214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

Metode moderne de control microbiologic al alimentelor Suport Curs Masterat Anul I

Titular curs: Conf. dr. Marcel Avramiuc

Metodele de evaluare a populaţiilor microbiene microbiene , care permit evaluarea concentraţiei de celule sau a biomasei; M etode dir ecte  , în care evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat în în M etode in dir ecte  corelaţie cu conţinutul de biomasă (turbiditatea mediului cultivat, fluorescenţa, impedanţa); , Metode culturale 

care necesită o perioadă de incubare pentru creşterea

coloniilor şi stabilirea rezultatului analizei; , "on M etode aut automatizate  omatizate 

line", care permit analiza directă a probelor din

fermentator, sau metode care necesită prelevarea aseptică de probe pentru analiză.

Tehnici de diluare

, în Seri i li niare 

care concentraţia de microorganisme descreşte în progresie

aritmetică (de exemplu: 0.8/0.6/0.4/0.2) şi care sunt puţin utilizate; Seri i lo   garítmice

(diluţii decimale), în care concentraţia de microorganisme

descreşte în progresie geometrică (ex. 0,1/0,01/0,001/0,0001 etc.). Pentru realizarea diluţiilor decimale, într -un număr de eprubete sterile egal cu numărul de diluţii necesar a se efectua, se pipetează aseptic 9 cm3 de lichid de diluţie (ser pentru Escherichia coli). fiziologic steril, apă distilată sterilă, mediu Ringer - pentru Escherichia

Tehnici de concentrare

Sunt utilizate în special pentru punerea în evidenţă a microorganismelor  patogene;  Metode de îmbogăţire ,

-un mediu care presupun inocularea probei de analiză într -un

favorabil pentru multiplicarea rapidă a celulelor aflate în concentraţii reduse în proba de analizat şi, după termostatare în condiţii optime de cultivare, se verifică prezenţa sau absenţa microorganismelor analizate, cu sau fără o determinare efectivă a concentraţiei de celule;  Metode de separare fizică sau fizico-  chimică chimică  a celulelor prin filtrare,

centrifugare, floculare, sedimentare, în care se determină concentrarea celulelor pe unitatea

de volum, ceea ce asigură posibilitatea evidenţierii lor ulterioare prin tehnici

directe sau culturale; 2

Metodele de evaluare a populaţiilor microbiene microbiene , care permit evaluarea concentraţiei de celule sau a biomasei; M etode dir ecte  , în care evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat în în M etode in dir ecte  corelaţie cu conţinutul de biomasă (turbiditatea mediului cultivat, fluorescenţa, impedanţa); , Metode culturale 

care necesită o perioadă de incubare pentru creşterea

coloniilor şi stabilirea rezultatului analizei; , "on M etode aut automatizate  omatizate 

line", care permit analiza directă a probelor din

fermentator, sau metode care necesită prelevarea aseptică de probe pentru analiză.

Tehnici de diluare

, în Seri i li niare 

care concentraţia de microorganisme descreşte în progresie

aritmetică (de exemplu: 0.8/0.6/0.4/0.2) şi care sunt puţin utilizate; Seri i lo   garítmice

(diluţii decimale), în care concentraţia de microorganisme

descreşte în progresie geometrică (ex. 0,1/0,01/0,001/0,0001 etc.). Pentru realizarea diluţiilor decimale, într -un număr de eprubete sterile egal cu numărul de diluţii necesar a se efectua, se pipetează aseptic 9 cm3 de lichid de diluţie (ser pentru Escherichia coli). fiziologic steril, apă distilată sterilă, mediu Ringer - pentru Escherichia

Tehnici de concentrare

Sunt utilizate în special pentru punerea în evidenţă a microorganismelor  patogene;  Metode de îmbogăţire ,

-un mediu care presupun inocularea probei de analiză într -un

favorabil pentru multiplicarea rapidă a celulelor aflate în concentraţii reduse în proba de analizat şi, după termostatare în condiţii optime de cultivare, se verifică prezenţa sau absenţa microorganismelor analizate, cu sau fără o determinare efectivă a concentraţiei de celule;  Metode de separare fizică sau fizico-  chimică chimică  a celulelor prin filtrare,

centrifugare, floculare, sedimentare, în care se determină concentrarea celulelor pe unitatea

de volum, ceea ce asigură posibilitatea evidenţierii lor ulterioare prin tehnici

directe sau culturale; 2

M etode de separ are  ar e  prin

interacţiuni hidrofobe-hidrofile, interacţiuni ale

sarcinilor electrice, anticorp-antigen, cu lectine.

I. TEHNICI MODERNE DE ESTIMARE DIRECTĂ A

NUMĂRULUI DE MICROORGANISME Estimarea electronică a numărului de microorganisme Aparatul

funcţionează

de

după

tip

Coulter

următorul

 principiu:

De o parte şi de alta a unui tub prevăzut cu un orificiu calibrat sunt dispuşi doi electrozi de platină imersaţi într -un electrolit, ale căror  borne sunt conectate la tensiune

continuă. Prin aspiraţia provocată la  partea superioară a tubului, celulele aflate în exteriorul tubului trec pe rând prin orificiu şi deplasează o dată cu fiecare pasaj un volum

de electrolit egal cu cel al celulei. Aceasta provoacă o creştere tranzitorie a

rezistenţei circuitului, ceea ce generează un impuls electric a cărui amplitudine este  proporţională cu volumul celulei. Impulsurile fiind de foarte scurtă durată, aparatul permite numărarea unui număr mare de celule, una câte una, într -un -un timp foarte scurt. 

Este posibilă şi o clasificare a celulelor în funcţie de de volumul lor.



Această tehnică, deşi sofisticată, este considerată extrem de interesantă şi se aplică

cu succes

pentru analiza suspensiilor de drojdii, realizând simultan cu numărarea şi

dimensionarea celulelor. 

Rezultatele sunt reproductibile când se utilizează suspensii diluate de celule;



Sarcina electrică a celulelor poate influenţa analiza conducând la obţinerea de

rezultate eronate; 3



Această tehnică nu se poate aplica în cazul culturilor ce conţin în suspensie, alături

de celulele microorganismului cultivat, şi particule solide. Citometrie în flux

Permite numărarea şi aprecierea stării fiziologice a celulelor, când detecţia se face prin măsurarea fluorescentei emise de celulele în prealabil marcate cu un colorant (fluorocrom).

După colorare, celulele sunt antrenate printr -un orificiu îngust şi trec una câte una prin faţa unei surse luminoase. Fluorescenta emisă de fiecare microorganism este captată printr -un fotomultiplicator şi analizată. Rezultatele sunt traduse pe o histogramă care redă numărul de evenimente în funcţie de intensitatea fluorescentei. Această histogramă traduce deci un profil al populaţiei. Adesea markerii coloranţi utilizaţi pot oferi diferite tipuri de răspunsuri: Dacă colorantul este un marker de viabilitate, din histogramă se deduce numărul de celule viabile şi starea fiziologică a populaţiei. Dacă histograma cuprinde net două picuri este posibilă numărarea separată a microorganismelor dintr-o cultură mixtă (de exemplu, streptococi şi

lactobacili).

Dacă markerul este un anticorp se pot număra specific anumite microor ganisme dintr-o populaţie heterogenă.

Principiul de funcţionare al citometrului în flux:  a, b – exemple de sisteme de detecţie  c  – diagramă de repartiţie a dimensiunilor  4

Tehnica de microscopie în fluorescenţă şi imunofluorescenţă Tehnica de microscopie în fluorescenţă

utilizează coloranţi specifici pentru

diferenţierea celulelor vii de cele moarte. Prin suspensionarea celulelor de drojdie în soluţie diluată de albastru de metilen cu citrat în preparat microscopic se vor putea diferenţia celulele vii (inc olore) de cele moarte (colorate în albastru). În mod similar, pot fi diferenţiate bacteriile vii de cele moarte după colorare cu acridin oranj. Tehnica de microscopie în imunofluorescenţă  permite detectarea unei categorii

 particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici.

Tehnica DEFT –  Direct Epifluorescent Filter Technique

Cuplează filtrarea prin membrane cu colorarea vitală a celulelor. Se aplică în cazul analizei microbiologice a produselor lichide (bere, vin, lapte).

 Numărarea se realizează prin studiu microscopic, după filtrarea produsului prin membrană (sau diluarea sa) şi colorarea vitală a celulelor. Procedeul este rapid (10-20 3

microorganisme/cm

min) şi sensibil. Limita de detecţie este de 104

, utilizând volume de probe de 100 cm3.

 Numărarea se poate realiza cu un microscop optic obişnuit după colorare cu albastru de metilen, albastru Loeffler sau amestec fucsină-albastru de metilen. Rezultate mai bune se obţin când numărarea se realizează cu un microscop cu fluorescentă sub lumină UV. În acest caz se utilizează coloranţi fluorescenţi (fluoresceina, primulina, auramina, acridin oranj, galben de acridină, acriflavina) ce  permit studiul la grosismente mici cu evidenţierea celulelor vii şi a celor moarte. II. TEHNICI INDIRECTE (CULTURALE) DE EVALUARE A

NUMĂRULUI DE MICROORGANISME A. metode de cul ti vare pe medii dense (metoda culturală Koch); B. metode de cultivare în medii lichide   (metoda titrului - metoda tuburilor

multiple; metoda diluţiilor limită). 5

Dezavantaje:

volum mare de muncă, sunt necesare ustensile sterile şi medii de

cultură adecvate, iar rezultatul analizei se obţine după un timp de termostatare necesar dezvoltării şi multiplicării celulelor, diferenţiat în funcţie de natura microorganismelor (în general: 3-5 zile/25...28°C -pentru fungi; 2 zile/37°C - pentru bacterii aerobe mezofile).

A. Numărarea microorganismelor prin cultivare pe medii dense Constă în inocularea unui volum cunoscut din suspensia de celule pe medii de cultură solidificate, în plăci Petri şi, după o perioadă de cultivare în condiţii optime, se numără coloniile formate. Rezultatul se exprimă în: 

număr de microorganisme [N/cm3 sau g] - în cazul microorganismelor care prezintă

celule individuale, neasociate; 

unităţi formatoare de colonii (ufc) [ufc/cm 3 sau g] — în cazul microorganismelor la

care celulele formează asociaţii (lanţuri, pachete, pseudomiceliu).

