3 - Métodos de Transformación y Preparación de ADN Plasmidico

 

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Métodos de transformación y preparación de ADN plasmídico Una de las grandes desventajas del clonado en sitio único es que si corto el plásmido y el fragmento de interés con una sola ER, debo tener en cuenta que el fragmento puede insertarse en el plásmido en la orientación correcta como no. No se puede manejar la direccionalidad. La direccionalidad es muy importante por ejemplo cuando se quiere expresar una proteína recombinante. Estadísticamente las probabilidades de que entre de un lado como de otro son iguales, pero la experimentación sugiere que es más probable que se inserte con la orientación incorrecta. De ser posible, siempre se elige clonar en dos sitios en lugar de uno. A veces eso no es posible porque el segmento a clonar puede tener por ejemplo muchos sitios, entonces cuando uno quiere usar cualquiera de los sitios del polylinker, el inserto se corta en muchos fragmentos; o puede ocurrir el caso contrario, no tener extremos compatibles con las enzimas del polylinker del plásmido elegido.

Se puede insertar un fragmento de ADN de cualquier origen en un plásmido bacteriano utilizando una enzima ligasa.

Transformación Hablamos entonces de aislar un fragmento; aislar y purificar un vector, cortar y ligar. El proceso de transformación implica que el plásmido recombinante que contiene el segmento de interés que queremos introducir y clonar, ingrese a la bacteria. No es simple porque la bacteria se resiste al ingreso de ADN exógeno. Se usan determinadas cepas bacterianas que son posibles de transformar. Objetivo: tener el plásmido + inserto (3000 a   10000pb) con el cromosoma bacteriano (3 órdenes de magnitud más grande). También obtendremos una cantidad de plásmidos que no han adquirido el inserto y se han religado que transformaran bacterias.

 

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Una vez que se transforma obtenemos un clon: una bacteria que puede replicarse en forma infinita para obtener infinitas copias de esa bacteria que incluye adentro un plásmido con el inserto de interés. Para hacer esto debo multiplicar a las bacterias en un cultivo celular en condiciones adecuadas. De la gran cantidad de bacterias que obtengo luego del cultivo obtendré el ADN plasmidico.

Clonado molecular. Pasos 1.

Selección y obtención del plásmido a utilizar (lo tenemos generalmente dentro de la bacteria o

purificado como ADN a partir de un cultivo de bacterias con el plásmido adentro). 2. Obtención del fragmento a clonar (debo cortar el fragmento y el plásmido con enzimas que generen extremos compatibles, una o dos). 3.

Ligación (no es automático por complementariedad).

4.

Transformación de bacterias.

5.

Selección de transformantes.

6.

Mini-preparación de ADN plasmídico.

7.

Análisis de ADN plasmídico.

8.

Conservación de los clones positivos.

Si transformo las bacterias con plásmido + inserto voy a obtener bacterias de E. coli con:

         

DNA genómico E. coli + plásmido con inserto, DNA genómico E. coli sin plásmido recombinante, DNA genómico E. coli + plásmido sin inserto, DNA genómico + vector cortado sin religar, DNA genómico + vector cortado religado en un solo extremo con inserto (segmentos lineales). Transforman bacterias pero no se replican por ser lineales (bacterias solo replican DNA circular).

Una vez que se replica plásmido haciendo crecer la bacteria, se multiplica celularmente para obtener muchas. Se hace siempre en presencia del marcador marc ador de selección porque es la única forma de asegurarse que lo que obtengo es el clon. Si elimino el marcador de selección, el medio se vuelve permisivo para que crezcan otras bacterias.

