3.Controlul Microbiologic Al Alimentelor[1]

CUPRINS 1. Microorganisme patogene transmise prin intermediul alimentelor si principalele boli produse de acestea 2. Evidentierea indicatorilor utilizati in controlul microbiologic al alimentelor. 1. Microorganisme patogene transmise prin intermediul alimentelor si principalele boli produse de acestea 1.1. Factori care influenţează creşterea şi dezvoltarea microorganismelor în produsele alimentare Calitatea şi siguranţa alimentelor depinde de menţinerea standardelor pe tot parcursul lanţului alimentar, de la producţia agricolă şi zootehnică, la prelucrare, transport şi consum. Din statisticile realizate la nivel global, reiese că 79% dintre bolile cauzate de alimente contaminate se datorează restaurantelor şi unităţilor de servire, 21% sectorului casnic şi 3% producătorilor de alimente (indicatie). CDC (Center for Disease Control) estimează că în fiecare an se înregistrează în jur de 76 milioane de cazuri, cu un număr de aproximativ 300.000 de spitalizaţi, iar pentru 1,6% evolutia este fatală. In România, la nivelul Ministerul Sănătăţii se desfăşoară programe de monitorizare a toxiinfecţiilor alimentare (TIA), datele fiind raportate în cadrul programului FWD (Food and Water Diseases) de supraveghere a bolilor de origine alimentara si hidrica initiat de ECDC (Centrului European de Prevenire si Control al Bolilor Transmisibile). Cu toate acestea, cazurile de TIA cu un număr redus de îmbolnaviri declarate, în cazul episoadelor familiale, sunt subraportate, la nivel mondial, fapt ce nu reflectă incidenţa reală. Creşterea şi multiplicarea microorganismelor în produsele alimentare este influenţată de o serie de factori care depind de caracteristicile ţesuturilor vegetale şi animale (factori intrinseci: valoarea pH, umiditatea relativă, potenţialul de oxidoreducere, conţinutul în substante nutritive, conţinutul de constituenţi antimicrobieni, structura biologică), dar şi de condiţiile de stocare a alimentelor (factori extrinseci). Majoritatea microorganismelor se dezvoltă optim la pH neutru, cu valoare de 7.0 (6.6-7.5). Puţine specii se dezvoltă la pH sub 4.0. Aciditatea naturală sau inerentă a unor alimente, în special a fructelor, poate proteja ţesuturile vegetale de distrugerea microorganismelor, şi în special, seminţele, acest mecanism fiind foarte important pentru evoluţia filogenetică a diferitelor specii vegetale.

1

Una din cele mai vechi metode de conservare a alimentelor este deshidratarea deoarece microorganismele nu se pot multiplica, iar unele nu supravieţuiesc în absenţa umidităţii. Microorganismele prezintă diferite grade de sensibilitate la potenţialul de oxido-reducere al mediului lor de creştere, cele aerobe necesitând valori ridicate pentru creştere, iar cele anaerobe, valori negative. Acidul ascorbic şi zaharurile reduse din fructe şi legume, grupările SH din proteinele animale contribuie la menţinerea unui potenţial redox redus în alimente. În cursul multiplicării într-un aliment, microorganismele

modifică

atât

valoarea

pH

cât

şi

potenţialul

redox.

Microorganismele aerobe pot reduce potenţialul redox al unui aliment până la -300 mV prin producerea metaboliţilor secundari, (de exemplu, H2S). Microorgansimele prezente în alimente pot utiliza ca sursă de carbon si energie, în procesele de creştere şi multiplicare, glucide simple, alcooli, aminoacizi, amidon, celuloză, grăsimi. Factorii extrinseci care influenţează creşterea şi dezvoltarea microorgansimelor sunt temperatura de depozitare, umiditatea relativă a mediului, prezenţa şi concentraţia gazelor în aerul atmosferic, prezenţa şi activităţile altor microorganisme. Microorganismele se pot dezvolta la o gamă foarte largă de temperaturi, de la -34° C la 100°C. Cele mai multe bacterii termofile prezente în alimente aparţin genurilor Bacillus şi Clostridium. Umiditatea relativă a mediului de conservare este importantă atât pentru menţinerea

calităţii

alimentelor,

cât

şi

pentru

prevenirea

multiplicării

microorganismelor. Alimentele cu valori mici ale umidităţii, atunci când, sunt depozitate în medii cu umiditate relativă înaltă, conţinutul lor în apă creşte până la p valpare de echilibru. În mod similar, alimentele cu un conţinut ridicat de apă, pierd o parte a apei atunci când sunt stocate într-un mediu cu umiditate relativă scăzută. În alegerea mediilor adecvate pentru depozitarea alimentelor trebuie să se ţină cont de relaţia dintre umiditatea relativă şi temperatură, între aceşti factori existând o strânsă corelaţie. Dioxidul de carbon (CO2) este cel mai important gaz folosit pentru controlul dezvoltării microorganismelor în alimente. Ozonul (O3) prezintă, de asemenea, proprietăţi antimicrobiene, fiind testat ca agent de conservare în scopul prelungirii termenului de valabilitate a anumitor produse alimentare, însă datorită caracterului

2

puternic oxidant, nu poate fi utilizat în cazul alimentelor cu un conţinut ridicat de lipide, deoarece le alterează prin oxidare (râncezire). Unele microorganisme contaminante ale alimentelor produc substanţe cu efect inhibitor sau letal (antibiotice, bacteriocine, peroxid de hidrogen şi acizi organici) asupra altor microorganisme. 1.1. Toxiinfecţiile alimentare Maladiile de origine alimentară au fost denumite generic toxiinfecţii alimentare, acestea cuprinzând: •

manifestari propriu-zise de toxiinfecţie alimentară produse de microorgansime şi paraziţi;

•

intoxicaţii de origine microbiană determinate de ingerarea alimentelor contaminate cu toxine preformate rezultat al multiplicării în aliment a tulpinilor bacteriene de C. botulinum, S. aureus, B. cereus sau cu micotoxine produse de fungi;

•

intoxicaţii cauzate de toxine prezente la nivelul ţesuturilor comestibile ale unor vieţuitoare marine.

Toxiinfecţiile alimentare sunt afecţiuni diareice acute, care apar sporadic sau în epidemii, ca urmare consumului de alimente contaminate cu diferite microorgansime a căror multiplicare este favorizată de conservare, în condiţii necorespunzatoare, şi/sau cu toxinele acestora, fiind caracterizate printr-o simptomatologie de gastroenterocolită, cu debut brusc, dramatic, febră şi fenomene toxice generale.

Fig. 1. Căile fecal-orale de transmitere a patogenilor intestinali de origine alimentară (Ivana si colab., 2011).

3

Toxiinfecţiile alimentare prezintă o etiologie variată, cu manifestări similare, afectând, de obicei, un număr mare persoane, apariţia lor fiind strâns legată de alimentaţia colectivă sau publică. În general TIA se manifestă prin sindroame acute intestinale sau neurologice, simptomele debutând în primele 72 de ore după ingerarea alimentului contaminat. Manifestările TIA, în funcţie de agentul microbian etiologic, pot fi: -

stare de rău general şi vomă, ce apar la 1-6 ore după ingerarea alimentului contaminat cu tulpini de S. aureus sau B. cereus, datorată toxinei preformate, iar ulterior diaree (77% din cazuri);

-

crampe abdominale şi diaree cu debut la 8-16 ore, după ingerarea alimentului contaminat cu tulpini de C. perfringens şi B. cereus, manifestări cauzate de enterotoxine;

-

crampe abdominale, diaree şi vomă (35-80% din cazuri) ce apar la 16-18 ore după ingerarea alimentelor contaminate cu tulpini de Salmonella, Shigella, V. parahemolyticus, E. coli invazivă şi C. jejuni ca urmare a invaziei celulare; conţinutul intestinal este infiltrat cu polimorfonucleare (PMN), iar diareea este deseori hemoragică;

-

crampe abdominale şi diaree apoasă ce apar la 16-72 de ore după ingerarea alimentelor contaminate cu tulpini enterotoxigene de E. coli (ETEC), V. parahemolyticus, V. cholerae non-O1, V. cholerae O1 (în zonele endemice); virusuri enterice;

-

febră şi crampe abdominale ce apar la 16-48 de ore după ingerarea alimentului contaminat, produse în general de Y. enterocolitica; din punct de vedere clinic, simptomele sunt asemănatoare cu cele prezente în apendicită; alte simptome: diaree, stare de rău general şi vomă în puţine cazuri.

-

sindrom de diaree hemoragică fără febră, ce apare la 72-120 de ore după ingerarea alimentului contaminat, produs de E.coli O157:H7 (EHEC), deseori cu sfârşit letal.

-

stare de rău general, vomă, diaree, pareze, paralizii, ce apar la 18-36 ore după ingerarea alimentului contaminat, produse de C. botulinum. Morbiditatea asociată TIA este influenţată de o serie de factori, dintre care cei

mai importanţi sunt: specia microbiană, tipul şi virulenţa tulpinii, numărul de microorganisme sau cantitatea de toxină acumulată în produsul alimentar (doza

4

infectantă), cantitatea de aliment contaminat consumată, particularităţile fizice ale alimentului. 1.2. Microorgansime implicate in etiologia TIA Microorgansimele ce determină TIA aparţin cel mai adesea următoarelor ordine: Pseudomonadales, Eubacteriales, Actinomycetales dintre bacterii şi genurilor Saccharomyces,

Zygosaccharomyces,

Torulopsis,

Rhodotorula,

Hansenula,

Mycoderma, Schizosaccharomyces, Debaromyces, Brettanomyces, Candida, dintre levuri. În general levurile şi bacteriile din genurile Lactobacillus produc modificări organoleptice ale preparatelor din carne tocată (cârnaţi, salam), mâzgă, înverzire şi acrire, iar speciile genurilor Streptococcus, Micrococcus şi Mycobacterium determină acidifiere (acrire). Fungii filamentoşi, contaminanţi ai produselor alimentare, pot determina modificarea proprietăţilor organoleptice: miros particular, modificări de culoare şi gust. De asemenea, fungii pot determina modificări ale valorii nutritive prin modificări ale conţinutului aminoacizilor, în cazul alimentelor bogate în proteine, sau în cazul alimentelor bogate în grăsimi, pot determina râncezire (Aspergillus niger, A. fumigatus, Penicillium stekii etc.). Riscul major asupra sănătăţii este reprezentat de consumul de alimente contaminate cu micotoxine, care determină diferite efecte nocive: hepatotoxice, nefrotoxice, teratogene, anemiante, alergene, hiperestrogenice, leucopenizante etc. Bacterii din alimente tabel 181 manescu Dintre produsele alimentare, carnea este cea mai perisabilă, deoarece prin conţinutul bogat în substanţe nutritive, oferă un mediu favorabil pentru dezvoltarea bacteriilor, levurilor şi fungilor filamentoşi. În carnea consevată la frigider s-au evidenţiat numeroase genuri de microorganisme: Pseudomonas, Achromobacter, Proteus, Micrococcus, Flavobacterium, Aeromonas, Streptococcus, Alcaligenes Candida, Torulopsis, Rhodotorula, Thamnidium, ?? Mucor, Rizopus, Cladosporium, Penicillim şi Sporotrichum. Ayers (1960) a demonstrat că mirosul cărnii alterate poate fi detectat atunci când numărul de microorgansime contaminante este cuprins între log. 7,0-7,5/cm2, iar modificarea consistenţei suprafeţei alimentului (mâzga) apare atunci când numărul microorganismelor este de aprox log. 7,5-8/cm2. În cazul alimentelor cu suprafaţă

5

uscată sau a celor tratate cu antibiotice (tetracicline), alterarea se produce ca urmare a dezvoltării cu preponderenţă a fungilor filamentoşi. În procesul de alterare a cărnii, la temperaturi de cca 20°C sunt implicate bacterii mezofile şi bacterii aerobe sporulate. Carnea de pasăre alterată la temperaturi scăzute este contaminată cu bacterii aparţinând

următoarelor

genuri:

Pseudomonas,

Achromobacter,

Alcaligenes,

ocazional lactobacili şi micrococi; aceste microorganisme determină formarea unei pelicule la suprafaţă şi un micros acid neplăcut. Microbiota peştelui proaspăt este reprezentată predominant, de Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Bacillus, Corynebacterium, Clostridium, în microbiota peştelui alterat predomină genurile Pseudomonas şi Achromobacter, Flavobacterium, Micrococcus, s.a. Legumele pot fi alterate de bacterii din genurile Erwinia, Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium, Lactobacillus, Bacillus, fungi filamentoşi din genurile Botrytis, Geotrichum, Rhizopus. Conţinutul ridicat de glucide şi pH acid al fructelor favorizează dezvoltarea, în general, a levurilor (Sacharomyces şi Torulopsis) şi a fungilor filamentoşi (Penicillium,

Aspergillus,

Boytrytis,

Rhizopus,

Alternaria,

Cladosporium,

Trichotecium). În general, ouăle sunt alterate de către bacterii din genurile Pseudomonas, Achromobacter, Proteus, Aeromonas, Escherichia, Alcaligenes, Salmonella,

Micrococcus

şi

fungi

filamentoşi:

Cladosporium,

Penicillium,

Sporotrichum, Thamnidium, Mucor. Laptele şi derivatele din lapte oferă, de asemenea, un mediu nutritiv bogat pentru dezvoltarea microorganismelor. În laptele netratat temic, depozitat la frigider timp de câteva zile, se dezvoltă bacterii din genurile Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Mycobacterium, Micrococcus, Enterobacter, Escherichia, Proteus, Bacillus, Clostridium, Pseudomonas etc. Distrugerea bacteriilor saprobionte din lapte se realizează prin pasteurizare, proces care nu influenţează viabilitatea sporilor bacterieni, fungici şi nici bacteriile termofile. Brânza de vaci oferă un mediu nutritiv pentru dezvoltarea bacteriilor din genurile Alcaligenes, Achromobacter, Pseudomonas, dar şi a fungilor Torulla, Geotrichum. Conţinutul redus de apă al brânzeturilor maturate determină dezvoltarea fungilor filamentoşi Penicillium. Mucor, Cladosporium, Geotrichum, Alternaria, Aspergilus şi a levurilor Torulla, Rhodotorula, Debaromyces. Uneori au fost izolate şi microorganisme anaerobe din genul Clostridium butyricum şi C. sporogenes, fapt ce 6

evidenţiază influenţa potenţialului oxidoreducator scăzut al unor brânzeturi maturate (caşcaval, brânza telemea). Depozitarea alimentelor uscate de tipul cerealelor, făinurilor şi produselor de panificaţie la o umiditate relativ crescută favorizează dezvoltarea fungilor filamentoşi care pot produce micotoxine cu implicaţii severe pentru sănătatea consumatorilor. Există de asemenea riscul ca aceste alimente să vehiculeze microorganisme patogene (Salmonella typhi, S. paratyphi, Vibrio cholerae, Shigella etc). 1.1.1. Toxiinfecţiile alimentare produse de Staphylococcus aureus Bacteriile din genul Staphylococcus sunt coci Gram pozitivi, grupaţi în grămezi, aerobi, se dezvoltă la 37°C. Coloniile sunt rotunde, de dimensiuni mici (1-2 mm), de tip S, pigmentate alb-galben. Stafilococii fermentează glucoza fără producere de gaz, fermentează manitolul, lactoza, zaharoza etc., cu producere de acizi. Sunt catalazopozitivi, caracter care îi diferenţiază de streptococi. Laptele, produsele lactate, diferitele creme pentru prăjituri, salatele, precum şi preparatele din carne, în special carnea tocată, carnaţii, pateul, şunca, jambonul, carcasele de vită sau pui, conservele de carne sau peşte reprezintă medii favorabile pentru dezvoltarea stafilococilor. Pasteurizarea distruge stafilococii, dar nu şi toxina preformata. Bacteriile se pot multiplica în laptele acidulat natural, laptele prins sau iaurt, iar datorită holotoleranţei, se poate găsi şi în telemeaua sărată. Sursele de contaminare pentru alimente sunt reprezentate de bolnavi cu infecţii cutanate, furuncule, panariţii, eczeme, leziuni supurative, infecţii ale căilor respiratorii şi digestive cu stafilococi sau “purtatorii sănătoşi “ de tulpini de S. aureus. Animalele bolnave sau purtătoare de stafilococi pot reprezenta surse de contaminare a alimentelor, dar cu o pondere redusă. 1.1.2.

