28 ava Edición HARPER BIOQUIMICA ILUSTRADA

28 ava Edición HARPER BIOQUIMICA ILUSTRADA CAPITULO 7 ENZIMAS: Mecanismos de acción IMPORTANCIA BIOMEDICA Las enzimas catalizan las reacciones químicas que hacen posible la vida, esenciales para la desintegración de nutrientes y en proporcionar energía. La valoración de la actividad de enzimas especificas ayuda al diagnostico y pronostico de enfermedades. La deficiencia de enzima (cantidad, actividad y/o estructura) puede ser producto de defectos genéticos, déficit nutricional, toxinas, mutaciones genéticas, enfermedades por virus o bacterias patógenas. Sus impresionantes características y funciones de las enzimas le permiten desempeñar funciones claves en procesos relacionados con la salud y el bienestar de seres humanos La estereoespecificidad absoluta de enzimas le permiten intervenir en síntesis de un fármaco o antibiótico. Importante en la producción y en el aumento del valor nutricional de los alimentos. LAS ENZIMAS SON CATALIZADORES EFICACES Y MUY ESPECIFICOS Las enzimas son muy eficientes y son catalizadores en extremo selectivos. Son especificas para el tipo de reacción catalizada y también para el sustrato, sea único o un pequeño conjunto estrechamente relacionados. La especificidad extrema le da a las células vivas la capacidad para conducir y controlar un gran número de procesos químicos LAS ENZIMAS SE CLASIFICAN POR EL TIPO DE REACCION Es necesario identificar el nombre para indicar el sustrato, La fuente de la enzima, su regulación o una característica de su mecanismo de acción, y la numeración alfanumérica para indicar las diferentes formas de enzimas La IUB (International Unión of biochemist s) creó un sistema de nomenclatura de enzima: con nombre, numero y código singular. Las Enzimas son divididas en 6 clases: Oxidorreductasas catalizan oxidaciones y reducciones Transferasas catalizan la transferencia de porciones, como grupos glucosilo, metilo o fosforilo. Hidrolasas catalizan la división hidroliticas del C-C, C-O, C-N y otros enlaces

Liasas catalizan la división C-C, C-O, C-N y otros enlaces mediante eliminación de átomo, dejando dobles enlaces Isomerasas catalizan cambios geométricos o estructurales dentro de una molécula Ligasas catalizan la unión de 2 moléculas acopladas a la hidrólisis de ATP Por la complejidad del nombre del sistema de la IUB aun se sigue usando los nombres tradicionales (reacción catalizada – “asa”) LOS GRUPOS PROSTETICOS, LOS COFACTORES Y LAS COENZIMAS TIENEN FUNCIONES IMPORTANTES EN LA CATALISIS Los grupos prostéticos, los cofactores y coenzimas son moléculas (no proteínicas) y iones metálicos que participan en la catálisis, o unión de sustrato, directamente Los grupos prostéticos están estrechamente integrados en la estructura de una enzima Los grupos prostéticos se caracterizan por su unión estrecha y estable hacia una proteína (fuerzas covalentes o no covalentes) Los metales (Co, Cu, Mg, Mn y Zn) son los más comunes, e importantes porque Facilitan unión y orientación de sustratos, Forman enlaces covalentes, Aumentan carácter electrofílico o nucleofílico Los cofactores se asocian de manera reversible con enzimas o sustratos Los cofactores tienen unión transitoria o disociable a la enzima o a sustrato, esta ultima requiere de cofactores en su medio para la Catálisis. Los más comunes son iones metálicos que denominan a la enzima como “enzimas activadas por metal”. Las coenzimas sirven como transbordadores de sustratos Las coenzimas transportan sustratos, también grupos metilos o acilos y oligosacaridos, desde su generación hasta su utilización, la asociación entre ambas moléculas le da estabilidad al sustrato. Muchas coenzimas, cofactores y grupos prostéticos son derivados de vitamina B La vit. B proporciona componentes importantes de muchas coenzimas. Mayoría de coenzimas.- contiene adenina, ribosa y fosforilo de AMP y ADP Coenzimas Redox.- contiene nicotinamida en NAD y NADP y riboflavina en FMN y FAD En el metabolismo de un “C” funcionan las coenzimas acido fólico y cobalamina LA CATALISIS OCURRE EN EL SITIO ACTIVO El complejo enzima-sustrato se asemeja a una cerradura mecánica con la llave apropiada; esta cerradura recibe el nombre de Sitio Activo (hendidura o bolsa en la superficie). El sitio activo protege a los sustratos de solvente y facilita la catálisis. Ambos se encuentran estrechamente unidos, los cofactores y grupos prostéticos catalizan su transformación a producto

LAS ENZIMAS EMPLEAN MULTIPLES MECANISMOS PARA FACILITAR LA CATALISIS Emplean diversas combinaciones de 4 mecanismos generales y logran un aumento catalítico notorio. Catálisis por proximidad Para su reacción deben de estar a la distancia formadora de enlace. A mayor concentración, mayor es el índice de su reacción. La unión enzima-sustrato crea una región de concentración local alta de sustrato, este ambiente produce aumentos del índice de al menos 1000 veces. Catálisis Acido-básica Puede ser especifica (protones o iones) o general . La catálisis especifica por acido o base, es sensible el índice de reacción a cambios de la concentración de protones (independiente de otros ácidos o bases presentes) En la catálisis general los índices responden a todos los ácidos y bases presentes. Catálisis por tensión En reacciones –líticas la ruptura de un enlace covalente se une a su sustrato provocando la división del enlace, imitando al intermediario de estado de transición (punto ½ de sustrato a producto). La tensión estira el enlace, lo debilita y luego se divide. El estado de transición es aprovechado por los químicos para crear inhibidores más eficaces (análogos de estado de transición) como farmacóforos potenciales. Catálisis Covalente Formación de enlace covalente entre la enzima y uno o más sustratos. Observada en transferencia de grupo. En la catálisis covalente la energía de activación es más baja y más rápida que la reacción en solución homogénea, pero la modificación química enzimática en transitoria, uan vez completada la reacción, vuelve a su estado original (función permanece catalítica). LOS SUSTRATOS INDUCEN CAMBIOS CONFORMACIONALES EN ENZIMAS Daniel Koshland dice que los sustratos inducen un Cambio Conformacional en la enzima posterior a su unión. La enzima y su sustrato inducen cambios recíprocos y aprovecha la energía de unión para transformar sustrato en producto LA PROTEASA DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) ILUSTRA LA CATALISIS ACIDOBASICA La catálisis comprende 2 residuos aspartilo conservados, que actúan como cataliicos acido básicos.