Métodos de transformación Método clásico Tiene una eficiencia de transformación de 1.10^6 UFC/ug DNA. Generar a partir de un cultivo bacteriano común un cultivo bacteriano competente. Bacterias que normalmente no aceptan el ADN externo se transforman en competentes (aceptan ADN externo). Se hace un maltrato de las bacterias a través de una serie de tratamientos que permeabilizan sus membranas y permiten que el ADN exógeno ingrese a la bacteria. E. coli: cloruro de calcio y frio. Buffer de pH 5,6. Son varios lavados. Principio: el catión calcio divalente y el frio son 2 factores que ayudan a que las membranas de las bacterias se permeabilicen y permitan el ingreso de ADN exógeno. DNA + bacteria se deja una hora. Luego shock térmico a 42˚C que termina de generar molestia grande para que ingrese DNA y después 1 hora a 37˚C para que se recuperen antes de considerar bacterias transformadas que van a terminar en una placa de Petri para seleccionar los clones positivos.

Método de electroporación Requiere de un equipamiento especial (electroporador). Requiero tener bacterias guardadas en stock. Tiene una eficiencia de transformación de 2 o 3 órdenes de magnitud mayor al método clásico.

 

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Maltrato con electroshock. Requiere que uno haga cultivo over-night, lo l o diluya 1/100 en medio fresco hasta obtener bacterias en etapa exponencial de crecimiento (ON: ( ON: muchas bacterias muertas). Le hago muchos lavados en agua estéril y frio al cultivo en base exponencial. Centrifugaciones, lavados,…,

generan bacterias en un medio que no les gusta porque no es nutritivo. Las bacterias en la última centrifugación se resuspenden en agua y se fraccionan en alícuotas de 50uL que se pueden guardar en un freezer a -80˚C.  Teniendo bacterias de esta forma, tomo del freezer la alícuota de bacterias que necesito para realizar la electroporacion. Bacteria competente no es resistente a ATB así que el medio no lo tiene. Luego de realizar el proceso para la transformación, pongo a las bacterias con el DNA que quiero introducir utilizando los controles necesarios. Descongelo alícuota necesaria, pongo en contacto con DNA en cubeta de electroporacion (dos paredes metálicas por donde se aplica corriente eléctrica). Se genera electroshock que permite ingreso DNA exógeno. Eficiencia de transformación: número de colonias que es capaz de generar 1ug de ADN (UFC).

Nos está diciendo cuan competentes fueron las bacterias. Si las bacterias fueron convertidas competentemente la eficiencia de transformación va a ser la esperada para cada método (si hubo un fallo con las bacterias competentes, baja eficiencia de transformación. Caen mis chances de éxitos de transformación de manera concomitante). Se calcula la eficiencia de transformación a partir del control positivo de transformación. Es el único experimento en el cual podemos saber a ciencia cierta cuál es la cantidad de ADN que estamos poniendo para esa transformación y podemos calcular el cociente de UFC y la cantidad de ADN.

Transformación de bacterias Hay

distintos

tubos

de

transformación. Transformadas las bacterias, deben ser plaqueadas en una placa de Petri preparada previamente que ya tiene un medio que es nutritivo y

sólido.

Se

desparraman

las

bacterias y se las deja formar las colonias ON para ser contadas o estudiadas al día siguiente. Luego de transformar hay que plaquear, además de los nutrientes y el medio sólido para las colonias, debo tener el ATB y en el caso que use un gen reportero necesito el sustrato y el inductor. Tanto el ATB como los sustratos son sensibles a las temperaturas, el preparado debe ser con mucho cuidado. Agar se funde a 95 ˚C. No debo volcarlo directamente en la placa, debo esperar que se enfríe a temperatura en la cual no se solidifique y pueda soportar el ATB (48-55˚C). Luego de agitar y mezclar se vuelca en las placas. Dejo crecer placas y en cada una de ellas voy a obtener clones individuales (una placa por transformación más la de los controles).

Selección de transformantes Por un lado está el marcador de selección. Nos dice que la bacteria tiene un plásmido. No nos dice si tiene el inserto. En algunos casos se usan vectores plasmidicos que pueden hacer alfa complementación (tienen un gen reportero). Ejemplo: serie pUC19.

