihomogenisasi. 6.1.1

Masukkan 10 ml asam sulfat pekat ke dalam butirometer.

6.1.2 Tambahkan 10,75 ml contoh susu dan 1 ml amil alkohol. Urutan dari pemasukan bahan ke dalam butirometer harus runtut seperti cara di atas. 6.1.3 Butirometer disumbatsampai rapat, kemudian dikocok sehingga bagianbagian di dalamnya tercampur rata. 6.1.4 Setelah terbentuk warna ungu tua sampai kecoklatan (terbentuk karamel), masukkan butirometer ke dalam sentrifus dan disentrifusi pada 1200 rpm selama 5 menit. 6.1.5 Kemudian masukkan butirometerke dalam penangas air dengan suhu 650 C selama 5 menit. 6.1.6

Setelah itu, bacalah skala yang tertera pada butirometer. Skala tersebut

menunjukkan kadar lemak. 6.2 Untuk susu yang dihomogenisasi 6.2.1 Cara pengerjaan contoh sama dengan di atas, hanya setelah pembacaan 0 skala, butirometer kembali disentrifusi dan dimasukkan ke dalam penangas air (65 C), lalu skala dibaca kembali. 6.2.2

Ulangi cara tersebut sebanyakdua sampai tiga kali.

6.2.3 Apabila perbedaan hasil pembacaan skala antara 2 dan 3, antara 3 dan 4 lebih dari 0.05%, maka pengukuran ini dianggap salah.

7

Hasil Uji

6 dari 82

Kadar lemak adalah angka yang ditunjukkan oleh skala dinyatakan dalam persen. Perhitungan kadar bahan kering tanpa lemak (BKTL)

Metoda 01 : Dengan menggunakan Rumus Fleischmann

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk perhitungan kadar bahan kering tanpa lemak dalam susu segar dengan cepat.

2

Prinsip

Untuk tujuan ini diperlukan persentase kadar lemak dan berat jenis susu.

BK = 1,311 x L + 2,738 100 (BJ - 1)

BJ dimana :

BK

=

Kadar Bahan Kering

L

=

Kadar Lemak susu

BJ

=

Berat Jenis susu

Penetapan Kadar Bahan KeringTanpa Lemak berdasarkan rumus:

BKTL = BK - L

dimana :

BKTL

=

Bahan Kering Tanpa Lemak

BK

=

Kadar Bahan Kering

L

=

Kadar Lemak susu.

7 dari 82

3

Prosedur

3.1 Setelah angka kadar lemak, dan BJ didapatkan,maka angka-angka tersebut dimasukkan ke dalam rumus, kemudian dihitung secara biasa, atau 3.2

Masukkan angka-angka tersebut kedalam tabel-tabel.

4

Hasil Uji

Hasil uji Kadar Bahan Kering Tanpa Lemak susu dinyatakan dalam persen (%).

8 dari 82

Tabel 2 Penyesuaian untuk lemak

Lemak

1,31 L

Lemak

1,31 L

Lemak

1,31 L

1,0

1,31

2,5

3,28

4,0

5,24

5,4

7,07

6,8

8,91

1,1

1,44

2,6

3,41

4,1

5,37

5,5

7,21

6,9

9,04

1,2

1,57

2,7

3,54

4,2

5,50

5,6

7,34

7,0

9,17

1,3

1,70

2,8

3,67

4,3

5,64

5,7

7,47

7,1

9,30

1,4

1,83

2,9

3,80

4,4

5,76

5,8

7,60

7,2

9,43

1,5

1,97

3,0

3,93

4,5

5,90

5,9

7,73

7,3

9,56

1,6

2,10

3,1

4,06

4,6

6,03

6,0

7,86

7,4

9,69

1,7

2,23

3,2

4,19

4,7

6,16

6,1

8,00

7,5

9,83

1,8

2,36

3,3

4,32

4,8

6,29

6,2

8,12

7,6

9,96

1,9

2,49

3,4

4,45

4,9

6,42

6,3

8,25

7,7

10,09

2,0

2,62

3,5

4,59

5,0

6,55

6,4

8,38

7,8

10,22

2,1

2,75

3,6

4,72

5,1

6,68

6,5

8,51

7,9

10,35

2,2

2,88

3,7

4,85

5,2

6,81

6,6

8,65

8,0

10,48

2,3

3,01

3,8

4,98

5,3

6,94

6,7

8,78

9 dari 82

Lemak

1,31 L

Lemak

1,31 L

Tabel 3 Penyesuaian untuk BJ

BJ

2,738

100(B-1)

BJ

2,738

100(B-1)

B

BJ

2,738

B

100(B-1) B

1,0220

5,89

1,0270

7,20

1,0320

8,49

1,0225

6,02

1,0275

7,33

1,0325

8,62

1,0230

6,16

1,0280

7,46

1,0330

8,75

1,0235

6,29

1,0285

7,59

1,0335

8,87

1,0240

6,42

1,0290

7,72

1,0340

9,00

1,0245

6,55

1,0295

7,85

1,0345

9,13

1,0250

6,68

1,0300

7,97

1,0350

9,26

1,0255

6,81

1,0305

8,10

1,0355

9,39

1,0260

6,94

1,0310

8,23

1,0360

9,51

1,0265

7,07

1,0315

8,36

Metode 02: Dengan menggunakanmetoda pengeringan

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk perhitungan kadar BKTL pada susu segar, krim, buttermilk dan susu kental tawar (tanpa gula).

2

Prinsip

Sejumlah contoh susu dikeringkan pada suhu yang tetap (konstan) sampai berat kering yang konstan tercapai. Berat setelah pengeringan adalah berat bahan kering.

10 dari 82

3

Peralatan

a)

Timbangananalitik,skala 0:1 mg.

b)

Oven

c)

Eksikator

d) Cawan dari bahan anti karat (alumunium, nikel, gelas) yang dilengkapi dengan tutup, mempunyai dasar rata, tinggi sekitar 3 cm dengan garis tengah 6-8 cm. e)

Penangasair

4

Prosedur

4.1 Keringkan cawan dan tutupnya dalam oven dengan suhu 102 + 20C selama 30 menit. 4.2 Setelah itu masukkan cawan beserta tutupnya ke dalam eksikator sampai suhunya sama dengan suhu kamar, kemudian timbang (G1). 4.3 Masukkan 3 ml contoh susu ke dalam cawan dan timbang kembali beserta tutupnya (G2). 4.4 Letakkan cawan di atas penangas air (mendidih) selama 30 menit. Untuk mencegah terbentuknya kulit, teteskan etanol sebanyak 5 - 10 tetes. 0

4.5 Masukkan kembali cawan ke dalam oven (suhu 102 + 2C) selama 1 jam dan letakkan tutup cawan disamping cawan. 4.6 Tutup kembali cawan dan masukkan ke dalam eksikatordan biarkanhingga suhu cawan sama dengan suhu kamar. 4.7

Timbang cawan beserta tutupnya (G3.1.).

4.8 Masukkan kembali cawan ke dalam oven selama 1 jam dan setelah itu masukkan kembali ke dalam eksikator hingga suhunya sama dengan suhu kamar, kemudian timbang lagi (G3.2.). 4.9

Lakukan prosedur tersebut sampai tercapai berat konstan (G3.1=G3.2)atau

selisih hasil pengukuran sebelum dan sesudahnya tidak melebihi 0,5 mg.

11 dari 82

5

Cara Perhitungan

Kadar Bahan Kering (%)= 100 x (G3 - G1) G2 - G1 Dimana :

G1 = berat cawan dan penutupnya G2 = berat cawan, penutupnya dan contoh G3 = berat cawan, penutupnya dan bahan kering

Beda pengukuran ulang susu = 0,05 %.

6

Hasil Uji

Hasil uji kadar BKTL dinyatakan dalam persen (%).

12 dari 82

Uji protein menurut Kjeldahl

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda penentuan kadar protein susu segar dengan metoda Kjeldahl.

2

Prinsip

Pemanasan contoh susu dalam asam sulfat pekat mengakibatkan terjadinya destruksi protein menjadi unsur-unsurnya. Untuk mempercepat proses destruksi tersebut sering ditambahkankalium sulfat bersamaan den gan cupri sulfat (sebagai indik ator) sehingga gugusan N (organik) akan berubah menjadi gugusan amonium sulfat. Melalui penambahan natrium hidroksida dan pemanasan terjadilah proses destilasi dimana amonium sulfat akan dipecah menjadi amonia. Selanjutnya amonium yang dibebaskan akan ditangkap oleh asam borat, sedangkan sisa asam borat yang tidak bereaksi dengan amonia akan dititrasi dengan asam klorida o,1 N. Selisih jumlah titrasi contoh dengan blanko merupakan jumlah ekivalen nitrogen.

3

Pereaksi

a)

Asam sulfat pekat (H2SO 4) (BJ 1,84 pada 20o C)

b)

Cupri sulfat (CuSO4.5H2O)

c)

Kaliumsulfat(K2SO 4)

d) Larutan natrium hidroksida (NaOH) 33% (500 gram NaOH dilarutkan dalam 1.000 ml aquades) e)

Larutan asam klorida (HCl) 0,1 N

f)

Asam borat 4% (40 gram asam borat dilarutkan dalam 1.000 ml aquades)

g) Larutan indikator Kjeldahl (2 gram methyl red dan 1 gram methylen blue dilarutkan dalam 1.000 ml etanol 96%).

4

Peralatan 13 dari 82

a)

Labu Kjeldahl500 ml

b)

Timbangan skala 0,1 mg

c)

Labu erlenmeyer500 ml

d)

Buret skala 0,05 ml

e) Alat pelengkap lain untuk analisa protein (pemanas, alat destilasi, sumbat penghubung) f)

PendinginLiebig

g)

Gelas ukur 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml

h)

Butir gelas, batu didih

5

Prosedur

5.1 Masukkan ke dalam labu Kjeldahl 5 gram contoh susu, batu didih, 10 gram K 2SO 4 dan 0,25 gram CuSO4. Kemudian tambahkan 20 ml 2HSO 4 dan campur dengan baik. 5.2. Panaskan hingga tidak ada uap, teruskan pemanasan sampai mendidih dan sekali-sekali labu diputar. 5.3. Setelah cairan dalam labu terlihat jernih dan tak berwarna, teruskan pemanasan selama 90 menit, kemudian didinginkan. 5.4 Setelah mencapai suhu kamar, tambahkan 150 ml aquades serta beberapa butir batu gelas, campur dan biarkan hingga dingin. 5.5. Di dalam erlenmeyerterpisah masukkan 50 ml asam borat, 4 tetes indikator dan campurkan. Kemudian tempatkan di bawah pendingin (Leibig) sehingga ujung pipa mengenai asam borat. 5.6. Melalui dinding, masukkan secara perlahan-lahan dan hati- hati 80 ml larutan NaOH ke dalam labu Kjeldahl sehingga NaOH tidak tercampur dengan isi dari labu tersebut. 5.7. Pasanglah labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Panaskan labu Kjeldahl, mula-mula secara perlahan-lahan sampai dua lapisan cairan tercampur, kemudian panaskan dengan cepat sampai mendidih. Atur panasnya sampai terjadi proses destilasi (waktu pemanasan minimum 20 menit).

14 dari 82

5.8. Menjelang berakhirnya proses destilasi letakkan erlenmeyer pada tempat yang lebih rendah sehingga ujung pipa tidak menyentuh larutan asam borat lagi. 5.9. Dinginkanhasil destilasi(destilat)dan jaga agar larutan asam borat tidak turut panas. 5.10.

Titrasi destilat dengan HCl 0,1 N.

5.11.

Lakukan prosedur diatas terhadap 5 ml aquades sebagai blanko/kontrol.

6

Cara Penghitungan

Kandunganprotein (%) =

1,4 x N x (A - B) x 6,38 C

Keterangan

:

=

Normal HCl

A

=

Jumlah HCl yang digunakan untuk titrasi contoh (ml)

B

=

Jumlah HCl blanko (ml)

1,4

=

berat dari N (secara analitik), ekivalen untuk 1 ml HCl 0,1 N

C

(gram)

7

N

=

yang digunakan untuk titrasi

Berat contoh susu yang digunakan

Hasil Uji

Hasil uji kadar protein dinyatakan dalam persen (%).

15 dari 82

Uji warna, bau, rasa dan kekentalan

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda uji warna, bau, rasa dan kekentalan pada susu segar secara organoleptik.

2

Definisi

Uji organoleptik adalah pengujian warna, bau, rasa dan kekentalan suatu produk makanan dengan menggunakan indera manusia sebagai alat utama untuk mengetahui kelainan-kelainan padaproduk makanan tersebut.

3

Prinsip

Susu dapat berubah warna, bau, rasa, dan kekentalannya oleh sebab-sebab di bawah ini: 3.1

Warna

3.1.1

Menjadi kebiruanbila ditambahdengan air ataupun dikurangilemaknya.