Tehnici de cultivare şi numărare a microorganismelor:

a - prin

filtrare; b - prin diluare (sau inoculare în volume mari)

6

A. 1. Tehnica clasică de numărare p rin cultivare pe medii dense,  în plăci Petri Metodologia de analiză presupune adoptarea a două modalităţi de inoculare a celulelor în/pe mediul de cultură solidificat, în plăci Petri, şi anume: a. inoculare în masa mediului solidificat   ,

când 1 cm3  din fiecare diluţie se

transferă cu câte o pipetă sterilă în plăci Petri sterile. Peste suspensia din fiecare placă se repartizează câte o eprubetă de mediu de cultură specific, cu agar (10 -15 cm3), fluidificat şi temperat la 40...45°C. Mediul se omogenizează cu suspensia din placă prin mişcări orizontale, circulare ale plăcii. După solidificarea mediului, prin termostatare în condiţii optime, se vor forma colonii atât la suprafaţa mediului cât şi în profunzimea acestuia. Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ

anaerobe, dar şi microorganismele aerobe le tolerează destul de bine. În cazul microorganismelor anaerobe se recomandă cultivarea în dublu strat, adică după înglobarea celulelor în mediu şi solidificare, primul strat de mediu se acoperă cu încă un strat de mediu steril; b. inoculare prin răspândirea celulelor pe suprafaţa mediului solidificat  - 0,1 3

cm

 probă diluată se transferă într -o placă Petri sterilă, în care, în prealabil, a fost

repartizat mediul de cultură cu agar. Suspensia se răspândeşte uniform pe întreaga suprafaţă a mediului de cultură cu ajutorul unui instrument special (de exemplu, spatulă Drigalski). Această tehnică prezintă dezavantajul că unele celule pot să rămână ataşate de instrumentul de etalare, cu efecte negative asupra acurateţei rezultatului analizei. Pentru obţinerea unor rezultate mai concludente se recomandă inocularea a câte două plăci în paralel pentru fiecare diluţie analizată.

7

Numărarea indirectă a microorganismelor prin cultivare pe medii dense

Citirea şi interpretarea rezultatelor 

După termostatarea în condiţii optime, apariţia vizibilă a coloniilor va depinde de  particularităţile fiziologice ale microorganismelor cultivate şi de condiţiile de cultivare, de obicei după 48-72 h de cultivare. În funcţie de numărul de colonii evidenţiate în plăcile din care s-a făcut numărarea se va calcula numărul de microorganisme pe gram sau cm3  probă de analiză, 3

cu formula: ufc/cm (g) = n • d 

în care

d este

coeficientul de diluţie corespunzător plăcii din care s-a realizat

numărarea. În cazul în care pentru aceeaşi diluţie s-au inoculat câte două plăci în paralel, n reprezintă media aritmetică a coloniilor numărate în cele două plăci. In cazul numărării coloniilor punctiforme se pot folosi sisteme dotate cu sursă de lumină, lupă pentru mărirea imaginii şi un dispozitiv de marcare şi înregistrare a coloniilor numărate.

8

A.2. Utilizarea Petrifilmelor pentru analiza

microbiologică

cantitativă şi calitativă " P etrifilms  " -

discuri în care mediul de cultură specific este deshidratat şi

acoperit cu o folie din plastic. La inocularea a 1 cm

suspensie

rehidratează

mediul

şi

prin

3

suspensie de celule, apa conţinută în

termostatare

este

posibilă

creşterea

microorganismelor. Există diferite tipuri de Petrifilm pentru: număr total de microorganisme, drojdii, bacterii coliforme. Avantaje: reducerea

timpului de analiză, reducerea preţului de cost/probă,

creşterea numărului de probe analizate, creşterea calităţii şi îmbunătăţirea substanţială a  productivităţii. Tehnica de utilizare a Petrifilmelor

Tip Petrifilm

Caracteristici

Petri film™ 3M™ bacterii aerobe Petrifilm™

jM1'1

mucegaiuri

Petrifilm™ Enterobacleriaceae

determinarea numărului total de bacterii aerobe;  analiza este eficientă prin prezenţa unui indicator care colorează coloniile în roşu drojdii şi  determinarea numărului total de drojdii şi mucegaiuri;  nu necesită adăugarea de antibiotice sau acid tartric 3M™  evidenţiere bacterii din familia Enterobacteriaceae;   producerea de acid evidenţiată cu ajutorul unui indicator de pH ce virează în galben;  evidenţiere formare gaz prin fermentaţia heterolactică 

a lactozei

Petrifilm™ 3M™ coliformi totali

evidenţiere coliformi totali;  analiza este înlesnită de prezenţa unui indicator care colorează coloniile în roşu;  filmul superior reţine gazele rezultate prin fermentaţia substratului lactoză 

9

Petrifilm™ 3M™ de înaltă  evidenţiere bacterii coliforme la diluţii mari în probele sensibilitate pentru evidenţiere de analizat - 1-2 celule/g;  bacterii coliforme - HSCC   permite inocularea a 5 cm' probă sau diluţii ale acesteia;

evaluare identică cu Petrifilm™ 3M™ coliformi totali şi fecali Petrifilm™ 3M™ Escherichia coli  două teste în unul singur: evaluare cantitativă a coliformilor fecali şi a lui E. coli;  conţine indicator P -glucuronidază pentru evidenţierea 

lui E coli;

rezultate pozitive în 24-48 h:  înaltă selectivitate Petrifilm™ 3M™ coliformi 2000  dezvoltarea rapidă a bacteriilor coliforme; (P2000)  indicator depH foarte sensibil - evidenţierea producerii de acid chiar de la începutul formării coloniilor;  reducerea timpului de analiză prin asigurarea unei creşteri accelerate;  rezultate test prezumtiv în 6 -14 h. cu confirmare în 18 

24 h 

Kit HEC

evidenţiere serotipurile enteropatogene 0157: H7 E.

coli, care produc glucuronaze;

se bazează pe utilizarea membranei active ELISA, care se pune în contact 2 min cu Petrifilmul; după 18 h de incubare testul pozitiv se evidenţiază prin apariţia petelor gri pe membrană;  analiză simplă, rapidă şi precisă fară echipament 

special Petrifilm 3M - teste de control al mediului



control mediu prin contact



metodă simplă şi eficientă

direct sau ştergere;

Particularităţi ale Petrifilmelor 3M Tipuri de microorganisme Caracteristici Bacterii aerobe mezofile Coliformi  Escherichia Drojdii şi mucegaiuri totali coli Indicator TTC TTC TTC BCIP Mediu OGA+cIoram.clor PCA VRBL VRBL+BCIG telr. Temperatura Incubare

30°C  48/72 h

c

30/44 C 24 h

30/44°C

20/30°C

24 h

72/120 h

TTC — clorură de trifenil tetrazoliu (culoarea virează spre roşu datorită reducerii

de către microorganisme cu formare de formazan); BCIP -  brom

cloro indoxil fosfat (indicator pentru fosfatază, produsă in general

de drojdii şi mucegaiuri; virajul culorii, precipitat bleu);

10

BCIG —  brom cloro

indoxil β glucuronidă este indicator al β glucuronidazei, pe

care o posedă Escherichia coli; are loc virajul culorii —  precipitat bleu. Tipuri de Petrifilme 1. Petrifilm pentru num ărat bacterii aerobe şi facultativ anaerobe

2. Petrifilm pentru num ărat drojdii şi mucegaiuri

Conţine un mediu selectiv cu 2 antibiotice cu spectru larg, pentru suprimarea

creşterii bacteriilor şi BCIP (brom cloro indoxil fosfat), ca indicator.

3. Petrifilm pentru num ărat bacterii coliforme

Conţine un mediu selectiv cu bilă, lactoză şi 2 indicatori: VR (roşu violet) şi TTC

11

4. Petrifilm pentru num ărat E. coli , coliformi şi necoliformi

Conţine un mediu selectiv cu bilă, lactoză şi BCIG (brom cloro indoxil β glucuronidă) ca indicator.

A.3. Evaluarea numărului de microorganisme după filtrare prin membrană Această metodă se pretează la analiza probelor lichide cu un conţinut redus de microoganisme, care nu conţin compuşi ce produc colmatarea filtrului. Pentru analiză, o cantitate controlată de lichid de analizat (1 - 10 cm3) se transferă aseptic în rezervorul aparatului de filtrare, apoi lichidul se trece prin fi ltru (cu  pori mici, capabili să reţină toate microorganismele), după care membrana se ridică aseptic cu o pensetă sterilă şi se transferă într -o placă Petri sterilă în care în prealabil s-a repartizat mediul de cultură adecvat, cu agar. In alte cazuri, mediul de cultură specific este impregnat în membrană şi astfel, după filtrare, membrana se plasează într -o placă Petri sterilă. Prin termostatare în condiţii optime la suprafaţa membranei se formează colonii caracteristice, care se pot număra şi analiza din punct de vedere morfologic. Firme specializate produc şi comercializează medii specifice şi membrane destinate analizei prin filtrare: Hach, Sartorius, Millipore.

A.4. Evaluarea numărului de microorganisme prin utilizarea mediilor de imersie Tehnici

moderne prevăd cultivarea microorganismelor pe lame de mediu cu

geloză sau benzi de hârtie impregnate cu medii adecvate. 12

 Lamele cu medii de cultură gelozate

se menţin în tuburi speciale, sterile. In

momentul utilizării se extrage aseptic lama din tub, se imersează în proba de analizat, după care se reintroduce în tubul steril şi se termostatează la temperatura optimă de creştere, specifică microorganismelor analizate. După termostatare, 16-24 h pentru  bacterii şi 3-4 zile pentru drojdii şi mucegaiuri, se pot număra coloniile caracteristice care s-au dezvoltat la suprafaţa lamei.