TIA produse de Salmonella sp

Aceste bacterii sunt bacili Gram negativi, variabili ca lungime, majoritatea mobile datorită flagelilor peritrichi (excepţie face S. gallinarium-pullorum), fermentează glucoza şi uneori produc H2S. Sursele majore de infecţie sunt animalele, iar omul intră în circuitul epidemiologic prin contaminare în timpul prelucrarii, transportului, stocării alimentelor, prin consumul cărnii şi preparatelor din carne (de pasare, porcine, ovine, peşte, crustacei, moluşte), prin consumul ouălor şi al diverselor preparate cu ou, prin 7

consumul zarzavaturilor contaminate. Purtătorul uman de Salmonella typhi şi S. paratyphi A, B şi C reprezintă unica sursă de infecţie prin contact direct sau pe cale hidrică şi alimentară. 1.1.3. TIA produse de E. coli şi Shigella Aceste bacterii sunt bacili Gram negativi, scurţi, nesporulaţi, fermentează glucoza cu sau fără producere de gaz, sunt oxidazo-negativi, reduc nitraţii la nitriţi, sunt mobile prin flageli peritrichi sau imobile. Sunt prezente pe plante, sol, în intestinul uman sau animal, reprezentând componenta majoră a microbiotei umane intestinale. Cresc pe medii uzuale, formează colonii rotunde, convexe, netede. Pentru identificare se folosesc o serie de medii politrope: mediu TSI (Triple Sugar Iron) pe care se evidenţiază fermentarea glucozei/lactozei/zaharozei, producerea de acizi din glucoză cu/fără gaz, producerea de H2S, mediul MIU (Mobility Indole Urease) pe care se evidenţiază mobilitatea, producerea de indol şi urează, mediul MILF (Mobility Indole Lysin-decarboxilase Phenylalanin-desaminase), pe care se evidenţiază mobilitatea, producerea de indol, lizin-decarboxilaza, fenilalanindezaminaza. Specia E. coli este indicatorul sanitar cel mai frecvent folosit pentru aprecierea contaminării fecale a alimentelor. Comitetul American National pentru Criteriile Microbiologice ale Alimentelor consideră că specia E. coli este un indicator igienicosanitar principal pentru verificarea contaminării fecale a carcaselor animalelor de măcelarie şi ale păsărilor din abatoare. Numeroasele tulpini de E.coli producătoare de TIA au fost clasificate în patru grupe principale: •

Tulpini de E. coli enteropatogene (Enteropathogenic E. coli (EPEC) şi EPEClike), care nu produc enterotoxine, cu excepţia unor tulpini ce produc o cantitate mică de toxine Shiga-like, nu sunt invazive, aderă la microvilozităţile intestinale şi le distrug. Serotipurile umane sunt O26:B6, O55:B5, O86:B7, O111:B4, O119:B14, O124:B77, O125:B15, O126:B16, O127:B8, O128:B12.

•

Tulpini de E.coli enterotoxigene (Enterotoxigenic E. coli (ETEC) şi ETEClike, care aderă la nivelul enterocitelor prin intermediul fimbriilor şi produc enterotoxine termostabile şi/sau termolabile. Serotipurile umane sunt O6:H16, O8:H9, O15:H11, O25:H42, O78:H12, O120:H7, O120:H-.

8

•

Tulpini de E. coli enteroinvazive (Enteroinvasive E. coli (EIEC) şi EIEC-like), care poseda plasmide de virulenţă, patrund în celulele epiteliale intestinale unde se si multiplica şi sunt pozitive la testul Sereny (inoculare conjunctivala la cobai). Serotipurile umane sunt O28a.c, O112, O124, O136, O143, O144, O173.

•

Tulpini de E.coli enterohemoragice (Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) şi EHEC-like), care produc cantităţi mari de toxine Shiga-like, distrug microvilozităţile intestinale ca urmare a aderenţei bacteriilor la enterocite, posedă plasmide de virulenţă. Serotipurile umane sunt O157:H7, O26:H11, O103:H2, O172:H?. Tulpinile ETEC-like patogene la animale produc diaree la animale nou-născute

dar nu şi la om datorită specificităţii de gazdă. Infecţiile cu tulpinile de ETEC afectează în special sugarii şi copii de 2-3 ani. Reprezintă agentul etiologic cel mai frecvent al “diareei călătorului” la persoanele din ţările dezvoltate, atunci când călătoresc şi consumă alimente în ţările emergente cu clima tropicală şi subtropicală. În ţările dezvoltate, infecţiile cu ETEC se produc după consumul de apă sau alimente contaminate prin fecalele purtătorilor. Mecanismele de patogenitate ale tulpinilor EPEC constau în capacitatea de aderenţă la microvilozităţile intestinale, urmată de distrugerea acestora. Aceste tulpini reprezintă una dintre principalele cauze ale diareei infantile în ţările emergente, sursele fiind alimentele contaminate, precum şi apa potabilă contaminată cu fecalele bolnavilor sau purtătorilor. Tulpinile de E. coli EIEC au fost izolate din conserve de peşte, brânza Brie şi Camembert (datorită contaminarii apei folosite la spălarea echipamentelor), salata de cartofi (contaminată de un lucrător). Au fost izolate, în principal, serogrupul O124 şi mai rar O164. Tulpinile de EHEC produc un sindrom urologic foarte grav cunoscut în pediatrie sub denumirea de sindrom HUS (sindrom hemolitic şi uremic). Numeroasele analize au condus la concluzia că alimentele care

produc

majoritatea episoadelor de TIA sunt cele de origine animală. Carnea de vită sub formă de diverse preparate, netratate termic sau tratate insuficient, laptele crud, brânza proaspată sau iaurtul preparate din lapte nepasteurizat au contribuit la izbucnirea unor

9

TIA produse de tulpini de E coli O157:H7. Acest serogrup rezistă în sucul de mere refrigerat şi la pH mai mic de 4. Epidemii majore produse de tulpini de E coli O157:H7 au avut loc în SUA, în 1993, după consumul de hamburgeri, în 1994, tot în SUA ca urmare a consumului de salam crud de porc. Cea mai recentă epidemie de TIA cu tulpini de E coli O157:H7 a avut loc, în anul 2011, în Europa. Sursa de contaminare a alimentelor cu tulpini de Shigella, o constituie omul bolnav sau purtătorul cronic. Contaminarea se realizeaza în timpul prelucrării sau manipulării. În TIA produse de tulpini de Shigella au fost incriminate alimente de origine vegetală (salată, ceapă verde), persoane contaminate, dar şi apa contaminată cu reziduuri fecaloid-menajere, folosită la irigarea culturilor sau spălarea legumelor înaintea comercializării. Carnea, produsele din carne, ouăle, laptele pot fi contaminate în timpul manevrelor de procesare sau manipulare. În literatura de specialitate, au fost citate, focare de dizenterie bacilară pe vase de croazieră sau transport aerian. 1.1.4. TIA produse de Bacillus cereus Specia Bacillus cereus prezintă morfologie de bacili Gram pozitivi, de dimensiuni mari, grupaţi în lanţuri lungi, mobili, cu capete drepte, necapsulaţi, sporulaţi (spor ovalar, central, nedeformant). Deşi au fost descrise numeroase episoade de TIA şi incriminate o serie de alimente contaminate cu tulpini de B. cereus, analizele microbiologice au evidenţiat că orezul este cel mai frecvent implicat în producerea acestor TIA cu B. cereus. Alte produse alimentare ce pot fi contaminate cu tulpini B. cereus sunt laptele şi produsele lactate, carnea tocată, mezelurile. Iminenţa TIA creşte ca urmare a multiplicării bacteriilor în alimentele preparate la temperaturi mai mici de 100oC şi menţinerea acestora la temperatura camerei pentru mai mult timp. B. cereus se găseşte în stratul superficial al solului şi pentru că este sporogen, poate uşor contamina apa, plantele (cereale, legume) dar şi animalele. 1.1.5. TIA produse de Clostridium Clostridium botulinum

este un bacil Gram pozitiv, de dimensiuni mari,

sporulat (endosporul este deformant), imobil, anaerob. Se dezvoltă saprobiont pe materia organică vegetală şi animală în descompunere, în sol şi ape. C. botulinum este β-hemolitic. Pe mediul Nagler în jurul coloniei formează un precipitat datorită descompunerii lecitinei, fermentează zaharurile cu producere de gaz, unele tulpini acidifică laptele, altele coagulează laptele (coagulare dulce) generând un aspect de 10

“cheag alveolar”. Reduce nitratul, fermentează glucoza, lactoza, manoza, sucroza etc. şi lichefiază gelatina. Lactoza din lapte este fermentată cu coagulare şi producere de gaz, dar nu digeră cazeina. Se izolează uşor dintr-un amestec de microorganisme, prin incubare la 45oC (temperatura optimă de creştere), având un timp scurt de generaţie (8 min). Clostridium botulinum produce botulismul, care este considerat ca o infecţie alimentară. Etiologia bacteriană şi natura toxică a acestei maladii s-a elucidat în 1895, cu ocazia unui focar de 50 de cazuri în Belgia, datorat consumului de jambon nepreparat termic (botulus, lb. latină = cârnat). Ulterior s-au înregistrat cazuri de botulism provocat de contaminarea rănilor, botulism infantil datorat absorbţiei toxinei produse de organisme toxigene care colonizează tractul intestinal al unor copii cu vârsta sub 1 an, datorită absenţei unei microbiote stabile care în mod normal inhibă germinarea sporilor ingeraţi. O sursă de spori de C. botulinum este mierea. Botulismul este o maladie neurologică severă caracterizată prin paralizie flască, ce afectează omul şi diferite specii de animale. Se recunosc 3 forme de botulism, ca entităţi clinice distincte: - botulismul clasic cauzat de ingestia toxinei preformate în alimente; - botulismul de plagă cauzat de creşterea bacteriei şi toxigeneza în plagă; - botulismul infantil cauzat de absorbţia toxinei produsă de bacteriile toxigene, care colonizează tractul digestiv al copiilor mai mici de un an. Botulismul este o toxiinfecţie sau o intoxicaţie cu repercursiuni neurologice ca urmare a acţiunii neurotoxinei asupra sistemului nervos central. Maladia se manifestă atât la om cât şi la alte mamifere. Păsările sunt rezistente. Pericolul principal îl reprezintă conservele, în special cele preparate în casă, deoarece conservanţii utilizaţi în industria alimentară prezintă şi activitate antimicrobiană. De asemenea, alimentele pot fi contaminate prin apă sau praf ce conţin spori. Botulismul sugarilor apare ca urmare a consumului de miere contaminată. Tulpini aparţinând speciei C. perfringens pot fi izolate din toate alimentele în stare crudă, dar şi din cele preparate şi păstrate la temperaturi de 20-57oC. C. perfringens (denumirea veche – C. welchii), este component al microbiotei intestinale la om şi animale şi a tractului genital la 5% dintre femei. Sporii sunt rari şi nu apar în culturile crescute pe mediile obişnuite. Creşte la temperaturi cuprinse între 20 şi 50 oC, cu un optim la 45oC. Coloniile pe geloză-sânge au contur dublu: o zonă clară internă datorată toxinei θ şi o zonă externă neclară datorată toxinei α (testul CAMP pozitiv) (fig.).

11

Fig. . C. perfringens – aspectul culturii pe mediul ….hemoliză dublă şi testul CAMP pozitiv http://www.graphicshunt.com/health/images/ clostridium_perfringens).

C. perfringens produce 4 toxine letale majore (α, β, ε, ι (iota)), pe baza cărora tulpinile se grupează în cele 5 tipuri toxigene: A, B, C, D, E. Alte 9 toxine minore (antigene solubile) pot avea rol în patogeneză: δ, θ, k, λ, µ, ν, γ, eta şi neuraminidaza. Enterotoxina poate cauza intoxicaţii alimentare. Toxina-β este toxina majoră din punct de vedere cantitativ, cu efecte letale, produsă de tulpinile B şi C de C. perfringens. Produce leziunile caracteristice enteritei necrotice la pacienţii cu un nivel scăzut al dietei proteice şi al activităţii proteazelor digestive, acestea fiind blocate de inhibitori prezenţi în cartof, consumat tradiţional în cantităţi mari împreună cu carnea de porc, cu rol de sursă a agentului infecţios, la sărbătorile din Noua Guinee. Toxina-ε produsă de tulpinile de tip B şi D, este sintetizată ca protoxină (311 aminoacizi) cu toxicitate minimă, convertită la forma activă, de peste 1000 de ori mai toxică după clivarea proteolitică a secvenţei N-terminale, sub acţiunea proteazelor bacteriene sau a tripsinei. Activarea protoxinei corespunde ruperii legăturii peptidice între aminoacizii 14-15 de la capătul N şi eliberarea “peptidului de activare” de 14 aminoacizi. Toxina lezează în primul rând intestinul, producând creşterea permeabilităţii peretelui intestinal, cu creşterea înglobării toxinei, care acţionează sistemic şi exercită efecte letale. După intrarea în circulaţie produce hiperemie renală, edem pulmonar, exces de lichid pericardic. Tulpinile de C. perfringens pot produce enterotoxemia (consecutivă creşterii accentuate a permeabilităţii barierei intestinale, consecinţa fiind tranzitul unei cantităţi crescute de toxine, din lumen, în mediul intern la om şi animale), după ingestia unui număr mare de celule vii sau după ingestia alimentelor contaminate. Se multiplică în intestin, unde enterotoxina atinge repede un nivel suficient de crescut pentru a fi