3.1.2 Menjadi kemerahan bila mengandung darah dari sapi yang menderita mastitis. 3.2

Bau

Lemak susu amat mudah menyerap bau dari sekitarnya. 3.3

Rasa

3.3.1

Susu menjadi terasa pahit oleh kuman pembentukpepton.

3.3.2

Susu memilikirasa lobak disebabkanoleh kuman coli.

3.3.3

Susu memilikirasa sabun disebabkanolehBacillus lactis saponacei.

3.3.4

Susu memilikirasa tengik disebabkanoleh kuman-kuman asam mentega.

3.3.5

Susu memilikirasa anyir oleh kuman-kuman tertentulainnya.

16 dari 82

3.4

Kekentalan

Susu akan berlendir bila terkontaminasi oleh kuman-kuman kokki yang berasal dari air, sisa makanan atau dari alat-alat susu.

4

Pereaksi

Tidak diperlukan.

5

Peralatan

a)

Tabung reaksi

b)

Kertas putih sebagai latar belakang.

6

Prosedur

6.1.

Uji warna

6.1.1

Masukkankurang lebih 5 ml susu ke dalam tabung reaksi.

6.1.2

Dengan latar belakangputih amati kelainanpada warna susu.

6.2.

Uji bau

6.2.1 Masukkan ke dalam tabungreaksi kuranglebih 5 ml susu, atau dapat pula dipakai susu dalam tabung yang telah diuji warnanya pada butir 5.1. di atas, kemudian dicium baunya. 6.2.2

Dipanaskan sampai mendidih, kemudian dicium baunya lagi.

6.3.

Uji rasa

6.3.1 Untuk pertimbangan kesehatan pemeriksa, maka susu harus dididihkan dahulu sebelum dilakukan uji rasa. 6.3.2

Tuangkan sejumlah susu di telapak tangankemudian dicicipi dan rasakan

adanya perubahan rasa susu. 6.4. Uji kekentalan

17 dari 82

6.4.1

Masukkankurang lebih 5 ml susu ke dalam tabung reaksi.

6.4.2

Miringkantabung,kemudiantegakkankembali.

6.4.3 Pada saat menegakkan tabu ng kembali perhatikan bagian susu yang membasahi dinding terhadap kecepatan turunnya susu serta adanya butiran, lendir dan sebagainya.

7

Hasil uji

Susu dianggap baik bila tidak dijumpai perubahan atau penyimpangan dalam warna, bau, rasa maupun kekentalannya.

18 dari 82

Uji titrasi keasaman Soxhlet Henkel

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda pengukuran derajat asam susu dengan cara titrasi.

2

Definisi

Yang dimaksud dengan derajat asam Soxhlet Henkel adalah jumlah ml NaOH 0,25 N yang diperlukan untuk menetralisasi asam yang berada dalam 100 ml susu dengan phenolphthalein sebagai indikator.

3

Pereaksi

a)

Larutan 0,25 N NaOH.

b) Larutan Phenolphthalein 2% (2 g phenolphtalein dilarutkan dalam 100 ml ethanol 96%). c).

Larutan Cobalt Sulfat (5 gram CoSO4. 7H2O, dilarutkan dalam aquadest sampai 100 ml) sebagai zat warna standar (kontrol) untuk memastikan bahwa reaksi pengikatan asam dalam susu oleh NaOH telah mencapai titik netral.

4

Peralatan

a)

Buret dengan skala 0,05 - 0,1 ml.

b)

Dua buah labu erlenmeyer 50 ml.

c)

Pipet berskala.

5

Prosedur

5.1.

Ke dalam labu erlenmeyermasing-masingdiisikan 50 ml susu.

5.2.

Tambahkan 2 ml phenolphthalein.

5.3. Salah satu dari labu erlenmeyer tersebut dititrasi dengan larutan 0,25 N NaOH hingga terbentuk warna merah muda yang tetap bila dikocok. 19 dari 82

5.4. Sebagai warna pembanding,susu di dalam labu erlenmeyerkedua ditambah dengan 1 ml larutan cobaltsulfat (CoSO 4. 7H2O). Warna standar ini hanya dapat dipakai maksimum 3 jam. Setelah 3 jam harus diganti yang baru.

6

Cara Penghitungan

Derajat Soxhlet 0( SH) adalah jumlah ,025 N NaOH yang digunakan dikalikan nilai dua. Misalnya dalam titrasi diperlukan 3,5 cc 0,25 N NaOH untukmenetralkan 50 ml susu, maka derajat keasamannya adalah:

3,5 x 100 ml = 70 SH 50ml

7

Hasil Uji

0 Hasil uji titrasi keasaman susu segar dinyatakan dalam derajat Soxhlet SH).(

20 dari 82

Uji alkohol

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk memeriksa dengan cepat derajat keasaman susu segar.

2

Prinsip

Kestabilan sifat koloidal protein-protein susu tergantung pada selubung air yang menyelimutinya. Hal ini terutama pada kasein. Bila susu dicampur dengan alkohol yang mempunyai sifat dehidrasi maka protein tersebut akan terkoagulasi sehingga susu tersebut akan pecah. Semakin tinggi derajat keasaman susu yang diperiksa, maka akan semakin rendah jumlah alkohol dengan kepekatan tertentu yang diperlukan untuk memecahkan susu dengan volume yang sama. Percobaan mulai positif pada derajat asam 8 - 90 SH.

3

Pereaksi

Alkohol 70%(tambahkan 74 ml alkohol96% dengan26 ml aquadest)

4

Peralatan

a)

Tabung reaksi.

b)

Gelas ukur 10 ml.

5

Prosedur

5.1.

Masukkan5 ml susu ke dalam tabung reaksi.

5.2.

Tambahkanalkohol70% dalam jumlah yang sama.

5.3. susu.

Amati terhadap adanya gumpalan dan atau pemisahan bagian-bagian protein

21 dari 82

6

Hasil uji

Adanya butiran atau gumpalan susu menunjukkan reaksi positif.

22 dari 82

Uji katalase

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk menentukan adanya sel-sel radang (leukosit), kuman dan adanya bahan organis seperti santan di dalam susu segar.

2

Prinsip

Di dalam susu terdapat enzim katalase yang dibentuk oleh sel-sel leukosit, kumankuman, reruntuhan sel ambing dan zat organis yang membebaskan oksigen (O 2) dari larutan peroksidanya (H 2O 2).

3

Pereaksi

Larutan H2O 2 0,5 % (larutkan 1 ml 2H 02 35% dengan 69 ml aquadest).

4

Peralatan

a)

Pipet steril 5 , 10 ml

b)

Tabung katalase

c)

Inkubatordengan suhu 37oC.

5

Prosedur

5.1.

Isi tabung katalasesteril dengan 10 ml susu.

5.2.

Tambahkan5 ml larutan H2O 2 0,5 % ke dalamnya.

5.3. Aduk dengan cara membalik-balikkan tabung, kemudian tempatkan campuran susu tersebut di bagian tabung yang vertikal dan berskala dan jaga agar jangan ada gelembung udara di puncaknya. 5.4. C.

Sumbat tabung dengan kapas, kemudian masukkan ke dalam inkubator 370

23 dari 82

5.5.

Tetapkan volume gas O2 yang terkumpul di dalam puncak tabung setelah 3

jam.

6

Hasil Uji

Angka katalase ad alah jumlah cc gas oksigen yang terkumpul di dalam puncak tabung. Angka katalase maksimum adalah 3,0.

24 dari 82

Penentuan titik beku

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda penentuan titik beku susu segar untuk mengetahui kemungkinan adanya pemalsuan susu dengan air.

2

Prinsip

Kenaikan atau penurunan titik beku susu adalah selisih antara titik beku air dengan standar titik beku susu. Kenaikan titik beku menyatakan adanya indikasi penambahan air, sedangkan penurunan titik beku menyatakan adanya indikasi penambahan susu bubuk atau tepung.

4

Pereaksi

4.1. Cairan pendingin dengan suhu kira-kira -40 C yang terbuat dari 2 gr NaCl yang telah ditumbuk halus di dalam 200 cc air dan kemudian dimasukkan kedalamnya 400 gr es.

5

Peralatan

a) Kryoskop yang dilengkapithermometerBeckmann dengan pembagianskala hingga 0,0010 C. b)

Tabung gelas yang kedua ujungnya terbuka.

c)

Tabung reaksi yang berdiameter2,5 cm.

d)

Tabung reaksi berdiameter 5 cm.

e)

Bak cairan pendingin.

f) Batang pengaduk terbuat dari logam yang tidak bereaksi terhadap susu, berdiameter antara 1 - 1,5 mm.

25 dari 82

6

Prosedur

6.1 Dalam tabung reaksi berdiameter 2,5 cm dimasukkan 30 cc aquadestilata yang telah dimasak dan didinginkan, kemudian tabung disumbat dengan gabus yang mempunyai dua lubang. 6.2 Pada lubang pertama masukkan/tanamkankristal es dan aduk cairan dengan alat pengaduk, sedang lubang yang satu lagi dimasukkan thermometer Beckmann dengan ujungnya tepat berada di pertengahan cairan. 6.3 Masukkan tabung ini ke dalam cairan pendingin berisolasi dengan suhu -2 sampai -60 C sambil diaduk terus secara teratur dan perlahan-lahan sampai suhu dalam tabung mencapai01C dibawah titik beku air. 6.4

Masukkan tabung ke dalam tabung reaksi berdiameter5 cm sehinggamantel

pendingin dan tabung pembeku tidak bersentuhan. 6.5 Kemudian masukkan keduanya ke dalam cairan pendingin kembali dimana cairan pendingin harus kira-kira 4 cm lebih tinggi dari permukaan air di dalam tabung pertama. 6.6 Ke dalam cairan pendingin dimasukkan kristal es murni kecil dan diaduk secara merata. Penaikan tiang raksa harus diperhatikan hingga kira-kira selama 1 menit tiang raksa tidak bergerak lagi. 6.7 Bila hal ini sudah tercapai, ketuk thermometerperlahan-lahan dan tingginya 0 tiang air raksa diperiksa dengan loupe hingga 0,001 C. Bila es yang terbentuk sudah meleleh lagi, ulangi lagi cara kerja ini dengan catatan perbedaannya tidak boleh lebih dari 0,0050 C. 6.8 Dengan cara yang serupa dilakukan perlakuan terhadap 30 cc susu. Akan tetapi cairan hanya didinginkan sampai 01,5 C dibawah titik beku air dan yang dimasukkan/ditanamkan adalah sepotong kecil susu beku. Perbedaan antara dua kali penentuan tidak boleh lebih dari 0,0050 C. 6.9 Bila menggunakan thermometeryang tidak ditera lebih dahulu, hendaknya dengan thermometer ini kita menentukan titik beku larutan 10 gr NaCl murni dalam 1 0 liter air, dimana titik ini harus -0,603 C.

7

Hasil uji

26 dari 82

0 Hasil uji titik beku susu dinyatakan dalam derajat Celcius C).( Titik beku susu yang 0 0 memenuhi syarat mutu adalah -0,520 C sampai -0,560 C.

27 dari 82

Pengukuran angka refraksi metoda Ackermann

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda penyimpangan terhadap susu.

2

untuk

mengetahui

kemungkinan

adanya

Prinsip

Angka refraksi ditetapkan dari serum kalsium khlorida (CaCl 2) susu yang o C, dan dihitung angka refraksinya. disesuaikan pada suhu 27,5

3

Pereaksi

Serum CaCl2 20% (20 gr CaCl2 dilarutkan dalam 100ml aquades) dengan BJ= 1,1375. 0 Bila larutan CaCl C, maka 2 diencerkan dengan aquades (1:10) pada suhu 17,5 refraktometer harus menunjukkan angka 26.

4

Peralatan

a)

Refraktometer celup (Zeiss)

b)

Penangas air

c)

Corong

d)

Kertas saring

e) Labu Erlenmeyer50 ml/100 ml dilengkapisumbat karet dengan pipa gelas yang panjangnya + 22 cm.

5

Prosedur

5.1.

Masukkan30 ml contoh susu ke dalam labu Erlenmeyer.

28 dari 82

5.2.

Tambahkan0,25 ml larutan CaCl2 20%.

5.3. Labu Erlenmeyer disumbat dengan sumbat yang dilengkapi gelas untuk menghindari kehilangan cairanakibat penguapan. 5.4.

Letakkanlabu Erlenmeyerdalam penangasair (mendidih)selama 15 menit.

5.5.

Dinginkansampai terlihatada pemisahanserum dengan endapan.

5.6.

Pisahkanserum dengan endapanmelaluisaringan.

5.7.

Serum dituang ke dalam cuvet sampai batas yang tertera.

5.8. Celupkan refraktometerke dalam cuvet dan baca skala yang tertera. Setelah itu ukur suhu serum tersebut dengan termometer. 5.9.