Lame specializate pentru control microbiologic selectiv 

Lame Hychech (Difco) (medii gelozate: PCA + PCA 0,01 TTC*) - destinate pentru

determinarea numărului total de microorganisme; 

Lame pentru evidenţierea bacteriilor din familia  Enterobacteriaceae (geloză

tripticază soia + VRBC geloză); 

Lame pentru evidenţierea selectivă a bacteriilor din genul  Pseudomonas (mediu

specific cu geloză); 

Lame pentru determinarea fungilor filamentoşi (geloză tripticază soia; tripticază

soia cu TTC + geloză cu roz bengal şi cloramfenicol ş.a.); 

Lame Biokar - pentru număr total de coliformi; număr total de drojdii şi mucegaiuri;



Lame Lactocult - pentru controlul microbiologic al laptelui;



Lame Microtest.

Benzile de hârtie impregnate cu medii selective (Dacto Strip) 

Sunt alte sisteme comerciale pentru controlul microbiologic rapid şi eficient al

alimentelor; 

Se pretează cel mai bine la controlul produselor lichide (industria laptelui);



Constau din benzi sterile

de hârtie impregnate cu mediu specific, pentru care se

 precizează: timpul necesar de menţinere în contact cu proba de analizat; volumul de lichid pe care îl adsorb (0,1-1 cm3); 

Pentru analiză, banda sterilă se imersează în lichidul de analizat, apoi se reintroduce

in ambalajul steril şi se termostatează in condiţii optime.

13

B. Evaluarea numărului de microorganisme prin cultivare în medii lichide

Prin inocularea celulelor în medii lichide şi termostatare în condiţii optime de multiplicare se determina

statistic numărul de microorganisme în funcţie de observaţiile

 privind prezenţa sau absenţa creşterii (determinare de

uft  - unităţi formatoare de

). turbiditate 

Creşterea poate fi apreciată vizual, prin analiză turbidimetrică, prin virajul culorii mediului, formarea de gaz ş.a.

Avantajele utilizării mediilor lichide 

Este posibilă analiza unor cantităţi mari de produse, fapt extrem de important pentru

cercetarea, în special, a microorganismelor patogene; 

Este posibil studiul unor proprietăţi fiziologice (producere de acid, formare de gaze

ş.a); 

Permite cultivarea în condiţii selective, specifice pentru un grup de microorganisme

ce trebuie determinat.

Metoda de cultivare în medii lichide se bazează pe două tehnici de analiză :  Metoda diluţiilor limită -  prin ino culare

din proba de analizat şi diluţii decimale

succesive în câte o eprubetă cu mediu de cultură adecvat şi, după termostatare corespunzătoare, prin analiza probelor se stabileşte numărul de microorganisme, în funcţie de ultima diluţie în care a fost observată creşterea. Aceasta este o metodă semicantitativă şi permite evaluarea orientativă a gradului de contaminare al produsului de analizat; Metoda

titrului

(metoda

tuburilor

multiple) 

 –   presupune inocularea

microorganismelor prezente în proba de analiză şi diluţii decimale succesive, în mai multe eprubete în paralel (2-5) cu mediu de cultură adecvat (9 sau 10 cm), După termostatare în condiţii optime se fac aprecieri asupra creşterii şi se stabileşte numărul de microorganisme prin analiza statistică a rezultatelor, folosind tabelul Mac Grady.

14

Metoda diluţiilor limită

Metoda titrului (metoda tuburilor multiple) a) Determinarea bacteriilor coliforme Metoda include teste  prezumtive

şi de confirmare, bazate, în primul rând, pe

capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO 2, H2, în timp

de 48 ore la 35°C. Testul prezumtiv

constă în inocularea probei în mediu nutritiv BCLP (bulion de

carne cu lactoză şi plutitor), mediu de îmbogăţire favorabil înmulţirii atât a bacteriilor coliforme cât şi a altor bacterii care folosesc lactoza ca sursa de carbon. Testul de confirmare,

constă în inocularea culturilor din eprubetele pozitive ale

testului prezumtiv pe medii selective BBLVP (bulion, bilă cu lactoză, verde briliant şi  plutitor)

care inhibă dezvoltarea bacteriilor însoţitoare şi asigură înmulţirea bacteriilor

coliforme.

Din grupul coliform, cel mai frecvent întâlnit este genul  Escherichia  cu specia  Escherichia coli,

care indică o contaminare fecală recentă. 15

a) Determinarea bacteriilor coliforme. Tehnica de lucru

Din probă şi diluţii succesive de inoculează câte 1ml în câte 3 eprubete cu BCLP. Se termostatează la 37°C timp de 24-48 ore. Se înregistrează eprubetele pozitive (mediu tulbure, bule de gaz în plutitor, pH acid), iar eprubetele negative sunt din nou termostatate timp de 24 ore şi se înregistrează din nou eprubetele pozitive. Pentru confirmare, din eprubetele pozitive se recoltează câte o ansă şi se inoculează eprubete cu BBLVP; după incubare la 37°C timp de 48 ore, în condiţiile în care se produc din nou gaze în plutitor, tulburare, virajul culorii indicatorului verde  briliant de la verde la galben, înseamnă că în apa (produsul analizat) sunt prezente  bacteriile coliforme.

Calcul şi interpetare Folosind metoda titrului,

în funcţie de numărul eprubetelor pozitive se stabileşte

numărul caracteristic (NC), şi din tabelul lui Mac Grady, corespunzator numărului caracteristic se notează numărul probabil de microorganisme (NPM). Pentru a calcula numărul probabil de coliformi/cm3  produs analizat, valoarea din tabel se înmulţeşte cu factorul de diluţie corespunzator primei cifre din numărul caracteristic. Numărul de coliformi admişi în 100 ml apă, conform SR EN ISO 9308 -1/2004, este de 0. Determinarea bacteriilor coliforme (Schemă)

16

Tabelul Mac Grady  NC

NPM

NC

NPM

000

0,0

102

1,1

001

0,3

110

0,7

010

0,3

111

1,1

011

0,6

222

3,5

020

0,6

223

4,0

100

0,4

321

15,0

101

0,7

333

140

17

III. TEHNICI DE EVALUARE A CREŞTERII  PRIN DETERMINAREA GLOBALĂ A BIOMASEI 

Pot fi

aplicate atât pentru evaluarea populaţiilor aparţinând microorganismelor

unicelulare, dar mai ales în cazul microorganismelor filamentoase. 

Biomasa microbiană este recuperată, în general prin centrifugare (2000 -4000 rot.,

10 min., la 4°C), este spălată de mai multe ori cu soluţie 0,9% NaCl, pentru îndepărtarea impurităţilor din mediul de fermentaţie, reţinute o dată cu celulele, apoi uscată la temperatura de 105°C, până la greutate constantă. Dezavantaje  

Este puţin sensibilă;  Nu se aplică decât în cazul mediilor lichide fermentate în care microorganismele

sunt singurele particule în suspensie;  

 Nu se poate face distincţie între biomasa vie şi cea autolizată; Conţinutul de biomasă nu reflectă întotdeauna gradul de multiplicare al celulelor.

De exemplu, în cazul mucegaiurilor, celulele cresc acumulând intracelular substanţe de rezervă şi formează pereţi celulari groşi fără să se producă diviziunea celulară.

IV. ESTIMAREA CANTITĂŢII DE BIOMASA PRIN DOZAREA UNOR CONSTITUENŢI CELULARI Determinarea cantitativă a unor componenţi aflaţi în concentraţie aproximativ constantă în celulele microbiene oferă indicaţii asupra evoluţiei unei culturi. Principiul acestor metode constă în măsurarea concentraţiei unor componenţi celulari şi, considerând aceasta aproximativ constantă per celulă, este posibilă stabilirea  prin echivalenţă a concentraţiei de biomasa. Astfel de componenţi sunt: proteine, acizi nucleici (ARN, ADN), ATP, NADH. Celulele separate de mediul de fermentaţie prin filtrare sau centrifugare sunt spălate pentru îndepărtarea impurităţilor, apoi sunt supuse unor tratamente mecanice sau fizice pentru eliberarea componenţilor celulari şi evaluarea acestora prin tehnici standardizate de analiză.

18

Determinarea concentraţiei proteinelor celulare Creşterea şi multiplicarea celulelor este în dependenţă directă cu biosinteza de  proteine. Pentru evaluarea conţinutului total de proteine sunt recomandate metodele clasice: metoda biuretului, metoda Lowry, metoda Bradford, metoda Kjeldahl, sau

hidroliza proteinelor şi dozarea aminoacizilor. Metoda biuretului  este

cea mai recomandată în astfel de studii. Principiul

metodei constă în formarea unui complex colorat între ionii de cupru şi grupările proteice încărcate cu sarcini negative. M etoda L owry se

utilizează atunci când concentraţia de celule în suspensia de

analizat este mică. Cantitatea de proteine se determină prin comparaţie cu o curbă etalon cu albumina serică bovină. Conţinutul în proteine se poate exprima şi prin dozarea azotului, utilizând metoda Kj eldahl (proteine = Nx 6,25).

Determinarea acizilor nucleici

Biomasa microbiană are un conţinut remarcabil, constant, de ADN. Acest constituent este în general absent în ingredientele mediului de cultură, ceea ce exclude eventualele interferenţe, dar, din păcate, determinarea sa este destul de sofisticată, necesitând tehnici de liză a celulelor, extracţie, separare. Pentru dozare se apelează la metode spectrofotometrice (λ= 260 nm) sau colorimetrice (λ = 600 nm) prin reacţia cu difenilamină în prezenţă de acid percloric. Studiul acizilor nucleici este utilizat mai mult pentru identificare.

Determinarea conţinutului de ATP Evaluarea biomasei microbiene prin determinarea conţinutului de ATP tinde să se generalizeze. ATP-ul este un constituent normal al celulelor vii, fiind un intermediar important

al metabolismului celular cu rol în metabolismului energetic. Principiul metodei de determinare a ATP-ului

se bazează pe emisia luminoasă

 produsă prin oxidarea luciferinei la oxiluciferină, reacţie catalizată de către enzima luciferază în prezenţă de ATP. 19

Această emisie, care poate fi măsurată spectrofotometric, este obţinută în câteva secunde, conform ecuaţiei: ATP + luciferina + O2

oxiluciferină + AMP+ PPi + CO2 + lumina

Măsurarea bioluminescenţei se realizează la  λ = 562 nm cu ajutorul unor aparate speciale (fluorimetre).