 

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Plásmido contiene gen que codifica subunidad alfa de la enzima beta galactosidada. Para esta transformación se usan bacterias que tengan en su genoma gen de subunidad omega de la beta galactosidasa. Gen reportero se transcribe y traduce. Tengo inductor de la traducción (represor del represor del operon lac). Se usa iptg que emula lactosa pero no es digerido. Al reprimir al represor del operon lac permite que se transcriba y traduzca subunidad alfa de la beta galactosidasa. Que se puede acoplar a subunidad omega que se transcribe y traduce a partir del genoma bacteriano para generar proteína activa con actividad enzimática que es capaz de transformar sustrato Xgal de color transparente en un compuesto de color azul oscuro. Si tengo gen reportero intacto dentro del PUC: azul en presencia de Xgal e iptg. Si se interrumpe marco de lectura por inserción en SMC, no da color co lor azul. Va a dar una subunidad alfa inactiva ya que ti tiene ene su marco de lectura interrumpido. No es viable, no se complementa con subunidad omega y no obtengo la enzima activa. Me diferencia las colonias cuando tengo gen reportero. Diferenciación entre colonias azules y colonias blancas: las azules no recibieron inserto. Mi objetivo son las blancas (siempre que los controles estén bien), en donde se ha interrumpido marco de lectura para dar origen al plásmido recombinante.

 

Algunos vectores tienen además de los tres elementos básicos (marcador de selección, origen de replicación y sitio de múltiple clonado) un gen reportero.

           

El más común es el gen que codifica el fragmento alfa de la beta-galactosidasa. La enzima activa es capaz de convertir el sustrato X-Gal (transparente) en un producto azul. Se usa entonces una cepa bacteriana que tenga esta característica lograda por ingeniería genética. El gen informador se encuentra flanqueando al sitio de múltiple clonado (SMC). Cuando se logra insertar un segmento de ADN en el SMC, se interrumpe el marco de lectura de la subunidad alfa y no se produce una enzima activa. La subunidad alfa sola no es activa, a ctiva, debe complementarse con la subunidad omega que se encuentra en el genoma de la bacteria huésped.

 

Cuando las subunidades alfa y omega se complementan, forman una enzima activa.

Análisis de las colonias luego de la transformación Obtengo las colonias y preparo ADN plasmidico y lo analizo por electroforesis. Gel de agarosa. Cortes con ER para chequear si obtengo los fragmentos deseados. Para hacer una transformación, necesitamos al menos cuatro tubos y luego cuatro placas de petri:

     

Tubo 1: control negativo. Tubo 2: control positivo. Tubo 3: vector religado.

  Tubo 4: vector más inserto. ¿Para qué sirve cada uno de estos? ¿Qué esperamos ver si usamos un vector con gen reportero? Cuando uno hace una transformación, tenga o no un gen reportero, requiere de cuatro tubos y de 4 placas de Petri. Si voy a hacer transformación una vez que tenga bacterias competentes los transfiero a 4 tubos. TUBO 1:

controlnegativo 

Mide que las bacterias son competentes y de ninguna forma fueron contaminadas con otras bacterias resistentes al ATB, o que se hayan encontrado en el proceso con algo que las haya hecho resistente al ATB. Tengo crecimiento de colonias: puedo casi descartar todos los demás controles porque nada de esto tiene sentido si todo proviene de una contaminación. c ontaminación. Contaminación de bacterias huésped x bacteria resistente o pérdida de efectividad del ATB: ATB : observo un pasto de bacterias. Contaminación por alguno de los reactivos con alguna bacteria o plásmido: voy a tener algunas bacterias pero no un pasto. Mismo volumen de agua pero sin ADN que lo que voy a poner en vector religado y vector+inserto.