Koreksi suhu serum yang didapat ke 27,50 C yang merupakan rata-rata suhu

kamar di Indonesia (Tabel 4).

6

Cara pengukuran

Cara pengukuran angka refraksi adalah seperticontoh di bawah ini: Jika pada suhu 30o C didapatkan angka 18,0, maka kalau dikembalikan pada 27,5o C akan menjadi : 18,0 + 0,75 = 18,75. 6.1

Jika pada suhu 20o C didapatkan angka 45,0, maka kalau dikembalikan pada 27,5o C akan menjadi : 45,0 - 2,55 = 42,45. 6.2

29 dari 82

Tabel 4 Tabel Koreksi Untuk Pembacaan Refraktometer yang dicelupkan pada suhu o o o antara 20 C - 30 C terhadap suhu koreksi 27,5 C

12,55

17,6

22,5

27,35

32,2

37,1

41,9

46,7

300

+0,75

+0,75

+0,75

+0,75

+0,75

+0,75

+0,80

+0,80

290

+0,40

+0,40

+0,45

+0,45

+0,45

+0,45

+0,45

+0,45

280

+0,10

+0,10

+0,15

+0,15

+0,15

+0,15

+0,15

+0,15

27,5 270

0,00 -0,15

0,00 -0,15

0,00 -0,15

0,00 -0,15

0,00 -0,15

0,00 -0,15

0,00 -0,15

0,00 -0,15

260

-0,45

-0,45

-0,45

-0,45

-0,45

-0,45

-0,50

-0,50

250

-0,70

-0,70

-0,70

-0,75

-0,75

-0,75

-0,85

-0,55

240

-0,90

-0,95

-0,95

-1,05

-1,05

-1,05

-1,15

-1,20

230

-1,20

-1,20

-1,20

-1,30

-1,35

-1,35

-1,45

-1,55

220

-1,45

-1,45

-1,45

-1,55

-1,65

-1,65

-1,80

-1,0

-1,65 -1,90

-1,65 -1,90

-1,70 -1,95

-1,80 -2,05

-1,90 -2,15

-1,95 -2,25

-2,05 -2,35

-2,25 -2,55

0

0

21 200

30 dari 82

Uji reduktase

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk menentukan adanya kuman-kuman di dalam susu segar dalam waktu cepat dengan menggunakan pereaksi warna indikator.

2

Prinsip

Di dalam susu segar terdapat enzim reduktase yang dibentuk oleh kuman yang mereduksi zat warnaindikator menjadi larutan yang tidakberwarna.

(M ethyl en bl ue reducti on test) Metoda 01 : Uji reduksi biru metilen

3

Pereaksi

Larutan biru metilen yang dibuat dengan cara : a)

Masukkan10 mg methylenblue DAB7 ke dalam labu erlenmeyersteril.

b)

Tambahkan 100 ml aquades steril.

c) Campur dengan baik dan simpan dalam temperatur 4-80 C dan terlindung dari cahaya. Larutan ini dapat bertahan selama 4 minggu.

4

Peralatan

a)

Pipet steril 1, 25 ml.

b) Tabung reduktase dengan batas melingkar pada 21 ml dilengkapi penyumbat karet atau parafin untuk mencegah terjadinya reaksi oksidasi. c)

Labu erlenmeyer.

d)

Inkubatoratau penangas air dengan suhu 37o C yang terlindung dari cahaya.

5

Prosedur 31 dari 82

5.1.

Masukkanke dalam tabung reduktasesteril 1 ml larutan biru metilen.

5.2.

Tambahkancontoh susu sampai batas lingkar.

5.3. Tutup tabung tersebut dengan sumbat, lalu campurkan biru metilen dengan contoh susu dengan cara membolak-balikkan tabung (+ 3 kali) sampai warna biru tersebar merata. 5.4. Masukkan tabung ke dalam penangas air (37 + 10 C) selama 4 - 4,5 jam. Letakkan penangas air di tempat yang terlindung dari cahaya. Bila menggunakan inkubator, masukkan dulu tabung dalam penangas (37 air + 10 C) selama 5 menit untuk menghangatkan baru dimasukkan ke dalam inkubator.

6

Cara Membaca Hasil

Pembacaan hasil dapat dimulai minimal setelah 2/3 dari warna sudah berubah menjadi putih. Sebaiknya reaksi ditunggu sampai seluruh warna biru hilang.

7

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dalam satuan waktu, dimana waktu reduksi (angka reduktase) menunjukkan waktu yang dibutuhkan sejak saat memasukkan tabung kedalam inkubator/penangas air bersuhu o37C sampai seluruh warna biru hilang.

32 dari 82

Tabel 5 Kualitas susu segar berdasarkan lamanya waktu reduksi

Waktu Reduksi

Kualitas Susu

0 menit - 20 menit

Jelek

20 menit - 2 jam

Kelas III

2 jam - 4,5 jam

Kelas II

4,5 jam - 5,5 jam

Kelas I

lebih dari 6 jam

Susu dicurigai telah mengalami perlakuan (dididihkan, ditambah atau mengandung desinfektan).antibiotika, ditambah

33 dari 82

Metoda 02 : Uji resazurin

1

Pereaksi

Larutan resazurin yang dibuat dengan cara : 1.1

Masukkan1 ampul resazurin(Fa. Retorte) ke dalam labu erlenmeyersteril.

1.2 Larutkan dengan air panas, kemudian dengan aquades bersuhu 600 C. Setiap ampul dapat dilarutkan dengan 250, 500 atau 1000 ml. 1.3 Larutan disimpan dalam tempat yang terlindung dari cahaya. Pembuatan larutan jangan lebih dari 3 jam sebelum pemeriksaan dilaksanakan.

2

Peralatan

a)

Tabung reduktasidengan batas lingkar 11 ml steril.

Sterilisasi tabung tidak boleh lebih dari 48 jam sebelum uji dilaksanakan. b)

Sumbat karet steril.

Sterilisasi sumbat karet dilakukan dalam autoklaf selama 10 menit atau dalam air mendidih selama 0,5 jam. c)

Pipet steril 1, 10 ml

d) e)

o Inkubatoratau penangas air dengan suhu 37 + 1 C. Kartu standar warna.

3

Prosedur

3.1 Masukkan 1 ml zat warna dalam tabung reduktasi steril dan tambahkan 10 ml susu. 3.2

Tutuplahtabung dengan sumbat karet dan dibolak-balik minimal 3 kali.

3.3

Masukkan tabung ke dalam penangas air (37 + 10 C) selama 1 jam. Bila

akan menggunakan inkubator, maka tabung terlebih dahulu harus dimasukkan ke dalam penangasair (37 + 10 C) selama 5 menit kemudian dimasukkan ke dalam inkubator selama 55 menit. 34 dari 82

3.4 Pembacaan dapat dilakukan 1 jam setelah tabung reduktase tadi dikeluarkan dari penangas air atau inkubator dan sebelum pembacaan dimulai hendaknya tabung dimiringkan atau dibalikkan dahulu 1 kali.

4

Hasil uji

Cocokkan warna yang terbentuk dengan standar warna yang tersedia setelah lewat waktu yang ditetapkan.

35 dari 82

Uji sedimen

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk mengetahui adanya kemungkinan penanganan susu yang tidak higienis.

2

Prinsip

Kadar sedimen susu ditentukan dengan cara memusingkan susu dengan kecepatan tinggi.

3

Pereaksi

Tidak diperlukan

4

Peralatan

a)

Tabung sentrifusTromsdorf.

b)

Sentrifus dengan kecepatan 3000 rpm/menit.

5

Prosedur

5.1

Susu yang belum disaringdipanaskanhingga 60o C selama 5 menit.

5.2 Isi tabung Tromsdorf dengan susu yang telah dipanaskan tadi sampai garis 10 ml. 5.3

Susu tersebutdisentrifusiselama 10 menit dengan putaran 3000 rpm/ menit.

5.4

Tabung dikosongkandan dicuci dengan aquades steril.

5.5 Letakkan tabung terbalik diatas rak untuk beberapa waktu kemudian kadar sedimen dibaca. 6

Hasil Uji

Hasil uji sedimen dinayatakan dalam persen (%). 36 dari 82

Pengujian cemaran mikroba

1

Pendahuluan

Pengujian cemaran mikroba dalam susu segar adalah bertujuan sebagai indikator sanitasi dalam roses produksi atau penanganan susu serta sebagai indikator kesehatan dan keamanan susu. Berbagai macam uji mikrobiologi dapat dilakukan, meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan kualitas, uji kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanannya, serta uji bakteri indikator untuk menentukan tingkat sanitasi susu tersebut.

2

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda pengujian kuantitatif

3

PeralatanUmum

Catatan: Seluruh peralatan yang mengalami kontak langsung dengan contoh susu yang diuji, pelarut maupun media biakan harus steril. a)

Pipet yang disumbatdengan kapas dengan ukuran 1 ml, 5 ml atau 10 ml.

b)

Cawan petri, terbuat dari gelas atau plastik, berdiameter 90 - 100 mm.

c)

Tabung reaksi dengan kapasitas20, 50 ml.

d)

Labu erlenmeyer.

e)

Inkubator.

f)

Pembakar Bunsen.

g)

Penangas air.

h)

Tube shaker/pengocok mekanis.

i)

Rak tabung reaksi.

j)

Penghitung koloni atau “Hand Tally Counter”.

37 dari 82

k)

Ose.

l)

Timbangan

m)

Spreader dari batang gelas/logam bengkok (hockey stick, spatel)

0

01- Penentuan Angka Lempeng Total pada 35 C

1

Prinsip

Angka lempeng total(Total Plate Count) dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah mikroorganisma yang terdapat dalam susu dengan metoda hitungan cawan. Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan matatanpa menggunakan mikroskop.

2

Media

Plate Count Agar (Standard Method Agar).

3

Prosedur

Umum : selama pengerjaan penuangan, beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut: a) Jaga agar tutup cawan tetap berada pada tempatnya kecuali pada saat akan menambahkan larutan contoh atau media PCA tutup cawan jangan dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar. b) Jarak waktu antara memipet larutan contoh hingga penuangan media PCA ke cawan petri dilakukan dalam waktu tidak lebih dari 10 menit. c) Waktu antara dimulainyapengenceransampai penuanganmedia pada cawan petri terakhir tidak boleh lebih dari 20 menit. d) Untuk mencegah terjadinya kontaminasi silang, maka semua pekerjaan dilakukan di dekat nyala api Bunsen dan mulut segala bejana harus disterilkan sebelumnya dengan nyala api Bunsen.

38 dari 82

3.1

Pemupukandan penuanganmedia pada cawan

3.1.1

Siapkan contoh susu secara aseptis.

3.1.2 Lakukan pengenceran contoh susu secara desimal (menjadi pengenceran 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya). 3.1.3 Letakkan labu erlenmeyer secara berderet dan masing-masingdiberi tanda 1:10, 1:100, 1:1.000, dan seterusnya serta 1 (satu) labu erlenmeyer lainnya dengan tanda K (Kontrol). 3.1.4 Deretkan pula cawan petri di depan labu erlenmeyerseperti dimaksud pada butir 3.1.3 disesuaikan dengan pengencerannya. Untuk meningkatkan ketepatan pengujian, sebaiknya pemupukan dilakukan secara duplo. Dengan mengetahui sejarah contoh susu serta berdasarkan pengalaman, maka cemaran mikroba dalam susu dapat diperkirakan jumlahnya secara kasar, sehingga pemupukan pada cawan petri dapat diambil dari 3 atau 4 konsentrasi tertentu yang berurutan. 3.1.5 Bila diharapkan jumlah cemaran susu adalah 105, maka contoh susu dikocok dengan shaker/pengocok mekanis dan dengan menggunakan pipet steril pindahkan 0,1 ml ke dalam cawan petri bertanda 10-1 dan sebanyak 1 ml ke dalam

Buffered Peptone Water 0,1% dalam labu erlenmeyer I bertanda 1 : 10. Kocok labu erlenmeyer(I) ini denganshaker/pengocok mekanis, kemudian -2 , 10 dengan pipet steril dipindahkan 0,1 ml ke dalam cawan petri bertanda dan 1 3.1.6

ml ke dalam labu Erlenmeyer II bertanda 1:100. 3.1.7

Lakukan proseduryang sama untuk mempersiapkanpemupukanselanjutnya.

3.1.8 Dengan pipet steril, pindahkan 1 ml Buffered Peptone Water dari labu Erlenmeyer bertanda K ke dalam cawan petri bertanda K. 3.1.9 Sementara itu tabung reaksi yang berisi 12 - 15 ml PCA dipanaskan dalam penangas air sampai mencair, kemudian didinginkan sampai suhunya mencapai 40 50oC. 3.1.10 Tuangkan tiap 12 - 15 ml PCA tadi ke masi ng-masing cawan petri yang sudah berisi larutan contoh. 3.1.11 Supaya larutan contoh dan media PCA dapat tercampur dengan baik, maka lakukan gerakan searah gerakan jarum jam yang dilanjutkan dengan gerakan berlawanan dengan arah jarum jam, atau dengan gerakan seperti angka delapan, masing-masing sebanyak 5 kali. Selama pencampuran, jaga jangan sampai tutup 39 dari 82

cawan terkena campuran laru tan contoh dan media tersebut. Biarkan cawan-cawan tersebut pada posisi horisontal sampai mengeras. 3.2.