Variaţia conţinutului de ATP al microorganismelor este în funcţie de specie şi de starea fiziologică, cu factori de variaţie de la 1 la 10. Se consideră conţinutul mediu de ATP în celule microbiene ca fiind aproximativ 5x 10-16 g ATP/celulă (= 1 mg ATP·g-1 substanţă uscată biomasă). Dezavantaje 

Metoda este laborioasă mai ales dacă se au în vedere dificultăţile de extracţie a

ATP-ului din celulele microbiene; 

Tehnica de analiză a ATP-ului nu oferă rezultate corespunzătoare în cazul unor

 populaţii heterogene ce conţin celule de vârste variabile; 

Se aplică cu succes pentru studiul culturilor pure în sisteme continue de fermentaţie;



Pentru rezultate mai concludente

se recomandă corelarea conţinutului în ATP cu

numărul de celule.

Măsurarea spectrofotometrică a fluorescentei Aceasta poate fi emisă de anumiţi componenţi celulari, care au abilitatea de a reemite lumina absorbită prin modificarea lungimii de undă.

20

Compuşii care emit fluorescentă (fluorofluori) cu importanţă pentru evaluarea populaţiilor microbiene

Relaţia dintre fluorescentă şi concentraţia compusului care emite fluorescentă Dacă fiecare celulă conţine o concentraţie intracelulară aproximativ constantă a unuia din fluorofluorii prezentaţi în tabelul 7.5. concentraţia de celule se poate determina în funcţie de fluorescenta emisă, măsurată spectrofotometric, conform curbei

Principiul măsurării fluorescentei unei culturi Dintre compuşii fluorofluori, cel mai adesea se recurge la NADH, care emite fluorescentă la 460 nm, când este excitată în lumină la lungimea de undă  λ = 340 nm. În forma oxidată (NAD+) coenzima nu are fluorescenţă. În cursul creşterii celulare, cantitatea de NADH creşte în raport direct proporţional cu multiplicarea celulelor,  permiţând astfel evaluarea concentraţiei de biomasă.

21

Factori care influenţează fluorescenţa  pH,

temperatura, prezenţa unui agent antispumant, modificări ale activităţii

metabolice a celulelor determinate, spre exemplu, prin limitarea oxigenului. Pentru

măsurare se lucrează întotdeauna cu celule vii, cu o stare fiziologică constantă. Această metodă de analiză permite evaluarea celulelor vii, este relativ specifică, sensibilă şi exactă, dar aplicarea sa este recomandată pentru evaluarea populaţiilor ce conţin celule cu vârste şi stări fiziologice constante (culturi continue, sincrone). În  practica industrială fluorescenta se măsoară "on line" direct în bioreactor.

Determinarea conţinutului de chitină şi ergoste rol Metoda este recomandată pentru estimarea biomasei fungilor filamentoşi. Chitina, polimer de N-acetil-D-glucozamină,

este un constituent major al

 pereţilor hifali şi învelişurilor sporale. Ea este prezentă în exoscheletul insectelor, dar lipseşte din compoziţia bacteriilor şi alimentelor. Astfel, prin determinarea cantitativă a conţinutului de chitină din mucegaiuri se poate estima indirect cantitatea de biomasă.

22

V. TEHNICI TURBIDIMETRICE ŞI NEFELOMETRICE DE

EVALUARE A CREŞTERII MICROORGANISMELOR  V.1. Metoda comparativă

Constă în compararea turbidităţii unei suspensii de celule cu turbiditatea unor etaloane cu albumină. De exemplu, turbiditatea unei suspensii de bacterii de 5-109 3

 bacterii/cm

corespunde unei suspensii cu o concentraţie de 0,5 g/dm3 albumină.

Această metodă este mai puţin precisă şi se utilizează de obicei în studii comparative.

V.2. Metoda turbidimetrică Tehnica permite stabilirea concentraţiei de celule în funcţie de absorbanţa suspensiei de celule, care se determină cu ajutorul unui sp ectrofotometru sau nefelometru.

Principiul metodei

Similar cu legea Beer- Lambert

există o proporţionalitate între absorbanta culturii

(densitatea optică) şi concentraţia de celule în suspensie, conform relaţiei:  A=εIC,

în care:  A este absorbanta, măsurată la λ = 600 nm; ε  - coeficient de

extincţie ''celular“, C - concentraţia celulelor în suspensie. În funcţie de substanţa uscată a masei celulare şi de absorbanţa culturii, comparativ cu mediul de cultură steril considerat ca referinţă, poate fi trasată o curbă etalon A = f (biomasă substanţă uscată) Această corelaţie este valabilă până la o valoare limită a absorbantei, variabilă în funcţie de: aparatul de măsură, lungimea de undă, natura suspensiei ş.a. 23

Corelaţia absorbanţă-biomasă substanţă uscată

Aplicabilitate 

Această metodă rapidă este valabilă în cazul microorganismelor unicelulare

dezvoltate în medii definite şi limpezi. Prezenţa de particule în suspensie, altele decât celulele microbiene, perturbă evident măsurătorile. 

Tehnica

nu se pretează întotdeauna pentru evaluarea creşterii microorganismelor

filamentoase. 

Se poate aplica pentru măsurări în sistem continuu ("on line"),  pe tot parcursul

desfăşurării procesului fermentativ, graţie punerii la punct a unor biofotometre sterilizabile cu funcţionare continuă. 

Există aparate care măsoară turbiditatea în microplacă, cum este de exemplu

analizorul Bioscreen-Labsistem.

Metoda nefelometrică 

Permite măsurarea luminii difuze şi oferă informaţii asupra dimensiunilor celulelor

şi concentraţiei lor în suspensii lichide. 

În practica de laborator se prepară etaloane nefelometrice din sulfat de bariu; într -o

serie de 10 eprubete egale se repartizează o soluţie de clorură de bariu 1%, în cantităţi  progresiv crescânde de la 0,1 cm3 Ia 1 cm3 . 

În fiecare eprubetă se completează apoi volumul până la 10 cm 3, cu o soluţie de acid

sulfuric 1%. 24



Opacitatea formată de sulfatul de bariu rezultat din reacţie corespunde în prima

eprubetă unei concentraţii bacteriene de 3·108 celule/cm3; etalonul următor corespunde la o concentraţie de 6·108 celule/cm3; al treilea etalon, la 9·10 8 celule/cm3. 

În momentul utilizării, eprubetelor care conţin etaloanele li se omogenizează

conţinutul.

VI. ESTIMAREA CANTITĂŢII DE BIOMASĂ PRIN EVALUAREA ACTIVITĂŢII METABOLI CE A CELULELOR Prin activitatea metabolică a celulelor, compoziţia mediului de cultură se modifică considerabil pe tot parcursul desfăşurării procesului fermentativ. În paralel cu acumularea de biomasă se produce un consum al nutrienţilor, oxigenului şi amoniacului, formarea produşilor de metabolism şi de asemenea se degajă căldura rezultată prin reacţii catabolice exergonice. Tehnicile de analiză nu sunt aplicabile decât în condiţii bine definite: faza exponenţială de creştere, temperatură, mediu de cultivare adecvate. Modificările stării fiziologice ale celulelor conduc la activităţi variabile care nu sunt întotdeauna corelate cu cantitatea de biomasă. Aceste metode asigură în primul rând evaluarea stării metabolice a celulelor şi, în mai mică măsură, determinarea concentraţiei de biomasă.

VI.1. Măsurarea luminescenţei naturale Ia bacterii Unele bacterii aparţinând genurilor  Alternomonas, Photobacterium, Vibrio ş.a.,  prezintă o luminescenţă naturală. În general, această luminescenţă este emisă ca urmare a reacţiei: FMNH2 + RCHO + O2

FMN + H2O + RCOOH + lumină (λ = 490 nm)

Măsurarea luminii emise se realizează prin numărarea fotonilor şi fotomultiplicare. Aceasta permite într -o oarecare măsură aprecierea numărului de microorganisme.

25

VI.2. Studiul proprietăţilor fizico -chimice ale mediului de fermentaţie 

Potenţial redox

  pH 

Vâscozitate



Cantitate de căldură degajată





Formarea de CO2

Impedanţa

Potenţialul de oxido -reducere - rH  Numeroase microorganisme modifică potenţialul oxido-reducător   al mediilor de cultură utilizând oxigenul şi eliberând substanţe reducă-toare ca urmare a activităţii lor reductazice.

Intensitatea şi viteza de modificare a potenţialului redox depind de numărul şi natura microorganismelor, de activitatea metabolică, de natura mediului de cultură şi de condiţiile de mediu (aerare, agitare, temperatură) etc. Tehnici de evaluare a activităţii reductazice se aplică în prezent pentru aprecierea numărului de microorganisme vii din lapte, carne, sucuri Principiul metodelor bazate pe studiul potenţialului oxido-reducător

Acestea se bazează pe măsurarea timpului necesar pentru virajul culorii unui indicator redox, timp care este în directă concordanţă cu numărul de microorganisme vii din proba de analizat. De exemplu, un număr d e 106  bacterii produc reductaze care determină decolorarea unei soluţii de albastru de metilen după o oră, ca urmare a trecerii albastrului de metilen din forma oxidată, colorată în albastru, la un leucoderivat incolor. Această metodă nu este specifică şi, în general, este utilizată pentru aprecierea numărului total de bacterii vii. Cei mai utilizaţi indicatori redox sunt: resazurina, albastru de metilen, clorura de trifeniltetrazoliu (TTC).