12

absorbită în sânge. Enterotoxemia este produsă de enterotoxine, β-toxină şi toxina ε. Ultima măreşte permeabilitatea intestinală, ceea ce permite absorbţia rapidă a toxinei din lumen. Are afinitate mare pentru ţesutul nervos şi rinichi, unde produce edem şi necroză. Enterotoxemia asociată cu intoxicaţia alimentară produsă de C. perfringens are un caracter particular, deoarece toxina nu se sintetizează în timpul creşterii vegetative, ci numai în timpul sporulării. Toxina se acumulează în sporangiul celular şi se eliberează numai după liza celulei vegetative şi după eliberarea sporului matur. Toxina pare a fi o proteină structurală a învelişului sporal. În cele mai multe cazuri de intoxicaţii alimentare, se consideră că celulele vii de C. perfringens sunt ingerate odată cu alimentele, ajung în intestin, sporulează şi se lizează eliberând enterotoxina. Argumentul major împotriva toxinei preformate este că, în produsele alimentare, bacteria sporulează puţin sau deloc. Tulpinile de C. perfringens care sintetizează toxina β în cantitate mare sunt asociate cu enterita necrozantă. Toxina produce paralizia locală a mişcărilor intestinale, urmată de inflamaţie, hemoragie, necroză gangrenoasă focală, în special în jejun. Enterotoxina (CPE) este o proteină oligomerică de 35 kDa, cu punctul izoelectric la pH 4,3, produsă de tulpinile de tip A, C şi D. Este un peptid cu 309 amioacizi, cu un grup sulfhidril liber. În anumite condiţii CPE formează un complex de cca 155 kDa, care ar corespunde unui por ce alterează permeabilitatea membranei. Activitatea enterotoxinei creşte de câteva ori după tratamentul cu tripsină. Tripsina clivează toxina, la două situsuri, fiecare cu un rest de lizină, rezultând două peptide de 15 şi respectiv de 10 aminoacizi. Toxina tripsinizată constă dintr-o catenă de 284 de aminoacizi şi cele două peptide asociate, care nu se separă de catena majoră decât în prezenţa SDS. Aminoacizii din regiunea 45–116 sunt esenţiali pentru activitatea toxinei, mediind interacţiunea acesteia cu ocludina, o proteină de 65 kDa situată la nvielul joncţiunilor intercelulare strânse. Receptorii celulari pentru enterotoxina de C. perfringens sunt necunoscuţi. Modul de acţiune al enterotoxinei de C. perfringens este asemănător cu al enterotoxinei holerice şi al enterotoxinei β de Staphylococcus sp.: produce creşterea permeabilităţii capilarelor, vasodilataţie şi creşterea motilităţii intestinale. Enterotoxina se leagă de receptorii de suprafaţă ai celulelor epiteliale intestinale. Legarea este urmată de inserţia întregii molecule în membrană, fără 13

internalizare. Se produce o schimbare bruscă a fluxului ionic, care influenţează metabolismul şi sinteza macromoleculelor, creşte nivelul Ca2+ intracelular, iar transportul apei, Na şi Cl este inversat, de la absorbţie spre secreţie. Se pierde lichidul celular, ionii şi moleculele de până la 3,5 kDa. Toxina are activitate maximă în ileum, moderată în jejun şi este inactivă în duoden. Identificarea se realizează prin inocularea produsului patologic pe mediu chopped meat ??-glucoză cu tioglicolat (pentru anaerobi) şi pe geloză-sânge. Cultura microbiană rezultată se transferă pe mediu cu lapte. Coagularea cu producere intensă de gaz în 24 ore este indicatoare pentru tulpinile aparţinând speciei C. perfringens (fig. ).

Fig. . Aspectul culturii de 48 de ore de C. perfringens pe mediu cu gălbenuş de ou (Nagler). Apariţia precipitatului indică activitatea lecitinazică (http://www.websters-onlinedictionary.org/definitions/Clostridium perfringens).

Identificarea finală constă în evidenţierea toxinei şi neutralizarea ei în prezenţa anticorpilor specifici. 1.1.5. TIA produse de L. monocytogenes Sunt bacili Gram pozitivi (cu forme cocoidale, cocobacilare), aerobi, facultativ anaerobi, cu capetele rotunjite, neramificaţi, care pot fi dispuşi în lanţuri, mobili, nesporulaţi, necapsulaţi. Cresc pe medii de cultură obişnuite şi medii îmbogăţite cu ser, sânge, glucoză, la 20-37°C. Pe geloză-sânge coloniile de tip S au 1-2 mm, sunt translucide, iar culturile au miros caracteristic de lapte acidulat. Listerioza este una dintre cele mai grave infecţii de origine alimentară şi cu frecvenţă relativ mare. În formele neuro-meningeale, literatura de specialitate, citează

14

rate de mortalitate de 50%, în septicemii, de 32%, iar listerioza la femeile gravide determină deseori moartea fătului sau nou născutului. Izvorul de infecţie este mediul înconjurător. Agentul infecţios este transmis de animale şi de produsele alimentare: legume proaspete, produse lactate nepasteurizate, peşte, carne şi produse din carne crudă sau netratate corespunzător, ouăle. Transmiterea de la persoană la persoană este favorizată în comunităţile cu deficienţe de igienă: spitale, centre pentru copii şi bătrâni. 2. Controlul microbiologic al alimentelor S-a considerat că agenţii patogeni care produc toxiinfecţii alimentare, fiind microorganisme cu localizare intestinală, se propagă direct sau indirect prin intermediul alimentelor contaminate în ciclul fecal-oral. Primul indicator de contaminare fecală utilizat a fost E. coli. Încă din 1865, T. Smith, a propus un test de potabilitate a apei, fapt ce a marcat începutul folosirii bacteriilor coliforme drept indicatori ai agenţilor patogeni din apă, practică extinsă şi apoi la alimente. 2.1. Recoltarea probelor în vederea analizelor de control microbiologic 2.1.1. Recoltarea probelor de carne Recoltarea probelor de carne se realizează în funcţie de produsul alimentar: 1. carne în carcase şi semicarcase: se recoltează 2 cuburi de carne şi grăsime, unul de la suprafaţă şi altul din profunzime, cu latura de aproximativ 8-10 cm şi un os lung. 2. organele întregi sau părţi din acestea: minim 200g în pungi sau recipiente sterile. 3. carnea preambalată, carnea de pasăre, specialităţi de pasăre: se recoltează 1% din numărul pachetelor care alcătuiesc lotul, nu mai puţin de cinci pachete. 4. carnea de lucru (din întreprinderile producătoare): se recoltează o probă de 500-1000g din fiecare lot dacă acestea sunt uniforme în privinta caracterelor organoleptice. În caz contrar, lotul se împarte în 3 subloturi: cu caractere organoleptice normale, cu uşoare modificări organoleptice, cu caractere organoleptice evident modificate, iar din fiecare sublot se recoltează o probă de 500-1000g. 5. carnea tocată: se recoltează 200-300 g / ambalaj, aproximativ 1% din numărul acestora (nu mai puţin de două şi nu mai mult de cinci ambalaje).

15

6. preparate din carne: batoanele sau calupurile recoltate se secţionează longitudinal, realizându-se examenul organoleptic, cele două jumătăţi constituind proba şi contraproba; din probă se recoltează (de la mijloc şi de la extremităţi) 300-800g şi se trimit la laborator. 2.1.2. Recoltarea probelor de conserve şi semiconserve se realizează în funcţie de mărimea lotului: • conserve Mărimea lotului până la 1000 1.001-5000 5001-10000 10.001-50000 50.001-150000 •

Număr de recipiente analizate 2 5 10 20 30

semiconserve Mărimea lotului până la 1000 1.001-2000 1001-3000 3001-5000

Număr de recipiente analizate 2 4 6 8

2.1.3. Recoltarea probelor de lapte şi produse din lapte •

Recoltarea din fermă se va efectua în recipiente sterile, din fiecare sfert in parte eliminand primele jeturi. Pentru depistarea mamitelor streptococice recoltarea se va realiza de la începutul mulsului, pentru tuberculoză, de la sfârşitul mulsorii, pentru bruceloză de la mijlocul mulsorii.

•

Lapte ambalat: în cazul recipientelor de peste 1 litru se recoltează aseptic 250500ml lapte.

•

Recoltarea probelor din lapte praf se face cu o sondă sterilă, îndepărtându-se stratul superficial (ancime de 5-10 cm), iar în cazul ambalajelor mici se recolteză 1% din lot, iar a celor mari, 10% din lot, realizându-se o proba medie de 250g.

16

•

Recoltarea probelor de lapte concentrat se face din 5% din numărul ambalajelor care formeaza lotul; lotul este format din maxim 2000 litri lapte concentrat pentru ambalajele mari (bidoane, butoaie) şi maxim 3000 litri pentru cutii. Recipientele se sterilizează prin flambare şi se deschid cu un perforator steril, se recoltează 25 g din care se cântăresc aseptic 10 g, iar prima diluţie se realizează cu citrat de sodiu 1,25%.

•

Recoltarea probelor de smântână: lotul este format din maxim 500 kg (în cazul ambalajelor de desfacere) şi maxim 3000 kg la ambalajele de transport; în cazul smântânii ambalate în bidoane se deschid 5% din numărul acestora şi se recoltează 250g; în cazul ambalajelor de transport se recoltează 1% din unităţile de ambalaj.

•

Recoltarea produselor lactate acide: din ambalajele mici se recoltează 1%, iar din cele mari 10% (cca 500 ml) în recipienţi sterili adecvaţi.

•

Recoltarea probelor de unt: cu ajutorul unei sonde speciale se recoltează de la suprafaţă şi din profunzime, câte 200 g din care se face o probă medie.

•

Recoltarea probelor de îngheţată se realizează pe loturi, lotul reprezentând o şarjă de producţie din acest sortiment.

•

Recoltarea probelor de brânzeturi se face cu ajutorul unui cuţit, cu sonde sau se pot recolta calupuri întregi: pentru brânza telemea ambalată în butoaie se recoltează un calup de la suprafaţă şi un calup din profunzime, precum şi 200300 ml saramură; brânza proaspătă de vaci se recoltează prin deschiderea a 10% din ambalajele care formează lotul; dacă ambalajele sunt mari (bidoane, tăvi) se prelevează probe de la suprafaţă şi din profunzime şi se formează o probă medie din care se recoltează 200-300 g care se trimit la laborator; dacă ambalajele sunt mici (pachete de 300 g) se recoltează 2% din numărul unităţilor de ambalaj.

2.1.4. Recoltarea probelor de peste Se recoltează de la mijlocul şi din partea inferioară a ambalajului, în cazul în care acesta conţine cel puţin câte doi peşti sau două bucăţi de peşte. Dacă ambalajele conţin peste 1kg peşte, se recoltează o fâşie transversală de carne (200-500 g), care se ambalează în hartie cerată, se etichetează şi se sigilează păstrându-se în loc uscat,

17

întunecos şi rece (maxim 8°C). Probele se supun analizei, în cel mult 12 ore de la recoltare. Peştele afumat (lot maxim 500 kg) se prelucrează în acelaşi mod.

2.2. Condiţiile de realizare a analizelor de control microbiologic Un laborator de control microbiologic al alimentelor trebuie să fie dotat corespunzător cu echipamente (hote cu flux de aer laminar, balanţe, frigidere (conservare esantioane), incubator, autoclav, etuvă, omogenizator (pentru prepararea suspensiilor din produse solide), pH-metru, baie de apă sticlarie, reactivi pentru medii de cultură, precum si consumabile corespunzatoare. Dezinfecţia suprafeţelor din laborator se face înainte de începerea analizelor şi la finalizarea acestora, iar eficienţa dezinfecţiei se va verifica periodic prin recoltări cu tampoane sterile, de pe suprafeţele de lucru şi de pe pereţi. Încărcatura microbiană a aerului va fi verificată, folosind metoda de contaminării mediilor de cultura neselective, repartizate în plăci Petri deschise. Proprietăţile eşantionului influenţează în mod direct rezultatul analizei. Prin urmare, eşantioanele trebuie să fie reprezentative pentru produs, să nu fi suferit deteriorări sau modificări în timpul transportului sau depozitării. Transportul eşantionelor la laborator trebuie să se realizeze în condiţii corespunzătoare şi într-un timp cât mai scurt. Depozitarea eşantioanelor se va face la temperaturi corespunzatoare (conservele la temperatura ambiantă, produsele proaspete sau refrigerate între 0 şi +4°C, produsele congelate sau puternic congelate la -18°C, produsele pasteurizate şi produse similare, între 0 şi +4°C. Pentru evitarea contaminării eşantioanele vor fi prelucrate în condiţii de asepsie în hote cu flux laminar sau în vecinatatea flăcării becului de gaz, folosind instrumente sterile.

2.3. Pregătirea probelor in vederea examenului microbiologic al produselor alimentare Eşantioanele trebuie depozitate corespunzător, protejate de lumina solară directă sau de alte surse de încălzire, iar analiza acestora trebuie să înceapă cât mai curând posibil după recepţia acestora. În cazul produselor congelate, decongelarea se realizează la frigider, dar nu mai mult de 24 ore.

18

Pregătirea eşantionelor în vederea examenului microbiologic se va efectua în hota cu flux laminar, cu respectarea condiţiilor de asepsie (suprafaţa de lucru se curăţă cu un dezinfectant adecvat atât înainte, cât şi după analiză). Dacă eşantionul de analizat are o consistenţă solidă se cântăresc 10 grame din eşantion şi se omogenizează în mojare sterile. Dacă materialul de analizat, datorită consistenţei, nu se poate omogeniza, se secţionează în fragmente mici în condiţii aseptice folosind foarfeci, pense. Se realizează o trirurare cât mai fină a produsului cu ajutorul pistilului şi apoi se adaugă 90 ml (40 ml) diluant. În acest mod se face omogenizarea diluarea probei în raport de 1/10 (1/5). Se realizeazî diluţii seriale zecimale: 10-2, 10-3 s.a.m.d., iar 1 ml (0.5 ml) fiecare diluţie se însamânţează în 9 ml (4.5 ml) mediu de cultură. În cazul eşantioanelor lichide (lapte, lapte concentrat, apă) se realizează diluţii ca mai sus şi se însămânţează în medii de cultură corespunzătoare. Eşantioanele sub forma de pulbere fină (lapte praf, produse deshidratate din ouă) se amestecă cu diluantul sub agitare, în recipiente cu perle de sticlă. Prima dilutie a produselor greu miscibile cu apa sau cu solutiile apoase (smantana, unt, margarina) cu puncte de topire relativ joase, se face prin topirea produsului cantarit si introdus in baloane cu cantitatea de diluant masurata, pe baie de apa cu temperatura de 40º - 45ºC, cu agitare, dilutiile urmatoare, realizandu-se de asemenea cu diluanti pre-încălziţi la 40º - 45ºC. Pentru diluarea probelor de alimente se folosesc serul fiziologic peptonat si serul fiziologic. Pentru probele de lapte (crud, concentrat, praf) si de produse lactate, prima dilutie se va face cu solutii de citrat de sodiu 2%. Analizele microbiologice se fac conform procedurilor specifice pentru fiecare analiza. 2.1. Determinarea numarului total de bacterii Acest parametru se refera la cuantificarea numărului de microorganisme care se dezvolta in aerobioza, la 30oC, dupa incubare de 72 h ± 3 h. Principiul metodei: Se stabileste gradul de contaminare microbiana al probei de analizat prin incorporarea unei cantitati de proba in mediul solid si incubare la 30 oC±0,1oC in 19

aerobioza. Se numara coloniile crescute si se raporteaza la mililitru sau gram de produs in functie de produsul analizat (lichid sau solid). Medii de cultura si diluanti: - ser fiziologic - ser fiziologic peptonat - agar cu triptona- extract de levuri- glucoza (P.C.A.) Diluarea probei Se realizeaza schema de dilutii corespunzatoare produsului analizat Insamantarea: produsele lichide si fiecare dilutie obtinuta se lucreaza in doua replici, folosind doua placi Petri. In fiecare placa se repartizează aseptic cate 1 ml proba nediluata sau 1 ml din dilutiile decimale. In fiecare placa se toarna aproximativ 15 ml mediu nutritiv, topit si racit la 45±0,5oC, apoi se omogenizeaza continutul placii Petri prin miscari de rotatie si se lasa in repaus pana la solidificarea mediului. Incubarea: la 30±1o C, 72±3h. Interpretarea si exprimarea rezultatelor Numararea coloniilor se face cu lupa sau cu ochiul liber, luand in considerare numai placile Petri care contin 15 – 300 colonii, iar cuantificarea rezultatelor se realizeaza cu ajutorul formulei de mai jos: Σc N= (n1+0,1n2) d N = numarul de microorganisme / gram sau pe mililitru Σc = suma coloniilor numarate in toate placile retinute n1 = numarul de placi retinute din prima dilutie n2 = numarul de placi retinute din a doua dilutie d = factorul de dilutie corespunzator primei dilutii Rezultatul este exprimat sub forma unui numar cuprins intre 1,0 si 9,9 înmulţit cu 10x pe mililitru sau gram de produs.