Inkubasi

3.2.1

Segera setelah mediamengeras, cawan-cawanpetri tersebut dibalik hingga posisi tutupnya berada di bawah, dan masukkan ke dalam inkubator 35oC selama 48 jam 3.2.2 Cawan-cawan harus diatur sedemikianrupa sehingga inkubatortidak terlalu penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.

4

Penghitungankoloni

4.1 Pilihlah cawan yang ditumbuhioleh koloni yang jumlahnyaantara 25 - 250. Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang lebih banyak. 4.2 Gunakanlahtally counter untuk menghitung koloni, dan berilah tanda koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang. 4.3 Bila ada koloni yang menyebar, maka dihitung sebagai satu koloni. Akan tetapi bila lebih dari 25% koloni yang tumbuh pada suatu cawan adalah koloni yang menyebar, maka cawan tersebut tidak perlu dihitung.

5

InterpretasiHasil/Perhitungan

Jumlah koloni per ml susu dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran Contoh: Misalnya, jika setelah diinkubasi diperoleh 60 dan 64 koloni pada masing-masing cawan duplo yang mengandung pengenceran -4 10 , maka jumlah koloni dapat dihitung sebagai berikut (1 ml larutan pengencer dianggap mempunyai berat 1 gram): Faktor pengenceran

=

Pengenceranx Jumlah yang ditumbuhkan

=

10-4 x 1,0

=

10-4 40 dari 82

Jumlah koloni =

6

Jumlah koloni x 1/faktor pengenceranper cawan

=

(60 + 64)/2 x 1/10-4

=

6.2 x 105

Pelaporan

6.1 Untuk melaporkanhasil analisa mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut Standard Plate Count (SPC) dengan satuancolony-forming units (CFU) per mililiter atau per gram, dan hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, maka dilakukan pembulatan satu angka lebih tinggi dari angka kedua. 6.2 Jika semua pengenceranyang dibuat untuk pemupukanmenghasilkanangka kurang dari 25 koloni, maka hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 25 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.

Jumlah koloni pengenceran

per

SPC

10-2

10-3

10-4

16

1

0

Keterangan

< 2,5 x 103

Hitung pengenceran

(1,6 x 103

10-2

6.3 Jika semua pengenceranyang dibuat untuk pemupukan menghasilkanlebih dari 250 koloni, maka hanya jumlah koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung, misalnya dengan cara menghitung jumlahnya pada 1/4 bagian cawan petri, kemudian hasilnya dikalikan empat. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 250 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.

41 dari 82

Jumlah koloni pengenceran

per

SPC

10-2

10-3

10-4

TBUD*)

TBUD

355

TBUD

325

Keterangan

20

< 2,5 x 106

Hitung pengenceran

(1,6 x 106

10-4

< 2,5 x 105

Hitung pengenceran

(1,6 x 105

10-3

*) TBUD = Terlalu banyak untuk dihitung

6.4 Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, maka data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh hanya dari salah satunya, meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut.

7

Hasil Uji

Jumlah koloni yang diperoleh dinyatakan dengan Colony Forming Units (CFU) per ml.

Escher ichi a coli 02- Penghitungan Coliform dan

1

Prinsip

Kristal violet dan garam empedu yang ada di media akan menghambat bakteri Gram positif lainnya sehingga hanya organisme coliform yang tumbuh. Selama pertumbuhannya, coliform akan mengubah laktosa menjadi asam dan perubahan ini akan dideteksi oleh indikatorneutral red yang akan berubah warnanya menjadi merah. Selain itu keadaan asam akan menyebabkan presipitasi asam empedu.

42 dari 82

2

Media, pereaksi dan kuman uji

a)

Peptone Water (PW) 0,1%

b)

Violet Red Bile Agar (VRBA)

c)

Violet Red Bile Dextrose Agar(VRBDA)

d)

Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB)

e)

Lauryl tryptose (LST) broth

f)

EC broth

g)

Levine's eosin-methylene blue (L-EMB) agar

h) i)

Tryptone (tryptophane) broth MR-VP broth

j)

Koser's citrate broth

k)

Plate count agar (PCA) (standard method)

l)

Reagen Kovac

m)

Reagent Voges-Proskaeur (VP)

3 a)

Peralatan Tabung reaksi berkapasitas20 ml dilengkapitabung Durham

4

Prosedur

4.1.

PenghitunganJumlah PresumtifColiformDengan Metoda HitunganCawan

4.1.1 Lakukan pengenceran contoh secara desimal seperti metoda hitungan cawan. Untuk pengenceran pertama dianjurkan mengambil 25 ml contoh yang dimasukkan ke dalam 225 ml larutan PW 0,1% steril. 4.1.2 Masukkan 0,1 ml atau 1,0 ml contoh ke dalam cawanpetri steril.Pengujian sebaiknya dilakukan se cara duplo. Kemudian tua ngkan 10 - 15 ml media VRBA 0 (suhu antara 45 - 48C). Supaya larutan contoh dan media agar dapat tercampur 43 dari 82

dengan baik, maka putarlah cawan dengan gerakan searah gerakan jarum jam yang dilanjutkan dengan gerakan berlawanan dengan arah jarum jam, atau dengan gerakan seperti angka delapan, masing-masing sebanyak 5 kali. Selama pencampuran, jaga jangan sampai tutup cawan terkena campuran larutan contoh dan media tersebut. 4.1.3 Setelah memadat tuangkankembali 3 - 4 ml VRBA cair (overlay) di atas permukaan agar. 4.1.4 Segera setelah mediamengeras, cawan-cawanpetri tersebut dibalik hingga posisi tutupnya berada di bawah, dan masukkan ke dalam inkubator 350C selama 18-24 jam. 4.1.5 Cawan-cawan harus diatur sedemik ian rupa sehingga inkubatortidak terlalu penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan. 4.1.6 Hitung semua koloni berwarnamerah keunguanyang dikelilingizona merah (diameter koloni pada umumnya 0,5 mm atau lebih). Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni yang jumlahnya antara 25 - 250. Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang lebih banyak. Gunakanlah tally counter untuk menghitung koloni, dan berilah tanda koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang. 4.1.7 Hasil yang diperoleh adalah jumlah presumtif coliform per ml/gram contoh. Untuk mendapatkan jumlah coliform sebenarnya perlu dilanjutkan ke uji konfirmasi coliform.

4.2

KonfirmasiColiform

4.2.1 Pilihlah koloni-koloni yangmewakili semua jenis kolon i yang tumbuh. Ambillah 10 koloni dengan ose steril, dan pindahkan masing-masing ke dalam 10 ml BGLBB steril dalam tabung-tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung durham. 4.2.2 Inkubasikan tabung-tabung reaksi tersebut pada suhu 350C selama 24-48 jam, amati terbentuknya gas dalam tabung durham sebagai reaksi positif. 4.2.3 Hitunglahtabung yang berisi gas. Untuk meyakinkanpertumbuhancoliform, buatlah preparat ulas dari tabung positif yang diwarnai pewarnaan Gram.

44 dari 82

4.3

Interpretasi Hasil

Tabung positif (%) =

Jumlah tabung positif x 100 % 10

Jumlah coliform per ml/gram = % tabung positif x jumlah (seluruh) koloni dalam cawan petri x faktor pengenceran cawan petri tersebut.

4.4 Uji konfirmasi Escherichia coli dengan metoda the Most Probable Number (MPN) 4.4.1 Siapkan beberapa seri (seri 3 atau 5) tabung yang berisi EC broth yang dilengkapi dengan tabung Durham. 4.4.2 Pilihlah tabung BGLB positif sedikitnya dari tiga pengenceran yang berurutan. Goyangkan secara hati-hati tabung positif tersebut dan dengan ose steril pindahkan suspensi ke masing-masing seri tabung reaksi berisi EC broth, disesuaikan dengan pengencerannya. 4.4.3 Inkubasikan tabung rekasi tersebut pada suhu 45,50C selama 48 jam. Amati terbentuknya gas sebagai reaksi positif setelah diinkubasikan selama 24 jam. Bila belum terbentuk gas, inkubasi dilanjutkan dan amati reaksi positif pada 48 jam. 4.4.4 Jumlah tabung yang positif dari masing-masing seridicocokkandengan tabel statistik untuk mengetahui jumlah fecal coliform, dan dinyatakan dengan MPN per unit sampel. 4.4.5 Dengan ose steril pindahkan suspensi dari masing-masin g tabung positif ke Levine's eosin-methylen blue (L-EMB) agar dan goreskan ke permukaan agar beberapa kali agar dapat diperoleh koloni tunggal. Inkubasikan cawan pada suhu 350C selama 18-24 jam dan amati adanya koloni berwarna gelap dan datar dengan atau tanpa warna metal. 4.4.6 Pindahkan 2 koloni yang dicurigai dari tiap cawanL-EMB ke agar miring PCA untuk pengujian morfologi dan biokimia, kemudian inkubasikanh pada suhu 0

35 C selama 18-24 jam.

45 dari 82

4.4.7 Lakukan pewarnaan Gram, amati adanya baktericoccus atau cocoid, Gram negatif. Uji konfirmasi E. coli dilanjutkan ke uji biokimia IMViC (Indol-Voges Proskauer-Methyl red-Citrat) sebagai berikut: a)

Produksi Indole.

0 Inokulasi tabung berisi tryptone broth dan inkubasikan pada suhu C 35 selama 24 jam. Tambahkan 0,2 - 0,3 reagent Kovacs untuk menguji adanya pembentukan indole yang ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas di bagian atas.

b)

Voges-Proskauer .

0 Inokulasi tabung berisi MRVP broth dan inkubasikan pada suhu C35 selama 48 jam. Pindahkan 1 ml suspensi ke dalam tabung berukuran 13 x 100 mm. Tambahkan 0,6 larutan alpha-naphthol dan 0,2 ml KOH 40%, kemudian kocok. Setelah itu tambahkan beberapa kristal kreatin, kocok lagi dan diamkan selama 2 jam. Uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna pink eosin.

c)

M ethyl r ed .

Setelah test VP, inkubasikan lagi tabung MRVP pada suhu0C35 selama 48 jam. Tambahkan 5 tetes larutanmethyl red ke masing-masing tabung. Positif test ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas. Sedangkan reaksi negatif ditunjukkan dengan adanya warna kuning. d)

Citrate .

Inokulasi secara ringan tabung yang berisi Koser citrate broth; hindari adanya kekeruhan yang dapat terdeteksi dengan jelas. Inkubasikan pada suhu0C 35selama 9 jam. Adanya kekeruhan yang jelas menunjukkan reaksi positif. e)

Pembentukangas dari fermentasilaktosa.

0 Inokulasi tabung berisi LST broth dan inkubasikan pada suhu C 35 selama 48 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan berpindahnya media dari tabung bagian dalam atau timbulnya busa setelah dilakukan agitasi secara halus.

f)

Interpretasi.

Semua kultur yang 1) memfermentasikan laktosa dengan produksi gas pada suhu 350C dalam 48 jam, 2) muncul sebagai bakteri coccus, Gram negatif, dan 3) mempunyai pola ++-- (biotipe 1) atau -+-- (biotipe 2) pada uji IMViC dinyatakan sebagai E. coli. Hitung MPN E. coli berdasarkan tabung-tabung EC yang mengandungE. coli yang berasal dari 3 konsentrasi yang berurutan.

46 dari 82

03.

PenghitunganStaphyl ococcus aur eus dengan metoda hitungan cawan

Metoda ini digunakan untuk menghitung jumlah S. aureus lebih besar dari 100 selS. aureus per ml/gram contoh. Metoda yang biasa digunakan adalah metoda sebar/permukaan.

1

Prinsip

Manitol akan diubah oleh Staphylococcus yang tumbuh menjadi asam dan susuana asam ini akan mengubah indikator phenol red menjadi kuning.Tellurite yang ada akan menjaditellurite yang berwarna hitam.

2

Media, pereaksi

a) Baird Parker Agar (BPA) (tambahkan 5 mlegg yolk tellurite ke dalam 95 ml agar cair b)

Trypticase Soy Agar (TSA)

c)

Brain Heart Infusion (BHI) broth

d)

Coagulase plasma kelinci mengandung EDTA 0,1%

e)

Buffered Peptone Water (BPW) 0,1%

3

Prosedur

3.1

Isolasidan enumerasiS. aureus

a)

Buat pengencerandesimal terhadap contoh seperti metoda hitungancawan.

b) Pindahkan 0,1 ml suspensi contoh dari masing-masing pengenceran ke dalam cawan petri berisi BPA. c) Dengan spreader sebarkan suspensi contoh di atas permukan agar secara merata dan biarkan suspensi contoh terserap ke dalam media agar dengan mendiamkan cawan-cawan tersebut sekitar 10 menit.

