23. Replicacion

UNIDAD N° 3:

Tema 2:

REPLICACIÓN DEL ADN 

Profesor Auxilar Aux ilar T.C. Area Biología Departamento Departam ento Académico Académic o de Ciencias - UPAO UPAO

REPLICACION DEL DNA

La replicación es el proceso mediante el cual, a partir de una molécula de DNA doble hélice, se sintetizan dos moléculas idénticas. Tiene lugar cada vez que se divide una célula, ya que las dos células hijas han de tener  exactamente, la misma dotación genética que la progenitora. CARACTERISTICAS        

Semiconservativa Bidireccional Semidiscontínua  Asimétrica  Asincrónica Es multifocal en eucariotas Requiere de Cebadores Ocurre en el período S.

Es semiconservativa

A partir de la doble hélice de una molécula de DNA se originan dos moléculas de DNA, ambas compuestas por una cadena original (preexistente) y una cadena nueva (recién sintetizada). Es decir, que las dos cadenas de la molécula progenitora se separan y sirven cada una de molde para la síntesis de una nueva cadena hija complementaria, siguiendo la regla normal de apareamiento.

A

Nucleótidos

Molécula parental de DNA

 Ambas cadenas parentales Sirven como molde

Dos moléculas de DNA hijas idénticas

Es Bidireccional  Al abrirse la doble hélice se forma una estructura llamada “burbuja de replicación”, cuyo tamaño aumenta a medida que avanza la separación de las dos cadenas de DNA, evento que se produce en forma simultánea en los 2 extremos de la burbuja. Cada burbuja, tiene dos horquillas de replicación que a partir de ese punto de origen común avanzan en ambas direcciones opuestas

Origen de replicación

Origen de replicación

Origen de replicación

Cadena parental

Cadena hija

Burbuja de replicación

Dos moléculas de DNA hijas

Es Semidiscontínua •

La cadena hija que adopta como molde a la cadena progenitora que corre en dirección 3’→5’ se sintetiza en forma continua, al crecer en dirección 5 ’→3’, y se denomina cadena adelantada strand”).

•

(“leading

La otra cadena hija, cuyo molde es la cadena del DNA progenitora que corre en dirección 5 ’→ ’→3’ es sintetizada de un modo singular, ya que para poder  crecer en esa dirección debe sintetizarse en dirección opuesta al avance de la horquilla de replicación. El problema se supera haciendo de que la síntesis sea discontinua, lo cual significa que la nueva cadena se sintetiza de a pequeños fragmentos y se le llama cadena retrasada (“lagging strand”).

La síntesis de la cadena retrasada se lleva a cabo en la dirección opuesta a la del movimiento de la horquilla de crecimiento, a partir de una serie de iniciadores de RNA cortos formados por la primasa en múltiples sitios de la segunda cadena molde. Los segmentos resultantes de RNA más DNA se conocen como fragmentos de Okasaki .

La Replicación es Multifocal en Eucariotas •

•

En eucariotas, para poder llevar a cabo la replicación en un tiempo razonable, ha de ser multifocal, es decir, empezar por muchos puntos a la vez. Se ha comprobado que en el DNA de células de mamíferos existen cerca de 50 000 a 100 000 replicones. En cambio la replicación del DNA bacteriano es monofocal, es decir, existe un sólo origen de replicación.

Requiere de Cebadores Para empezar la síntesis de DNA se requiere una cadena de nucleótidos para agregarle un nuevo nucleótido. Cada fragmento de Okazaki se inicia con un RNA cebador  “primer” (~10 bases de largo).

Ocurre en Fase S del ciclo celular . La replicación del DNA ocurre con alta fidelidad dentro de un período de tiempo determinado en forma precisa dentro del ciclo celular. Síntesis de DNA = replicación replicación

REQUERIMIENTOS DE LA REPLICACION EN PROCARIOTAS

EN EUCARIOTAS •

•

DNA Helicasa. Proteínas SSB (Single- Strand binding). Topoisomerasas I y II (girasa) RNA primasa. DNA Polimerasas (DNA Pol) I, II y III Pirofosfatasa. DNA Ligasa

•

DNA Helicasa. Proteínas RFA y RFC Topoisomerasas I y II RNA primasa. DNA Polimerasas (DNA Pol) α,β, γ, δ, ε Pirofosfatasa. DNA Ligasa

•

DNA mol molde de o “te “templ mplate ate””

•

DNA mold molde e o “te “templ mplate ate””

•

Cebadores Los 4 desoxirribonucleótidos trifosfato: (dATP,, dCTP (dATP d CTP,, dGTP d GTP,, dTT dTTP) P) Mg++ PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) ORC (origin recognition complex) Nucleasa reparadora