1era etapa de la reacción un aspartato (base) extrae un protón de la molécula de agua, lo que la hace más nucleofílica. El nucleofilo resusltante ataca al carbono carbonilo electrofílico del enlace peptídico, formando un intermediario de transición tetraédrico. El 2do aspartarto facilita la descomposición de este último al donar un protón al grupo amino producido por la rotura del enlace peptidico. LA QUIMOTRIPSINA Y LA FRUCTOSA – 2,6 – BISFOSFATASA ILUSTRAN LA CATALISIS COVALENTE Quimotripsina La catálisis por la serina proteasa quimotripsina comprende la formación previa de un intermediario de enzima acilo covalente. Un residuo serilo muy reactivo, la srina 195, participa en una red de transmisión de carga con histidina 57 y aspartato 102 – His 57 – Ser 195, constituye una “red de transmisión de carga” que funciona como un “Transbordador de protón”. Fructosa – 2,6 – bifosfatasa Enzima reguladora de la gluconeogénesis y cataliza la liberación hidrolítica del fosfato en el carbono 2 de la fructosa – 2,6 – bifosfato. LOS RESIDUOS CATALÍTICOS ESTAN MUY CONSERVADOS todas las familias de enzimas surgieron de la duplicación de genes, estas proteínas luego evolucionan independientes y reconocen diferentes sustrato. Ejm: La quimotripsina que desdobla enlaces peptídicos en el lado carboxilo terminal al igual que la Tripsina, la 1era de aminoácido hidrofobicos y la otra de aminoácidos básicos. La presencia de aminoácidos específicos en la misma posición de cada miembro familiar se les llamaba residuos conservados. LAS ISOZIMAS SON NFORMAS DE ENZIMA DISTINTA QUE CATALIZAN LA MISMA REACCION Los organismos superiores varias versiones de una enzima, pero cada una cataliza la misma reacción. Estas isozimas surgen por medio de duplicación de gen y se diferencian de manera sutil por: Sensibilidad a factores reguladores particulares y Afinidad a sustrato que las adapta a tejidos Aumenta la supervivencia con copia de “respaldo” de una enzima esencial LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DE ENZIMAS FACILITA SU DETECCIÓN La baja concentración de enzimas presentes en célula determinan su presencia, pero su rapidez para transformar miles de sustratos en productos permite revelar presencia de la enzima. El índice de reacción catalítica es proporcional a la cantidad de enzima q permite conocer su concentración.

Enzimología de molécula única La nanotecnología ha hecho posible observar (microscopia de influorescencia) catálisis por enzima o molecula de sustrato individual. Ahora es posible medir el índice de eventos catalíticos únicos, incluso los pasos individuales en la catálisis mediante enzimología de molécula única. EL DESCUBRIMIENTO DE FARMACOS REQUIERE VALORACIONES ENZIMÁTICAS IDONEAS PARA INVESTIGACIÓN DE “ALTA CAPACIDAD DE PROCESAMIENTO” Las enzimas están dirigidas para la creación de fármacos y otros agentes terapéuticos. Es mucho más fácil descubrir nuevos fármacos cuando se valora gran número de farmacóforos potenciales rápido y automatizado, proceso denominado investigación de alta capacidad de procesamiento aprovechando los grandes avances recientes. Esta investigación es ideal para analizar los muchos productos de química combinacional. Este complejo equipo solo está disponible casa farmacéuticas, laboratorio patrocinado por gobiernoy universidades de investigación cuyo principal uso es el análisis de compuestos inhibitorios con potencial final para uso como fármacos. Inmuno análisis ligado a enzima El análisis inmunosorbente ligado a enizima( ELISA) se usan anticuerpos enlazados (covalente) con una “enzima reportera”. El suero o muestra biológica se coloca en la placa de microtitulación de plástico, las proteínas se inmovilizan en la superficie del plástico. Se añade proteína no antigénica (albumina de suero bovino) y bloquea las areas absorbente del pozo, luego se añaden los anticuerpos covalente con enzima reportera, los anticuerpos de pegan en el antígeno y ambos se inmovilizan. Presencia y cantidad de anticuerpo unido luego de añadir sustrato a la enzima reportera Las deshidrogenasas dependientes de NAD(P) son valoradas de manera espectrofotométrica En valoraciones espectrofotométricas se determina la capacidad de un sustrato o producto para absorber luz. Las coenzimas NAD(P)H absorben luz a 340nm, cuando el NAD(P) se reduce, la basorvancia aumenta con la cantidad de NAD(P)H producida. A una deshidrogenasa que cataliza que cataliza la NAD(P)H se obsevara un decremento de absorbancia . En cada caso el índice de cambio de la densidad óptica sera proporcional a la cantidad de enzima presente. _______________________________________________________________________________ Muchas enzimas son valoradas mediante acoplamiento a una deshidrogenasa Hay valoraciones difíciles de realizar porque no producen un cambio de absorbancia o fluorescencia. Las alternativas serian obtener: un compuesto fácil de detectar, o un producto que absorbe luz o muestra fluorescencia.

El más común es una Valoración “Acoplada”.- generalmente una Deshidrogenasa cuyo sustrato (producto de la enzima de interés) está en exceso catalítico. El índice de aparición o desaparición de NAD(P)H depende del índice de la reacción enzimática a la cual se ha acoplado la hidrogenasa. EL ANALISIS DE CIERTAS ENZIMAS AYUDA AL DIAGNOSTICO La presencia de enzimas en el plasma sanguíneo y su posterior análisis cuantitativo son fundamentales para el diagnostico de procesos morbosos, es decir, estas enzimas que son liberadas hacia el plasma después de muerte o lesión celular, son importantes porque su aparición o concentración son útiles para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades y lesiones (tejidos específicos) y la respuesta al tratamiento. Análisis de la actividad enzimática.- hecho por valoraciones cinéticas estándar de índices de reacción inicial. Radioinmunovaloraciones (RIA).- cuantificación de la cantidad absoluta de una enzima o de proteína no catalítica. Enzima Sérica Aspartato aminotransferasa (AST o SGOT) Alanina aminotransferasa (ALT o SGPT) Amilasa Ceruloplasmina Creatina cinasa - Glutamil transferasa Isozima 5 de la lactato deshidrogenasa Lipasa Fosfatasa ácida Fosfatasa alcalina (isozimas)

Principal uso Diagnostico Infarto de miocardio Hepatitis viral Pancreatitis aguda Degeneración hepatolenticular (enfermedad de Wilson) Trastornos musculares e infarto de miocardio Diversas enfermedades hepáticas Enfermedades hepáticas Pancreatitis aguda Carcinoma metastásico de la próstata Diversos trastornos óseos, enfermedades hepáticas obstructivas

Las enzimas ayudan al diagnóstico de infarto de miocardio (MI) En enzimología diagnóstica las enzimas: Deben ser especificas para el tejido u órgano bajo estudio, Presencia en plasma o cualquier liquido en el momento justo para el diagnóstico (ventana diagnóstica) y Factible a la valoración automatizada. Para el diagnóstico de M.I las 1eras enzimas usadas fueron el Aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y Lactato deshidrogenasa (LDH). AST y ALT no ayudaron por no ser específica del musculo cardiaco, sin embargo la LDH tiene ventaja de especificidad hística como una consecuencia de su estructura cuaternaria. La Cratina Cinasa (CK) tiene 3 isozimas: CK-MM (músculo estriado), CK-BB (cerebro), y CK-MB (corazón y músculo estriado), esta ultima tiene una ventana diagnóstica útil, aparece en el transcurso de 4 a 6 h luego de un M.I, alcanza máximo a 24 h y regresa a basal de 48 – 72 h.