47 dari 82

3.2

Inkubasi

3.2.1 Inkubasikan cawan-cawan tersebut dengan posisi tutup berada di bawah pada suhu 35-370C selama 45-48 jam. 3.2.2 Cawan-cawan harus diatur sedemikianrupa sehingga inkubatortidak terlalu penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.

3.3

Penghitungan jumlahpresumtifS. aureus

3.3.1 Pilihlahcawan yang ditumbuhioleh koloni tipikalS. aureus yang jumlahnya antara 20 - 200 koloni. Bila cawan dari tingkat pengenceranberbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang lebih banyak. Koloni khasS. aureus adalah bulat, licin halus, cembung, basah dan berdiameter 2-3 mm jika koloni tidak padat, berwarna abu-abu sampai hitam pekat, dikelilingi zona opak, dengan atau tanpa zona luar yang jelas. 3.3.2 Gunakanlahtally counter untuk menghitung tipikal koloni, dan berilah tanda koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang. Bila ditemukan adanya beberapa jenis koloni, hitung dan catat jenis koloni. Uji konfirmasi dapat dilakukan dengan uji koagulase, clumping faktor dan pewarnaan Gram.

3.4

Uji konfirmasiS. aureus dengan uji koagulase

3.4.1

Pindahkankoloni yang didugaS. aureus ke dalam tabung berisi 0,2-0,3 ml

BHI broth dan larutkan dengan seksama. 3.4.2 Tambahkan 0,5 ml coagulase plasma yang mengandung 0,1 5 EDTA ke dalam kultur BHI dan campur dengan seksama. Kemudian inkubasikan pada suhu 350C dan periksa secara periodik adanya penggumpalan setiap 6 jam sekali. Reaksi positif S. aureus ditunjukkan bila terjadi gumpalan yang kokoh dan lengkap dan apabila tabung dijentikkan atau dibalik, gumpalan tadi akan tetap berada ditempat semula. Penggumpalan parsial, dinyatakan dengan reaksi koagulase 2+ dan 3+, harus dilanjutkan dengan uji lebih lanjut. 3.4.3 Bila reaksi koagulase dari kultur yang diduga tidak dapat dipastikan berasal dari S. aureus, maka inokulasikan kultur tersebut pada kultur yang sudah diketahui positif dilanjutkan pada kultur yang sudah diketahui negatif S. aureus. 3.4.4 Lakukan pewarnaan Gram terhadap semua kultur yang diduga S. aureus dan periksa di bawah mikroskop. 48 dari 82

4

InterpretasiHasil/Perhitungan

Jumlah S. aureus per ml susu dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran

04

PengujianSalmonellae

1

Prinsip

Dalam metoda inidilakukan penggunaan gabungan larutan untukpemulihan/resusitas i (liquid resuscitation), larutan pre-enrichment dan media solid selektif untuk mengisolasi presumtif salmonellae, sedangkan konfirmasi salmonellae harus dilanjutkan dengan uji konfirmasi secara biologi dan serologi.

2

Media, pereaksi, antiserum dan uji

2.1

Media dan pereaksi

2.1.1

Buffered Peptone Water (BPW) (0,1%)

2.1.2

Mannitol selenite cystine broth (MSCB)

2.1.3

Rappaport-Vassiliadis (RV) media

2.1.4

Xylose Lysine desoxycholate (XLD) agar

2.1.5

Bismuth sulfite (BS) agar

2.1.6

Lysine decarboxylase broth

2.1.7

ONPG broth

2.2

Kuman uji

2.2.1

Kultur dari Salmonella hadar

2.2.2

Kultur dari Citrobacter freundii 49 dari 82

3

Prosedur

3.1

Resusitasi(Pre-enrichment)

3.1.1 Masukkan 25 ml contoh susu ke dalam 225 ml BPW dan campur hingga benar-benar merata, kemudian inkubasikan pada suhu 370 C selama 24 jam. 3.1.2 Sebagai kontrol, inokulasi BPW dalam 2 tabung reaksi dengan masing0 masing kuman uji dan inkubasikan pada suhu C37 selama 24 jam. 3.2

Enrichment pada media selektif

3.2.1 Inokulasikan 1 ml susp ensi dari masin g-masing larutan resusitasike 10 ml MSCB dan inkubasikan pada suhu 037 C selama 18-24 jam., serta 0,1 ml lainnya ke 0

10 ml RV media dan kemudian diinkubasikan pada suhuC42 selama 18-24 jam.

3.3

IsolasipresumtifSalmonellae pada media agar selektif

3.3.1 Dengan menggunakan ose steril inokulasikan suspensi dari masing-masing media enrichment ke cawan yang berisi XLD agar dan BS agar dengan cara goresan kuadran, kemudian inkubasikan pada suhu 037 C selama 18-24 jam untuk cawan XLD serta 24-48 jam untuk cawan BS. Amati terbentuknya koloni-koloni yang diduga sebagaiSalmonellae. 3.3.2 Pada XLD agar, koloni Salmonellae berbentuk bulat dan berwarna hitam mengkilat, sedangkan pada media BS koloni Salmonellae berwarna hitam. 3.3.3 Pilihlah tiga koloni tipikalSalmonellae dari tiap cawan dan inokulasikan masing-masing koloni ke tabung reaksi berisi 2,5 ml larutan pepton 1% kemudian 0 inkubasikan pada suhu 37 C selama 4 jam atau hingga terjadi adanya kekeruhan. 3.4

Konfirmasi biokimia

3.4.1 Dengan ose steril inokulasikan suspensi dari masing-masingtabung reaksi berisi larutan pepton ke Lysine-Decarboxylase broth (sebagai kontrol), ONPG broth dan media agar CLED. 3.4.2 Interpretasi hasil. Suspensi dipastikan mengandungSalmonellae apabila pada media Lysine-Decarboxylase terjadi reaksi positif dengan adanya perubahan

50 dari 82

warna menjadi kuning, pada media ONPG terjadi reaksi negatif ditunjukkan dengan tidak adanya perubahan warna.

51 dari 82

Penghitungan jumlah sel radang

Metoda langsung

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metoda langsung penghitungan jumlah sel radang dalam susu segar dengan menggunakan metoda Breed.

2

Prinsip

Untuk menetapkan jumlah sel radang dalam susu, maka dihitung jumlah sel radang dalam 0,01 ml susu yang disebarkan di atas gelas objek hingga mencapai luas2 1 cm dan kemudian diwarnai.

3

Pereaksi

a)

Larutan alkohol ether (ana)

b)

Larutan alkohol 96%

c)

Larutanmethylen blue Loeffler

4

Peralatan

a)

Gelas objek bersih yang bebas dari lemak

b)

Pipet Breed steril

c)

Bunsen

d)

Mikroskop

e)

Ose siku

5

Prosedur

52 dari 82

5.1 Siapkan sebuah gelas objek yang telah dibersihkan dan bebas dari lemak, kemudian diberi tanda yang menunjukkan asal contoh susu. 5.2

Letakkan gelas objek tersebut di atas kertas yang sudah berisi gambar kotak

seluas 1 cm2. 5.3 Pipet sejumlah 0,01 ml contoh susu dengan pipet Breed ke daerah yang dibatasi kotak, dan dengan bantuan ose siku contoh susu tadi disebarkan sehingga menutupi seluruh gambar kotak (luas 1 2cm ). 5.4 Keringkan di udara sampai kering (sekitar 5 - 10 menit),kemudiandifiksasi di atas nyala api. 5.5

Lakukan pewarnaandengan cara:

a)

Celupkan preparat tadi ke dalam larutan alkohol- ether (ana) selama 2 menit,

b) Masukkan preparat tadi ke dalam larutan methylen blue Löffler selama 1 menit, c)

Bilas secara hati-hatidengan air,

d) Celupkan ke dalam alkohol 96% (untuk membersihkanbahan pulasan yang tidak terikat), e)

Preparat dikeringkandi udara atau dengan kertas pengisap.

5.6 Penetapan jumlah sel radang dilakukan dengan bantuan mikroskop (pembesaran 100x) dengan menggunakan lensa minyak imersa. 5.7 Hitung jumlah sel radang dalam 20 lapangan pandang, kemudian dirataratakan. 6

Cara Perhitungan

Tentukan luas lapang penglihatan dengan cara menghitung diameter lapangan penglihatan dari mikroskop yang digunakan dengan rumus: π r2. 2 disebarkan 0,01 ml susu, maka jumlah sel radang pada Diketahui pada bidang 1 cm luas lapang penglihatan adalah: 2 π

r 100

X 0,01 ml

53 dari 82

7

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dengan jumlah sel per ml.

54 dari 82

Pengujian residu antibiotik

I

Skrining residu antibiotika

Pendahuluan Pada dasarnya cara pengujian residu antibiotika dibedakan antara uji skrining dan uji konfirmasi. Tujuan dilakukannya skrining residu antibiotika pada susu segar adalah untuk mengetahui kemungkinan adanya residu antibiotika dalam susu secara kualitatif atau semi kuantitatif. Dengan demikian dengan cara ini hanya dapat diketahui ada/tidak adanya suatu residu antibiotika serta golongan dari antibiotika yang ditemukan dari contoh susu yang diperiksa, sedangkan untuk mengetahui jenis dan konsentrasi residu antibiotika secara pasti harus dilanjutkan dengan uji konfirmasi.

Metoda -1

1

RuangLingkup

Standar ini menetapkan metodeuntuk skrining residu antibiotika padaair susu dengan batas kepekaan adalah antara konsentrasi 0.04 µg/ml sampai 1 µg/ml tergantung dari jenis antibiotika, sedangkan angka perolehan kembali antara 75% 95%.

2

Prinsip

Sampel susu dihomogenisasi. Tetesi kertas cakram dengan sampel susu, lalu letakkan kertas cakram tersebut di atas permukaan media agar yangtelah dicampur dengan biakan bakteri uji dan diinkubasikan pada suhu0 C 37selama 16-18 jam. Contoh susu dinyatakan positif mengandung residu antibiotika bila terbentuk zone hambatan di sekitar kertas cakram.

3

Bahan

a)

Media Agar NV- 4, NV-8, MX.

55 dari 82

b)

Larutan dapar fosfat pH 7,0 ± 0,1 dan pH 8,0 ± 0,1.

c)

Kuman uji :

1)

M icr ococcus lu teus AT CC 9341 - untuk golongan Makrolida .

2)

Bacil us subti li s AT CC 6633 - untuk golongan Amino-glikosida.

3)

Baci l l us cer eus AT CC 11778 - untuk golongan Tetrasiklin .

4)

Bacil lu s cali dolactis

- untuk golongan Penisilin.

d) Larutan stok baku pembanding untuk antibiotika penisilin (PC), kanamisin (KM), tilosin (TS) dan oksitetrasiklin (OTC). e)

Larutan baku kerja.

f)

Kultur media (inokulasikan sebanyak 1% kuman uji pada media agar:

Bacillus subtilis pada media NV-4, Micrococcus luteus pada media NV-8 dan Bacillus cereus pada media MX). g)

Kurva baku

4

Peralatan

a)

Cawan petri steril 100 x 12 mm

b)

Inkubator 370 C dan 300 C

c)

Tabung sentrifus50 ml, tabung reaksi 50 ml.

d)

Kertas cakram steril berdiameter 8-10 mm, silinder cakram 0,3 ml.

e)

Ultra turax.

f)

Sentrifus.

g)

Mikro pipet.

5

Prosedur

5.1

Persiapan media agar

5.1.1 Media NV-4 : Larutkan 5 gr pepton, 3 gr beef extract dan 16 gr agar dalam 1.000 ml air suling, lalu ukur pH 8,5 ± 0.1, dan kemudian didihkan. Media 56 dari 82

disterilisasi dengan memasukkannya ke dalam otoklaf pada suhu0C, 12115 psi selama 15 menit. 5.1.2 Medium NV-8: Larutkan 6 gr pepton, 1,5 gr beef extract, 3 gr yeast extract , 1 gr D(+) Glucose dan 16 gr agar dalam 1.000 ml air suling, ukur pH 8.5 ± 0.1, didihkan, kemu dian sterilisasi dengan otoklaf pada suhu 1210C, 15 psi selama 15 menit. 5.1.3 Medium MX: Larutkan 6 gr pepton, 1,5 gr beef extract, 3 gr Yeast extract , 1,35 gr kalium dihidrogenfosfat dan 15 gr agar dalam 1.000ml air suling dengan pH 5,7 ± 0.1, didihkan dan dilakukan sterilisasi dengan otoklaf pada suhu 1210 C, 15 psi selama 15 menit

5.2.

