290115381 Laporan Praktikum Flowcytometry

LAPORAN PRAKTIKUM INSTRUMEN DAN TEKNOLOGI ANALISIS FLOWCYTOMETRY PEMERIKSAAN SEL T CD4 dan CD8

Oleh : Yulia Dwi Setia NIM 156070100111002

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA 2015

PENDAHULUAN a. Dasar Teori Metode flow cytometry adalah teknik untuk mengukur sel yang memiliki berbagai karakteristik atau molekul di permukaan maupun di dalam sitoplasma pada suspensi sel. Metode ini dilakukan dengan cara mengamati bagaimana sel tersebut mengalir di dalam cairan. Molekul yang menjadi target tersebut biasanya diikat dengan antibodi monoklonal yang berlabel fluorokrom tertentu. Kemudian sel dilewatkan celah sempit, dan ditembak sinar. Pada suatu populasi sel yang sejenis, misal pada sel kanker yang diberi perlakuan suatu senyawa sitotoksik, dapat dilakukan analisis terhadap fase - fase daur sel, sel apoptosis, serta sel yang mengalami poliploidi. b. Tujuan kegiatan 1. Memahami prinsip kerja teknik Flowcytometry 2. Mampu melakukan pemeriksaan sel CD4 dan CD8 3. Mampu menentukan jumlah sel yang memiliki CD4 dan CD8 pada sample. c. Pelaksanaan Kegiatan Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Biomedik FKUB pada tanggal 28 September 2015 pukul 09.40 – 12.00 d. Alat dan Bahan : a) Tabung sentrifus 1,5 ml b) Sentrifuge dingin c) Micropipet d) Kuvet fcm e) Vacutainer EDTA f) Swing centrifugated g) Ficoll Hipaque h) Phospat Buffer Salin i) Sample darah j) Antibodi sel surface marker k) Larutan sel staining buffer

e. Prosedur kerja a)

Semua bahan yang diperlukan dikeluarkan dari lemari pendingin dan dibiarkan sampai suhu ruang

b)

Menyiapkan tabung sentrifuse 15 ml dan diisi dengan Ficoll Hipafique d = 1,077 g/mL sebanyak 2,5 mL

c)

Sampel darah dalam vacutainer EDTA yang akan diuji diambil dengan micropippete dan disalutkan secara perlahan pada dinding tabung sentrifus sehingga terbentuk 2 lapisan

d)

Mensentrifuse dengan kecepatan 1600 rpm selama 30 menit dalam suhu ruang

e)

Setelah disentrifuse akan terpisah menjadi 5 lapisan, yaitu plasma, sel PBMC, Ficoll, granulosit dan sel darah merah

Plasma Sel PBMC Ficoll Granulosit Sel darah merah

f)

Cincin Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) yang terbentuk diambil secara perlahan menggunakan micropippete dan diletakkan dalam botol sentrifuse 15 mL yang baru

g)

Larutan PBMC dicuci dengan PBS hingga 10 mL dan disentrifuse suhu ruang dengan kecepatan 1200 rpm selama 10 menit. Pencucian ini dilakukan sebanyak 2 kali

h)

Pelet yang terbentuk dicuci dengan sel staining buffer (2% Fetal Bovine Serum (FBS) dalamPBS) 1 kali

i)

Divortex, kemudian disentrifuse pada suhu 4°C 2500 rpm selama 3 menit

j)

Supernatan dibuang dan pelet sel yang terbentuk siap untuk distaining dengan antibodi surface marker (2,5µL FITC CD4 ditambah 2,5µL PE CD8 diencerkan dengan 45µL sel staining buffer)

k)

Pelet sel dicampurkan dengan antibodi surface marker yang telah diencerkan

l)

Diinkubasi 20 menit dalam gelap di suhu ruang

m)

Setelah diinkubasi ditambahkan sel staining buffer kurang lebih 300µL

n)

Dipindahkan ke kuvet baca dan siap untuk dibaca dengan flowcytometry

HASIL

a.