2.2. Determinare a numarului de levuri Principiu. Stabilirea gradului de contaminare cu levuri a unei probe de analizat prin insamantarea unei cantitati de produs in mediul gelozat. Se incubeaza mediul

20

insamantat in aerobioza timp de 3 zile, dupa care se numara coloniile vizibile de levuri tipice dupa morfologia macroscopica si se raporteaza la un gram (1 cm2) proba. Medii de cultura si reactivi - solutie salina fiziologica peptonata - mediu Czapek-Dox cu clorhidrat de tetraciclina - mediu cu extract de levură-dextroză- cloramfenicol-agar Diuarea probei Determinarea se face pe proba ca atare si/sau din diluţii zecimale ale acesteia. Obţinerea dilutiilor A se vedea schema de dilutii specifice pentru fiecare produs în parte. Insamantarea Din proba omogenizata si/sau din fiecare dilutie pentru analiza, se preiau cu pipeta câte 1cm3 si se distribuie în câte doua placi Petri. În fiecare placa Petri se introduc cate 13+2 cm3 din mediul solid, topit si racit la 45+1oC. Continutul placilor Petri se omogenizeaza apoi se lasa în repaus pâna la solidificare. Incubarea Dupa solidificare placile Petri cu mediul însamântat se introduc la termostat cu capacul în jos la 25+1 oC timp de 5 zile. Confirmarea prezentei levurilor Dupa trei, patru si cinci zile de incubare se numara coloniile dezvoltate in fiecare placa Petri. Dupa cinci zile sunt retinute acele placi care contin sub 150 colonii. Daca este necesar, se face o examinare stereomicroscopică, pentru a diferentia, dupa morfologia lor, coloniile de levuri de cele de bacterii sau de fungi filamentoşi. Calculul si exprimarea rezultatelor Numararea coloniilor de levuri dezvoltate pe întreaga suprafata a mediului însamântat se face cu ochiul liber, luându-se în considerare numai placile Petri în care s-au dezvoltat între 15 si 150 colonii. Numarul de levuri pe gram sau mililitru se calculeaza cu ajutorul formulei de mai jos: ΣC ———————— ( n1 +0,1 n2) d in care : ΣC = suma coloniilor numarate in toate placile; n1 = numarul de placi retinute la prima dilutie; n2 = numarul de placi retinute la a doua dilutie; d = dilutia cea mai mica.

21

Se rotunjeste rezultatul obtinut la doua cifre semnificative. Rezultaul se exprima ca un numar cuprins intre 1,0 si 9,9 înmulţit cu 10x. Daca nu exista nici o colonie in placile corespunzatoare suspensiei initiale, in cazul produselor solide, numarul de levuri pe gram de produs trebuie raportat ca fiind mai mic de 10. Daca in placile cu proba nu exista nici o colonie, in cazul produselor lichide, numarul de levuri pe mililitru produs se raporteaza ca fiind mai mic de 1. 2.3. Determinare a numarului de fungi filamentoşi Principiu. Stabilirea gradului de contaminare cu fungi filamentoşi a unei probe de analizat prin insamantarea unei anumite cantitati din produs intr-un mediu de cultura adecvat. Se incubeaza mediul insamantat in aerobioza timp de 5 zile, dupa care se numara coloniile tipice de fungi filamentoşi dupa morfologia macroscopica si se raporteaza la un gram (1 cm2) proba. Medii de cultura si reactivi - solutie salina fiziologica peptonata - mediu Czapek-Dox cu tetraciclina clorhidrica - mediu cu extract de levuri-dextroza-cloramfenicol-agar Diluarea probei Determinarea se face pe proba ca atare si/sau din dilutii zecimale ale acesteia. Insamantarea Din proba analizata omogenizata si/sau din fiecare dilutie se preiau cu pipeta câte 1cm3 si se distribuie în câte doua placi Petri. În fiecare placa Petri se introduc cate 13+2 cm3 din mediul solid, lichefiat si racit la 45+1oC. Continutul placilor Petri se omogenizeaza apoi se lasa în repaus pâna la solidificare. Dupa solidificare, placile Petri cu mediul însamântat se introduc în termostat cu capacul în jos la 25+1oC timp de 5 zile. Confirmarea prezentei fungilor filamentoşi Dupa trei, patru si cinci zile de incubare se numara coloniile din fiecare placa Petri. Dupa cinci zile sunt retinute acele placi care contin sub 150 colonii. Daca este necesar, se executa o examinare microscopica, pentru a diferenţia, dupa morfologia lor, coloniile de levuri de cele baccteriene sau de fungi filamentoşi.

22

Calcularea si exprimarea rezultatelor Numararea coloniilor de fungi filamentoşi dezvoltate pe întreaga suprafata a mediului însamântat se face cu ochiul liber, luându-se în considerare numai placile Petri în care s-au dezvoltat între 15 si 150 colonii. Numarul de levuri pe gram sau mililitru se calculeaza după formula de mai jos: ΣC ———————— ( n1 +0,1 n2) d in care: ΣC = suma coloniilor numarate in toate placile; n1 = numarul de placi retinute la prima dilutie; n2 = numarul de placi retinute la a doua dilutie; d = dilutia cea mai mica. Se rotunjeste rezultatul obtinut la doua cifre semnificative. Rezultaul se exprima ca un numar cuprins intre 1,0 si 9,9 inmultit cu 10x. Daca nu exista nici o colonie in placile corespunzatoare suspensiei initiale, in cazul produselor solide, numarul de levuri pe gram de produs trebuie raportat ca fiind mai mic de 10. Daca in placile cu proba nu exista nici o colonie, in cazul produselor lichide, numarul de levuri pe mililitru produs se raporteaza ca fiind mai mic de 1. 2.4. Determinarea numarului de bacteriilor coliforme Principiu. Se toarna in doua placi Petri mediul de cultura selectiv solid, impreuna cu o cantitate specifica din proba de analizat daca produsul initial este lichid, sau cu o cantitate specifica dintr-o suspensie initiala in cazul altor produse. Alte doua replici de placi Petri cu mediu de cultura selectiv solid sunt preparate in aceleasi conditii, folosind dilutii zecimale din proba de analizat sau din suspensia initiala. Placile Petri sunt incubate la 30°C sau la 37°C timp de 24 h. Coloniile caracteristice sunt numarate iar daca este necesar, numarul de colonii este confirmat prin testul fermentarii lactozei. Numarul de colonii pe mililitru sau pe gram din proba este calculat dupa numararea coloniilor caracteristice dezvoltate in placile Petri folosite (conform ISO 7218 ). Medii de cultura si reactivi - diluanti (ser fiziologic peptonat, apa peptonata tamponata, citrat de sodiu 2%); 23

- agar-cristal violet-rosu neutru-bila-lactoza (VRBL); - bulion-verde briliant-bila-lactoza (BBLV); Modul de lucru Recoltarea probelor si efectuarea dilutiilor se face conform SR EN ISO 6887-4 /AC2005 Inocularea si incubarea Se pregatesc doua placi Petri pentru proba lichida si/sau pentru fiecare dilutie aleasa. Se transfera cu o pipeta sterila 1 ml din produsul lichid sau dilutia adecvata in centrul fiecarei placi. Se foloseste o alta pipeta sterila pentru a inocula fiecare dilutie in placile Petri. Se distribuie aproximativ 15 ml de VRBL incalzit la 44-47° C, in fiecare placa Petri. Perioada de timp intre prepararea dilutiilor si momentul in care mediul este turnat in placile Petri nu trebuie sa depaseasca 15 minute. Inoculul se omogenizeaza cu atentie in mediul turnat si se lasa sa se solidifice, avand grija ca placile Petri sa fie plasate pe o suprafata orizontala rece. De asemenea, se pregateste o placa martor cu 15 ml mediu pentru verificarea sterilitatii mediului. Dupa completa solidificare, se toarna aproximativ 4 ml mediu VRBL, incalzit la 44- 47° C, pe suprafata mediului inoculat. Se lasa sa se solidifice conform descrierii de mai sus. Se intorc placile astfel preparate si se introduc în termostat la o temperatura de 37° C timp de 24 ± 2 h. Nota. In cazul laptelui si al produselor lactate, temperatura de incubare este de 30° C. Numararea coloniilor Dupa perioada specifica de incubare, se selecteaza, daca este posibil, placile Petri care contin intre 10 si 150 de colonii. Se numara coloniile rosii purpurii cu un diametru mai mic de 0.5 mm (uneori acestea sunt inconjurate de o zona rosie de precipitare a bilei). Acestea sunt considerate ca fiind colonii tipice de coliformi si nu necesita o alta confirmare. De asemenea, se numara si se confirma coloniile atipice (de dimensiuni foarte mici ) si toate coloniile provenite de la produsele lactate ce contin glucide, altele decat lactoza, imediat dupa perioada de incubare a placilor Petri. 24

Metabolizarea glucidelor, altele decat lactoza, se evidentiaza prin aparitia coloniilor cu un aspect similar coliformilor tipici. Nota. Aparitia unei zone rosii de precipitat a bilei in jurul coloniilor depinde de tipul coliformilor si de calitatea mediului. Confirmarea coloniilor dezvoltate Se selecteaza, daca este posibil, 5 colonii din fiecare tip de colonie atipica si se insamanteaza in tuburi cu BBLV (bulion-verde briliant- bila- lactoza). Se incubeaza eprubetele la 37oC timp de 24±2h. Se sconsidera pozitive eprubetele in care se acumuleaza gaz in tuburile Durham. Se retin rezultatele pentru introducerea lor in formula de calcul. Exprimarea rezultatelor Cazul general. Calculul numarului de bacterii coliforme identificate pentru fiecare placa selectata: -se calculeaza, pentru fiecare placa, numarul de bacterii coliforme, conform formulei: bnc a = Cc + --------- x cnc Anc In care: Cc- numarul total de colonii tipice identificate pe placa; Anc – numarul de colonii atipice supuse testului; bnc- numarul de colonii atipice confirmate; cnc- numarul total de colonii atipice identificate pe placa; -se rotunjeste rezultatul la un numar intreg (conform ISO 7218). Calculul numarului N de bacterii coliforme prezente in proba Pentru placile care contin maxim 150 colonii tipice si/sau atipice la doua dilutii consecutive, se calculeaza numarul de bacterii coliforme pentru fiecare placa si se calculeaza, ca o medie ponderata din doua dilutii succesive, numarul N de bacterii coliforme identificate, prezente in proba, folosind urmatoarea formula: Σa N = ------------------------

25

V (n1 + 0.1 n2) d In care: Σ a – suma coloniilor de bacterii coliforme identificate pe toate placile selectate; V- volumul de inocul aplicat pe fiecare placa, in ml; n1- numarul de placi selectate la prima dilutie; n2 – numarul de placi selectate la a doua dilutie; d –factorul de dilutie care corespunde la prima dilutie selectata (suspensia initiala este o dilutie). Rezultatul calculat se rotunjeste la doua cifre semnificative (conform ISO 7218). Rezultatele se raporteaza ca numar de bacterii coliforme / mililitru (produse lichide) sau /gram (alte produse), exprimat ca un numar cuprins intre 1.0 si 9.9 inmultit cu 10x. 2.5. Determinare a numarului de colonii Escherichia coli glucuronidază-pozitive Principiu. Proba diluata se inoculeaza pe placi cu mediu TBX incubat la 44 +/- 1oC, timp de 18-24 h, dupa care se examineaza pentru prezenta coloniilor specifice caracteristice E. coli glucuronidază- pozitive, care se numara si se raporteaza pe gram sau ml de produs. Medii de cultura si reactivi - solutie salina fiziologica pepetonata pentru diluţii; - mediu TBX ( mediu cu triptona bila glucuronidă). Pregatirea esantionului pentru analiză Pregatirea esantionului pentru analiza se face conform standardului specific al produsului examinat. Daca nu exista standarde internationale specifice, se recomanda ca partile interesate sa se puna de acord asupra acestui punct. Diluarea. Dilutia initiala si dilutiile succesive ale probei de analizat se realizeaza conform ISO 6887 si standardului international specific al produsului respectiv. Inocularea Folosind pipete sterile se distribuie in placa Petri 1 ml din proba de analizat daca este lichida sau 1 ml din dilutia initiala ( 10-1) din proba de analizat daca este solida. Se inoculează doua placi pentru fiecare dilutie. Se repeta procedura pentru urmatoarele dilutii daca este necesar, folosind pipete sterile pentru fiecare dilutie. In fiecare placa Petri se distribuie cate 15 ml mediu TBX, racit anterior la 44 -47° C pe baie de apa. Se omogenizeaza cu grija inoculul cu mediul de cultura, dupa care placile se lasa la solidificat pe o suprafata perfect orizontala.

26

Timpul scurs intre adaugarea mediului peste inocul nu trebuie sa depaseasca 15 minute. Incubarea: Dupa solidificarea mediului, placile Petri inoculate se incubeaza la 44° C, timp de 1824 ore. Daca se suspecteaza prezenta celulelor stresate ??, placile se incubeaza initial 4 ore la 37°C si apoi se mareste temperatura de incubare la 44° C, timp 18-27 h. Temperatura de incubare nu trebuie sa depaseasca 45° C. Numararea unitatilor formatoare de colonii (UFC) Dupa incubare se iau in considerare pentru citire placile ce contin mai mult de 15 colonii si cel putin 150 colonii tipice sau/ si 300 de colonii totale (tipice sau atipice) de E. coli glucuronidază-pozitive. Formula de calcul a numarului de UFC de E. coli prezente in proba Σa N = V (n1+0,1n2)d N = numarul de UFCde E. coli glucuronidaza pozitive pe gram sau pe ml; Σa = suma UFC numarate pe toate placile retinute din dilutii succesive, din care cel putin o placa contine 15 colonii; n1 = numarul de placi retinute din prima dilutie; V = volumul de inocul in ml folosit la fiecare placa; n2 = numarul de placi retinute din a doua dilutie; d = factorul de dilutie corespunzator primei dilutii. Se raporteaza numarul intreg de elemente semnificative (colonii caracteristice daca sunt sub 100) sau ca numar intre 1.0 si 9.9 inmultit cu 10x. Estimarea incarcaturii minime a probei Daca cele doua placi Petri ale dilutiei contin mai putin de 15 UFC, numarul de UFC de E. coli β glucuronidaza pozitiva se calculeaza dupa formula: Σc NE = Vnd Σc= suma coloniilor albastre dezvoltate in cele 2 placi Petri ale dilutiei; V = volumul de inocul in ml pentru fiecare placa; n = numarul placilor retinute per dilutie; d = factorul de dilutie care corespunde la prima dilutie; Se rotunjesc rezultatele.