Persiapan larutan dapar fosfat

5.2.1

Dapar fosfat pH 7.0± 0.1: Campuran 6,4 grkalium dihidrogen fosfat, 18,9 0C,121 gr dinatrium hidrogen fosfat dalam 1.000 ml air suling, otoklaf pada suhu 15 psi selama 15 menit 5.2.2

Dapar fosfat pH 8.0±0.1: Campuran 13,3 gr kalium dihidrogen fosfat dan 0C, 6,2 gr kalium hidroksida dalam 1.000 ml air suling, otoklaf pada suhu 121 15 psi selama 15 menit.

5.3

Larutan stok baku pembanding : Timbang 20 mg masing-masing baku

pembanding penisilin (PC), kanamisin (KM), tilosin (TS) dan oksitetrasiklin (OTC), kemudian larutkan masing-masing dengan larutan dapar fosfat pH 7.0.

5.4 Larutan baku kerja : Untuk masing-masing antibiotika buat 6 serial pengenceran larutan stok baku kerja dengan air atau larutan dapar fosfat hingga konsentrasi 0,05 IU/ml atau 1 µg/ml.

5.5

Kultur media :

5.5.1 Cairkan media agar (NV-4, NV-8, MX) dengan pemanasan pada suhu 0 C. 1000 C, kemudian dinginkan dan simpan dalam penangas air bersuhu 56

57 dari 82

5.5.2 Inokulasikan 1% kuman uji Bacillus subtilis pada media agar NV-4, Micrococcus luteus pada media NV-8 dan Bacillus cereus pada media MX dan campur secara seksama sehingga kuman uji dan media dapat tercampur rata. Tuangkan sebanyak 7 ml masing-masing kultur media tersebut ke dalam cawan petri steril dan biarkan menjadi beku. 5.6

Kurva baku

5.6.1

Siapkan tabung reaksi berisi 9 ml susu

5.6.2 Tambahkan masing-masing larutanbaku kerja dari tiap konsentrasike dalam susu (hitung konsentrasi akhir dalam susu). 5.6.3 Siapkan media agar NV-4, NV-8 dan MX masing-masing sebanyak 5 cawan petri untuk setiap konsentrasi pengenceran. 5.6.4

Ambil kertas cakram steril dengan pinset steril dan letakkanmasing-masing4

buah kertas cakram di atas permukaan media agar. 5.6.5 Teteskan 30 µl setiap pengenceran ke kertas cakram. Inkubasikan 35-370 C selama 16-18 jam.Ukur diameter zona hambatan. 5.6.6 Buat kurva semilogaritmik dari rata-rata diameter zona hambatan yang terbentuk dengan konsentrasi antibiotika. Respon point (RP) diambil darimasingmasing antibiotikadengan zona hambatanberdiameter antara 1,2-1,5 mm.

5.7

Pengujiancontoh susu

5.7.1 Siapkan kultur media untuk masing-masingkelompokantibiotika.Pengujian contoh susu dilakukan secara triplet. 5.7.2 Letakkan kertas cakram steril di atas permukaan kultur media. Tiap cawan petri kultur media berisi 4 buah kertas cakram. Dengan menggunakan pipet steril, tetesi kertas cakram steril dengan contoh susu. 5.7.3 Inkubasikan pada suhu 37o C selama 16-18 jam. Ukur diameter zona hambatan dengan kaliper atau jangka sorong. 5.7.4

Sesuaikan dengan kurva baku

6

Cara menyatakanhasil

58 dari 82

Sampel susu dinyatakan positif mengandung residu apabila terbentuk zona hambatan di sekitar kertas cakram, minimal 1 mm lebih besar dari diameter kertas cakram.

Metode-2

1

Ruanglingkup

Standar ini menetapkan metoda skrining residu antibiotika dari susu segar, terutama residu antibiotika golongan penisilin dan golongan tetrasiklin. Batas kepekaan antara 0,1 µg/ml sampai 20 µg/ml tergantung jenis antibiotika.

2

Prinsip

Kultur Bacillus stearothermophillus var calidolactis diinokulasi pada media agar. Teteskan contoh susu pada kertas cakram, letakkan pada media agar, kemudian 0 diinkubasikan pada 55 C selama 2 jam 30 menit. Untuk memastikan adanya residu golongan penisilin, maka penisilinase ditambahkan pada contoh susu sebelum diteteskan pada kertas cakram. Tidak terbentuknya zona hambatan menunjukkan indikasi adanya penisilin karena antibiotika tersebut telah diinaktifkan oleh penisilinase.

3

Bahan Media

a) Skim M ilk: Larutkan 100 gr skim milk dalam 1.000 ml air dengan suhu 45-50 0 C, bagikan ke dalam tabung-tabung reaksi 50 ml, tutup dan otoklaf selama 0 20 menit pada suhu 115 C, simpan dalam lemari pendingin hingga saat akan digunakan. b) Nutr ient broth: Larutkan 20 gr tryptone, 10 gr yeast extract, 0,5 gr dextrose dalam air 1.000 ml dengan suhu 45-500 C, masukan ke dalam tabung masing-masing 15 ml, tutup dan otoklaf dengan suhu0121 C selama 15 menit. c)

Stok kultur media : Larutkan masing-masing 5 gr pepton, 2 yeast gr extract

dehydrated, 1 gr beef extract, 5 gr natrium klorid dan 12,18 gr agar dalam 1.000 ml air, ukur agar pH 7,4 kemudian didihkan. Masukkan sejumlah 10 ml kultur media ke dalam tabung,tutup dan otoklaf dengan suhu1210 C selama 15 menit.

59 dari 82

d) Media agar difusi : Larutkan masing-masing 5 grtryptone, 2,5 gr yeast extract dehydrated, 1 gr dextrose dan 12,18 gr agar dalam 1.000 ml air, ukur agar pH 7,0. Otoklaf dengan suhu 1210 C selama 15 menit.

e)

Larutan stok baku pembanding:

1) Larutan baku penisilin : Larutkan 100 mg benzil-penisilindengan 100 ml dapar fosfat pH 6 + 0,1. Simpan dalamlemari pendingin (Tahan2 minggu) 2) Larutan baku penisilin dalam air susu: Encerkan stok baku penisilin dengan air susu sampai kon sentrasi 0.006 µg/ml, setaradengan 0,01 IU/ml.

4

Peralatan

a)

Cawan petri 100 mm x 12 mm

b)

Labu erlenmeyer 125 ml

c)

Glass beads 5 mm

d)

Inkubator 37-65 oC

e)

Labu ukur 125 ml dengan tutup

f)

Gelas piala 100 ml dan 1000 ml

g)

Otoklaf

h)

Kertas cakram 8-10 mm

i)

Wire-loop

j)

Tabung pembiak 5 ml, 10 ml, 20 ml

k)

Tangas air 45-100 oC

l)

Vortex - mixer

5

Prosedur

5.1

Persiapan biakan Bacillus stearothermophillus var calidolactis C 953 60 dari 82

5.1.1

Aktivasiulang biakan (Reactivation culture).

Dengan menggunakanwire loop, tambahkan biakan dalam bentuk freeze dried ke dalam 3 tabungnutrient broth yang masing-masing berisi 10 ml, inkubasikan pada suhu 550 C selama 16 jam.

5.1.2

Stok biakan.

Inokulasikan biakanyang telah diaktivasi ulang tadi ke atas permukaan media, inkubasikanpada suhu 550 C selama 48 jam. Simpan di lemari pendingin (00 -C). 5 5.1.3

Biakan uji.

Inokulasikan stok biakan menggunakan wire loop ke dalam 10 mlnutrient broth , 0 inkubasikan pada suhu 55C selama 6-16 jam .

5.2

Persiapankultur media agar

0 5.2.1 Inokulasikan biakan uji ke dalam 5 bagian media agar pada suhu 55 C. Pindahkan 6 ml media agar ke dalam cawan petri, dinginkan.

5.2.2

Persiapankultur media agar dilakukanpada hari akan dilakukanuji.

5.3

Persiapan cuplikan

5.3.1 Pindahkan 2 ml contoh susu ke dalam tabung10 ml, masukkanke dalam penangas air yang bersuhu 800 C selama 10 menit, kemudian dinginkan sampai0 40 C. 5.3.2 Celupkan kertas cakram ke dalam contoh susu, letakkan di atas permukaan media agar. Inkubasikan pada suhu 550 C selama 2 jam 30 menit, amati zona hambatan yang terbentuk. 5.3.3 Proses yang sama lakukan terhadap kontrol negatif dan kontrol posistif (Air susu standar tidak dipanaskan ).

5.4

Penetapan

Diameter konsentrasizona 0.01hambatan IU/ml. yang terbentuk tidak boleh kurang dari 12 mm untuk

61 dari 82

6

Cara menyatakanhasil

Contoh susu dinyatakan positif mengandu ng residu, bila rata-rata diameter zona hambatan tidak kurang dari 12 mm.

Metoda -3

1

Ruanglingkup

Metode ini digunakan untuk skrining residu kloramphenikol, nitrofurandan sulfonamidadengan batas kepekaan berturut- turut 10,5 dan 100 µg/kg.

2

Prinsip

Cuplikan dihomogenisasidengan etil asetat, supern atan dimurnikan pada kolom silika. Ekstrak ditotolkan pada lempeng kromatografi lapis tipis kinerja tinggi (KLKT), dan setelah dikembangkan maka adanya golongan nitrofuran dapat diketahui dengan pewarna pyridin di bawah UV 366 nm, sedangkan adanya golongan sulfonamida dan khloramfenikol dapat diketahui dengan pewarna stannum klorida dan fluoresamina.

3

Pereaksi

a)

Asam asetat, asam borat.

b)

Asetonitril, dimetilformamid, dioksana, etil asetat, heksana, metanol.

c)

Fenolftalein.

d)

Piridin,fluoresamina.

e)

Kalium klorida,natrium klorida,stannumklorida,natrium sulfatanhidrat.

f) Larutan pereduksikhloramfenikol: Larutkan 0,4 gr stannum klorida dengan 10 ml asam asetat (5%, v/v), tambahkan 1 ml larutan 5% fenolftalein dalam dioksan. Larutan ini tidak stabil sehingga harus dibuat segar setiap kali hendak dipergunakan.

62 dari 82

g) Larutan dapar pH 8,3 : Larutkan 19 gr asam borat dan 19,75 gr kalium klorida dalam 800 ml air. Tepatkan pH dengan larutan natrium hidroksida pekat dan himpitkan hingga volume 1.000 ml. h) Larutan pewarna (pendeteksi):Larutkan 50 mg fluoresaminadalam 500 ml aseton. Larutan akandapat stabil selama 12bulan apabila disimpanpada suhu 180C. i)

Gas nitrogen.

j)

Larutan baku pembanding :

1) Larutan stok baku kloramfenikol (CP) : Larutkan 10 mg khloramfenikol baku dalam 10 ml metanol, simpan dalam lemari pendingin. 2) Larutan baku kerja khloramfenikol: Buat seri pengencerandengan metanol dari larutan stok baku hingga konsentrasi 10 ng/ml. 3) Larutan stok baku nitrofuran (furazolidon, furaltaldon, nitrofurazon atau nitrofurantoin): larutkan 10 mg baku nitrofuran dalam 10 ml dimetilformamida, kemudian himpit hingga volume menjadi 100 ml dengan penambahan metanol. 0 Simpan pada suhu -18 C. 4) Larutan baku kerja nitrofuran : Buat seri pengencerandengan metanol dari larutan stok baku hingga konsentrasi 0,5 ug/ml. Catatan: Golongan nitrofuran sangat sensitif terhadap sinar, sehingga harus dihindari kontak langsung dengan sinar. Oleh karena itu semua larutan baku harus dipersiapkan dalam botol berwarna coklat. Seandainya dipergunakan botol berwarna putih, maka botol itu harus dibungkus dengan alumunium foil. 5) Larutan stok baku sulfonamida (sulfametasin, sulfadimetoksin , sulfamonometoksin, sulfonamida atau sulfadiasin): Larutkan 10 mg baku sulfonamida dalam 100ml metanol.Simpan pada suhu -180 C. 6) Larutan baku kerja sulfonamida : Buat seri pengencerandengan metanol dari larutan sto k baku hingga konsentrasi 1 µg/ml. k) Kontrol positif: Tambahkan masing-masing1 ml larutan baku kerja kedalam 1 gram bahan asal hewan. l)

Cartridge Silika Sep Pak Vac 1 ml.

m)

Larutan pengembang: campuran etil asetat dan heksana (2:1)

63 dari 82

4

Peralatan

a)

Pipet otomatis (Finpipette).

b)

Bejana kromatograf dan alat penyemprot.

c) Lempeng Si-60 kromatograf lapis tipis kinerja tinggi (KLTKT), tanpa fluorescen 10 x 10 cm atau 20 x 10 cm (Merck). d)

Kotak lampu UV.

e)

Catridge Seppak Sil(Waters).

f)

Syringe50 mikroliteruntuk KLT (Hamilton)atau pipa kapiler.

g)

Sentrifusberpendingin.

h).