Para diagnóstico de M.I la CK se ha complementado mediante la troponina, esta última implicada en la contracción muscular en los musculos estriados y cardiacos. La concentración de troponinas aumenta de 2 a 6 h luego de un M.I o cualquier daño al musculo cardia y permanecen de 4 a 10 días. El activador de plasminógeno hístico (tPA) o la estreptocinasa se usan en tratamiento de M.I agudo, y la tripsina en fibrosis quística. LAS ENZIMAS FACILITAN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS E INFECCIOSAS La especificidad y eficiencia de las enzimas es aprovechada en técnicas diagnósticas para actuar sobre oligonucleótidos como el DNA. La endonucleasa de restricción divide (sitios específicos) el DNA bicatenario en sitios de restricción (secuencia de pares de bases) que son pequeños fragmentos característicos de DNA. Polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) son desviaciones del modelo que ocurren por mutación que deja al sitio de restricción irreconocible para su endonucleasa. El RFLP facilita la detección prenatal de diversos trastornos hereditarios (rasgo de cel. Falciformes, fenilcetonuria en lactantes y enfermedad de Huntington). En la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se emplea una DNA polimerasa para producir miles de copias de un segmento de DNA a partir de pequeñas cantidades de material. Por eso la PCR es usada por científicos médicos, biólogos y forenses para caracterizar DNA de cifras iniciales bajas, también puede usarse para detectar e identificar agentes patógenos o parásitos por medio de amplificación selectiva de su DNA. EL DNA RECOMBINANTE CONSTITUYE UN IMPORTANTE RECURSO PARA ESTUDIAR ENZIMAS A fin de examinar su estructura y funciones se desea el aislamiento de una enzima individual pero es una tarea extremo difícil entre tantas proteínas existentes en la célula. No todas las proteínas animales pueden expresarse de forma activa en células microbianas, ni estos pueden tampoco realizar procesamiento postraduccional. Empleando el vector de expresión baculovirus para transformar células de insectos cultivadas, puede expresar un gen. Las proteínas de función recombinantes se purifican mediantes cromatografía de afinidad El gen de interés se enlaza a una secuencia de olgonucleotidos que codifica una extensión carboxilo o amino terminal para la proteína codificada. La Proteina de fusión o modificada contiene un dominio exacto para interactuar con un soporte de afinidad específico. Las proteínas de fusión codifican también para un sitio de división para una proteasa muy específica (trombina), en la región que enlaza las 2 porciones de la proteína permitiendo la eliminación del dominio de fusión añadido después de purificación de afinidad. La mutagénesis dirigida hacia sitio proporciona información mecanicista. La mutagénesis dirigida hacia sitio permite cambiar residuos aminoacilos específicos al alterar sus codones, este método facilita la identificación de las funciones específicas de residuos aminoacilos dados en la unión a sustrato y la catálisis.

CAPITULO 8 ENZIMAS: CINÉTICA IMPORTANCIA BIOMEDICA La cinética enzimática permite la medición cuantitativa de los índices de reacciones catalizadas por enzimas y del estudio de factores que afectan estos índices. La comprensión de la cinética enzimática es importante para entender de que modo los estados de estrés fisiológico o agentes farmacológicos afectan la homeostasis. En casi todos los procesos fisiológicos participan las enzimas por eso son objetivo de fármacos. La cinética enzimática aplicada permite identificar y caracterizar agentes terapéuticos que inhiben selectivamente los índices de procesos catalizados por enzimas específicas; importante para el descubrimiento y modo de acción del fármaco. LAS REACCIONES QUÍMICA SE DESCRIBEN USANDO ECUACIONES BALANCEADAS Especies químicas iniciales (sustrato) y nuevas especies químicas (producto).

La doble flecha indica reversibilidad (A y B forman P y Q pero también P y Q pueden formar A y B) Por eso la designación es un poco arbitraria debido a que los productos en una reacción son los sustratos para la reacción inversa. El termino productos se emplea para los reactivos cuya formación fue favorecida por la termodinámica, en estos casos solo se usa un flecha como si fuese “irreversible”

Este tipo de reacción sucede en células vivas donde el producto es consumido de inmediato por una reacción subsiguiente lo cual impide la reacción inversa, entonces la hace “irreversible” desde el punto de vista funcional en condiciones fisiológicas. LOS CAMBIOS DE LA ENERGÍA LIBRE DETERMINAN LA DIRECCIÓN Y EL ESTADO DE EQUILIBRIO DE REACCIONES QUÍMICAS El cambio o variación de la Energía libre de Gibbs (

G) en una reacción química es igual a la

suma de las energías libres de la formación de productos ( libres de la formación de sustratos ( Si la

Gp) menos la suma de las energías

Gs)

G en una reacción es negativa se deduce que favorece de izquierda a derecha, es decir

que es Espontanea. El signo y la magnitud de

G determina que tan lejos procederá la reacción

Relación entre la constante de equilibrio (Keq) y

G :

G = - RT In Keq

R: constante gaseosa (1.98 cal/mol. K) T: temperatura absoluta en K

Si

G es (-), Keq será mayor que 1 y la concentración de productos excederá a la de sustratos

Si

G es (+), Keq será menor que 1 y se favorecerá la formación de sustratos. G informa sobre la dirección y estado de equilibrio de la reacción, y aunque la reacción tenga G negativa grande puede dar lugar a índice insignificante.

LOS INDICES DE REACCIÓNES ESTAN DETERMINADOS POR SU ENERGÍA DE ACTIVACION Las reacciones proceden por estados de transición. El estado de transición es fundamental para entender la base química y termodinámica de la catálisis. En una reacción de transferencia de grupo en el cual el grupo E (está entrando) reemplaza al grupo L (está saliendo).

En la mitad del proceso el enlace entre R y L se debilito (no está roto) y en nuevo enlace entre E y R esta incompleto. Es este el estado de transición (no existe ni sustrato ni producto libre)

Las líneas punteadas indican los enlaces que pasan por formación o rotura. La reacción consta de 2 reacciones parciales: formación de (F) y la descomposición (D) Los cambios característicos de la energía libre

GF

GD se relacione con cada reacción parcial

GF

GD

G=

GF +

GD

A partir de la G general es imposible inferir el número o tipo de estados de transición de una reacción, es decir la termodinámica no dice nada de la cinética. La

G define la energía de activación

La

GF generalmente en las reacciones químicas es (+) quiere decir que la formación de estados

de transición debe superar barreras de energía. Por eso la GF para llegar a un estado de transición a menudo se denomina la energía de activación (E act.) Los parámetro termodinámicos que determinan la rapidez de una reacción, son los formación de los estados de transición de una reacción.