27

Exprimarea rezultatelor Estimarea numarului de UFC de E. coli β glucuronidază-pozitive / ml sau pe gram. NE = Y Daca placile Petri nu contin nici o colonie albastra de E. coli β glucuronidazăpozitive, rezultatele se exprima astfel: mai putin de 1/d E. coli, unde d este factorul de dilutie al suspensiei initiale sau prima inoculata sau dilutia retinuta (b= 1 in cazul in care proba direct incoculata este retinuta pentru produsele lichide). Daca numarul total de colonii tipice si atipice E. coli din cele doua placi ale primei dilutii d1 este mai mare de 300, cu UFC albastre vizibile si daca cele doua placi ale dilutiei d2 contin mai putin de 300 de colonii, cu nici o colonie albastra, rezultatele se exprima astfel: mai putin de 1/d 2 si mai mult de 1/d1 E. coli β glucuronidaza pozitiva pe ml sau pe gram, unde d1 si d2 sunt factorii de dilutie care corespund dilutiilor d1 si d2. Daca numarul total de colonii tipice si atipice de E. coli din cele doua placi ale primei dilutii d1 este mai mare de 300, fara UFC albastre vizibile si dacă cele doua placi ale dilutiei d2 contin mai putin de 300 de colonii si nici o colonie albastra, rezultatele se exprima astfel: mai putin de 1/d2 UFC de E. coli β glucuronidază-pozitive / ml sau pe gram, unde d2 este factorul de dilutie ce corespunde dilutiei d2. Cazuri speciale Cand numarul de UFC albastre este mai mare de 150 la prima dilutie d 1 si sub 15 la dilutia d2: •

daca numarul de UFC albastre de pe fiecare placa a primei dilutii este cuprins intre 150 si 167 calculul se face ca pentru cazul general;

•

daca numarul de UFC albastre de pe fiecare placa a primei dilutii este mai mare de 167 pentru rezultat se ia in considerare numai numarul de colonii de la dilutia d2;

•

când numarul de UFC albastre de pe fiecare din cele doua placi ale fiecarei dilutii este mai mare de 150, exprimarea rezultatelor se va face astfel: mai mult de 150/d E. coli β glucuronidază-pozitive / ml sau pe gram, unde d este factorul de dilutie de la ultima dilutie inoculata.

•

când numai cele doua placi ale celei mai mici dilutii (cea mai mare densitate) contin mai putin de 150 de colonii tipice, calculul numarului de E. coli se face folosind urmatoarea formula : 28

Σc N= Vnd In care: Σc= suma de UFC albastre numarate in cele doua placi, din care cel putin una contine minim 15 colonii tipice CFU; V = volumul de inocul in ml pentru fiecare placa; n = numarul placilor retinute (n= 2 in acest caz); d = factorul de dilutie care corespunde dilutiei retinute 2.6. Cuantificarea stafilococilor coagulazo-pozitivi Principi. Insamintarea pe suprafata unui mediu selectiv solid a unei cantitati din proba, urmata de incubarea mediului selectiv la 35 ± 0,5ºC sau la 37 ± 0,5ºC, 24 - 48 ore. Calculul numarului de S. aureus /ml sau g se face pornind de la numarul de colonii caracteristice si/sau necaracteristice care se dezvoltă in placile alese la nivelurile de dilutii sau din rezultate semnificative si care se confirma prin proba coagulazei. Medii de cultura si reactivi - diluant: ser fiziologic, ser fiziologic peptonat 1%; - mediu gelozat Baird – Parker; - bulion de inima – creier; - plasma de iepure; Realizarea dilutiilor de lucru Recoltarea probelor si scara de diluţii se fac conform metodei descrise pentru fiecare produs. Inocularea Cu o pipetă sterilă se transferă 0.1 ml proba lichidă sau 0.1 ml din suspensia initiala (dilutie 10-1) in cazul celorlalte produse, pe fiecare din cele doua placi cu agar BairdParker. Se repeta procedura pentru dilutia 10 -2 si pentru urmatoarele dilutii, daca este cazul. Daca, pentru anumite produse, se doreste stabilirea celui mai mic număr de stafilococi coagulazo-pozitivi, limita de detectare poate fi marita cu un factor de 10 prin inocularea a 1.0 ml de proba lichidă sau 1.0 ml din suspensia initiala pentru celelalte produse, fie pe suprafata unei placi mai mari de agar (140 mm), fie pe suprafata a trei

29

placi mici de agar (90 mm). In ambele cazuri, se pregatesc duplicate prin folosirea a doua placi mari sau a sase placi mici. Se distribuie inoculul, cat mai repede posibil, pe suprafata placii de agar, fara a se atinge marginile placii, folosind pulverizatorul sau bagheta de sticla in forma de crosa de hochei. Se lasa placile inchise sa se usuce cca 15 minute la temperatura laboratorului. Incubarea Se intorc placile pregatite cu capacul in jos si se incubeaza timp de 24±2 ore apoi se reincubeaza din nou 24±2 h in incubator la 35oC si la 37oC. Selectarea placilor si interpretarea rezultatelor Dupa incubare timp de 24±2 ore, se marcheaza pe dosul placii pozitia fiecarei colonii tipice prezente (a se vedea nota 1). Se reincubeaza toate placile la 35oC si la 37oC pentru inca 24±2 h si se marcheaza orice colonie tipica nou aparuta. De asemenea, se marcheaza orice colonie atipica prezenta (a se vedea nota 1). Se considera pentru numarare numai acele placi (a se vedea nota 2) care contin maximum 300 colonii din care 150 colonii tipice si/sau atipice la doua dilutii succesive. Una dintre placile selectate trebuie sa contina cel putin 15 colonii. Se selecteaza pentru confirmare un anumit numar A (in general 5 colonii tipice daca exista numai colonii tipice sau 5 colonii atipice daca exista numai colonii atipice sau 5 colonii tipice si 5 colonii atipice daca ambele tipuri de colonii sunt prezente, de pe fiecare placa). Daca sunt prezente mai putin de 15 colonii tipice si/sau atipice pe placile inoculate cu produs lichid nediluat sau cu cea mai mica dilutie pentru celelalte produse, se poate face o numarare estimativa. Nota 1. Coloniile tipice sunt negre sau gri, stralucitoare si convexe (intre 1 mm si 1.5 mm in diametru dupa incubare timp de 24 ore si intre 1.5 mm si 2.5 mm in diametru dupa incubare de 48 ore) inconjurate de o zona clara, care poate fi partial opaca. Dupa incubare de cel putin 24 ore poate să apară in aceasta zona clara, un inel opalescent, in contact cu coloniile. Coloniile atipice pot prezenta una din urmatoarele caractere morfologice: a) colonii stralucitoare negre cu sau fara margine ingusta alba; zona clara este absenta sau slab vizibila si inelul opalescent este absent sau greu vizibil. b) Colonii gri fara zone clare. 30

Coloniile atipice sunt formate in principal de tulpini de stafilococi coagulazo-pozitivi care contamineaza produsele lactate, crevetii si organele de pasare si mult mai rar, alte produse. Nota 2. Alte bacterii pot forma colonii cu aspect asemănător coloniilor de stafilococi, necesitand examinarea microscopica prin coloratie Gram, inainte de confirmare. Daca 1.0 ml inocul a fost repartizat in trei placi, se trateaza aceste trei placi ca una in toate numararile si procedurile de confirmare ulterioare. Pentru a face o estimare a numarului celui mai mic de stafilococi coagulazo-pozitivi, se retin toate placile care contin colonii tipice si atipice. Se selecteaza toate acele colonii pentru confirmare intre limitele descrise mai sus. Confirmarea (testul coagulazei) De pe suprafata fiecarei colonii selectate se preleveaza inocul cu o ansa sterila si se transfera intr-o eprubeta sau sticla cu mediu infuzie ?? de creier-inima. Se incubeaza la 35oC si la 37oC timp de ( 24±2 ) h. Se adauga aseptic 0.1 ml din fiecare cultura la 0.3 ml plasma de iepure (daca nu sunt specificate de producator alte cantitati) in eprubete sau sticle de hemoliza sterile si se incubeaza la 35oC si la 37oC. Prin inclinarea eprubetei se examineaza coagularea plasmei dupa incubare de 4 - 6 ore si, daca testul este negativ, se reexamineaza la 24 ore de incubare sau se examineaza la timpii de incubare precizati de producator. Se considera testul coagulazei pozitiv daca volumul de plasamă coagulată ocupă mai mult de jumatate din volumul initial al lichidului. Controlul negativ. Pentru fiecare lot de plasmă, se adaugă 0.1 ml infuzie sterila creierinima la cantitatea recomandata de plasma de iepure si se incubeaza fara inoculare. Pentru ca analiza sa fie validata, plasma controlata nu trebuie sa prezinte semne de coagulare. Exprimarea rezultatelor Cazul general: calculul numarului de stafilococi coagulazo-pozitivi identificati pentru fiecare placa selectata. Se calculeaza, pentru fiecare placa, numarul a de stafilococi coagulazopozitivi, conform formulei:

31

bc bnc a = --------- x Cc + --------- x cnc Ac Anc In care: Ac – numar de colonii tipice supuse testului coagulazei; Anc – numar de colonii atipice supuse testului coagulazei; bc – numar de colonii tipice coagulazo-pozitive; bnc- numar de colonii atipice coagulazo-pozitive; cc- numar total de colonii tipice numarate pe placa); cnc- numar total de colonii atipice numarate pe placa. Se rotunjeste valoarea obtinuta la un numar intreg (conform ISO 7218). Calculul numarului N de stafilococi coagulazo-pozitivi prezenti in proba Pentru acele placi care contin maxim 300 colonii tipice si/sau atipice la doua dilutii consecutive, se calculeaza numarul de stafilococi coagulazo-pozitivi pentru fiecare placa si apoi se calculeaza, ca o medie ponderata din doua dilutii succesive, numarul N de stafilococi coagulazo-pozitivi identificati, prezenti in proba, folosind urmatoarea formula: Σa N = -----------------------V (n1 + 0.1 n2) d In care: Σ a – suma coloniilor de stafilococi coagulazo-pozitivi identificate pe toate placile selectate; V- volumul de inocul aplicat pe fiecare placa, in ml; n1- numarul de placi selectate la prima dilutie; n2 – numarul de placi selectate la a doua dilutie; d – factorul de dilutie care corespunde la prima dilutie selectata (suspensia initiala este considerata o dilutie). Rezultatul calculat se rotunjeste la doua cifre semnificative (conform ISO 7218). Rezultatele se raporteaza ca numar de stafilococi coagulazo-pozitivi pe ml (produse lichide) sau pe gram (alte produse), exprimat ca un numar intre 1.0 si 9.9 înmulţit cu 10x. Estimarea dilutiei celei mai mici Daca cele doua placi care corespund probei (produse lichide) sau suspensiei initiale (alte produse) contine fiecare mai putin de 15 colonii identificate, rezultatele se raporteaza dupa cum urmeaza: a) Pentru produse lichide, numarul estimat de stafilococi coagulazo-pozitivi pe ml: Σa Na = -------------Vx2

32

In care: Σ a – suma coloniilor de stafilococi coagulaza-pozitive identificate pe cele doua placi selectate; V – volumul aplicat pe fiecare placa. b) Pentru alte produse, numarul estimat de stafilococi coagulazo-pozitivi pe gram: Σa Ne = --------------Vx2xd In care: Σa – suma coloniilor de stafilococi identificate coagulazo-pozitive (IV.5.1.1.) pe cele doua placi selectate; d – factorul de dilutie a suspensiei initiale; V – volumul aplicat pe fiecare placa. Daca cele doua placi, care corespund probei (produse lichide) sau suspensiei initiale (alte produse) nu contin nici o colonie de stafilococi coagulazo-pozitivi si daca inocularea a fost efectuata cu 0.1 ml proba, se raporteaza rezultatele dupa cum urmeaza (cazul general de 0.1 ml inocul): -

mai putin de 10 stafilococi coagulazo-pozitivi pe mililitru (produse lichide);

-

mai putin de 10/d stafilococi coagulazo-pozitivi pe gram (alte produse), unde d este factorul de dilutie a suspensiei initiale.

Daca inocularea a fost facuta cu 1 ml de proba, rezultatul se raporteaza dupa cum urmeaza: -

mai putin de 1 stafilococ coagulazo-pozitivi pe mililitru (produse lichide);

-

mai putin de 1/d stafilococ coagulazo-pozitivi pe gram (alte produse).

2.7. Cuantificarea clostridiilor sulfit-reducatoare Principiul metodei: Punerea in evidenţă a clostridiilor sulfit-reducatoare din produsele alimentare se bazeaza pe capacitatea lor de a reduce compuşii oxidaţi ai sulfului, cu formarea hidrogenului sulfurat (H2S), care reacţionează cu ionii de fier (Fe2+) din mediu si formeaza sulfura feroasa (FeS) care coloreaza în negru coloniile si mediul de cultura din jurul lor. Mediile pe care se cuantifică aceste bacterii trebuie sa conţină compuşi

33

ai sulfului (cisteina, cistina, sulfit de sodiu) si indicatori pentru decelarea hidrogenului sulfurat, cum sunt sarurile de fier. Medii de cultura -bulion VF cu acid tioglicolic si albastru de metilen; -agar cu sulfit; -agar cu sulfit de sodiu, polimixina B si neomicina (TSN); - agar 2 %. Modul de lucru Proba ca atare si/sau diluţiile ei se inoculeaza in cantitate de 1 ml, in câte 3 eprubete pentru fiecare dilutie în profunzimea mediului VF cu acid tioglicolic si albastru de metilen. Notă. Pentru condiţia “gram produs” se inoculeaza 1 ml din proba lichida nediluata sau cate 10 ml din dilutia 1/10, pentru probele solide. Inainte de însămânţare, mediul repartizat se regenerează timp de 10 minute la 100o C. Incubarea. Mediile insamanţate se incubeaza la 35± 0,5o C, timp de 1-3 zile, in functie de intensitatea cresterii. Interpretarea rezultatelor Cresterea se apreciaza prin gradul turbidităţii si prin examen bacterioscopic (prezenţa bacililor Gram pozitivi). Din fiecare eprubeta în care se observa crestere se fac treceri pe mediul DRCA sau pe agar cu sulfit de sodiu si citrat feric, care se incubeaza la 35 o C timp de 5 zile, examinandu-se zilnic pentru a depista înnegrirea mediului, care indica prezenta clostridiilor sulfit-reducatoare. Mediul se toarna lichefiat si racit la 47 - 50º C, astfel încat sa ocupe ¾ din volumul eprubetei. Se omogenizeaza inoculul in mediu prin 8-10 miscari de rotatie a eprubetelor, intre palme, evitând formarea bulelor de aer. Eprubetele se introduc imediat in pozitie verticala intr-un vas cu apa rece, pana la solidificarea mediului. Dupa solidificarea mediului, in fiecare eprubeta se toarna deasupra coloanei de mediu însămânţat, agar 2 % in coloana de cca 2 cm. Interpretarea si exprimarea rezultatelor Numarul de clostridii sulfit-reducatoare pe gram produs se stabileste în functie de numarul de eprubete pe fiecare serie de dilutie care au dat reactii pozitive si confirmate pe mediul solid conform tabelului din anexa. 34

2.8.