• • • • • •

Cebadores • Los 4 desoxirribonucleótidos trifosfato: (dATP,, dCTP (dATP d CTP,, dGTP d GTP,, dTT dTTP) P) • Mg++ •  Abrazadera β •

• • • • •

• • • •

•

RNAH asa

•

DNA POLIMERASAS (DNA Pol) •

• •

La DNA Polimerasa, Polimerasa, agrega un nucleótido al extremo extremo 3’ de la cadena de DNA en crecimiento y forma un enlace fosfodiéster entre este extremo y el grupo 5 ’-fosfato de nucleótido entrante. El nucleótido trifosfato entrante provee la energía necesaria para esta reacción por la hidrólisis de los dos fosfatos terminales (PP i). Este pirofosfato es es luego hidrolizado a fosfato inorgánico (Pi), lo cual permite que la reacción de polimerización sea irreversible.

DNA HELICASAS y PROTEÍNAS SSB.  – Una helicasa y las proteínas de unión a las

monocadenas (SSB) trabajan para desenrollar y mantener las cadenas de DNA separadas antes del avance de la horquilla de replicación  – Las helicasas son enzimas capaces de desplazarse a lo largo del DNA utilizando la energía de la hidrólisis del ATP, para separar las cadenas. c adenas.  – Las proteínas SSB mantienen las cadenas separadas

Topoiso merasas Las Topoisomerasas tipo I relajan el DNA, por corte y cierre de una cadena del DNA. Las Topoisomerasas tipo II cambian la topología del DNA mediante el corte y la reparación del DNA bicantenario.

ETAPAS DE LA REPLICACION INICIACION Reconocimiento de orígenes de replicación Separación de hebra Posicionamiento de maquinaria de replicación

ELONGACION Crecimiento bidireccional de la horquilla de replicación Replicación semiconservativa, semidoscontinua, coordinada .

TERMINACION Reconocimiento de señales de terminación Desensamble de replisomas

1) INICIACION • •

La síntesis del DNA se inicia en regiones especiales llamadas orígenes de replicación . Los orígenes de replicación típicamente contienen múltiples secuencias repetidas cortas. Estos segmentos de DNA singulares son reconocidos por proteínas multiméricas que se unen al origen y, a su vez, reclutan hacia éste otras enzimas de la replicación.

1) INICIACION • •

La síntesis del DNA se inicia en regiones especiales llamadas orígenes de replicación . Los orígenes de replicación típicamente contienen múltiples secuencias repetidas cortas. Estos segmentos de DNA singulares son reconocidos por proteínas multiméricas que se unen al origen y, a su vez, reclutan hacia éste otras enzimas de la replicación.

•

•

La iniciación de la replicación del DNA en E. coli , se produce por la unión de la proteína dnaA al único origen de replicación (oriC), seguida por la fijación de la DnaB, una helicasa que disocia el DNA a la altura de la horquilla. La asociación de la primasa (dnaG) a este complejo forma un primosoma. Tras la síntesis del iniciador la primasa se separa.

2) ALARGAMIENTO DE LAS CADENAS : Una vez que el origen de replicación se ha formado, el alargamiento para formar la cadena adelantada progresa sin mayor dificultad. Una primasa se une a un sitio adyacente a la helicasa en el segmento monocatenario del molde de la cadena retrasada e inicia la síntesis de otro inic iador de RNA, el mismo que la polimerasa procede a alargar para formar otro fragmento de Okasaki . El núcleo polimerásico que sintetiza la cadena adelantada se desplaza, junto con su abrazadera de subunidad β, a lo largo de su molde en la dirección del movimiento de la horquilla, y así alarga la cadena.

Una vez que los cebadores de la cadena retrasada han sido elongados por la DNAP III, ellos son removidos Por  la RNAHasa + DNA polimerasa I y ésta última rellena dichos espacios. La enzima tiene actividad polimerasa 5 ’→ 5 ’ ’  3’→ exonucleasa ’→3’, (“proofreading”) en una sola cadena ’→3’ polipeptídica. La exonucleasa 5 ’→ remueve los cebadores, mientras que la polimerasa funciona simultáneamente llenando los espacios con DNA por  elongación del extremo 3 ’ del fragmento de Okasaki  adyacente. El enlace fosfodiéster final entre los fragmentos es catalizado por la DNA ligasa

3) TERMINACIÓN La replicación finaliza cuando una horquilla de replicación replic ación se encuentra con el otro lado del cromosoma circular en el lugar de terminación, la región ter (τ ). La región ter está formada por un par de secuencias ter de repeticiones invertidas. Cada secuencia ter evita una progresión posterior de una de las horquillas de replicación cuando se une una proteína de unión ter (TBP) de 26 KDa. Las dos moléculas hijas de DNA se separan porque actúa una topoisomerasa de tipo II.