GF para la

MUCHOS FACTORES AFECTAN EL INDICE DE REACCIÓN La teoría cinética o de la coalición dice, para que 2 moléculas reaccionen deben: -Estar dentro de la distancia formadora de enlace o chocar -Poseer suficiente energía cinética y alcanzar el estado de transición. Es decir cualquier cosa que aumente la frecuencia o energía de colisión entre sustratos aumentare el índice de la reacción. Temperatura Al aumentar la temperatura, aumenta la energía cinética de las moléculas, seguido de un aumento en su rapidez de movimiento, y por ende aumenta la frecuencia del choque (mas energéticos y productivos). Todo esto produce un aumento en el índice de reacción. Concentración de reactivo La concentración de las moléculas es directamente proporcional a la frecuencia con la cual chocan. Por ejemplo:

si las concentraciones de A y B se duplicaran, la probabilidad de choque aumentara cuatro veces. El número de choques con suficiente energía para formar P (producto) es directamente proporcional al número de choques entre A y B. La suma de las proporciones molares de los reactivos definen el orden cinético de la reacción. En un laboratorio, el orden cinético de una reacción respecto a un reactivo particular o variable (sustrato) se puede determinar al mantener constante la concentración de los otros reactivos en un gran exceso del reactivo variable. El índice de reacción dependerá de manera exclusiva de la concentración del reactivo variable o llamado reactivo limitante. Estos procesos también son aplicados en reacciones catalizadas por una enzima.

Keq es una proporción de constantes de índice Las reacciones químicas son hasta cierto grado reversibles, en condiciones de equilibrio (concentraciones generales constantes) el índice de conversión de sustratos a productos es igual que el de productos a sustratos. Indice1 = Indice -1 K1[A] [B] K1 K-1

=K -1[P]

[P] [A]

[B]

La proporción de K1/K-1 = Keq Propiedades importantes que siguen de un sistema en equilibrio: 1) La constante de equilibrio es una proporción de las constantes de índices de reacción. 2) En equilibrio, los índicea de reacción de las reacciones hacia adelante y hacia atrás son iguales 3) El equilibrio es un estado dinámico, por pequeñas interconversiones de moléculas individuales 4) El valor numérico de la constante de equilibrio (Keq) se calcula a partir de las concentraciones en equilibrio o por la proporción K1/K-1 LA CINÉTICA DE LA CATALISIS ENZIMÁTICA Las enzimas disminuyen la barrera de energía de activación para una reacción Las enzimas aceleran los índices de reacción al disminuir la transición, pudiendo diferir en la manera en que se logra.

GF para la formación de estados de

En algunos casos el ambiente del sitio activo disminuye la GF al estabilizar los estados de transición, es decir la enzima puede imaginarse como unida al ntermediario de manera más estrecha que a sustratos y productos. La proteasa del VIH ilustra la catálisis por una enzima que disminuye la barrera de activación al estabilizar los estados de transición. La catálisis por enzima (mecanismo de reacción singular) ocurre cuando el intermediario del estado de transición forma un enlace covalente con la enzima (catálisis covalente). LAS ENZIMAS NO AFECTAN LA Keq Las enzimas pasan por modificación durante la catálisis pero al terminar la reacción salen sin cambios, la enzima no causa ningún efecto sobre la

reactivos.

G para la reacción general, solo importa el estado inicial y final de los

Reacción catalizada por enzima:

A ambos lados de la flecha la enzima esta en igual cantidad y forma por ende: [P][Q][Enz] [A][B][Enz] Se elimina la concentración de la enzima y se reduce: [P][Q] [A][B] Por ende las enzimas carecen de efecto sobre Keq

MULTIPLES FACTORES INFLUYEN SOBRE LOS INDICES DE REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMA Temperatura El incremento de la temperatura aumenta el índice de reacciones no catalizadas y catalizadas por enzimas al aumentar la energía y la frecuencia de choque de las moléculas que están reaccionando. Este incremento también produce aumento en la energía cinética de la enzima hasta un punto que excede la barrera de energía para alterar las interacciones no covalentes que mantienen su estructura tridimensional, empieza a desnaturalizarse con pérdida de actividad catalítica. Las enzimas de seres humanos muestran estabilidad hasta 40 – 55 °C. Q10 o coeficiente de temperatura, para un incremento de 10 °C el índice de un proceso biológico aumenta, generalmente estos índices se duplican para un aumento de 10 °C (Q10 =2) Para organismos homeotérmicos, los cambios de los índices de reacción de enzimas (por temperatura) tiene importancia fisiológica en caos como fiebre e hipotermia. Concentración de ion hidrógeno Existe una dependencia a la concentración de ion hidrógeno de los índices de las reacciones catalizadas por enzima (actividad optima a ph 5 – 9) La concentración de ion hidrógeno juega un papel importante en el equilibrio entre la desnaturalización de la enzima (ph alto o bajo) y los efectos sobre el estado cargado de la enzima y/o sustrato. La ganancia o perdida de grupos cargados cruciales(carboxilato(-) y amina(+)) afecta la unión a sustrato, por ende retrasa o suprime la catálisis.

LAS VALORACIONES DE REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMA POR LO GENERAL MIDEN LA VELOCIDAD INICIAL En las condiciones de velocidad inicial las mediciones de los índices se hacen en periodos breves, por tantos se acumula trazas de producto. La velocidad inicial (Vi) de la reacción es la del índice hacia adelante. Vi es proporcional a la concentración de enzima presente en exceso molar grande de sustrato. La medición de la Vi permite estimar la cantidad de enzima en muestra biológica. LA CONCENTRACION DE SUSTRATO AFECTA EL INDICE DE REACCIÓN En condiciones de seudoprimer orden, la conducta de una enzima con varios sustrato imitara a la de otra con uno solo, pero el índice observado dependerá de la constante de índice de K 1 para la reacción y de la concentración de sustrato(s). A medida que la concentración de sustrato aumenta, para una enzima común, Vi aumenta hasta un valor máximo (Vmax), hasta que la enzima se satura cuando la Vi ya no aumenta a pesar de seguir aumentando la concentración de sustrato, en este caso dependerá de la rapidez de disociación del producto con la enzima para combinarse con mas sutrato. LAS ECUACIONES DE MICHAELIS - MENTEN Y DE HILL MODELAN LOS EFECTOS DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO La ecuación de Michaelis – Menten Relación entra la velocidad inicial y la concentración de sustrato [S] Vmax [S] Km + [S] La constante Km de michaelis es la concentración de sustrato, Vi es la mitad de la Vmax alcanzable a una concentración particular de enzimas. La ecuación de Michaelis se da en 3 condiciones: 1) Cuando [S] es menor que Km .- donde Km + [S] es igual a la Km En estas condiciones, Vi es proporcional a K[S], por ende Vi es directamente proporcional a [S] Vmax [S]