Cuantificarea bacteriilor din genul Salmonella

Cuantificarea salmonelelor comporta 4 faze succesive: preîmbogăţirea, îmbogăţirea, izolarea si identificarea si confirmarea. Materiale si aparatură -balanta tehnica -microscop cu obiectiv cu imersie 90 x sau 100 x si ocular 10 x -termostat reglabil la 37±0,5o C -termostat reglabil la 42±0,5o C -vase Erlenmeyer sterile a 200-300 ml -eprubete 10/100 mm si 16/160 mm, sterile -placi Petri cu diametrul de 10 cm, sterile -lame de sticla degresate -ansa bacteriologica -omogenizator electric sau mojare sterile -pungi de plastic sterile -foarfece, pense, spatule -vata -alcool Medii de cultura si reactivi - apa peptonata tamponata - mediul Rappaport-Vassiliadis cu soia (bulion RVS) - bulionul Muller-Kauffmann tetrationat/novobiocina (bulion MKTTn) - agar xiloza-lizina-dezoxicolat (agar XLD). - agar Istrati-Meitert (agar cu bila) - agar nutritiv - agar cu citrat de fier, trizaharat (agar TSI) - mediul cu uree (Christensen) - mediul cu lizina - agar nutritiv semisolid - reactiv pentru evidentierea β galactozidazei, discuri de hartie gata preparate - reactiv Kovacs

35

- reactivi pentru reactia Voges –Proskauer - solutie salina fiziologica Antiseruri aglutinante polivalente “O” si de grup”O”, antiseruri Vi. Preîmbogăţirea in mediul neselectiv lichid Însămânţarea probei în apa peptonata tamponata, urmata de incubare la 37±1o C timp de 18 ±2 h. Imbogăţirea în medii selective lichide Se utilizeaza mediu Rappaport-Vassiliadis modificat (bulion RVS) si bulionul MullerKauffmann tetrationat/novobiocina (bulion MKTTn), care se însămânţeaza cu cultura de preimbogăţire. Bulionul RVS se incubeaza la 41,5 ± 1o C timp de 24 ± 3 h, iar bulionul MKTTn la 37 ± 1o C timp de 24 h ± 3 h. Izolarea si identificarea Presupune inocularea celor două medii de îmbogăţire pe câte doua medii solide selective din care unul in mod obligatoriu este agar xiloza-lizina-dezoxicolat (agar XLD) . Agarul XLD se incubeaza la 37 ± 1o C timp de 24 ± 3 h. Al doilea agar selectiv se incubeaza conform recomandarilor fabricantului. Dupa incubare de 24 ore la 35 sau la 37o C mediile sunt controlate pentru prezenta coloniilor suspecte de Salmonella, după caracteristicele prezente. Confirmarea coloniilor: repicarea coloniilor suspectate ca fiind Salmonella care se confirma cu ajutorul testelor biochimice si serologice adecvate.

36

Proba de analizat, 25g +225 ml apa peptonata la temperatura camerei

Incubare timp de 18 ± 2 h la 37 ± 1°C

0,1 ml cultura + 10 ml bulion RSV incubare timp de 24 ± 3h la 41,5 ± 1° C

1 ml cultura + 10 ml bulion MKTTn incubare timp de 24 ± 3 h la 37 ± 1° C

Mediu XLD si incubare timp de 24 ±3 h la 37 ± 1° C Colonii caracteristice: zona centrală neagră si o zona transparentă luminoasă de culoare rosiatică

Agar I.M. incubare timp de 24 ±3 h la 37 ±1° C Colonii caracteristice verzuialbastrui cu sau fără zonă centrală neagră

De pe fiecare placa se testeaza o colonie caracteristică. Daca rezultatul este negativ, se testeaza alte 4 colonii.

Agar nutritiv Incubare timp de 24 ±3 h la 37 ± 1° C

Confirmare metabolică

Confirmare serologică

Exprimare rezultate

37

Confirmarea metabolică -

Agar TSI Suprafata înclinata a agarului se însămânţeaza in striuri in zig-zag, iar portiunea dreapta a mediului se însămânţeaza prin înţepare. Incubare la 37 ± 1° C timp de 24 ± 3 h. Se intrepreteaza schimbarile aparute in mediu, dupa cum urmeaza: a) coloana mediului -galbena

....

glucozo-pozitiva (fermentarea glucozei)

- rosie sau neschimbata ... glucozo-negativa (nu fermenteaza glucoza) - neagra

.....

formarea H2S

- bule de gaz sau fisuri în coloana de mediu .... fermentarea glucozei b) suprafata inclinata a mediului - de culoare galbenă ... fermentează lactoza si/sau zaharoza - de culoare neschimbata sau roşie .... nu fermenteaza lactoza si nici zaharoza. Mediul TSI însămânţat cu tulpini tipice de Salmonella prezintă suprafaţa înclinata a mediului alcalina (roşie) si coloana acida (galbena) cu formare de gaz si (90% din cazuri) formarea H 2S (innegrirea agarului). Dacă tulpina de Salmonella izolată este lactozo-pozitiva, suprafata inclinata a mediului TSI este galbenă. De aceea, confirmarea preliminara a culturilor de Salmnella nu trebuie sa se bazeze exclusiv pe rezultatele testului pe agar TSI. -Agar uree Suprafata inclinata a medului se însămânţeaza în striuri in zig-zag. Se incubeaza la 37 ± 1° C timp de 24 ±3 h si se examineaza la diferite intervale de timp. Daca reacţia este pozitiva, culoarea mediului vireaza la roz inchis si mai tarziu la rosu închis. Reactia este adesea aparenta dupa 2 - 4 h. - Mediul cu L-lizina Mediul lichid se inoculeaza imediat sub interfata lichid-aer. Incubare la 37 ± 1° C timp de 24 ± 3 h. Dupa incubare, turbiditatea si culoarea purpurie indica 38

o reactie pozitiva. O coloratie galbena indica o reactie negativa. -Evidenţierea β-galactozidazei Conţinutul unei anse din coloniile suspectate ca fiind Salmonella se suspendă intr-o eprubeta care contine 0,25 ml solutie salina. În eprubetă se adauga o picatura de toluen si se agita. Eprubeta se încălzeşte pe baie de apa la 37° C, timp de 5 minute. Se adauga 0,25 ml reactiv pentru detectarea β-galcatozidazei si se amesteca. Eprubeta se reîncălzeşte pe baie de apa la 37° C si se lasa timp de 24 h ±3 h, examinand eprubeta la intervale de timp. O culoare galbena indica o reacţie pozitivă. Reactia este de obicei vizibila dupa 20 minute. Daca se folosesc discuri de hârtie, se respecta instructiunile producătorului. - Mediu pentru reactia Voges-Proskauer Continutul unei anse dintr-o colonie suspectată se suspendă intr-o eprubeta care contine 3 ml mediu VP. Incubare la 37 ±1° C timp de 24 ± 3 h. Dupa incubare, se adauga doua picaturi de solutie de creatina, trei picaturi de solutie etanolica de 1-naftol si apoi doua picaturi de solutie de hidroxid de potasiu. Se agita dupa adaugarea fiecarui reactiv. Apariţia unei coloratii roz până la rosu stralucitor in interval de 15 minute indica o reactie pozitiva. - Mediu pentru reactia indolului O eprubeta care contine 5 ml mediu triptona/triptofan se inoculează cu o colonie suspectată ca fiind Salmonella. Se incubeaza la 37 ±1° C timp de 24 ± 3 h. Dupa incubare se adauga 1ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel rosu indica o reacţie pozitivă. Un inel galben brun indica o reactie negativa. Tabelul... Interpretarea testelor biochimice pentru tulpinile de Salmonella

39

Test Glucoza, TSI (formare de acid) Glucoza, TSI (formare de gaz) Lactoza ,TSI Zaharoza,TSI Hidrogen sulfurat, TSI Descompunerea ureei Decarboxilarea lizinei Evidenţierea β- galactozidazei Reacţia Voges-Proskauer Formarea indolului

Reactie pozitiva sau negativa sau negativa + + + + -

Confirmare serologica Prezenţa anigenelor “O” ,”Vi”, sau “H” de Salmonella se evidenţiază prin reacţia de aglutinare pe lama cu serurile adecvate, din colonii pure si dupa eliminarea tulpinilor auto-aglutinabile. Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile: Pe o lama de sticla curata se depune o picatura de solutie salina. Cu ansa, se disperseaza o fractiune din colonia de testat, astfel încât sa se obtina o suspensie omogena. Se înclină lama, timp de 30 s- 60 s. Rezultatul se observă pe fond negru, de preferinta cu ajutorul unei lupe. Daca bacteriile se agrega, tulpina este autoaglutinabila si nu mai trebuie examinată pentru evidenţierea antigenelor specifice. Evidentierea antigenelor “O” O parte a unei colonii ne-autoaglutinabila, se disperseaza într-o picatura de ser anti- “O”, astfel incat sa se obtina o suspensie omogena. Daca se produce aglutinarea, reacţia este pozitivă. Se utilizeaza serurile poli- si monovalente, în succesiune, in functie de rezultate. Evidentierea antigenelor “Vi” Se procedeaza ca la punctul anterior, utilizand o picatura de ser anti-“Vi”, in locul solutiei saline. Daca se produce aglutinarea, reactia este pozitiva. Evidentierea antigenelor “H”

40

Agarul nutritiv semisolid se însămânţează cu o colonie neautoaglutinabila. Incubare la 35 sau la 37° C, timp de 18 - 24 h. Cultura se utilizează pentru evidenţierea antigenelor “H”, procedand ca la punctele anterioare: în locul solutiei saline, pe lamă se depune o picatura de ser anti “H”. Daca se produce aglutinarea, reactia este pozitivă. Tabelul. Interpretarea reactiilor biochimice si serologice Reactii

Auto-

Reactii

metabolice

aglutinare

serologice

Tipice

Nu

Antigene

Confirmare

“O”, “Vi”

diagnostic:

sau”H’

Salmonella

Tipice

Nu

Interpretare

pozitive Toate reactiile

Tipice Lipsa

Da Nu

negative Neefectuate Antigene

reactiilor

“O”,”Vi”

tipice

sau “H”

Prezumptie diagnostic: Salmonella

pozitive Toate

Infirmare

reactiilor

reactiile

diagnostic

tipice

negative

Salmonella.

Lipsa

Nu

Confirmarea definitivă Tulpinile confirmate sau suspectate ca fiind Salmonella se trimit la un centru de referinta pentru determinarea definitiva a serotipului (INCDMI Cantacuzino). Exprimarea rezultatelor: In functie de rezultatele interpretarii, se indica prezenta sau absenta Salmonella, în x g sau ml.

41

2.9.

Determinarea Bacillus cereus

Principiu. Pe suprafaţa unui mediu selectiv solid repartizat în placi Petri, se însămânţează un volum determinat din esantionul pentru analiză (daca produsul este lichid sau din dilutia initiala a altor produse), precum si din diluţii zecimale ale eşantionului. După incubarea in aerobioză, la 30 ±1o C timp de 18-48 h se calculează numarul de celule de Bacillus cereus / gram sau pe /ml de proba, pornind de la numarul de colonii caracteristice, confirmate prin analize specifice. Materiale si aparatura -

Balanta tehnica

-

Microscop cu obiectiv de imersie (90 x sau 100 x) si ocular 10 x

-

Termostat reglabil la 30 ±1o C

-

Eprubete de 18/180 mm si flacoane de cultura, sterile

-

Pipete gradate de diferite capacităţi, sterile

-

Placi Petri cu diametrul de 90 mm, 100 mm sau 140 mm, sterile

-

Anse bacteriologice

-

Mojar de portelan, cu diametrul de 10 cm, steril sau omogenizator electric

-

Baghete de sticla sau material plastic, pentru etalare (in forma de L)

-

Trusa de colorat, lame de sticla

-

Foarfece, pense, spatule, sterile

-

Vata, alcool

Reactivi si medii de cultura Soluţii de diluare: -

Soluţie fiziologică

-

Solutie fiziologică peptonată

Medii de cultura: -

Mediul agar-manita-galbenuş de ou-polimixina (MYP- dupa Mossel)

-

Mediul agar cu sânge

Diluarea probei. Se realizeaza schema de dilutii recomandata pentru produsul respectiv. Însămânţarea. Cu o pipeta sterila se repartizeaza câte 0,1 ml esantion pentru analiza, daca acesta este lichid, sau din diluţie iniţială, pentru alte produse, pe suprafata mediului din doua placi Petri. Se repeta operatia pentru dilutiile decimale urmatoare.

42

Pentru anumite produse cu incarcatura microbiana redusa de B. cereus, limita de detectare poate fi marita cu un factor de 10, prin examinarea a 1 ml din proba lichida si a 1 ml din suspensia initiala pentru produse solide. Se distribuie 1 ml din inocul fie pe suprafata unei placi Petri mari (140 mm), fie pe suprafata a 3 placi Petri mici (90 mm). Cu ajutorul baghetei de etalare, se disperseaza inoculul, cat mai repede posibil, pe suprafata mediului, evitand atingerea marginilor placii. Se utilizeaza cate o bagheta sterila pentru fiecare placa. Se lasa placile acoperite cu capac, timp de 15 min. la temperatura camerei, pentru a permite absorbtia inoculului în agar. Se intorc placile cu capacul în jos si se incubeaza timp de 18-24 ore la temperatura de 30oC. Daca dupa acest interval, coloniile nu sunt vizibile, incubarea se continua inca 24 h. Numararea coloniilor Dupa perioada de incubare se retin placile cu mai putin de 150 colonii, pe cat posibil din doua dilutii succesive. Se numara in fiecare placa, coloniile suspectate ca fiind Bacillus cereus, care sunt mari, de culoare roz (nu fermenteaza manitolul) si aproape totdeauna inconjurate de o zona de precipitare (indicand producerea de lecitinaza). Daca in placile insamantate din produsul lichid sau din dilutia cea mai mica, sunt mai putin de 15 colonii caracteristice, se poate face o estimare. Confirmarea coloniilor Se aleg la intâmplare 5 colonii suspecte din fiecare placa selecţionată. Daca sunt mai putin de 5 colonii suspectate, se analizeaza toate coloniile dezvoltate. Daca s-au dezvoltat foarte multe colonii si nu este posibila selectarea unor colonii suspectate, bine izolate, se însamânţeaza 5 colonii din acestea, prin tehnica epuizarii ansei, pe suprafata unor placi cu mediul MYP. Incubare la 30oC, timp de 18 – 24 h. Se alege pentru confirmare, din fiecare placa, cel putin o colonie bine izolata, de culoare roz. Confirmarea prin testul hemolizei Se repica cate o colonie selectata si se paseaza pe suprafata unei placi Petri cu agar cu sânge de berbec. Incubare la 30o C, 24 ± 2 h si se interpreteaza reactia hemolizei. Tabelul . Interpretarea testelor metabolice de identificare si confirmare

43

TEST

CONFIRMARE PREZUMTIVĂ

MYP agar Reactia hemolizei

Bacillus cereus Colonii roz inconjurate de precipitat Reactie pozitiva

Interpretarea si exprimarea rezultatelor Dacă cel puţin 80 % din coloniile selectate sunt confirmate, se consideră ca numar de celule de Bacillus cereus, cel obţinut prin numărarea facuta conform 6.3. In toate celelalte cazuri, numărul de celule de B. cereus se calculeaza ca procent al celor care au fost confirmate, din numărul de colonii numărate. Calculul numarului in placile au crescut 15-150 colonii Numarul de microorganisme pe ml sau pe gram se calculeaza după formula: Σa N = -------------------- , în care: V.(n1 + 0,1 n2)d V= volumul de inocul depus in fiecare placa exprimat în ml; Σ = suma coloniilor caracteristice de B. cereus, numarate pe toate placile retinute; n1 = numarul de placi retinute la prima dilutie; n2 = numarul de placi retinute la a doua dilutie; d = rata dilutiei celei mai mici. Estimarea numerelor mici Daca la cele doua dilutii alese, corespunzatoare esantionului pentru analiza sau dilutiei initiale, s-au dezvoltat sub 15 colonii, se face media coloniilor din cele doua placi, iar rezultatele se raporteaza sub forma: -

Număr estimat, NE, de microorganisme pe ml

-

NE = m (produse lichide)

-

Numar estimat, NE, de microorganisme pe gram NE = m/d (alte produse) in care d = rata de dilutie a suspensiei initiale.