26

Resazurina este un indicator redox care îşi schimbă culoarea de la albastru violet spre roz şi incolor, în funcţie de potenţialul de oxido-reducere. Cu albastru de metilen reducerea se traduce prin virarea culorii indicatorului de la albastru la incolor, iar în cazul clorurii de trifeniltetrazoliu culoarea variază de la incolor la roşu-violet. Indicatori redox utilizaţi pentru aprecierea numărului total de bacterii

Determinarea pH - ului

Ca urmare a activităţilor metabolice, microorganismele determină frecvent modificarea pH-ului

mediului de cultură prin formare sau consum de acizi organici,

 producerea de compuşi alcalini sau ca efect al schimburilor ionice. Atunci când aceste modificări pot fi corelate cu creşterea, este posibilă estimarea concentraţiei de biomasă. Modificarea pH-ului mediilor de cultură este în general sesizată senzorial prin virajul culorii unui indicator de pH. Nivelul de detecţie al acestei metode este foarte scăzut. Se preferă să se realizeze dozarea titrimetrică cu determinarea: acidităţii totale şi volatile (aciditate Dornic la lapte); alcalinităţii

totale (alcalinitate brută); azotului bazic

total, volatil (ABVT).

27

Evaluarea vâscozităţii mediului Ca urmare a evoluţiei proceselor metabolice celulare pe parcursul fermentaţiei se  produc modificări ale proprietăţilor reologice ale mediului fermentativ. Modificarea vâscozităţii mediului fermentativ poate constitui un criteriu de evaluare a creşterii. Aceasta se poate datora fie consumului unui nutrient (de exemplu glicerol), fie acumulării de produşi de fermentaţie (poliglucide: xantan, dextran ş.a.), sau ca urmare a creşterii concentraţiei de celule. Există în prezent vâscozimetre pentru un domeniu larg de măsurare a vâscozităţii, care pot face măsurători “on line". În cazul vâscozităţilor foarte mari, nu s-a realizat până un prezent un instrument de precizie pentru măsurarea acestora. Determinarea CO2

Sunt cunoscute în prezent mai multe tehnici de evaluare a conţinutului de CO2 rezultat ca urmare a activităţii metabolice a microorganismelor. Una dintre metode se bazează pe măsurarea conductivităţii într -un mediu cu geloză şi KOH în care este captat CO 2 rezultat prin fermentaţie. Prin înlocuirea progresivă a ionilor hidroxil cu ioni carbonat, mai slabi conductori, se reduce conductivitatea mediului.

Această tehnică se utilizează în special pentru evaluarea numărului de drojdii, Clostridium tyrobutyricum, coliformi totali, Escherichia coli etc.

Măsurarea impedanţei Impedanţa electrică Z, sau conductanţa mediului de cultură, se modifică prin dezvoltarea celulelor microbiene pe parcursul desfăşurării  procesului fermentativ, ca urmare a transformării moleculelor electric neutre în molecule ionizante, cu atât mai rapid cu cât microorganismele se dezvoltă mai repede. Modificarea impedanţei variază în funcţie de: concentraţia de celule şi tipul microorganismului,

mediul de cultură, temperatură, modul de măsurare, frecvenţa

semnalului aplicat, proprietăţile suprafeţei şi geometria electrodului şi distanţa dintre electrozi.

28

Se măsoară modificarea impedanţei mediului pe parcursul dezvoltării culturii, Za, comparativ

cu un mediu martor de referinţă, Zref . Variaţia impedanţei se calculează

cu formula:

Aplicabilitate 

Metoda este rapidă şi permite analiza unui număr mare de probe, dar nu permite

evaluarea numărului de celule vii, iar în cazul culturilor de drojdii şi mucegaiuri nu se  produc modificări mari ale conductanţei mediului, deoarece prin metabolismul lor se  produc puţine molecule ionizabile. 

Această metodă este utilizată pentru analiza cărnii, a laptelui, iar pragul de detecţie 6

7

3

este de aproximativ 10  -10  celule/cm . 

Aparatele utilizate pentru astfel de determinări sunt cunoscute sub denumirea

comercială: Bactometru-Bactomatic (Meriuex); Bactobridge (TEM, CS); Bactrac (SyLab/Foss Electric): Malthus (Tacussel); Rabbit (Whitler-AES); ESP (Difco) ş.a

VI.3. Evaluarea consumului de substrat şi formare de produşi de metabolism

Creşterea şi multiplicarea celulelor microbiene într -un mediu adecvat au ca rezultat consumul de substrat şi formarea produşilor de metabolism. Dacă biomasa este produsul principal al fermentaţiei, atunci, prin măsurarea consumului de substrat se poate determina concentraţia de biomasă. Astfel, substanţa uscată solubilă a mediului se regăseşte în substanţa uscată a biomasei.  În acest caz,  se poate urmări cinetica creşterii şi multiplicării celulelor prin analiza densimetrică sau refractometrică a mediului fermentativ. La microorganismele aerobe, folosirea surselor de C, N, O sau minerale, reprezintă indicii ale creşterii culturii.

 Evaluarea consumului de substrat şi formarea produşilor de metabolism se poate realiza prin: 

Dozarea chimică 29



Evaluarea activităţii unor enzime



Dozarea în flux continuu



Măsurarea directă a schimburilor de gaze



Tehnici radiometrice

Dozarea chimică Determinarea cantitativă a produşilor de fermentaţie care au legătură directă cu creşterea: CO2, etanol, acid acetic, ergosterol (în cazul mucegaiurilor) ş.a., oferă informaţii asupra evoluţiei culturii şi pot fi corelaţi cu creşterea. Prin cromatografie de înaltă performanţă a fost posibilă cuantificarea foarte fină a cineticii formării substanţelor volatile în timpul fermentaţiei şi corelarea acestora cu creşterea celulelor. De exemplu, aplicând această metodă a fost posibilă stabilirea corelaţiei dintre cinetica producerii aldehidei acetice şi cinetica creşter ii celulelor de Streptococcus salivarius ssp. thermophilus.

Evaluarea activităţii unor enzime Testele se referă la dozarea de compuşi din mediul de fermentaţie (substrat sau  produşi de fermentaţie), care pot fi determinaţi prin evaluarea activităţii unor enzime. În  prezent, firme specializate (ex. compania Boehringer) comercializează numeroase kituri de dozare, şi anume: 

teste pentru măsurarea în UV a unui cofactor oxidat



(NAD

+

NADH + H  ): aldehida acetică -  aldehid dehidrogenaza; acid acetic -

citrat sintetaza, malat dehidrogenaza, lactic dehidrogenaza; 

teste colorimetrice: acid ascorbic - ascorbat oxidaza; acid gluconic - gluconat

kinaza; acid glutamic - diaforaza, glutamat dehidrogenaza; Prin cromatografie gaz-lichid se poate determina cantitativ metanolul eliberat din

 pectină de către pectinesterazele fungice şi prin aceasta se poate estima indirect cinetica creşterii culturii fungice.

Dozarea în flux continuu (Flow Injection Analysis - FIA) Aceste tehnici automatizate permit dozarea a unor

compuşi (alcooli, glucide,

uree, oxigen, fosfat ş.a.) prin metode chimice, biochimice, spectrofotometrice şi anume: 30

Sistemul FIA Enviroflow

(Tecator/Perstorp) permite determinarea, prin analiză

spectrofotometrică, în flux continuu, a substraturilor sau produşilor rezultaţi din activitatea metabolică a microorganismelor din apă şi diferite alimente; Cromatografía în fază gazoasă şi cromatografía în fază lichidă (HPLC)  permit

dozarea unei game largi de compuşi. Prin cromatografie în fază gazoasă se pot determina: etanolul, alţi alcooli, acizii volatili, acetoina, hidrocarburile, CO2. Cromatografía în fază lichidă permite evidenţierea: glucidelor, etanolului, acizilor organici, aminoacizilor, hidrocarburilor, fosfaţilor, antibioticelor;  Biosenzorii sunt instrumente

de măsură a concentraţiei unei game variate de

compuşi sau de determinare a numărului de celule dintr -o populaţie de micro-organisme. Biosenzorii sunt utilizaţi pentru: controlul proceselor biotehnologice industriale, controlul calităţii produselor alimentare (detectarea concentraţiei unor substanţe utile: glucide, acizi organici, alcooli, aminoacizi, nitraţi, ioni metalici; detectarea contaminării cu microorganisme - Salmonella, Listeria, Staphylococcus), monitorizarea parametrilor

mediului înconjurător:  Alte metode

utilizate pentru dozarea compuşilor chimici sunt: rezonanţa

magnetică nucleară (RMN) -  pentru dozarea etanolului, compuşilor cu azot, ionilor fosfat; analiza în infraroşu (IR) - pentru alcooli, CO2; analiză paramagnetică determinarea oxigenului;  spectrometrie de masă (SM) - pentru alcooli, amoniu, oxigen;

absorbţia atomică - pentru metale.

Măsurarea directă a schimburilor de gaze Se poate realiza printr-o

tehnică manometrică cu ajutorul aparatului clasic

Warburg sau cu ajutorul unui oximetru Gilson.

Se consideră că intensitatea acestor schimburi este direct proporţională cu mărimea unei populaţii de celule, dar această corelaţie este mult influenţată de starea fiziologică a celulelor . Tehnici radiometrice

Tehnica de analiză constă în cultivarea celulelor pe un substrat radioactiv, după care se măsoară radioactivitatea mediului, prin analiza unui compus marcat (de exemplu, 31

se determină cantitatea de 14CO2 rezultat din metabolizarea 14C glucoza). Aceste tehnici sunt complexe şi, în prezent, puţin utilizate.

TEHNICI DE STUDIU ŞI IDENTIFICARE A MICROORGANISMELOR

Identificarea unui microorganism se poate realiza numai după ce a fost izolat în cultură pură. Tehnicile utilizate sunt numeroase, variate şi specifice in funcţie de natura microorganismelor

studiate

(bacterii,

drojdii,

mucegaiuri).

Identificarea

microorganismelor se realizează pe baza caracterelor morfologice (culturale, microscopice), fiziologice (biochimice), sexuale, imunologice, genetice, lizotipice şi de  patogenitate.