Vmax

Km

Km

: “aproximadamente igual a”

2) Cuando [S] es mucho mayor que Km.- el término Km + [S] es igual a [S] En estas condiciones, la velocidad de la reacción es máxima (Vmax) y no está afectada por aumentos adicionales de la concentración de sustrato. Vmax [S] [S]

3) Cuando [S] = Km La velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima

Vmax [S] 2 [S]

Una forma lineal de la ecuación de Michaelis – Menten se usa para determinar Km y Vmax Esta forma lineal permite extrapolar Vmax y Km desde datos de velocidad inicial obtenido a concentraciones menores de sustrato sin necesidad de llegar a la saturación. Vmax [S] Km + [S] Se invierte: Km + [S] Vmax [S] Se factoriza: Km

[S]

Vmax [S]

Vmax [S]

Km

1

Se simplifica: 1 Vi

1

Vmax [S]

Vmax

Es una ecuación para una línea recta expresada en el grafico de doble recíproco o de Lineweaver – Burk, cuya mayor virtud es la facildad para determinar los mecanismos cinéticos de inhibidores de enzima

La constante catalítica, K cat La actividad de preparaciones de enzimas impuras o actividad específica (Vmax dividida entre la concentración de proteína) Para una enzima homogénea es posible calcular su número de recambio (Vmax divida entre los mol de enzima presente), pero si se conoce el número de sitios activos presentes, la actividad catalítica de una enzima homogénea se expresa mejor con su constante catalítica (K cat) (Vmax dividida entre el número de sitios activos, S t) V max St Eficiencia catalítica, K cat / K m Los beneficios de una K cat alta solo pueden obtenerse si la K m es suficientemente baja. La eficiencia catalítica de enzimas se expresa mejor en términos de la proporción de estas 2 constantes cinéticas, K cat / K m. Los ejemplos de enzimas para las cuales K cat / K m se aproxima al límite de difusión de 10 - 10 M s incluyen la triosafosfato isomerasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa y adenosina desaminasa. La naturaleza a menudo sortea las limitaciones sobre K cat / K m impuestas por la difusión al montar grupos de enzimas relacionadas para formar complejos de múltiples enzimas. La K m puede aproximar una constante de unión La afinidad de una enzima por su sustrato es la inversa de su constante de disociación (K d), mientras menor es la disociación de la enzima y sustrato, mayor es la afinidad entre ambas. La constante de michaelis K m a menudo aproxima la constante de disociación K d, esto no sucede a menudo.

K -1 K1

1 / K m solo aproxima a 1 / K d , cuando la asociación y disociación del complejo ES son rapidas en comparación con la catálisis

LA ECUACIÓN DE HILL DESCRIBE LA CONDUCTA DE ENZIMAS QUE MUESTRAN UNIÓN COOPERATIVA DE SUSTRATO Algunas enzimas se unen a sus sustratos de una manera cooperativa, análoga a la unión de oxígeno por la hemoglobina. Esta conducta cooperativa es exclusiva de enzimas multiméricas que unen sustratos en múltiples sitios. Los enzimólogos emplean una representación gráfica de la ecuación de Hill, dispuesta en una forma que predice una línea recta donde k´ es una constante compleja Log Vi

n log [S] – log K´

V max - Vi El coeficiente de Hill es una pendiente de la línea “n” Cuando n=1, todos los sitios se comportan de manera independiente , y se observa conducta cinética de Michaelis – Menten simple, si n es más que 1 significa que la enzima muestra cooperación positiva , cuanto más alto sea el grado de cooperación más sigmoideo será el gráfico de Vi contra [S] EL ANÁLISIS CINÉTICO DISTINGUE ENTRE INHIBICION COMPETITIVA Y NO COMPETITIVA Los inhibidores de las actividades catalíticas enzimáticas proporcionan agentes farmacológicos y recursos de investigación para el estudio del mecanismo de acción de las enzimas. Los inhibidores pueden clasificarse con base en su sitio de acción en la enzima (modificación química), o en los parámetros de cinética en los cuales influyen. Desde un punto de vista cinético encontramos 2 clases de inhibidores con base en la superación o no del aumento de la concentración de sustrato a la inhibición. Los inhibidores competitivos típicamente semejan sustratos Con el aumento de la concentración de sustrato se puede superar los efectos de los inhibidores competitivos. Las estructuras de estos inhibidores tiende a asemejarse a la estructura de un sustrato (análogos de sustrato), lo cual le permite unirse y bloquear la porción de unión a sustrato del sitio activo. Proceso dinámico en la formación y disociación del complejo E-I

E–I

E+I

La constante de equilibrio (K i) es: [E] [I]

Ki

[E – I]

K –i

Un inhibidor competitivo actúa al disminuir el número de moléculas de enzimas libres disponibles para unión a sustrato. E–I E E–S

E+P

El aumento de la [S] disminuye la concentración del complejo E – I (eliminando la enzima libre disponible) y aumenta la velocidad de la reacción. Los gráficos del doble recíproco facilitan la evaluación de inhibidores Estos gráficos distinguen entre inhibidores competitivos y no competitivos, y simplifican la evaluación de constantes de inhibición . La Vi se determina en presencia o no del inhibidor a varias concentraciones de sustrato. Un inhibidor competitivo no tiene efecto sobre la V max pero aumenta la K´ m y la K m aparente para el sustrato. Se calcula Ki y los valores se usan para comparar diferentes inhibidores de la misma enzima, mientras más bajo sea el valor de K i, más eficaz es el inhibidor. Los inhibidores no competitivos simples disminuyen V max pero no afectan K m E n la inhibición no competitiva, la unión del inhibidor no afecta la unión del sustrato, por ende se forman tanto EI como EIS, pero aun pudiéndose unir a sustrato su eficiencia para transformarlo en producto, expresado en V max está disminuida. Estos inhibidores unen enzimas en sitios distintos del sitio d unión al sustrato, muestran poco o ninguna semejanza con el susutrato. Aquí la E y el complejo EI tienen afinidad idéntica por el sustrato, lo más complejo ocurre cuando la unión del inhibidor afecta la afinidad de la enzima por el sustrato.