Daca cele doua dilutii alese, corespunzatoare esantionului sau dilutiei initiale, nu s-a dezvoltat nici o colonie, rezultatul se raporteaza sub forma : -

mai putin de un microorganism pe mililitru (produse lichide)

-

mai putin de 1/d microorganisme pe gram (alte produse), d fiind rata dilutiei initiale.

44

2.10.

Analiza bacteriologică a conservelor alimentare în recipiente

închise ermetic 2.10.1. Examinarea recipientelor (probe elementare) Se noteaza tipul si formatul recipientelor si, de asemenea, toate datele marcate pe recipiente sau înscrise pe etichetele acestora pentru identificarea produsului. Se scoate eticheta si se notează toate defectele de aspect exterior al recipientelor (rugina, deformari, bombarea fizica si biologica), inchidere necorespunzatoare, fisuri, scurgeri de continut etc. Se considera necorespunzatoare din punct de vedere microbiologic si se elimina din lucru, recipientele care prezinta bombaj biologic si inchidere necorespunzatoare, fisuri, scurgeri de continut. Examinarea interioara a recipientelor se efectueaza dupa incubare si dupa recoltarea probei pentru analiza microbiologica. Se verifica si se noteaza toate defectele interioare care pot influenţa salubritatea si conservabilitatea continutului (corodarea ambalajului, starea vernisului etc.) si de asemenea, aspectul şi mirosul conţinutului. 2.10.2. Incubarea probelor la termostat Aparatura necesara: termostate reglabile la 35 ± 1; 45 ± 1; 55 ± 1º C. Modul de lucru Recipientele considerate corespunzatoare la examenul exterior, dupa indepartarea etichetei se curata la exterior si se incubează la termostat. Pentru incubarea în termostat sunt necesare minimum cinci recipiente: -

trei recipiente se introduc in termostat la 35 ± 1º C timp de 14 zile, pentru punerea in evidenta a microorganismelor mezofile;

-

doua recipiente se incubeaza în termostat, pentru evidentierea microorganismelor termofile, astfel: -

la 45 ± 1º C, timp de 7 zile pentru recipientele din sticla cu capac de inchidere Omnia- Twist- off si pentru cele din material plastic (baghete, tuburi etc) ;

-

la 55 ± 1º C, timp de 5 zile pentru recipientele din tabla.

45

Recipientele care prezinta bombaj biologic si/sau scurgere de continut se scot din termostat, considerandu-se necorespunzatoare. La sfârşitul perioadei de incubare, recipientele se scot din termostat, se racesc la temperatura camerei si se supun examenului microbiologic. 2.10.3. Recoltarea probelor pentru analiza Condiţii de lucru Deschiderea recipientelor, recoltarea probei pentru analiza si insamantarea mediilor de cultura se fac in boxe special amenajate, prevazute cu lampi bactericide, pentru evitarea contaminarii probei. Nota. In lipsa boxelor special amenajate, operatiile se fac in încăperi obisnuite de laborator cu ferestre si usi bine inchise, fara curenti de aer. Înainte de inceperea lucrului, mesele se vor dezinfecta cu alcool si se vor pune in functiune lampile bactericide, timp de 30 minute. În incaperile destinate analizei microbiologice, accesul altor persoane este interzis. Materiale, instrumente, aparate si medii de cultura -

alcool

-

vata hidrofila

-

perforator metalic cu ∅ 10 – 20 mm steril

-

dispozitiv de deschis placi, steril, cu decupare circulara

-

pipete negradate, sterile, cu diametrul orificiului de 5 – 10 mm

-

microscop cu obiectiv de imersie 90 x sau 100 x si ocular 10 x

-

lame

-

lamele

-

ansa bacteriologica

-

bulion nutritiv cu ficat (sau bulion tioglicolat)

-

bulion simplu glucozat

-

agar glucozat inclinat

Pregatirea recipientelor in vederea prelevarii probelor Recipientele care la sfârşitul perioadei de termostatare nu prezintă bombaj biologic si/sau scurgeri de continut se pregatesc pentru operatiunea de deschidere si prelevare a probei pentru analiză, astfel: -

se curata si se degreseaza suprafata exterioara a recipientului; 46

-

se dezinfecteaza capacul cu alcool si se flambeaza (pe capacul neştanţat).

Deschiderea recipientelor Se realizeaza prin perforarea capacului neştanţat cu perforatorul metalic, care are avantajul de a protejza atat continutul recipientului, cat si pe operator. In timpul deschiderii recipientului, se indreapta flacara unui bec de gaz spre locul de deschidere, pentru sterilizarea aerului care poate patrunde in interiorul acestuia. Modul de recoltare al probei pentru analiza Din recipientul deschis se recolteaza cca 8 – 10 g de produs, cantitatea necesara pentru inocularea mediilor de cultura si examenului microscopic. Din produsele la care poate sa apara alterarea prin acrire fara bombaj se recolteaza o cantitate suplimentara de proba pentru analiză în vederea efectuarii testului cu purpur de bromcrezol (in cazul conservelor cu pH mai mare de 4,5 ) sau a verificarii valorii pH ( în cazul conservelor cu pH mai mic de 4,5). Testul cu purpur de bromcrezol Intr-o eprubeta curată se introduc cateva picaturi de solutie apoasa de 0,04 % de purpur de bromcrezol, peste care se adauga 5–6 ml din faza lichida a continutului recipientului. Continutul eprubetei se agita pentru omogenizare. Daca la adaugarea indicatorului culoarea continutului eprubetei vireaza in galben, se considera ca proba analizată prezinta semne de alterare prin acidifiere fara bombare. Insamantarea Din proba de analizat se însămânţează mediile de cultura adecvate fiecarei grupe de microorganisme, mai întâi cele pentru punerea in evidenţă a microorganismelor anaerobe, apoi cele pentru punerea in evidenţă a microorganismelor aerobe. Eprubetele cu mediile însămânţate se incubeaza la termostat la 35 ± 1º C, pentru evidentierea bacteriilor mezofile, respectiv la 55 ± 1º C, pentru evidentierea bacteriilor termofile. Examinarea culturilor In timpul perioadei de incubare, culturile microbiene insamantate se examineaza zilnic. Toate culturile microbiene aerobe mezofile se supun examenului microscopic in cazul in care, la acest examen, nu se identifica pe preparat forme sporulate de bacterii, ci doar bacterii nesporulate, se procedeaza astfel:

47

a) din culturile dezvoltate pe bulion glucozat insamantate direct din proba de analizat, se fac insamantari pe agar glucozat inclinat, care se incubeaza la temperatura de 35 ± 1º C, timp de 24 ore, dupa care se face un examen microscopic. b) daca nu se observa prezenta sporilor bacterieni, eprubeta cu agar glucozat se pastreaza la temperatura camerei, timp de 48 ore, dupa care se examineaza microscopic. Dacă nici in acest caz nu se observa spori bacterieni, se considera ca proba pentru analiza contine numai bacterii nesporulate. c) Eprubetele cu agar glucozat insamantate direct din probele de analizat, în momentul aparitiei semnelor de dezvoltare microbiana, se scot din termostat si se mentin la temperatura camerei, timp de 48 ore. Dupa aceasta se realizeaza preparate microscopice si se examineaza la microscop. Daca nu se observa spori bacterieni, se considera ca proba de analizat contine doar bacterii nesporulate. d) daca in recipientele cu medii anaerobe se observa crestere microbiana in profunzimea mediilor, dar pe mediile aerobe nu se constata creştere microbiana, se confirma prezenta bacteriilor anaerobe in proba analizata. Culturile termofile aerobe provenite dintr-o proba de analizat cu pH mai mare de 4,5 care au produs virarea culorii mediului de la rosu, la purpuriu la galben, indica prezenta bacteriilor de fermentaţie acidă fara bombare. Toate culturile termofile aerobe dezvoltate dintr-o proba de analizat cu pH mai mare de 4,5, indica prezenta bacteriilor acidifiere fara bombare. Interpretarea rezultatelor Dacă la sfarsitul perioadei de incubare, niciuna din eprubetele cu medii de cultura insamantate nu prezinta semne de dezvoltare microbiana, se considera ca proba de analizat nu contine microorganisme reziduale vii. 2.11.

Cuantificarea numarului celulelor de Listeria monocytogenes

Principiu. Numararea Listeria monocytogenes necesita sase faze succesive: i)

prepararea suspensiei initiale in una din cele doua solutii de diluare: apa peptonata tamponata sau mediu de baza semi-Fraser;

48

ii)

resuscitarea timp de 1 h, la 20o C;

iii)

însămânţarea in striuri in zig-zag, pe suprafata mediului selectiv solid din doua placi Petri, a unei cantitati specificate din esantionul pentru analiza, in cazul produselor lichide sau din suspensia initiala, in cazul altor produse, precum si a dilutiilor zecimale;

iv)

incubarea placilor la 35o C sau la 37o C si examinarea lor dupa 24 si 48 h;

v)

confirmarea coloniilor suspectate ca fiind Listeria monocytogenes;

vi)

calculul numarului celulelor de Listeria monocytogenes pe baza numarului de colonii confirmate, pe gram sau pe mililitru de proba.

Aparatura si materiale - etuva (aparat pentru sterilizarea uscata) - autoclav (pentru sterilizarea umeda) - etuva pentru uscare sau termostat, menţinute între 25o ± 1oC si 50 ± 1oC - termostate pentru mentinerea mediilor inoculate, a placilor si eprubetelor in urmatoarele intervale de temperatura: a) 20 ± 1oC b) 25 ± 1oC c) 37 ± 1oC - baie de apa, mentinuta la 44 – 47o C - anse bacteriologice, pipete Pasteur sau anse de unica folosinta - dispersoare de material plastic sau de sticla, sterile - pH-metru - eprubete sau flacoane - pipete gradate - placi Petri - microscop - balanta tehnica Medii de cultura si reactivi: – apa peptonata tamponata – bulion semi-Fraser cu citrat – agar Listeria (Ottaviani si Agosti) – agar cu sânge de berbec – bulion cu ramnoza – bulion cu xiloza 49

– agar pentru testul de mobilitate Pregatirea dilutiilor de probă Pentru prepararea suspensiei initiale se foloseste bulion TSYEB, apa peptonata tamponata, agar TSYEA sau bulion semi-Fraser. Se lasa suspensia iniţială în repaus 1h ± 5 min. la 20 ± 2oC, în scopul resuscitării microorganismelor stresate. Daca se foloseste o serie de dilutii, acestea se pregatesc dupa resuscitare. Inocularea si incubarea Se transfera cu ajutorul unei pipete sterile, cate 0,1 ml din suspensia initiala in doua placi cu mediu LISTERIA AGAR (Ottaviani si Agosti). Se repeta procedeul, folosind dilutiile urmatoare, daca este necesar. Inoculul se dispersează, cat mai repede posibil, pe suprafata agarului din placa, fara a atinge marginile placii cu pipeta. Se foloseste o pipeta sterila pentru fiecare dilutie. Plăcile inchise se lasă aproximativ 15 minute, la temperatura ambianta, pentru ca inoculul sa fie absorbit in agar. Se intorc placile cu capacul in jos si se aseaza în termostat la 35 sau la 37oC. Numararea coloniilor caracteristice Dupa incubare timp de 24 de ore si o incubare suplimentară de 18 ore, daca dezvoltarea este slaba, sau absentă, se examineaza plăcile pentru prezenta coloniilor suspecte de Listeria spp. Se considera ca fiind L. monocytogenes coloniile verzi-albastrui inconjurate de un halou opac (colonii caracteristice). Daca cresterea este nesemnificativa, sau daca nu se observa nici o colonie, sau daca nici o colonie caracteristica nu este prezenta dupa 24 ± 3 h de incubare, trebuie ca plăcile Petri sa fie reincubate pentru înca 24 ± 3 h. Nota 1. Unele tulpini de L. monocytogenes prezinta un halou slab (uneori lipseşte) in cazuri de stres, în special stresul generat de un mediu acid. Nota 2. Unele tulpini de L. monocytogenes sunt caracterizate prin activitatea PIPLC redusa (fosfatidul inozitol fosfolipaza C), mai ales cand perioada totala de incubatie este mai mare de 4 zile. Unele dintre aceste tulpini pot fi patogene. Se numara coloniile suspectate ca fiind Listeria spp. din fiecare placa care contine mai putin de 150 colonii caracteristice sau necaracteristice. Selectarea coloniilor pentru confirmarea Listeria spp. a) Dupa perioada de incubare (24 h), se retin placile care contin mai putin de 150 50

colonii suspectate ca fiind Listeria spp, din toate dilutiile si, daca este posibil, la doua dilutii succesive. Se aleg cinci dintre coloniile suspectate din fiecare placa retinuta. Daca sunt mai putin de cinci colonii suspectate pe o placa, se iau pentru confirmare toate coloniile suspectate. b) Se însmânţeaza coloniile selectate pe suprafata placilor preuscate cu agar cu extract de levuri, soia, triptonă (TSYEA), intr-un mod care sa permita dezvoltarea coloniilor bine izolate. Se aşează placile intr-un termostat, la 35 sau la 37oC, timp de 18-24 h sau pana cand dezvoltarea este satisfacatoare. Coloniile tipice au diametrul de 1-2 mm, sunt convexe, nepigmentate si opace, cu marginile netede. Daca nu se obtin colonii bine izolate, se repica o colonie de Listeria spp. tipica, pe o alta placa cu TSYEA. Testele urmatoare se executa pe colonii dezvoltate pe agar TSYEA. c) Reactia catalazei Se preleveaza o colonie izolata si se suspenda într-o picatura de solutie de peroxid de hidrogen, pe o lama. Formarea imediata a bulelor de gaz indica o reactie pozitiva. d) Coloratia Gram Listeria spp. apare sub forma de bacili scurti, Gram-pozitivi (cu grosimea de 0,4 - 0,5 μm si lungimea de 1-2 μm). e) Testul mobilitatii (daca este necesar) Se preleveaza o colonie izolata si se suspenda intr-o eprubeta care contine TSYEB. Se incubeaza intr-un termostat la 25oC, timp de 8-24 h pana cand se observa o tulburare a mediului. Se depune o picatura din cultura de mai sus folosind o ansa pe o lama microscopica pentru obtinerea unui preparat proaspat lama/lamela care se examineaza la microscop, observandu-se bacili scurti, subtiri, cu mobilitate prin rostogolire. Culturile dezvoltate la temperaturi mai mari de 25oC pot fi lipsite de mobilitate. Totdeauna testul se realizeaza cu o cultura standard. Ca o alternativa a testului de mobilitate, se inteapa agarul pentru mobilitate, cu o colonie tipica de pe TSYEA folosind un ac de inoculare. Se incubeaza timp de 48 de ore, in termostat, la 25o C. 51