I.1 Studiul microscopic al microorganismelor

Cu ajutorul preparatelor microscopice se pot studia forma şi dimensiunile celulelor unor elemente de structură, starea fiziologică şi se pot evidenţia tinctorial anumite proprietăţi ale microorganismelor. Examenul microscopic

începe întotdeauna prin realizarea unui preparat între

lamă şi lamelă (umed), care se analizează cu obiective uscate, cu grosisment x 10 şi x  40. Acest examen permite diferenţierea culturilor de drojdii şi mucegaiuri de cele de bacterii. În cazul microorganismelor eucariote (drojdii, mucegaiuri) examenul microscopic în stare vie, în preparate umede, permite un studiu eficient al caracterelor morfologice, studiul unor particularităţi privind modul de reproducere şi dimensionarea în plan orizontal a celulelor. În cazul bacteriilor, utilizarea preparatelor umede pentru studiul morfologic nu este eficientă din cauza dimensiunilor lor extrem de reduse. Cu excepţia unor studii de evidenţiere a mobilităţii, bacteriile se studiază numai in preparate uscate şi colorate (colorarea simplă, colorare diferenţială, colorare de structuri celulare: capsule, cili. incluziuni ş.a). Dimensionarea în plan orizontal a celulelor microbiene Măsurătorile în plan orizontal permit stabilirea, pe cale microscopică, în mod indirect,

a două din dimensiunile celulei (lungime - lăţime), prin intermediul unei scări 32

arbitrare - micr ometr u ocul ar   , etalonată

pentru grosismentul de lucru al microscopului

 prin intermediul micr o-metr ul ui obiectiv (scara etalon).

Pentru măsurare se folosesc de preferinţă preparate umede în care suspendarea celulelor se face în soluţie de 0,1% geloză, pentru a evita deplasarea celulelor. Micrometrul ocular şi Micrometrul obiectiv

 Micrometrul ocular

este un disc de sticlă în centrul căruia se află o scară gradată

cu lungimea de 10 mm, divizată în 100 de diviziuni. Se montează în interiorul ocularului  prin deşurubarea lentilei superioare şi se sprijină pe diafragma ocularului. În cazul în care liniile scării nu se văd distinct, se potriveşte distanţa optimă prin deplasarea diafragmei din tub şi se înşurubează din nou lentila frontală a ocularului.  Micrometrul obiectiv

este o lamă de sticlă dreptunghiulară în centrul căreia se

află un cerc cu contur uniform în care este gravată scara de 1 mm împărţită în 100 de diviziuni egale. O diviziune a micrometrului obiectiv este egală cu 10 μm. Mod de dimensionare

Se plasează lama micrometrului obiectiv pe măsuţa microscopului şi se caută imaginea scării etalon cu obiectivul cu grosisment x10 şi apoi cu cel x45; prin manevrarea platinei se face suprapunerea celor două scări. Se notează câte diviziuni ale micrometrului

obiectiv se suprapun exact peste un număr de diviziuni ale micrometrului

ocular. Cunoscând că o diviziune reală a scării etalon este egală cu 10 µm, se calculează coeficientul micrometric, care stabileşte corespondenţa dintre cele două scări:

unde: C este coeficientul micrometric; N numărul de diviziuni  pe micrometrul obiectiv; n

numărul de diviziuni ale micrometrului ocular care se cuprind

în N După stabilirea coeficientului micrometric, în locul scării etalon, pe măsuţa microscopului se aşează preparatul care conţine celulele de dimensionat. Cu ajutorul scării, prin rotirea ocularului sau prin deplasarea platinei, se determină numărul de diviziuni ale celulelor (pentru lungime/lăţime). Pentru obţinerea dimensiunilor reale ale celulelor dimensionate, numărul

de diviziuni citite cu ajutorul micrometrului ocular se

multiplică cu coeficientul micrometric stabilit anterior. 33

I.2 Studiul caracterelor culturale

Caractere culturale ale microorganismelor în diverse tipuri de culturi a - for ma coloniil or  : punctiformă (1); circulară

(2); ondulată (3); lobată (4); erodată (5); filamentoasă (6); rizoidală (7); plisată cu striaţiuni radiale (8); plisată cu striaţiuni concentrice (9); formă de fus în masa de geloză (10); b -profi lul coloniil or  :  plat (1): bombat (2);

convex (3); în formă de dom (4); umbonat (5): c -culturi pe geloză înclinată (inoculare lineară):

 biomasa invadează întreaga suprafaţă (1);

creştere filiformă (2); creştere ondulată (3); creştere difuză (4); creştere rizoidală sau arborescentă (5); d - culturi prin înţepare în medii cu gelatină ;

filiformă (1); perlată (2); ondulată (3); arborescentă (4): lichefiere cratiformă (5); lichefiere stratiformă (6); lichefiere sub formă de sac (7): lichefiere totală (8); e – c ultur i pe mediu l ichid  : sediment (1): tulburare (2); peliculă sub formă de inel (3), voal (4).

II. STUDIUL PROPRIETĂŢILOR BIOCHIMICE ŞI FIZIOLOGICE ALE MICROORGANISMELOR II.1. Stabilirea tipului de metabolism energetic

Viaţa celulei microbiene în condiţii compatibile oferite de mediul ambiant este determinată de caracterele genetice care îi imprimă un anumit metabolism, determinat de totalitatea reacţiilor biochimice catalizate secvenţial de enzimele celulei vii, prin care se asigură transferul de masă şi energie între celulă şi mediul a mbiant. Importanţa generală a metabolismului energetic în viaţa microorganismelor, a surselor de energie, a donatorilor de electroni sau de hidrogen şi a acceptorului final de 34

electroni, a determinat utilizarea acestora drept criterii de clasificare şi nomenclatură a  principalelor tipuri de metabolism.

În funcţie de natura acceptorului final de electroni, microorganismele pot  prezenta trei tipuri de metabolism energetic.

Respiraţia aerobă Este procesul în cursul căruia reacţiile chimice producătoare de energie necesită  prezenţa oxigenului molecular ca acceptor final de electroni. Procesul este dependent de oxigenul din aer, având ca produse finale CO2 şi H2O. Respiraţia aerobă este foarte avantajoasă din punct de vedere energetic pentru celula microbiană, de aceea, atunci când urmărim obţinerea de celule în cantităţi mari (drojdie comprimată) sau obţinerea de substanţe intracelulare, cultivarea se face în condiţii de aerare.

Respiraţia aerobă este dependentă de cantitatea de oxigen din aer, iar carbonul din compusul organic se regăseşte în dioxidul de carbon. Microorganismele aerobe dispun de o catenă respiratorie diversificată, în componenţa căreia intră dehidrogenaze: citocromi, citocrom-oxidaze, oxidaze.  Numeroase bacterii pot oxida hidrogenul (Pseudomonas), amoniacul până la NO2 (Nitrosomonas),

sulful şi H2S până la sulfat (Thiobacillus) sau fierul Fe2+  la Fe3+

(Thiobacillus ferooxidans) cu rol important în circuitul natural al elementelor.

Respiraţia anaerobă Este procesul prin care substratul este transformat până la CO 2, iar e- sunt cedaţi  prin procesul de oxidare unor compuşi anorganici acceptori. Este întâlnită la bacteriile strict anaerobe, când accept orul de electroni sau hidrogen este un compus anorganic. Aceste bacterii obţin o cantitate mică de energie şi  pot creşte în absenţa oxigenului molecular, Ia un potenţial de oxidoreducere de -0,2; -0,3 V.

Ţinând cont că mediile ce vin în contact cu O2  au un  potenţial redox de +0,2; +0,4 atunci când  pH = 7, pentru a asigura dezvoltarea anaerobilor, în mediu se adaugă substanţe cu caracter reducător ca tioglicolat de Na, cisteină, sulfura de Na. Substanţele 35

reducătoare permit menţinerea unui potenţial de oxido-reducere scăzut. Pentru cultivarea anaerobilor se pot folosi şi vase speciale numite anaerostate în care O2 este legat chimic, sau cultura se menţine în atmosferă de gaze inerte (CO 2, N2).

Fermentaţia Este un proces în care reacţiile chimice producătoare de energie necesită prezenţa unor compuşi organici ca acceptori finali de electroni. Metabolismul oxidativ anaerob poate fi întâlnit şi la microorganisme facultativ anaerobe. Aceste microorganisme au capacitatea de a creşte aerob utilizând oxigenul din aer

(respiraţie aerobă) sau anaerob,  folosind compuşi organici ca acceptori finali ai

electronilor.

Microorganismele facultativ anaerobe, în condiţii aerobe, îşi adaptează echipamentul enzimatic pentru procese de oxidare

 până la produşii finali, utilizând

 preferenţial oxigenul când este disponibil, datorită cantităţii mai mari.

Tipuri de comportamente diferenţiate ale microorganismelor Aerobe -

sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvoltă la suprafaţa lichidelor,

a mediilor solide. Oxigenul serveşte ca acceptor final de electroni transportaţi prin catena respiratorie; Facultativ anaerobe -

nu necesită oxigen pentru creştere, dar cresc mai bine în

 prezenţa sa. Se dezvoltă bine în medii lichide în care solubilitatea oxigenului din aer este mai redusă; Aerotolerante anaerobe - nu necesită O2 pentru creştere şi cresc la fel de bine în

 prezenţa sau absenţa sa (ex. Enterococcus fecalis, Lactobacillus plantarum). Microorganismele incluse în aceste tipuri pot produce superoxid dismutază şi catalază care catalizează reacţiile:

Microaerofile -

se dezvoltă la distanţă mică de suprafaţa mediului de cultură

când concentraţia în oxigen este de 2-10%; Strict (obligat) anaerobe -

nu tolerează oxigenul şi mor în prezenţa acestuia,

deoarece nu pot descompune apa oxigenată cu efect distructiv asupra celulei. Nu pot 36

obţine energie prin respiraţie propriu-zisă şi folosesc fermentaţia şi respiraţia anaerobă în acest scop (ex. bacterii butirice, metanogene).