Tabungsentrifus20 ml.

i)

Oven.

j)

Vortex-mixer.

5

Prosedur

5.1

Persiapan cuplikan

5.1.1

Masukkan1 ml susu kedalam tabung sentrifuse10 ml.

5.1.2

Tambah 0,25 ml etil asetat, campur selama 1 menit diatasvortex / mixer .

Tambah secara perlahan-lahan 1,75 ml etil asetat, sonikasi selama 10 menit. 5.1.3 Sentrifus 3500 rpm selama 10 menit, buang sedimen dan tambahkan15 ml heksana pada fase etil asetat. Sentrifuse 3500 rpm selama 10 menit. pindahkan fase etil asetat ke dalam tabung 5 ml dan buang sedimen. 5.1.4 Alirkan fasa etil asetat-heksana kedalam Catridge Seppak Sil. Cuci cartridge dengan 2 ml campuran etil asetat dan heksana (3:1). Cuci kembali dengan 2 ml campuran 95 bagian asetonitril dan 5 bagian metanol. 5.1.5 Elusicartridge dengan 2 ml campuran aseton dan heksana (2:1).Tampung eluat pada labu pemekat (labu evaporator) 5.1.6

Keringkan eluat dan larutkan residu dengan 50 µl metanol.

5.2

Penetapan

64 dari 82

Totolkan 10 µl ekstraks dengan syringe pada KLT. Teteskan juga setiap larutan baku kerja pada lempeng yang sama. Keringkan pada suhu kamar. Masukkan ke dalam larutan pengembang dalam bejana kromatograf yang telah dipersiapkan sebelumnya. Biarkan larutan pengembang naik hingga sekitar 2 cm dari sisi atas lempeng. Keringkan lempeng pada suhu kamar. 6

Cara menyatakanhasil

6.1

Untuk mengetahuiadanya nitrofuran

Semprot lempeng dengan piridin, amati di bawah lampu UV 366 nm. Adanya nitrofuran akan terlihat sebagai bercak atau noda berwarna kuning dengan latar belakang warna ungu. Pada konsentrasi rendah, noda akan terlihat berwarna biru. Bandingkan dengan noda dari larutan baku kerja. Waktu tambat retention ( time/RF) dari golongan nitrofuran sekitar 0,2. 6.2

Untuk mengetahuiadanya sulfonamidaatau khloramphenikol

6.2.1 Masukkan lempeng tersebut diatas ke dalam oven selama 10 menit untuk menghilangkan piridin, lalu dinginkan. 6.2.2 Setelah itu semprot dengan larutan stannum klorida hingga lempeng berwarna abu-abu. Biarkan 15 menit dalam ruang gelap, kemudian masukkan ke dalam oven 0C, dinginkan. selama 15 menit pada suhu 110 6.2.3 Secara hati-hati semprot dengan larutan natrium hidroksida hingga lempeng berwarna sedikit merah muda. 6.2.4

Semprot dengan larutan dapar borat hingga lempeng sedikit keabu-abuan.

Keringkan dalam oven, dinginkan. 6.2.5 Semprotdengan larutan fluoresamina. 6.2.6 Adanya khloramfenikol atau sulfonamida akan terlihat sebagai no da berwarna kuning dengan latar belakang ungu di bawah UV 366 nm. Bandingklan dengan noda dari larutan baku kerja. Waktu tambat khloramfenikol adalah sekitar 0,4 sedangkan sulfonamida adalah sekitar 0,7.

II

Identifikasidan KuantifikasiResidu Antibiotika

Pendahuluan

65 dari 82

Identifikasi dan kuantifikasi residu antibiotika dilakukan untuk mengetahui adanya residu secara kualitatif maupun kuantitatif. Secara kualitatif dapat mengetahui jenis residu antibiotika dan secara kuantitatif dapat diketahui tingkat kandungan (konsentrasi) residu antibiotika dengan menggunakan standar pembanding.

A

Residu Khloramfenikol

1

Ruanglingkup

Metode ini digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi residu kloramfenikol dalam air susu dengan batas kepekaan 0,01 mg/kg.

2

Prinsip

Cuplikan diekstraksi, dihilangkan kandungan lemak, protein dan airnya. Dimurnikan melalui kolom silika dan dianalisa mempergunakan Kromatograf Kinerja Tinggi (KCKT) dengan UV detektor pada panjang gelombang 270 nm.

3

Pereaksi

a)

Asam asetat 0,2 M: larutkan 11,5 ml asam asetat glasial dalam 1 liter air.

b)

Asetonitril, etil asetat, heksana, kloroform dan metanol.

c)

Larutan dapar asetat pH 4,6: atur pH dengan penambahannatrium asetat.

d)

Natriumsulfat anhidrat.

e).

Eluen untuk kolom silika : campurankhloroformdan metanol(9:1).

f) Larutan stok baku: larutkan 10 mg khloramfenikolbaku pembandingdengan 10 ml air. g) Larutan baku kerja: buat seri pengenceran larutan stok baku sampai konsentrasi1 µg/ml. h)

Fase gerak untuk KCKT: campuran asetonitril dan air (3:7).

66 dari 82

4

Peralatan

a)

Silikakolom:Catridge Seppak Sil (Waters)

b).

Wol kaca

c)

Homogeniser

d) Kromatograf Cair kinerja Tinggi (KCKT) dengan detektor UV-Vis, kolom fase terbalik C-18. e)

Kertas saring Whatman no.4 dan kertas saring 0,45 Fm.

f)

Rotavapordan labu rotavapor 50 ml.

g)

Labu pisah.

h)

Sentrifusdan tabung sentrifus100 ml.

i)

Tangas ultra sonnnik.

5

Prosedur

5.1

Persiapan cuplikan

5.1.1 Timbang 10 gram cuplikan, masukan ke dalam tabung sentrifus 100 ml, tambah 100 ml etil asetat dan homogenisasi. Sentrifus 300 rpmselama 10 menit. 5.1.2

Ambil 50 ml supernatandan keringkan melaluinatriumsulfat anhidrat

5.1.3 Keringkan dan larutkan ekstraks dengan 50 ml larutan asam asetat 0,2 M Pindahkan ke dalam labu pisah 300 ml. Ekstraksi dengan 100 ml-heksana. n Buang lapisan n-heksana. 5.1.4 Ekstraksi fase dengan 2 x 40 ml etil asetat, kocok, biarkan terpisah. Tampung lapisan etilasetat danevaporasi samp ai kering. Larutkan residu dengan 10 ml kloroform.Alirkan ke silik a kolom. Cuci cartridge dengan 10 ml kloroform. Elusi dengan eluendan tampung elu at pada labu rotavapo r. 5.1.5 Keringkan dengan rotavapor di atas penangas air, larutkan ekstraks dalam 0,5 ml fase gerak dan saring. 5.2

Penetapan

67 dari 82

5.2.1 Suntikkan50 µl ke dalam KCKT yang dilengkapi dengan kolom analitikC18, menggunakan fase gerak campuran asetonitril dan air (3:7), laju aliran 1 ml/menit, detektor UV 270 nm. 5.2.2 Amati waktu tambat dan puncak atau area kromatogram cuplikan dan larutan baku.

6

Cara menyatakanhasil

6.1 Secara kualitatif: adan ya puncak dalam kromatogram yang mempunyai waktu tambat (waktu retensi/ retention time ) yang sama dengan baku (standar) antibiotika menunjukkan adanya residu.

6.2

Secara kuantitatif:

6.2.1 Dengan membandingkantinggi puncak atau luas areadi bawah puncak dari larutan ekstrak cuplikan dengan larutan baku standar. 6.2.2

Menggunakankurva kalibrasilarutan baku kerja:

a)

Buat minimal 6 konsentrasilarutan baku kerja.

b) Buat kurva kalibrasi atau persamaan linear dari tinggi puncak atau luas area di bawah puncak terhadap konsentrasi pada kertassemilogaritma. c) Hitung konsentrasi cuplikan dari tinggi puncak cuplikan atau luas area di bawah puncak ke dalam kurva kalibrasi atau persamaan yang diperoleh. Catatan : Tinggi puncak atau luas area di bawah puncak dalam kromatogram dapat diukur secara otomatis dengan mempergunakan integrator/komputer atau secara manual.

B Residu tetrasiklin (TC)

1

Ruanglingkup

68 dari 82

Standar ini menetapkan metoda untuk identifikasi dan kuantifikasi residu tetrasiklin dalam susu dengan batas kepekaan 0,01 - 0,05 mg/kg.

2

Prinsip

Cuplikan diekstraksi, dipisahkan dari lemak, protein dan air. Ekstrak yang diperoleh dianalisa menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan UV detektor pada panjang gelombang 350 nm.

3

Pereaksi

a)

Etylen diamine tetraacetic acid (EDTA).

b)

Asetonitril

c)

Hexana

d)

Etylacetat

e)

Natrium sulfat (Na2SO 4) anhidrat

f)

Natrium dihidrogenfosfat

g) Larutan stok baku: larutkan 20 mg dari masing-masing baku oksitetrasiklin, klortetrasiklin dan doksisiklin dalam 20 ml metanol h) Larutan baku kerja: buat seri pengenceran larutan stok baku hingga konsentrasi 10 µg/ml i) Fase gerak untuk KCKT yaitu campuran metanol, asetonitril dan asam oksalat 0,02 M (1:1:8)

4

Peralatan

a)

Labu erlenmeyer250 ml

b)

Corong pisah 250 ml

c)

Rotavapor dan labu rotavapor 100 ml

69 dari 82

d) Kromatograf Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan kolom U Bondapak, detektor UV e)

Corong

f)

Kertas saring Whatman no. 41

g)

Sentrifuse

5

Prosedur

5.1

Persiapan cuplikan

5.1.1

Masukkan 20ml contoh susu ke dalam erlenmeyer250 ml

5.1.2

Tambahkan 2 gr EDTA, kocok

5.1.3

Saring dengan kertas saring hingga diperoleh10 ml filtrat

5.1.4 Masukkanfiltrat kedalam labu erlenmeyer250 ml, tambahkan15 ml hexana dan kocok. Buanglah lapisan hexana dan ambillah lapisan air. Lakukan penambahan hexana sebanyak 2 kali. 5.1.5 Tambahkan 20 ml etilasetatpada lapisan airlalu kocok. Buang lapisan air dan kumpulkan lapisan etilasetat. Lakukan penambahan etilasetat sebanyak 2 kali. 5.1.6 Tambahkan natrium sulfat anhydrat padalapisan etilasetat,kemudian saring dengan kertas saring. 5.1.7 Uapkan filtrat dengan rotavapor hingga kering, kemudian tambahkan 1 ml fase gerak pada sisa penguapan, lalu kocok. 5.1.8 Sentrifus pada kecepatan tinggi (10.000 rpm). Pisahkan larutan yang jernih dari kotoran. 5.1.9

Larutan siap dianalisa pada KCKT.

5.2

Penetapan

5.2.1 Suntikkan 50 µI larutan ke dalam KCKT dengan mempergunakankolom fase terbalik C-18. Fase gerak campuran metanol, asetonitril dan asam oksalat 0,02 M (1:1:8), kecepatan aliran 1 ml/menit. Dengan UV detektor pada panjang gelombang 350 nm.

70 dari 82

5.2.2 Amati waktu tambat dan puncak atau area kromatogram cuplikandan larutan baku.

6

Cara menyatakanhasil

Lihat cara menyatakan hasil dalam residu khloramfenikol.

C

Residu penisilin(PC)

1

Ruanglingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk identifikasi dan kuantifikasi residu penisilin dalam susu dengan batas kepekaan 0,01 - 0,05 mg/kg.

2

Prinsip

Cuplikan diekstraksi, dipisahkan dari lemak, protein dan air. Ekstrak yang diperoleh dianalisa menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan UV detektor pada panjang gelombang 350 nm.

3

Pereaksi

a)

Asam fosfat (H3PO 4) pekat

b)

Acetonitril

c)

NaCl

d)

Dichlorometana (CH2Cl2)

71 dari 82

e)

Fase gerak untuk KCKT yaitu: KH2PO 4 0.01M : Metanol : CH 3CN (50:20:30)

4

Peralatan

a)

Labu erlenmeyer250 ml

b)

Corong pisah 250 ml

c)

Labu florentine100 ml

d)

Corong

e)

Glasswool

f).

Kertas saring Whatman no. 41

g)

Rotavapor

h). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan kolom U Bondapak, Detektor UV

5

Prosedur

5.1

Masukkan20 ml contoh susu ke dalam labu erlenmeyer250 ml.

5.2

Tambahkan 7 tetes asam fosfat (H3PO 4) pekat, lalu kocok.

5.3

Tambahkan40 ml acetonitrildan kocok selama 30 menit.

5.4

Saring dengan glasswool dan ambil 30 ml filtrat.