(T1)

(T2 )

LA DNA POLIMERASA HACE UNA LECTURA DE PRUEBA (PROOFREADING) Muchos errores de copiado que se producen durante la replicación del DNA son corregidos por la función de lectura de prueba de la DNA Polimerasa, que pueden reconocer bases erróneas (mal apareadas) en el extremo 3 ’ de la cadena en crecimiento y luego extraerlas por medio de una actividad inherente de exonucleasa 3 ’ →5’.

DNA POLIMERASAS EUCARIOTICAS: , , , y . •

•

•

• •

Las enzimas son similares a aquellas involucradas en la replicación del DNA bacteriano. La DNA topoisomerasa II está involucrada en aliviar superenrollamientos positivos en el DNA, mientras que la helicasa desenrolla las dos cadenas. LA DNA Pol- tiene baja procesividad y una primasa asociada y carece de actividad actividad exonucleasa. Está involucrada en la síntesis síntesis de la cadena retrasada. Es fuertmente fuertmente inhibida inhibida por afidicolina (fuerte (fuerte también para  y ) DNA Pol  tiene alta procesividad en presencia de PCNA (tiene una función homóloga a la subunidad  de Pol III de  E. coli ) y no tiene asociada una primasa, sugiriendo que replica la cadena líder  eucariótica. DNA Pol  es encontrada en la mitocondria y replica su DNA. DNA Pol  y  tienen buena procesividad y están involucradas en la reparación del DNA.

INICIO DE REPLICACION EN EUCARIOTAS Los origenes de replicación contienen contienen tramos de  ADN especiales, compuestos por  cientos de nucleótidos. Todos poseen una secuencia común denominada ARS (autonomous replication sequence). El ADN de los orígenes de freplicación se halla asociado aun complejo de proteínas llamadas ORC (origin recognition complex). El ORC es requerido durante la activación de los orígenes de replicación. En G1, Factores de replicación defosforilados se unen al ORC para formar complejo de prereplicación.

 Al comienzo de la fase S, ORC recluta a otras proteínas  – por  ejemplo la denominada MCM (minichromosome maintenance proteins) y cdc6 (cell division cycle)con las cuales integra un cimplejo mayor llamado pre-RC (pre replication complex). Este cataliza el inicio de la replicación despues de ser inducido por el factor SPF (S-phase promoting factor), este también es llamado FPR (factor promotor de la replicación).

La unión de cdc45 activa el MCM helicasa y facilita la unión de RPA, una proteína de unión a cadena simple (SSB).

 Además de participar en la activación de los orígenes orígenes de replicación, el ORC impide que el  ADN se reduplique dos veces durante durante la fase G 2, por lo que evita que la célula c élula comience la mitosis teniendo un número de moléculas de ADN mayor que el normal.

•

• •

La DNA Polimerasa α, que posee actividad de primasa, inicia la síntesis del DNA a través de la formación de un RNA cebador seguido por una cadena corta de nucleótidos de DNA. Una vez que la DNA polimerasa α colocó entre 30 y 40 nucleótidos, la DNA polimerasa  completa la replicación sobre las cadenas líder y retrasada. La DNA polimerasaε también parece participar en la replicación nuclear. Estudios recientes muestra que la DNA Pol ε replica la cadena líder. líder. Los cebadores son eliminados por una nucleasa reparadora y su lugar lo ocupa una pieza equivalente de DNA, sintetizada por la DNAP- . El proceso culmina al actuar la DNA ligasa.

REMOCIÓN DE CEBADORES RNase R1 – remueve RNA primer  Endonuclease: remueve ribonucleótidos y la DNA Pol δ sintetiza los deoxiribonucleóotidos

DNA LIGASA 

Cataliza formación del enlace fosfodiester entre dos fragmentos de Okazaki

INHIBIDORES DE SINTESIS DE DNA •

Quinolonas, ácido nalidíxico: se unen a la DNA girasa. girasa. La unión del antibiótico al complejo DNA-girasa inhibe la replicación del DNA. Las quinolonas y las nuevas fluoroquinolonas fluoroquinolonas,, como ciprofloxacina y norfloxacina son antibióticos de amplio espectro y especialmente utilizados en infecciones urinarias y en infecciones por  Escherichia coli y Salmonella.