II.1.1 Tehnici de studiu al tipului de metabolism energetic

În eprubete (8 x 180 mm) se repartizează câte 10-15 cm3 mediu de cultură, BCA + glucoză şi se

sterilizează. În momentul utilizării, mediul se

fluidifică

prin încălzire pe baie de apă şi apoi se

temperează la 42...45°C. Urmează inocularea în strii în profunzimea masei de gel, cu ajutorul unei pipete Pasteur. Pipeta se introduce până la partea inferioară a eprubetei, apoi se ridică încet pentru inocularea uniformă (cu 3-4 picături suspensie celule) a mediului de cultură. După răcire şi  solidificare mediul se termostatează corespunzător. În funcţie de particularităţile de creştere în raport cu necesarul de oxigen, microorganismele sunt încadrate în 4 categorii principale: strict aerobe (a), strict anaerobe (b), aerotolerante anaerobe (c), microaerofile (d).

II.1.2 Evidenţierea metabolismului oxidativ şi fermentativ Determinarea produselor rezultate prin metabolismul celulei microbiene (acizi,

alcooli, enzime ş.a.) prezintă interes practic în scopul stabilirii condiţiilor optime de mediu pentru creşterea randamentului în produsul cu importanţă economică, la selectarea unor microorganisme înalt productive. În funcţie de particularităţile metabolice şi de condiţiile de cultivar e, microorganismele au capacitatea de a metaboliza în mod diferit substratul cu formare de acizi, CO2

şi apă (metabolism oxidativ), sau acizi, alcooli şi gaze (CO2, H 2) (metabolism

fermentativ anaerob).

Evidenţierea tipului de metabolism se va face prin punerea în evidenţă a  produşilor finali de metabolism, în special formarea de gaze, care în cazul metabolismului fermentativ se concretizează în: acumulare de gaz în tub Durham (mediu lichid), formarea de alveole de gaz (în mediu cu geloză). În cazul respiraţiei aerobe, prin dezvoltarea microorganismelor la suprafaţa mediului de cultură, CO2 format este eliberat în mediul înconjurător. 37

Pentru evidenţierea tipului de metabolism se utilizează două metode principale.

A. Metoda bazată pe studiul pH -ului Se aplică în general pentru studiul bacteriilor, care prin fermentaţie produc acizi şi uneori gaze. Pentru cultivare,

se utilizează un mediu semisolid care conţine un indicator de

 pH.

Înainte de utilizare, mediul se f luidifică pe baie de apă, apoi se adaugă soluţie de glucoza astfel încât concentraţia finală în mediu să fie de 0,1% şi se solidifică din nou. Pentru analiză se utilizează câte două eprubete de mediu care se inoculează prin înţepare cu firul exact în zona centrală a tubului de gel. În una din eprubete se acoperă suprafaţa mediului cu 1 cm3 ulei de parafină steril. După termostatare corespunzătoare, se examinează eprubetele şi se notează virarea culorii indicatorului şi eventual formarea de gaz Posibile rezultate 

Acidifiere la suprafaţa mediului din

eprubeta fără parafină;



A bsenţă modificări în eprubeta cu parafină - metabolism oxidativ;



A bsenţă

acidifiere sau formare de gaz; uneori creşte alcalinitatea în eprubeta cu

 parafină- metabolism inactiv sau "inert"; 

Acidifiere

în ambele eprubete cu sau fără formare de gaz; modificarea poziţiei

dopului de parafină - metabolism fermentativ. După inoculare şi termostatare rezultatele se interpretează astfel: 

absenţă formare gaz; absenţă acidifiere sau alcalinizare mediu; uneori acidifiere

mediu fără for mare de gaz - metabolism oxidativ sau "inert"; 

acidifiere cu formare de gaz; formare gaz fără acidifiere; uneori acidifiere fără

formare de gaz - metabolism fermentativ (bacterii).

B. Metoda bazată pe evidenţierea producerii de gaz Se utilizează frecvent în cazul drojdiilor, dar şi pentru anumite bacterii. Pentru analiză se utilizează un mediu lichid, ce conţine o sursă de carbon asimilabilă şi un indicator de pH. 38

Mediul se repartizează în eprubete cu tub Durham şi se sterilizează. Cele mai utilizate medii sunt: pentru drojdii - mediul Wieckerman; pentru  bacterii -  bulion

de carne cu lactoză (BCL), bulion de carne - lactoză -  bilă - verde

 briliant (BLBV).

Studiul potenţialului oxidativ sau fermentativ al microorganismelor a - cultivare pe mediul Hugh şl Leifson:

metabolism oxidativ (1); metabolism inactiv sau

inert în raport cu substratul (2); metabolism fermentativ (3, 4, 5);

b - cultivare pe mediul

Wickerham: metabolism oxidativ sau inert (1, 2);

metabolism fermentativ (3, 4).

II.1.3 Evidenţierea capacităţii unor microorganisme de a cataliza procese de respiraţie anaerobă Punerea in evidenţă a acestei capacităţi se poate realiza prin procedeele următoare:   Reducerea

nitraţilor şi nitriţilor 

  Reducerea

compuşilor cu sulf 

Reducerea nitraţilor şi nitriţilor

Reducerea nitraţilor de către microorganisme se poate realiza prin

mecanisme moleculare, cu semnificaţie diferită

pentru

microorganismele

efectoare: A) denitrificarea sau reducerea

dezasimilatorie adevărată; B) reducerea asimilatorie.

Produşii finali ai reducerii pot fi:

N2

în

cazul

procesului

denitrificare (tip A) sau NH3

de

în cazul 39

 procesului de reducere asimilatorie (tip B).

Reducerea compuşilor cu sulf  educerea sulfaţilor (SO4 R educerea Reducera

2-

) se studiază foarte puţin.

sulfiţilor (SO32-) se evidenţiază prin cultivare pe medii care conţin

sulfiţi şi o sare a unui metal solubil (în general fier sau, uneori, bismut sau plumb). Bacteriile

anaerobe sunt de multe ori capabile să utilizeze sulfiţii ca acceptori de

hidrogen. Caracterul sulfito-reducător se evidenţiază prin cultivare pe bulion de carne sau

 bulion de carne cu extract de drojdie la care se adaugă, după sterilizare, 0,4% sulfit de sodiu şi câteva picături de citrat de fier (sau alaun de fier). După inoculare şi termostatare corespunzătoare, reducerea sulfitului se evidenţiază prin apariţia petelor negre date de sulfură. Se pot utiliza şi alte medii precum: bulion-lactoză-sulfit; geloză Wilson Blair. Reducerea tiosulfatului (S2O3

2-

) se studiază prin cultivarea microorganismelor pe

 bulion de carne sau bulion bul ion de carne cu extract de drojdie cu adaosul unei sări de fier, sau s au  pe mediul geloză cu acetat de plumb, prin adăugarea unei picături de 10 % tiosulfat de sodiu. Producerea de H2S este caracteristică şi microorganismelor care au capacitatea de

a produce reducerea sulfaţilor şi sulfiţilor prezenţi în mediul de cultură. Din grupul microorganismelor

sulfito-reducătoare

fac parte bacteriile anaerobe din genul

Clostridium (Cl. sporogenes, CI. perfringens ş.a.). Prin cultivar e, e, fier, timp de 10- 14

în condiţii strict anaerobe, pe mediii specifice ce conţin sulfat de

zile, testul este pozitiv când la baza vasului de cultivare se formează

un sediment de sulfură de fier de culoare neagră.

II.1.4 Evidenţierea puterii reducătoare Punerea în evidenţă a capacităţii reducătoare a unor

microorganisme se realizează

 prin cultivare pe medii specifice în prezenţa indicatorilor redox: albastru de metilen, clorură de trifenil tetrazoliu (TTC) sau tinctură de turnesol. Reacţia de reducere este catalizată de reductazele produse de celulele vii. Reducerea este certificată de schimbarea culorii probei.

Pentru studiul streptococilor se recomandă utilizarea mediului Sherman - lapte cu 0,1% albastru de metilen. În aerobioză se produce reoxidarea albastrului de metilen cu 40

oxigenul din aer, cu eliberare, în cazul unei aerări puternice, de apă oxigenată. În aceste condiţii se dezvoltă numai microorganismele catalazo-pozitive. Prin reducere, clorura de trifenil tetrazoliu (TTC) îşi modifică culoarea de la gălbui la roşu- brun  brun ca urmare a apariţiei formazanului (punerea în evidenţă a streptococilor fecali sau a entero-bacteriilor).

Reducerea turnesolului se evidenţiază prin decolorare indicatorului, reacţie utilizată pentru studiul bacteriilor lactice, prin cultivare pe lapte turnesolat.

II.1.5 Evidenţierea enzimelor respiratorii Punerea în evidenţă a enzimelor respiratorii se face, în special, prin:   Evidenţierea

producerii de oxidaze

  Evidenţierea

producerii de catalază

  Studiul

inhibiţiei enzimelor respiratorii

Evidenţierea producerii de oxidaze Oxidazele microbiene au proprietatea de a cataliza reacţia de oxidare a unui substrat organic, în prezenţa oxigenului din aer. Substratul utilizat este soluţie 1% oxalat de N-dimetil

parafenilen diamină. Acest compus este incolor în forma redusă şi se

colorează în roşu-violet când trece în forma oxidată. Se mai poate utiliza clorhidrat de tetrametilen parafenilen diamina, care dă o coloraţie purpurie. Analiza permite evidenţierea globală a potenţialului oxidazic (oxidazo pozitiv) al unei tulpini, fără a putea evidenţia prezenţa unor oxidaze particulare. Pentru studiu se utilizează o cultură tânără aflată pe mediul cu geloză, utilizând diferite tehnici de analiză. Tehnica de pulverizare a reactivului Mac Lead se poate aplica pentru coloniile

dezvoltate pe medii dense, în cutii Petri. Se utilizează o soluţie proaspătă de reactiv, care se pulverizează pe suprafaţa culturii. Coloniile oxidazo- pozitive  pozitive se vor colora în roşu în câteva minute. Pentru a evita pierderea culturii, se face imediat repicarea culturii de interes, deoarece reactivul are o acţiune toxică asupra celulelor.