5.5

Masukkan filtrat ke dalam labu kocok 250 ml.

5.6 Tambahkan 3 gram NaCl dan ekstrak 2 kali dengan dichlorometan (CH2Cl2) kemudian kocok. 5.7

Kumpulkan fase CH2Cl2 ke dalam labu florentine, kemudian uapkan dengan

rotavapor hingga hampir kering. 5.8 5.9

Tambahkan1 ml fase gerak pada sisa penguapan. Larutan siap diinjeksikanpada KCKT.

72 dari 82

73 dari 82

Uji kebersihan

1

Ruanglingkup

Standar ini menetapkan metode pengujian kebersihan penanganan susu di perusahaan atau di tempat produksinya apakah telah dilakukan dengan cara yang baik dan benar.

2

Prinsip

Kotoran dan benda asing yang terdapat di dalam susu akan tertinggal di kertas saring atau saringan yang akan tampak dengan mata telanjang.

3

Perekasi

Tidak diperlukan.

4

Peralatan

a) Botol susu khusus (tidak memiliki dasar) berkapasitas 500 ml yang dilengkapi dengan alat penjepit penyaring pada bagian leher botol. b)

Labu erlenmeyer.

c)

Corong berdiameter15 cm.

d)

Kapas penyaringkhusus.

5

Prosedur

Catatan: untuk pengujian ini diperlukan minimal 500 ml susu dan jumlah ini harus seragam dalam satu seri pemeriksaaan. 5.1 Atur posisi “botol susu” dengan bagian leher yang dilengkapi kapas penyaring berada di bawah. Letakkan corong pada dasar botol susu.

74 dari 82

5.2 Tuangkan contoh susu ke dalam “botol susu” secara perlahan-lahanmelalui dinding dengan bantuan corong dan hasil penyaringan tersebut ditampung dalam labu erlenmeyer. 5.3 Setelah semua susu melalui saringan, saringan diambil dan dikeringkan di udara atau diinkubasikan kemudian dibandingkan dengan kapas penyaring khusus yang belum dipakai.

6

Hasil uji

Hasil positif ditunjukkan dengan adanya kotoran yang tersangkut dalam saringan, dan dapat berupa bulu sapi, rumput, sisa makanan, tinja dan lain-lain.

75 dari 82

Uji pemalsuan

1

Uji terhadap penambahansusu masak

1.1

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metode pengujian kemungkinan adanya pemalsuan pada susu segar berupa epnambahan susu yang telah mengalam i pemanasan denganuji Storch.

1.2

Prinsip

Di dalam susu segar terdapatenzim peroksidase yang akan terurai/musnah oleh pemanasan di atas 750C. Enzim ini akan membebaskan oksigen dari larutan peroksida yang ditambahkan ke dalam susu. Oksigen akan bersenyawa dengan zat pemulas sehingga warnanya berubah.

1.3

Pereaksi

a)

Larutanparaphenildiamin 2% dalam air

b)

Larutan hidrogen peroksida (H2O 2) 0,2 - 1 %

1.4

Peralatan

Tabung reaksi

1.5

Prosedur

1.5.1 Masukkan 5 ml contoh susu ke dalam tabungreaksi, kemudiantambahkan2 tetes larutanparaphenildiamin 2%. 1.5.2

Tambahkan 1-4 tetes larutan H2O 2 (0,2 - 1 %) dan amati terjadinya

perubahan warna.

76 dari 82

1.6

Hasil uji

Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru.

2

Uji terhadappenambahangula

2.1

Ruang lingkup

Standar ini menetapkan metoda pengujian kemungkinan adanya pemalsuan susu dengan penambahan gula yang bisa berasal dari gula asir, p sakarin, air kelapa atau susu kental manis dengan cara uji Conradi.

2.2

Prinsip

Uji ini digunakan untuk membuktikan adanya sakarosa. Gula akan terhidrolisa oleh HCl pekat menjadi 4-hidroksi metil furfural. Furfural dan turunannya akan bereaksi dengan resorsin membentuk warna merah jambu.

2.3

Pereaksi

a). b)

Resorsin Asam khlorida (HCl) pekat (min. 37%).

2.4

Peralatan

a)

Cawan porselin

b)

Pengaduk kaca

c).

Bunsen dan kawat asbes

d).

Gelas ukur10ml.

77 dari 82

2.5

Prosedur

2.5.1

Masukkan 100 mg resorsin ke dalam cawan porselin.

2.5.2 Tambahkan 25 ml contoh susu, kemudian dengan menggunakan gelas ukur tambahkan 2,5ml HCl pekat. 2.5.3 Panaskan campuran tersebut sampai mendidih di atas bunsen dengan dialasi asbes sambil terus diaduk dengan pengaduk gelas. 2.5.4

Angkat cawan porselindari pemanas dan tunggu selama 5 menit.

2.5.5

Amati terbentuknyawarna merah jambu.

2.6

Hasil uji

Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah jambu.

3

Uji terhadap penambahanpati

3.1

Ruanglingkup

Standar ini menetapkan metoda pengujian kemungkinan adanya pemalsuan susu dengan penambahan pati yang bisa berasal dari penambahan tepung kanji, air pencuci beras dan larutan tepung beras.

Metoda 01: Pemeriksaan secara kimiawi

3.2

Prinsip

Dengan penambahan larutan lugol, adanya pati/amilum di dalam contoh susu akan dibuktikan dengan terbentuknya warna biru.

3.3

Pereaksi

a)

Larutan asam asetat 78 dari 82

b)

Larutan lugol.

3.4

Peralatan

a)

Tabung reaksi

b)

Corong

c)

Kertas saring

d)

Pipet 1 ml, 10 ml

e)

Bunsen.

3.5 a)

Prosedur Masukkan10 ml contoh susu ke dalam tabung reaksi.

b)

Tambahkan 0,5 ml asam asetat.

c)

Panaskantabung kemudiancontoh susu disaring.

d) Teteskan 4 tetes lugol ke filtrat yang diperoleh dan amati terjadinya perubahan warna.

3.6

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru.

4

Uji terhadap penambahanbahan pengawet

4.1

Formaldehida(formalin)

4.1.1

Pereaksi

Larutan asam klorida (HCl) mengandung besi

79 dari 82

Cara membuat: campurkan 100ml HCl (BJ = 1.124 - 1.126 g/ml pada suhu 200C) dengan 0,2 ml larutan FeCl 3 10%.

4.1.2

Peralatan

a)

Tabung reaksi

b)

Penangas air

c)

Pipet.

4.1.3

Prosedur

a)

Masukkan2 ml contoh susu ke dalam tabung reaksi.

b) Tambahkan 10 ml larutan asam klorida mengandung besi, kemudian panaskan. c)

Biarkan mendidihselama 1 menit dan amati perubahanwarna yang terjadi.

4.1.4

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu.

4.2

Hidrogen peroksida

Metoda 01

4.2.1

Pereaksi

Larutan titanil sulfat Cara membuat : larutkan 2 gram titandioksida dalam 100 ml asam sulfat yang diperoleh dari pengenceran asam sulfatpekat dengan aquades (1:3). 80 dari 82

4.2.2

Peralatan

a).

Pipet tetes

b)

Tabung reaksi.

4.2.3

Prosedur

a)

Ke dalam 10 ml susu ditambahkan10 tetes larutan titanilsulfat.

b)

Amati perubahan warna yang terjadi.

4.2.4

Hasil Uji

Hasiluji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning hingga merah jingga.

Metoda 02

4.2.1

Pereaksi

a)

Asam sulfat pekat (d=1.19)

b)

Kertas Jodkalium (KI)

c)

Larutanformalin.

4.2.2

Peralatan

a)

Pipet tetes

b)

Tabung reaksi.

c)

Penangas air.

4.2.3

Prosedur

a) Masukkan contoh susu dan asam sulfat pekat dengan perbandingan yang sama ke dalam tabung reaksi. 81 dari 82

b)

Tambahkan 1 tetes larutan formalin encer, kocok dan hangatkan pada suhu

600C. c) Celupkan kertas Jodkalium dan amati terbentuknya warna yang terjadi pada kertas Jodkalium. 4.2.4

Hasil Uji

Hasil uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru keunguanatau biru pada kertas Jodkalium.

4.3

Sublimat

4.3.1 Pereaksi Amoniak

4.3.2

Peralatan

Labu erlenmeyer

4.3.3

Prosedur

a) Msukkan ml contoh susu ke dalam labu erlenmeyer, kemudian tambahkan 100 ml100 amoniak. b)

Amati perubahan warna yang terjadi.

4,3.4

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dalamhasil positif ataunegatif. Hasil ujipositif ditunjukkan dengan terbentuknya warna abu-abu.

82 dari 82

5

Uji residu desinfektandalam susu

5.1

Uji Quartenarium Amonium Sulfat (QAS)

5.1.1

Ruang lingkup

Standar ini menetapkan metoda pengujian dengan cara biologis adanya residu quartenarium amoniumsulfat (QAS) pad a susu segar dengan metoda Kluyver.

5.1.2

Prinsip

Mikroorganisme Saccharomyces cerevisiae akan memfermentasi glukosa dan membentuk gas. Adanya desinfektan akan menghambat proses fermentasi dan proses pembentukan gas.

5.1.3

Bahan

a)

Glukosa

b)

Biakan Saccharomyces cerevisiae atau ragi roti.

5.1.4

Peralatan

a)

Tabung reaksi

b)

Inkubator

5.1.3

Prosedur

83 dari 82

a)

Tambahkan 2-2,5% glukosa ke dalam contoh susu.

84 dari 82

Uji peroksidase dengan metoda Storch

1

Ruanglingkup

Standar inimenetapkan metodapengujian enzim peroksidase yangterdapat dalam susu segar untuk mengetahui adanya indikasi susu telah mengalami pemanasan atau terjadi penambahan susu yang telah dipanaskan diatas 800C.

2

Prinsip

Enzim peroksidase yang terdapat dalam susu segar/mentah akan terurai dan menjadi tidak aktif apabila susu tersebut dipa naskan pada suhu 70 - 800C. Enzim akan membebaskan oksigen dari larutan 2O2 H yang akan dibubuhkan ke dalam susu. Oksigen akan bereaksi dengan zat pemulas dan menyebabkan perubahan warna.

3

Pereaksi

a)

Larutan H2O 2 0,2 - 1%.

b)

Larutan paraphenildiamide 2%.

4

Peralatan

Tabung reaksi.

5

Prosedur

5.1

Masukkan5 ml contoh susu ke dalam tabung reaksi.

5.2

Tambahkan2 tetes larutan paraphenildiamide2%.

5.3

Tambahkan 1 - 4 tetes larutan H2O 2 0,2 - 1%.

5.4

Amati perubahanwarna yang terjadi.

85 dari 82

6

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru. Sedangkan hasil negatif apabila susu tetap berwarna putih, menunjukkan adanya indikasi susu telah mengalami pemanasan atau dicampur dengan susu yang telah dipanaskan di atas suhu0C. 80

86 dari 82

Daftar isi

Halaman

Pendahuluan Daftar isi

i

Judul

1

Uji penetapan berat jenis

1

Pengukuran kadar lemak dengan metoda Gerber

5

Perhitungankadar bahankeringtanpa lemak (BKTL)

7

Metoda : 01 Dengan menggunakan rumus Fleischmann Metoda : 02 Dengan menggunakanmetoda pengeringan

7 10

Uji proteinmenurutKjeldahl

13

Uji warna, bau, rasa dan kekentalan

16

Uji titrasi keasaman Soxhlet Henkel

19

Uji alkohol

21

Uji katalase

23

Penentuantitik beku

25

Pengukuranangka refraksi metoda Ackermann

27

Uji reduktase

30

Metoda : 01 Uji reduksi biru metilin Methylen ( blue reduction tes)

30

Metoda : 02 Uji resazurin

33

Uji sedimen

35

Pengujiancemaran mikroba

36

i

0 01 - Penentuan angka lempeng C total pada 35

37

02 - Perhitungan Coliform dan Escherichia coli 03 - PerhitunganStaphylococcus aureus dengan metoda hitungancawan 04 - PengujianSalmonellae

41 46 48

Perhitunganjumlah sel radang

51

Metoda langsung

51

Pengujian residu antibiotik

53

I

Skriningresidu antibiotika

53

Metoda - 1

53

Metoda - 2

57

Metoda - 3

60

II Identifikasidan kuantifikasi residu antibiotika

63

A Residu Khloramfeniko l

64

B Residu tetrasiklin(TC)

66

C Residu Peniciline

69

Uji kebersihan

71

Uji pemalsuan

73

1

Uji terhadap penambahansusu masak

73

2

Uji terhadappenambahangula

74

3

Uji terhadap penambahanpati

75

4

Uji terhadap penambahan bahan pengawet

76

5

Uji residu desinfektandalam susu

80

Uji peroksidasedengan metoda Storch

81

ii