 

5 TUBO 2:

controlpositivo 

Me dice si las bacterias son o no competentes. Me mide eficiencia de transformación. Pongo una cantidad de plásmido medido y cerrado (que sepa cuánto es), el plásmido antes de ser cortado porque es el único que puedo cuantificar con exactitud gracias a un espectrofotómetro. Caculo cuando ADN debo poner en transformación para tener un número de colonias contables (entre 5001000 colonias). Numero de colonias contables: eficiencia de transformación con método clásico ronda el millón de UFC por microgramo de ADN mientras que en electroporacion sube de 2- 3 órdenes de magnitud. Clásico: 1 millón bacterias en placa de Petri. Diámetro 7cm, me da un pasto. Puedo contar entre 500-1000 colonias. Necesito una milésima parte de microgramos para tener mil colonias col onias con la eficiencia mencionada. Al control positivo lo debo hacer con una cantidad muy diluida de ADN para no pasarme en la cantidad de bacterias. Tampoco puedo tener muy pocas colonias porque si no el número no va a ser estadísticamente representativo por extrapolación. Lo hago con una cantidad muy diluida de la solución de ADN. Debo tener entre 50-500 colonias para considerarlo positivo. Ejemplo: en mi tubo tengo 1ug por mL, tomo un uL para tener un ng. Me daría mil colonias si la eficiencia fuera de 1x10^6. Al control positivo lo calculo c alculo haciendo cuadrantes y contando el número de colonias que tengo por cuadrante y multiplicando por cuatro para poder extrapolar y poder calcular eficiencia de transformación. TUBO 3:

vectorreligado 

Me mide cuan eficiente fue el corte de ER. Si corte con una sola enzima voy a tener mucho Vr porque un brazo del plásmido se va a encontrar más fácil con el otro brazo que con el inserto. Debo ver más o menos cuantas colonias me da la religación del vector. Aunque corte con 2 enzimas el problema es que las enzimas cortan (cuando están bien conservadas) con una eficiencia del 99% Pasa con ambas enzimas. Voy a tener especies cortadas con una sola enzima o con ninguna. Al religarlo voy a tener plásmido cerrado. El que nunca se cortó o el que se religa. Me da un número que me indica la eficiencia de corte. Tengo muchas colonias: dejan de tener relevancia las colonias del tubo 4. Muchas deben ser de vector religado. TUBO 4:

vector+inserto(productodeligación) 

Es donde espero ver colonias. Mi tubo objeto. Si tengo gen reportero: Tubo 1: nada. Tubo 2: colonias azules. Tubo 3: colonias azules. Tubo 4: colonias blancas.

Tips: Mirar en v+i si hay colonias blancas. No tengo gen reportero: Numero de colonias esperables en el tubo 4 es mayor al número de colonias esperables en el tubo 3. Siempre y cuando tubo 1 y 2 den bien. Puede no ser mayor y aun así quizás valga la pena analizar colonias.

 

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Puedo tener control negativo contaminado (pasto azul o blanco me da una idea de donde viene la contaminación). Puedo tener contaminación en control positivo (veo colonias blancas en vez de azules). Resultados solo se pueden interpretar en su conjunto. Si hago más de una transformación y uso el mismo vector puedo usar los mismos controles. Si use el mismo vector pero corte con otra enzima debo hacer otro vector religado aparte del v+i. Si use vector distinto debo hacer nuevamente los controles. Supongamos que hicimos transformación y obtuvimos resultado que nos permite seguir trabajando (cantidad de colonias aceptables):

 

Primer paso: minipreparaciones de ADN plasmidico (ver que ADN tengo y si tiene el tamaño esperado y si larga inserto esperado).