Gráfico de Dixon Se emplea para determinar constantes de inhibición. La V i se mide a varias concentraciones del inhibidor pero a una fija del sustrato (S). Para un inhibidor competitivo o no competitivo simple, el grafico de 1/Vi contra la concentración del inhibidor (I) da una línea recta. En publicaciones farmacéuticas a menudo se emplean gráficos de Dixon para evaluar la potencia comparativa de inhibidores competitivos. IC50 Alternativa menos rigurosa y más frecuente para K i como una medida de la potencia inhibidora es la concentración de inhibidor que produce inhibición de 50%. El valor numérico de IC50 varía en función de las circunstancias específicas de la concentración de sustrato, etc. (bajo la cual se determina) Inhibidores estrechamente unidos Cuando la concentración de inhibidor requerida para medir K i cae por debajo de la concentración de enzima típicamente presente en una valoración, suponemos que una fracción del inhibidor está presente como un complejo EI (unido con afinidad muy alta) El análisis cinético de estos inhibidores muy unidos requiere de ecuaciones cinéticas especializadas que incorporan la concentración de enzimas para estimar K i o IC 50 y distinguir inhibidores competitivos y no competitivos estrechamente unidos. Los inhibidores irreversibles “envenenan” enzimas Varios inhibidores producen modificación (hacer o romper enlaces covalentes) química en la enzima actuando de manera irreversible. Una enzima “envenenada” por un inhibidor irreversible, como un átomo de metal pesado o un reactivo acilante, permanece inhibida aun habiéndolo eliminado del medio circundante. Inhibición basada en mecanismo También llamados inhibidores “suicidas”. Después de la unión al sitio activo, la catálisis por la enzima genera un grupo muy reactivo que forma un enlace covalente con un residuo esencial y bloquea la función del mismo. Los inhibidores suicidas son específicos para enzimas y no reactivo fuera de los confines del sitio activo, importante para la creación de fármacos específicos para enzima. CASI TODAS LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMA COMPRENDE 2 O MAS SUSTRATOS Las enzimas tienen desde 1 hasta 2 o más sustratos productos, sin embargo los principios fundamentales son aplicables para enzimas con único o múltiples sustratos.

La diferencia está en la expresión matemática donde para las de múltiples sustratos son más complejas. Aspectos comunes de conductas cinéticas para reacciones de 2 sustratos y 2 productos (“Bi – Bi”): Reacciones secuenciales o de desplazamiento único Reacciones donde ambos sustratos deben combinarse con la enzima formando un compuesto ternario antes de la catálisisLas reacciones Bi-Bi secuenciales pueden distinguirse si los 2 sustratos se agregan al azar o en uno forzoso. En orden al azar el sustrato A o el B pueden combinarse primero con la enzima para formar EA o EB En orden forzoso, A debe combinarse primero con E antes de que B pueda combinarse con EA, la adición de A induce a un cambio conformacional en la enzima que alinea residuos que reconocen B y se unen. Reacciones de Ping – Pong Estas reacciones comprenden catálisis covalente y una forma transitoria, modificada, de la enzima. Las reacciones Bi-Bi de ping-pong son reacciones de doble desplazamiento. El grupo que se transfiere primero es desplazado de A por la enzima para formar P y una forma modificada de la enzima (F), la transferencia del grupo subsiguiente desde F hacia B que forma el producto (Q) y regenera E, constituye el 2do desplazamiento. Casi todas las reacciones Bi-Bi se conforman a la cinética de Michaelis – menten Donde la Vmax se refiere al índice de reacción que se alcanza cuando ambos sustratos están presentes a concentraciones que producen saturación. El valor K m característico de un sustrato corresponde a la concentración que da la mitad de la V max cuando el 2do sustrato está produciendo saturación. Pueden usarse gráficos de doble recíproco para determinar V max y K m. La V i se mide como una concentración de un sustrato (variable) mientras que la del otro (fijo) es constante. Los estudios de inhibición del producto se usan para complementar análisis cinéticos y distinguir entre reacciones Bi-Bi ordenas y al azar. EL CONOCIMIENTO DE LA CINÉTICA, EL MECANISMO Y LA INHIBICION DE ENZIMAS, AYUDAN A LA CREACIÓN DE FARMACOS Muchos fármacos actúan como inhibidores de enzimas Objetivo de la farmacología es identificar agentes que pueden: 1) Destruir o alterar el crecimiento, la invasividad o el desarrollo de agentes patógenos invasores. 2) Estimular mecanismos de defensa endógenos 3) Suspender u obstaculizar procesos moleculares aberrantes desencadenados por estímulos genéticos, con trastorno mínimo de las funciones celulares normales del huésped.

Gracias a sus diversas funciones fisiológicas y alto grado de selectividad de sustrato, las enzimas constituyen blancos naturales para la creación de fármacos que son tanto potentes como específicos. La cinética enzimática define condiciones de investigación apropiadas La cinética enzimática, tiene un papel crucial en el descubrimiento de fármacos, es necesario el conocimiento de la conducta cinética enzimática para seleccionar condiciones de valoración apropiadas que detectan con facilidad la presencia de un inhibidor. También proporciona el medio para cuantificar y comparar la potencia de diferentes inhibidores y definir su modo de acción. Los inhibidores no competitivos son los más resaltantes ya que sus efectos nunca pueden superarse por completo Muchos fármacos se metabolizan in vivo La enzimas presentes en el paciente o en el agente patógeno actúan sobre fármacos, dicho proceso se denomina metabolismo de fármaco: Por ejemplo: La penicilina y otros antibióticos beta-lactámicos bloquean la sintesis de la pared celular en bacterias al envenenar (irreversible) la enzima alanil alanina carboxipeptidasatranspeptidasa, pero muchas bacterias producen beta-lactamasas que hidrolizan la función betalactámica crucial en la penicilina y farmacos relacionados. Para superar la resistencia a antibióticos, administrar de manera simultanea un inhibidor de beta-latamasa y un antibiótico betalactámico. También se requiere transformación metabólica para convertir un precursor farmacológico inactivo (profármaco) en su forma biológica activa, el diseño y la administración eficaces de profármacos requieren conocimientos de la cinética y mecanismos de las enzimas encargados de transformarlos en sus formas biológicas activas. CAPITULO 9 ENZIMAS: REGULACION DE ACTIVIDADES IMPORTANCIA BIOMÉDICA Gracias a Claude Bernard (regulación metabólica) y Walter Cannon (homeostasis), se sabe que los organismos responden a cambios de sus ambientes externo e interno por medio de ajustes balanceados y coordinados de los índices de reacciones metabólicas específicas. El mantenimiento del equilibrio homeostático depende de la maquinaria de estímulo- respuesta que si se altera puede ser nociva para la salud de seres humanos. Ejemplos como: el cancer, la diabetes, fibrosis quística y la enfermedad de Alzheimer, se caracterizan por disfunciones de la regulación desencadenadas por agentes patógenos o mutaciones genéticas. El conocimiento de los factores que controlan los indices de reacciones catalizadas por enzimas es esencial para un entendimiento de la base molecular de la enfermedad.