Se examineaza dezvoltarea culturii in jurul striului de însămânţare. Coloniile de Listeria spp. se dezvolta sub forma de umbrela, imediat sub suprafata agarului. Daca dezvoltarea nu este suficienta, se incubeaza inca cinci zile si se examineaza cultura in cursul acestei perioade. Confirmarea pentru Listeria monocytogenes a) Testul hemolizei a.1. Pe placi cu agar cu sange de berbec. Suprafata agarului cu sange se usuca complet, apoi se marcheaza agarul in patrate. Pentru fiecare cultura se preleveaza o colonie izolata şi se însămânţeaza în striuri intrun patrat marcat, folosind o ansa bacteriologica. Se folosesc culturi martor pozitive (L. monocytogenes) si negative (L. inocua) Se incubeaza la 35 sau la 37oC, timp de 24 ± 2 h. L. monocytogenes formeaza zone luminoase, clare, inguste de β-hemoliza. L. innocua nu prezinta zone clare in jurul striului de insamantare. L. seeligeri prezinta o zona mica de de β-hemoliza. L. ivanovii prezinta zone bine delimitate, mari, de β-hemoliza. a.2. Reactia hemolitica se poate efectua odata cu testul CAMP sau folosind eritrocite in suspensie, dupa cum urmeaza: –

se omogenizeaza o colonie in 150 µl TSYEB

–

se incubeaza la 35 sau la 37 timp de 2 ore

–

se adauga 150 µl suspensie de globule rosii de berbec, se incubeaza la 35 sau

la 37oC timp de 15- 60 minute –

se raceste la +3 ± 2oC, timp de 2 h

–

se examineaza pentru prezenta sau absenta β-hemolizei

–

daca reactia nu este clara se lasa cultura la +30C ± 20C timp de 24 h.

b) Utilizarea hidratilor de carbon Folosind o ansa bacteriologica se inoculeaza fiecare din mediile pentru utilizarea hidratilor de carbon, cu cultura de pe mediul TSYEB. Se incubeaza la 35 sau la 37oC timp de pana la 5 zile. Reactia pozitiva este indicata de virarea culorii de la purpuriu la galben si are loc dupa 24 h - 48 h de incubare.

52

c) Testul CAMP Se insamanteaza fiecare din culturile de Staphylococcus aureus si Rhodococcus equi in striuri longitudinale paralele, pe suprafata mediului agar cu sange de berbec. Este necesar ca inoculul sa fie uniform si putin dens. Acesta se poate obtine pozitionand ansa bacteriologica in unghi drept fata de agar la prelevarea culturii. In mod asemanator, se insaminteaza tulpina de testat, in unghi drept fata de aceste culturi, astfel incat cultura de testat si culturile de S. aureus si R. equi sa nu se atinga, dar punctele lor cele mai apropiate sa fie la distanta de 1- 2 mm. Pe aceeasi placa pot fi insamantate mai multe tulpini de testat. Simultan, se insamanteaza culturile martor de L. monocytogenes, L. innocua si L. ivanovii. Daca se foloseste agarul cu sange, placile se incubeaza placile la 35 sau la 37oC, timp de 18 h - 24 h. Daca se folosesc placile cu strat dublu, acestea se incubeaza la 35 sau la 37oC, timp de 12 - 18 h. O zona accentuata de β-hemoliza la intersectia tulpinii de testat cu culturile de S. aureus si R. equi se considera a fi o reactie pozitiva. Reactia pozitiva cu R. equi apare ca o zona lata de hemoliza (5 - 10 mm), sub forma de „cap de sageata“. Reactia se considera negativa daca o zona de hemoliza slaba se extinde numai aproximativ la 1 mm de la intersectia tulpinii de testat cu zona culturii de R. equi. O reactie pozitiva cu S. aureus apare ca o zona mica de hemoliza accentuata, care se intinde numai aproximativ 3 - 4 mm de la tulpina de testat si in zona de hemoliza slaba data de dezvoltarea culturii de S. aureus. Zonele mari de βhemoliza nu apar in aria apropiata dintre S. aureus si L. monocytogenes. Interpretarea proprietatilor morfologice si fiziologice si a reactiilor biochimice Listeria moncytogenes: -produce hemoliza - produce acid din ramnoza si xiloza - testul CAMP: S. aureus + si R. equi – Confirmarea definitiva Tulpinile considerate a fi L. monocytogenes pot fi trimise la un laborator de referinta pentru Listeria, recunoscut pentru posibilitatea tipizarii serologice sau lizogenice sau 53

pentru o metoda de tipizare moleculara acceptata. Trimiterea trebuie insotita de toate informatiile posibile care privesc tulpina(-ile). Exprimarea rezultatelor cantitative a) Se calculeaza pentru fiecare placa numarul de colonii de L. monocytogenes, folosind urmatoarea relatie: b A=— xC A b : nr. colonii confirmate A: nr. colonii luate in lucru pentru confirmare C: nr. total de colonii caracteristice numarate in placa. b) Pentru placile care contin mai putin de 150 colonii de L. monocytogenes, din care una contine cel putin 15 colonii de L. monocytogenes, se calculeaza numarul, N, de celule L. monocytogenes prezent in 1 ml sau 1 g de produs: ∑a N=

, in care: V (n1 + 0,1 n2) ∙ d

∑a: suma coloniilor de L. monocytogenes, calculata dupa confirmare, din toate placile retinute la doua dilutii consecutive, din care cel putin una contine minimum 15 colonii identificate. V: volumul inoculului insamantat in fiecare placa, in mililitri; n1: numarul de placi retinute la prima dilutie; n2: numarul de placi retinute la a doua dilutie; d: factorul de dilutie care corespunde primei dilutii retinute. Rezultatul numarului de L. monocytogenes pe ml (produse lichide) sau pe gram (alte produse) este exprimat ca un numar cuprins intre 1,0 si 9,9 multiplicat cu 10 x. c) Daca cele doua placi insamantate cu suspensie initiala contin mai putin de 15 colonii de L. monocytogenes, se calculeaza numarul de colonii confirmate din fiecare placa, folosind relatia data mai sus. Se calculeaza media artimetica, y, a coloniilor numarate in doua placi, iar numarul estimat, N E de L.

54

monocytogenes pe gram sau pe mililitru se exprima cu ajutorul formulei: y NE = —, in care: dxV d: factorul de dilutie al suspensiei initiale; V: volumul de inocul din fiecare placa. d) Daca cele doua placi însamanţate cu suspensia initiala nu contin nici o colonie, rezultatul se exprima astfel: –

mai putin de A 1/d x v L. monocytogenes pe gram sau pe mililitru, in care: d: factorul de dilutie al suspensiei initiale; V: volumul de inocul din fiecare placa

2.12. Determinarea numarului total de enterobacterii Metoda prezentata in continuare pentru determinarea numarului total de enterobacterii din produsele alimentare si de pe suprafetele de lucru sau suprafata carcaselor foloseste ca documente de referinta SR ISO 21528-2 /2007; SR ISO 18593/2007. Principiu. Enterobacterile sunt microorganisme ce formeaza colonii caracteristice pe mediul solid agar VRBG, fermenteaza glucoza si sunt oxidaza negative. Se stabileste numarul de enterobacterii din proba de analizat, prin incorporarea unei cantitati de proba in mediul solid si incubare la 37 sau la 30 o C , timp de 24 ± 2 h. Se numara coloniile crescute si se raporteaza la 1 ml sau la 1g produs. Se stabileste gradul de contaminare cu enterobacterii a unei suprafete de lucru sau care intra in contact cu alimentele prin stergerea cu ajutorul tampoanelor din bumbac a unei suprafete de 100 cm2, marcata cu un sablon steril dupa care se introduc in 10 ml ser fiziologic peptonat cu 0,1 % agar. Din dilutie se incorporeaza cate 1 ml in medii solide si se incubeaza la 37 ±0,1o C in aerobioza. Se numara coloniile crescute si se raporteaza la 1 cm2. Aparatura si materiale necesare - termostat reglabil la 37 ±1o C - baie de apa pentru topirea mediilor - lupa cu putere de marire de 3 ori 55

- pipete de diferite capacitati, sterile - placi Petri cu Ø 10 mm, sterile - balanta tehnica - eprubete de 16 x 160 mm, sterile - vata - alcool sanitar - foarfeci, pense, spatula - pH-metru - omogenizator Medii de cultura si diluanti - ser fiziologic peptonat 0,1% agar (8,5 g NaCl, 1 g triptona-cazeina-peptona, 0,1% agar, 1000 ml apa distilata) - agar glucoza-bila-rosu violet (VRBG) - agar nutritiv - agar glucozat - Reactiv pentru oxidază Recoltarea probelor de sanitatie Recoltarea cu tamponul Probele trebuie recoltate cu tampoane din bumbac umezite într-un 1 ml solutie 0,1% NaCl peptona (8,5 g NaCl, 1 g triptona – cazeina – peptona, 0,1% agar si 1000 ml apa distilata) de pe o suprafata, de preferinta de 100 cm 2, marcata cu sablon steril; pentru tampoane trebuie adaugata o cantitate de 30 g / l Tween 80 si 3 g / l lecitina (sau alte produse cu un efect similar). Pentru zonele umede pot fi suficiente tampoanele din bumbac uscate. Tampoanele trebuie manipulate cu pense sterile sau eprubete cu tampoane prevazute cu tije. Suprafata de pe care se face recoltarea trebuie stearsa de 10 ori vertical, de sus in jos, apoi orizontal si pe diagonala, aplicand o presiune ferma pe suprafata. Tampoanele trebuie sa fie colectate intr-un recipient ce contine 10 ml apa peptonata tamponata cu solutie salina 0,1% agar. Probele recoltate cu tamponul trebuie refrigerate la temperatura de 4o C pana la prelucrarea ulterioara. Recipientul trebuie agitat puternic inainte de insamantarea pe medii de cultura. 56

Prelevarea de probe la carcase Pentru evaluarea bacteriologica a suprafetei carcaselor prin metoda distructiva trebuie obtinute 4 probe de tesut de la carcase, reprezentand un total minim 20 cm2, prelavate dupa toaletare. Aceasta operatiune trebuie efectuata inainte de inceperea procesului de racire. Portiunile de tesut pot fi obtinute de la carcase, folosindu-se un dispozitiv steril (2,5cm) sau prin decuparea unui lambou cu dimensiunea de minim 5 cm 2 si maximum 5 mm grosime. In abator probele trebuie introduse, in conditii asptice, intr-un container pentru probe sau intr-o punga din plastic. Pentru controlul procesarii se vor utiliza de regula urmatoarele locuri de recoltare a probelor: (i)

Vită: gât, piept, flanc, coapsa

(ii)

Oaie, capra: flanc, torace lateral si piept

(iii)

Porc: spate, gusa, pulpa si piept

(iv)

Cal: flanc, piept, spate si coapsa Probele recoltate prin metoda distructiva si tampoanele trebuie pastrate la o temperatura de refrigerare de 4o C pana la examinare. Ele trebuie trimise la laborator in maxim 2 ore de la recoltare. Pregatirea probelor pentru analiza, a suspensiei initiale si dilutiilor zecimale se face conform SR EN ISO 6887 – 4 / 2005 Insamantarea Din produsele lichide si din fiecare dilutie obtinuta se insamanteaza in cate 2 placi Petri cate 1 ml. Se adauga 15 ml mediu solid (VRBG) in fiecare placa. Din lichidul de eprubete cu tampoane si pentru fiecare dilutie obtinuta se insamanteaza cate 1 ml, in paralel in cate doua placi Petri, din fiecare dilutie. In fiecare placa se introduc aseptic cate 15 ml agar glucoza, bila si rosu violet (VRBG) topit si racit la 45 ± 0.5o C, apoi se omogenizeaza continutul placii Petri prin miscari de rotatie alternate cu miscari perpendiculare pe diametrul placii si se lasa in repaus pana la solidificarea mediului. Daca lambourile sunt mai mari de 20 cm2 in total, se recolteaza aseptic cate 5 cm2 din fiecare lambou, care vor fi transferate intr-un omogenizator sau mojar mare cu 20 ml 57

mediu de dilutie (0,1 % apa petonata tamponata, 0,9 % solutie clorura de sodiu). Pentru lucru se vor efectua dilutii zecimale seriale in diluant 0,1 % peptona + 0,85 % NaCl. 1 ml din omogenizatul de carne reprezinta 1 cm2. Din fiecare dilutie se insamanteaza cate 1 ml in doua placi Petri in paralel. In fiecare placa se introduc aseptic cate 15 ml VRBG, topit si racit la 45 ± 0.5 o C, apoi se omogenizeaza continutul placii Petri prin miscari de rotatie alternate cu miscari perpendiculare pe diametrul placii si se lasa in repaus pana la solidificarea mediului, Incubarea se realizeaza la 37 ± 1o C, 24 h. Numararea si selectarea coloniilor pentru confirmare Coloniiile caracteristice sunt roz spre rosu sau purpurii cu sau fara halou de precipitare. Se selecteaza placile ce contin mai putin de 150 colonii. Se aleg apoi 5 colonii caracteristice pentru testele de confirmare metabolică, care se paseaza pe placile cu agar nutritiv (cate o colonie pe cate o placa) . Se incubeaza la 37 o C, timp de 24 h. Se selecteaza o colonie bine izolata din fiecare dintre cele 5 placi incubate pentru testele de confirmare metabolică. Confirmarea metabolică (biochimică) a) Reactia oxidazei Se preleveaza o portiune din fiecare colonie bine izolata folosind o ansa sau o bagheta de sticla si se depune pe o hartie de filtru imbibata cu reactiv de oxidaza sau pe un disc comercial. Daca culoarea hartiei de filtru nu vireaza in negru in 10 secunde, reactia este negativa. b) Testul fermentarii glucozei Cu ansa, se preleveaza o portiune dintr-o colonie negativa pentru reacţia oxidazei. Se insamanteaza in eprubete cu agar glucozat. Se incubeaza la 37o C, timp de 24 h. Dezvoltarea culorii galbene in eprubetele insamantate indica o reactie pozitiva. c) Interpretarea testelor biochimice Coloniile negative pentru testul oxidaza si pozitive pentru fermentarea glucozei sunt confirmate ca enterobacterii. 58

Exprimarea rezultatelor: Numarul de enterobacterii din proba de calculeaza dupa formula: Σc N=

, in care: (n1+0,1n2)d

N = numarul de microorganisme pe gram sau pe cm2; Σc = suma coloniilor numarate in toate placile retinute; n1 = numarul de placi retinute din prima dilutie; n2 = numarul de placi retinute din a doua dilutie; d = factorul de dilutie corespunzator primei dilutii. Exprimarea rezultatelor pentru suprafata carcaselor. Media zilnica a valorilor logaritmice a minim 5 carcase (log10 pentru fiecare rezultat individual al testului si apoi se calculeaza media aritmetica a acestor valori logaritmice).

59