   

Replico las células en un tubo con el marcador de selección ATB. Amplifico células: saco colonia de placa de Petri y la siembro en tubo de ensayo con medio de cultivo rico y el ATB (cada colonia va a tubos diferentes porque cada colonia es un clon)

Mini-preparación de ADN plasmidico. Rotulo los tubos y dejo crecer cultivos ON. Eso me da una suspensión saturada de bacterias que es lo que necesito para preparar DNA plasmidico. A la mañana siguiente en condiciones de esterilidad centrifugo las bacterias y descarto el sobrenadante. Me quedo con el pellet de bacterias. Lo resuspendo en medio isotónico que tiene glucosa 150mM y un buffer adecuado. Y en ese medio de resuspension voy a hacer la lisis alcalina con SDS y NaOH que lleva el pH muy alto, desestabiliza DNA (neutraliza las cargas negativas del fosfato) y precipita porque se desnaturaliza la célula. Luego neutralizo con una solución de Acetato de Potasio y sucede que el ADN plasmidico se renaturaliza rápidamente porque es pequeño mientras que el ADN genómico no logra renaturalizarse y precipita. El principio de la miniprep se basa esencialmente en la diferencia de tamaño del ADN genómico y plasmidico. Purifico ADN plasmidico y lo diferencia del ADN genómico basándome en su tamaño molecula. Luego se precipita y se purifica.

 

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1. Resuspensión Tomo cultivo ON, lo centrifugo. Descarto sobrenadante. Resuspendo pellet en medio isotónico en tubo eppendorf. Obtengo suspensión de bacterias (enteras y vivas). pH cercano a 8. Si quiero guardarlas lo hago con glicerol.

2. Lisis En la etapa de lisis agrego SDS (detergente iónico muy fuerte) que junto con EDTA desestabiliza todas las membranas, se rompen las células y aparece el ADN plasmidico y genómico entre otras cosas. El NaOH que agrego junto al SDS rompe los puentes de hidrogeno que unen a las 2 hebras complementarias de ADN desnaturalizando ADN en sus dos hebras formadoras.

3. Neutralización Estos pasos se hacen muy rápidamente y en frio. Se agrega acetato de potasio en un pH bajo. El acetato neutraliza el pH (antes tenía uno muy alto por agregar NaOH 0,2 N) y el potasio se une al SDS y genera un producto absolutamente insoluble: KDS (forma un moco blanco). Arrastra ADN genómico cuando precipita. El ADN plasmidico logra rehibridarse rápidamente y quedar en solución.

Luego de la neutralización, se siguen los siguientes pasos 1.

Centrifugación

2.

Fenolización

3. 4.

Precipitación alcohólica Lavado con etanol 80%

5.

Secado

 

8

6.

Resuspensión en agua estéril

Luego de la neutralización se centrifuga a altas revoluciones. Se descarta el pellet y uno se queda con el sobrenadante. Ese sobrenadante debe ser tratado con fenol porque no está solo el ADN plasmidico sino que también tenemos proteínas celulares que van a interferir en reacciones futuras. Agrego fenol y genero 2 fases. El fenol precipita proteínas luego de agitación. Centrifugo. Fenol queda en la parte de abajo, en el medio una interfase que contiene las proteínas, y en la parte superior queda una solución acuosa que contiene ADN plasmidico. Con cuidado tomo fase soluble y traspaso a tubo libre (400uL). En ese tubo está muy diluido. Debo concentrar y limpiar. Para concentrar agrego 3 volúmenes de etanol (concentración al 75%). No agrego cationes monovalentes porque anteriormente añadí acetato de potasio y NaOH y ya tengo una alta concentración de cationes monovalentes. Alcohol deshidrata ADN plasmidico y en conjunto con los ccationes ationes monovalentes dejan de ser solubles. Centrifugo a alta velocidad. ADN queda en pellet. Hago lavado con etanol al 70-80% 70 -80% para eliminar las sales que precipitaron también. Manteniendo precipitado ADN. Vuelvo a centrifugar, descarto sobrenadante, y dejo que se seque al aire (que se evapore etanol que pudo haber quedado). Lo resuspendo en agua estéril y paso a análisis por electroforesis.