LA REGULACION DEL FLUJO DE METABOLITOS PUEDE SER ACTIVA O PASIVA Los valores de K m para enzimas guarda proporcion con la concentración intracelular promedio de sus sustratos, por tanto los cambios de esta concentración generan cambios correspondientes del flujo de metabolitos. Las respustas a cambios de la concentración de sustrato de manera pasiva permite coordinar el flujo de metabolitos y manterner la homeostasis en células quiescentes, pero con alcance limitado para respuestas a cambios ambientales. Los mecanismos que regulan la eficiencia de las enzimas de manera activa en respuestas a señales interna y externas. El flujo de metabolitos tiende a ser unidireccional En las células vivas los productos de reacción sirven como sustratos para otras reacciones catalizadas por enzimas, por ende las supuestas reacciones “reversibles” ocurren de manera unidireccional La sucesión de reacciones metabólicas acopladas se acompaña de un cambio global de la energía libre que favorece el flujo unidireccional de metabolitos. Esto es análogo al flujo de agua a travez de una tubería inclinada, donde hay pasos individuales catalizados por enzima (codos y vueltas). El flujo de agua permanece unidireccional debido al cambio general de altura que es el cambio general de la energía libre en una vía. LA COMPARTAMENTALIZACIÓN ASEGURA EFICIENCIA METABÓLICA Y SIMPLIFICA LA REGULACIÓN Las vías anabólicas y catabólicas que interconvierten productos comunes pueden tener lugar en compartimientos subcelulares específicos. Por ejemplo: los lisosomas que sirve como compartiemiento para enzimas que degradan proteinas y polisacáridos, o tambien los mitocondrias para la oxidación de acidos grasos. La segregacion de vias metabólicas en celulas especializadas puede proporcionar compartimentalización física adicional. La capacidad de las enzimas para distinguir entre coenzimas similares como NAD+ y NADP+ tambien origina una forma de compartimentalización ya que segrega los electrones de NADH (generación de ATP) a partir de los del NADPH (pasos reductivos de vias biosintéticas) El control de una enzima que cataliza una reaccion limitante regula una vía metabólica completa. La enzima ideal para intervención reguladora es quella cuya cantidad o eficiencia catalítica dicta que la reacción que cataliza sea lenta en comparación con todas las otras en la vía, por ende el decremento de la eficiencia o cantidad de catalizador para la reacción limitante de la velocidad , reduce el flujo de metabolitos por toda la vía, y a la inversa. Como “rectoras” naturales del flujo metabólico, las enzimas que catalizan pasos limitantes, constituyen blancos eficientes para intervención reguladora de fármacos.

REGULACION DE LA CANTIDAD DE ENZIMA La capacidad catalitica puede verse influenciada tanto al cambiar la cantidad de enzima presente como al alterar su eficiencia catalítica intrinsica. Las proteinas se sintetizan y degredan de manera continua Schoenheimer dedujo que las proteinas del cuerpo se encuentran en estado de “equilibrio dinámico” en el cual se estan sintetizando y degradando de manera continua (recambio de proteina) La cantidad absoluta de una enzima refleja el balance neto entre sus índices de síntesis y de degradación. En seres humanos las alteraciones de la cifras de enzimas específicas pueden estar afectadas por un cambio de la constante de índice para los procesos generales de sintesis (K s), degradación (K deg) o ambos Enzima

Aminoácidos

Control de la sintesis de enzima La sintesis de ciertas enzimas depende de la presencia de inductores, sustratos o compuestos relacinados (estructural) que inician su síntesis. Un exceso de un metabolito puede restringir la síntesis de su enzima cognada por medio de represión. Tanto la inducción como la represión implican elementos cis (DNA específicos de genes regulados) y proteinas reguladoras que transactúan La síntesis de otras enzimas puede estimularse mediante la unión de hormonas y otras señales extracelulares a receptores celulares específicos. Control de la degradación enzimática En animales muchas proteinas se degradan por medio de la vía de la ubiquitina-proteasoma Esta vía se encarga tanto de la degradación regulada de proteinas celulares seleccionadas, como de la eliminación de especies proteínicas defectuosas o aberrantes. La vía dela ubiquitinaproteasoma puede degredar de manera selectiva proteinas cuya integridad física y competencia funcional han quedado comprometidas por la pérdida de un grupo prostético o por daño del mismo, oxidación de residuos cisteina o histidina, o desaminación de residuos asparagina o glutamina. Se cree que las disfunciones de la ubiquitina-proteasoma contribuyen a la acumulación de especies proteínicas plegadas de modo aberrante, características de varias enfermedades neurodegenerativas.

HAY MULTIPLES OPCIONES PARA REGULAR LA ACTIVIDAD CATALÍTICA Los cambios de eficiencia catalítica intrinsica por unión de ligandos disociables (regulación alostérica) o por modificación covalente logran regulación de la ctividad enzimática en segundos. Los cambios de la concentración de proteinas satisfacen requisitos adaptativos a largo plazo, mientras que los cambios de la eficiencia catalítica son mas idóneos para alteraciones rápidas y transitorias del flujo de metabolitos LOS EFECTORES ALOSTÉRICOS REGULAN CIERTAS ENZIMAS La inhibición por retroalimentación se refiere a la inhibición de una enzima en una vía biosintética por un porducto terminal. Ejm:

A

B

C

D

Las altas concentraciones de D inhiben la conversión de A en B. La inhibicion depende de la capacidad de D para unirse s Enz 1 e inhibirla. D se une a un sitio alostérico separado (espacial) del sitio catalítico de la enzima blanco, es decir D actua como efector alostérico negativo de Enz1. En una vía biosintética ramificada, las reacciones iniciales participan en la síntesis de multiples productos terminales, donde cada producto inhibe por retroacción la secuencia de reacción lineal. La cinética de inhibición por retroalimentación puede ser competitiva, no competitiva, parcialmente competitiva o mixta. Los inhibidores por retroalimentación por lo general inhiben el primer paso comprometido en una secuencia biosintética particular. Cada producto terminal solo puede inhibir de manera parcial la actividad catalítica, el efecto de un exceso de 2 o más productos terminales puede ser estrictamente aditivo o mayor que su efecto individual (Inhibicion por Retroalimentación Cooperativa) La aspartato transcarbamoilasa (ATCasa) es un modelo de enzima alostérica La ATCasa, el catalítico para la primera reacción única para la biosíntesis de pirimidina, es un blanco de regulación por retroalimentación por trifosfato de citidina (CTP) y trifosfato de Adenosina ( ATP). El CTP, producto terminal de la vía biosintética de pirimidina, inhibe la ATCasa, mientras que el ATP la activa. Los sitios alostérico y catalítico son distintos desde el punto de vista espacial Los inhibidores por retroalimentación no son isostéricos con un sustrato, sino alostéricos (ocupan otro espacio). Las enzimas alostéricas son aquellas que tienen el sitio activo para la catálisis que puede modularse por la presencia de efectores en un sitio alostérico.