Grafik pencar (scatter) pada sample PBMC

Keterangan : Gate (terdapat lingkaran) pada scatter di atas menunjukkan sel limfosit b. Persentase gate limfosit

c. Grafik pencar (scatter) pada populasi sel limfosit T

d. Persentase pada populasi sel limfosit T

Keterangan : yang merupakan sel yang hanya memiliki CD4 tanpa CD8 ditunjukkan pada persentase kuadran kanan bawah (LR), untuk sel yanghanya memiliki CD8 tanpa CD4 ditunjukkan pada persentase kuadran kiri atas (UL). Sedangkan sel yang memiliki marker CD4 dan CD8 ditunjukkan pada kuadran kanan atas (UR). PEMBAHASAN

Pada grafik pencar (scatter) sample PBMC, sumbu x menunjukkan ukuran sel, sedangkan sumbu y menunjukkan kompleksitas dari sel. Pada sumbu x, semakin ke kanan, maka ukuran sel semakin besar. Sedangkan pada sumbu y, semakin ke atas maka kompleksitas sel semakin tinggi, yang dapat pula diartikan bahwa semakin ke atas maka semakin tinggi granularitas sel tersebut. Berdasarkan ukuran dan tingkat granularitasnya, sel yang paling besar dan memiliki banyak granul adalah sel makrofag. Sel terbesar dan tingkat granular yang tinggi kedua adalah monosit, di bawahnya lagi adalah sel limfosit. Untuk ukuran yang lebih kecil lagi dan tidak bergranul atau kompleksitasnya rendah merupakan sel yang telah mati atau debris – debris. Jadi, populasi yang ditandai (gate) pada grafik pencar (scatter) sample whole blood menunjukkan populasi sel limfosit. Dari data tersebut dapat diketahui bahwa terdapat 55,61% sel limfosit dari 24367 event yang direkam pada alat flowcytometry. Dari gate tersebut kita dapat menganalisa banyaknya sel yang memiliki permukaan CD4 dan atau CD8. Pada grafik pencar (scatter) pada populasi sel limfosit T, sumbu x menunjukkan penanda permukaan CD4, sedangkan sumbu y menunjukkan penanda permukaan CD8. Grafik tersebut dibagi menjadi empat kuadran, yaitu kuadran kiri atas (UL), kanan atas (UR), Kuadran kiri bawah (LL), dan kuadran kanan bawah (LR). Sel yang memiliki CD4 tanpa CD8 ditunjukkan pada persentase kuadran kanan bawah (LR), untuk sel yang memiliki CD8 tanpa CD4 ditunjukkan pada persentase kuadran kiri atas (UL). Sedangkan sel yang memiliki marker CD4 dan CD8 ditunjukkan pada kuadran kanan atas (UR). Dari tabel persentase dapat diketahui bahwa sel limfosit T yang hanya memiliki CD4 sebanyak 36,05% dari keseluruhan sel limfosit dan 20,05% dari keseluruhan sel PBMC. Sedangkan sel limfosit yang hanya memiliki CD8 sebanyak 24,25% dari keseluruhan sel limfosit dan 13,6% dari keseluruhan sel PBMC. Sel yang memiliki CD4 dan CD8 sebanyak 0,50% dari keseluruhan sel limfosit dan 0,28% dari keseluruhan sel PBMC.

Pemeriksaan pemeriksaan flowcytometry hanya bisa didapatkan presentase saja, untuk jumlah absolut dari sel yang diperiksa diperlukan pemeriksaan differential count atau penghitungan sel PBMC menggunakan kamar hitung.KESIMPULAN DAN SARAN a) Kesimpulan -

Prinsip kerja pemeriksaan flowcytometry pada praktikum ini adalah mengukur sel PBMC yang memiliki molekul CD4 dan CD8 di permukaan sel yang telah diikat dengan antibodi monoklonal yang berlabel fluorokrom tertentu. Kemudian sel

-

dilewatkan celah sempit, dan ditembak sinar laser. Dari tabel persentase dapat diketahui bahwa sel limfosit T yang hanya memiliki CD4 sebanyak 36,05% dari keseluruhan sel limfosit dan 20,05% dari keseluruhan sel PBMC. Sedangkan sel limfosit yang hanya memiliki CD8 sebanyak 24,25% dari keseluruhan sel limfosit dan 13,6% dari keseluruhan sel PBMC. Sel yang memiliki CD4 dan CD8 sebanyak 0,50% dari keseluruhan sel limfosit dan 0,28% dari keseluruhan sel PBMC.

b) Saran -

Pemeriksaan pemeriksaan flowcytometry hanya bisa didapatkan presentase saja, untuk jumlah absolut dari sel yang diperiksa diperlukan pemeriksaan differential count atau penghitungan sel PBMC menggunakan kamar hitung.