Jacques Monod propuso la existencia de sitios alostéricos que son distintos desde el punto de vista físico del sitio catalítico. Esta hipótesis se ha confirmado por cristalografía con rayos X y mutagénesis dirigida hacia sitio, lo que demuestra la existencia de sitios activos y alostéricos distintos desde el punto de vista espacial sobre diversas enzimas. Los efectos alostéricos pueden ocurrir sobre K m o sobre V max Se hace referencia a 2 clases de enzimas reguladas: de la seria K y de la serie V. Las alteraciones de K m y de V max se producen por cambios conformacionales en el sitio catalítico inducidos por union del efector alostérico en su sitio Para las enzimas alostéricas de la serie K, la cinética de saturación de sustratos es competitiva en sentido de que K m esta incrementada sin un efecto sobre V max. El cambio conformacional puede debilitar los enlaces entre sustrato y residuos. Para enzimas alostéricas de la serie V, el inhibidor alostérico disminuye V max sin afectar la K m. Si hay cambio conformacional su efecto primario es alterar la orientación o la carga de residuos catalíticos, lo que genera un decremento de V max. LA REGULACIÓN POR RETROALIMENTACIÓN NO ES SINÓNIMO DE INHIBICIÓN POR RETROACCIÓN Los productos terminales de una reacción producen “retroalimentación” de su propia síntesis y aveces la controlan por medio de de inhibición por retroacción de una enzima biosintética temprana. La regulacion por retroalimentación es un termino fenomenológico desprovisto de inferencias mecanísticas e inhibición por retroalimentación es el mecanismo para la regulación de la actividad enzimática Ejm: el colesterol de la dieta aminora la síntesis hepática de colesterol, esta regulación por retroacción no incluye inhibición por retroacción. MUCHAS HORMONAS ACTUAN MEDIANTE SEGUNDOS MENSAJEROS ALOSTERICOS Los impulsos nerviosos y la unión de hormonas a receptores de superficie celular, desencadenan cambios del indice de reacciónes catalizadas por enzimas dentro de celulas blanco, al inducir liberación o síntesis de efectores alostéricos especializados llamados segundos mensajeros (3´,5´cAMP; 3´,5´-cGMP y los polifosfoinositoles) cuya participación es importante en procesos de regulación celular. El primer mensajero es considerado la hormona o el impulso nervioso. LAS MODIFICACIONES COVALENTES REGULADORAS PUEDEN SER REVERSIBLES O IRREVERSIBLES Las formas más frecuentes de modificación covalente reguladora son proteolisis parcial y fosforilación.

La proteolisis constituye una modificación irreversible dado que los organismos carecen de la capacidad de volver a unir 2 porciones de una proteina producidas por hidrólisis de un enlace peptídico. La fosforilación es un proceso de modificación reversible, por ejemplo la fosforilación de proteinas den residuo serilo, treonilo o tirosilo, catalizada por proteinas cinasa, es favorecida desde el punto de vista termodinámico. LAS PROTEASAS PUEDEN SECRETARSE COMO PROENZIMAS INACTIVAS DESDE EL PUNTO DE VISTA CATALÍTICO Las proproteinas.- ciertas proteinas son sintetizadas como proteinas precursoras inactivas La proteólisis selectiva convierte una proproteina por medio de uno o más “cortes” proteolíticos sucesivos en una forma que mustra la actividad característica de la proteina madura, por ejemplo su actividad enzimática. Ejemplos: Insulina (proinsulina), pepsina (pepsinógeno), tripsina (tripsinógeno), colágeno (procolágeno) Las proenzimas facilitan la movilización rápida de una actividad en respuesta a demanda fisiológica. La síntesis y secreción de proteasas como proenzimas inactivas en el aspecto catalítico, protege al tejido de origen contra autodigestión . La formación de coagulo de sangre, la disolución de coagulo y la reparación del tejido, solo se ponen en marcha en respuesta a necesidades fisológicas o fisiopatológicas apremiantes. Las enzimas necesarias de manera intermitente pero con rapidez se secretan en forma inactiva, puesto que la sintesis nueva de las proteinas requeridas podría ser insuficientemente rápida para responder a la perdida de sangre La activación de la proquimotripsina requiere proteólisis selectiva La proteólisis selectiva suele originar cambios conformacionales que “crean” el sitio catalítico de una enzima. Los cambios conformacionales de la proteólisis selectiva de la proquimotripsina (quimotripsinógeno) alinean los 3 residuos de la red de transmision de carga lo que forma el sitio catalítico LA MODIFICACIÓN COVALENTE REVERSIBLE REGULA ENZIMAS CLAVES DE MAMÍFERO Las modificaciones covalentes (glucosilación, hidroxilación y acilación) introducen características estructurales singulares en proteinas recien sintetizadas. Entre las modificaciones covalentes que regulan la función de las proteinas, la más frecuente es la fosforilación-desfosforilación. Una célula de mamífero típica posee miles de proteinas fosforiladas y varios cientos de proteinas cinasas y proteinas fosfatasas que catalizan su interconversión. La facilidad de interconversión de

enzimas entre sus formas fosfo- y desfosfo- , explica la frecuencia en que la fosforilación y desfosforilación ocurren como un mecanismo para el control regulatorio. La fosforilacióndesfosforilación permite alterar las propiedades funcionales de la enzima afectada solo durantes el tiempo que satisfaga una necesidad específica. La fosforilación influye sobre la eficiencia catalítica intrínsica de una enzima o sobre otras al inducir cambios conformacionales. La modificación covalente regula el flujo de metabolitos Tanto la fosforilación-desfosforilación como la inhibición por retroalimentación proporcionan regulación a corto plazo, facilmente reversible, del flujo de metabolitos en respuesta a señales fisiológicas específicas. La fosforilación-desfosforilación y la inhibición por retroalimentación actuan sobre las primeras enzimas de una secuencia metabólica larga y a menudo biosintética, y ambas actuan en sitios alostéricos más que catalíticos. LA FOSFORILACION DE PROTEINA ES EN EXTREMO VERSATIL La función enzimática afectada a menudo es la eficiencia catalítica de la proteina, la fosforilación tambien puede alterar su ubicación dentro de la célula, la suceptibilidad a la degredación proteolítica, o la capacidad de respuesta a regulación por ligandos alostéricos. La fosforilación y desfosforilación en cualquier sitio puede catalizarse por multiples proteinas cinasas o proteina fosfatsas, ambas actuan sobre varias proteinas y se interconvierten en forma activa e inactiva. En redes reguladoras complejas, las enzimas individuales muestran respuesta a diferentes señales ambientales. La capacidad de muchas proteinas cinasas y proteinas fosfatasas para marcar a más de una proteina proporcionan un medio para una señal ambiental con el fin de regular de manera coordinada múltiples procesos metabólicos. EVENTOS REGULADORES INDIVIDUALES SE COMBINAN PARA FORMAR REDES DE CONTROL COMPLEJAS. Para mantener la homeostasis y satisfacer las demandas de estas, las enzimas interconvertibles y las enzimas de las cuales depende la interconversión están enlazadas para formar redes reguladoras integradas, un ejemplo claro de este tipo de red es el cilco de las células eucaritoas que controla la división celular.