41

Evidenţierea producerii de catalază Catalaza este

enzima care catalizează reacţia de descompunere a apei oxigenate

formate prin activitatea metabolică a microorganismelor.

Pentru evidenţierea activităţii catalazice se depun pe o lamă o picătură din suspensia de celule de analizat şi o picătură soluţie proaspătă de apă oxigenată (10 volume). Celulele au activitate catalazică când în scurt timp se observă degajarea de bule de gaz, prin formare de spumă. Reacţia se poate verifica şi într -o suspensie densă de celule sau direct pe mediu solidificat, când coloniile formate la suprafaţa mediului se acoperă cu 2-3 picături apă oxigenată. La suprafaţa coloniilor catalazo-pozitive se va evidenţia degajarea de bule de gaz cu formare de spumă mai mult sau mai puţin abundentă, în funcţie de potenţialul catalazic al microorganismelor. La unele bacterii lactice poate să se evidenţieze un fals efect catalazo -pozitiv. Pentru confirmare se realizează un test cu benzidină. 3

Dintr-un amestec format din 0,5 cm

reactiv (cu benzidină) + 0,5 cm3 H2O2 (4

volume) se depun câteva picături pe o cultură aflată pe mediu solidificat. Apariţia unei coloraţii albastru închis confirmă prezenţa catalazei.

Studiul inhibiţiei enzimelor respiratorii Se utilizează testul de inhibiţie cu cianură. Cianura inhibă enzi mele respiratorii implicate în secvenţele căilor metabolice terminale. Microorganismele care posedă aceste enzime nu se pot dezvolta într -un mediu cu KCN. Mediile recomandate pentru acest test sunt: Buttiaux, Braun sau Möller , pH =7,5.

După preparare, mediul se repartizează în eprubete, se sterilizează şi se răceşte, apoi se adaugă 0,5 cm3 soluţie apoasă 0,5% cianură de potasiu, pH=7,5. Celulele recoltate cu o ansă, dintr -o cultură în vârstă de 24 h, se inoculează în mediul astfel  pregătit, apoi, după 48 h de termostatare în condiţii optime, se examinează creşterea microorganismelor.

Se apreciază: KCN (+) - microorganisme dezvoltate în condiţiile testate; KCN (-) -

absenţă creştere.

42

II.2 Studiul capacităţii microorganismelor de a metaboliza glucidele Pentru

identificarea microorganismelor, este important să se studieze şi

capacitatea lor de a se dezvolta pe anumite medii selective de diagnosticare sau prin

urmărirea potenţialului de metabolizare a unor compuşi introduşi în mediul de cultură al microorganismului studiat. II.2.1 Asimilarea glucidelor simple - auxanograma

Pentru identificarea microorganismelor organotrofe se stabilesc glucidele care le

favorizează creşterea, atunci când acestea reprezintă unica sursă de carbon prezentă în mediul de cultură. Dintre acestea mai frecvent se utilizează: arabinoza, xiloza, glucoza, fructoza, galactoza, zaharoza, maltoza, lactoza. Prin metabolizarea specifică a acestor substanţe se pot forma acizi organici, gaze, aldehide şi cetone. II.2.2 Studiul potenţialului de hidroliză al amidonului Unele microorganisme (bacterii şi mucegaiuri) sunt capabile să sintetizeze hidrolaze extracelulare de tipul α

şi β amilaze, glucoamilaze, care pot hidroliză enzimatic

amidonul până la produse cu greutăţi moleculare din ce în ce mai mici, şi anume eritrodextrine, acromo-dextrine,

maltoză, glucoza, ce pot fi utilizate de microorganisme

drept surse de carbon şi energie. Pentru punerea în evidenţă a acestor proprietăţi se foloseşte un mediu nutritiv (BCA sau MMA) cu 0,2% amidon solubil. După sterilizare, mediul se repartizează în plăci Petri şi după solidificare, cu firul inoculat în suspensia de celule se inoculează "în punct" sau se trasează o linie de-a lungul diametrului plăcii. După 7-10 zile se observă vizual hidroliza amidonului după zona clară aflată în jurul coloniei sau în jurul liniei de inoculare. Zona devine mai evidentă prin adăugarea în placă a unei soluţii de Lugol. în acest caz amidonul nehidrolizat va căpăta culoare albastră, zona de formare a dextrinelor o culoare roşie - brună, iar zona în care amidonul este complet hidrolizat va rămâne incoloră. Determinarea semicantitativă a activităţii amilolitice a diferitelor microorganisme

se poate realiza prin stabilirea raportului între

diametrul zonei în care s-a produs hidroliza completă a amidonului şi diametrul coloniei microorganismului de studiat, în condiţii determinate de timp şi temperatură de termostatare.

43

II.2.3 Studiul fermentaţiei alcoolice Pentru studiul fermentaţiei alcoolice şi al factorilor care condiţionează viteza de fermentare a glucidelor fermentescibile se folosesc culturi pure de drojdii aparţinând genului Saccharomyces.

Pentru obţinerea inoculului, celulele de drojdie din eprubeta cu cultură pură, pe must de malţ-agar înclinat, se transferă în must de malţ lichid (baloane cu 25 cm 3 mediu) şi se termostatează 24 h la 25...30°C. Inoculul obţinut se transferă, în proporţie de 2-4 %, cu o pipetă sterilă în 3 vase de fermentare ce conţin 150 cm3 must de malţ cu aceeaşi concentraţie sau must de struguri cu 20% zahăr, prevăzute cu ventile de fermentaţie. După montarea ventilului de fermentaţie, sterilizat separat de vasul ce conţine mediul, în ventil se introduce, prin orificiul superior, un volum redus (2-3 cm3) de acid sulfuric concentrat. Acesta va permite eliminarea dioxidului de carbon rezultat in timpul

fermentaţiei şi va reţine vaporii de apă şi alte substanţe volatile. După cântărirea iniţială a fiecărui vas, la o balanţă cu precizie, acestea se termostatează la 30°C, timp de 3 zile. La intervale de 6, 24, 48, 72 ore se face agitarea mustului pentru eliminarea CO2

format, apoi se cântăreşte fiecare vas şi se calculează

 prin diferenţă cantitatea medie de CO2 degajată. II.2.4 Studiul fermentaţiei lactice Fermentaţia lactică este un proces anaerob prin care substratul hidrocarbonat este metabolizat sub acţiunea echipamentului enzimatic al bacteriilor lactice în acid lactic ca  produs principal al fermentaţiei. În cazul bacteriilor lactice homofermentative, pe lângă acid lactic se acumulează şi produse secundare: acid acetic, alcool etilic, glicerol, CO2. II.2.5 Studiul fermentaţiei butirice Fermentaţia  butirică este un proces strict anaerob, prin care substratul hidrocarbonat (amidon, dextrine, lactoză, glucoza ş.a) este metabolizat în condiţii neutre de pH, sub acţiunea enzimelor elaborate de bacterii din genul Clostridium, în acid butiric, CO2 şi H2 ca produse principale.

44

II.3 Studiul metabolismului compuşilor cu azot II.3.1 Evidenţierea potenţialului microorganismelor de a hidroliza ureea

Hidroliza ureei este realizată de un grup numeros de microorganisme capabile să  producă enzima urează. Ele aparţin eubacteriilor (genurile:  Achromobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Pseudomonas),

actinomicetelor şi fungilor filamentoşi, urobacteriilor

(caracterizate prin rezistenţă la concentraţii mari de uree şi  pH alcalin şi prin capacitatea de a elibera cantităţi mari de NH3). Din grupul urobacteriilor fac parte o serie de bacterii precum: Bacillus probatus,  Bacillus freudenreichii, Urobacillus paslearii, Urobacillus miquellii. Sarcina ureae,  Micrococcus ureae, Planosarcina ureae ş.a. Conversia ureei la NH3, sub acţiunea ureeazei decurge conform reacţiilor: CO(NH2)2 + 2H2O

(NH4)2CO3

2NH3 + CO2 + H2O

Evidenţierea producerii de urează este sesizată calitativ, ca urmare a creşterii alcalinităţii, printr -un indicator de pH. Cultivarea se realizează pe medii lichide specifice: mediul Ferguson (uree-idol);

mediul Stuart (care conţine roşu de fenol). În cazul

microorganismelor ureazo- pozitive, culoarea mediului virează în roşu.

II.3.2 Studiul activităţii de proteoliză (hidroliza gelatinei şi a cazeinei) Bacteriile de putrefacţie şi majoritatea fungilor produc enzime proteolitice extracelulare şi determină degradarea substraturilor bogate în protide. Pentru determinarea activităţii de proteoliză se folosesc metode calitative şi cantitative bazate pe hidroliza enzimatică a gelatinei sau a unor protide mai complexe (cazeină, ovalbumină). Hidroliza gelatinei

În funcţie de potenţialul lor de biosinteză a enzimelor proteolitice, microorganismele pot fi capabile să producă lichefierea gelatinei (bacterii, fungi filamentoşi), sau sunt lipsite de această proprietate (drojdii). După inocularea culturii de studiat, prin înţepare în tub de mediu drept (bulion de carne cu gelatină-BCG sau must de malţ cu gelatină-MMG), în eprubete, şi termostatare

45

la temperatura de 20°C,

la o periodicitate de 48 h, pe un interval de 2 săptămâni, se

descrie modul în care s-a produs lichefierea gelatinei, pentru culturile gelatinazo-pozitive. Pentru determinări semicantitative se recomandă utilizarea mediului Frazier (cu 4% gelatină). După inocularea "în punct" a celulelor aparţinând microorganismului de testat, pe suprafaţa mediului Frazier repartizat în plăci Petri şi termostatare la 37°C, timp de 24-48

h (pentru bacterii de putrefacţie), sau la 25...28°C, timp de 3 zile (pentru

mucegaiuri), se inundă placa cu soluţie de clorură mercurică. În aceste condiţii, în jurul coloniilor aparţinând microorganismelor cu activitate gelatinolitică apare o zonă clară, transparentă, în contrast cu zona opacă în care gelatina nu a fost hidrolizată. Hidroliza cazeinei

Studiul capacităţii microorganismelor de a produce hidroliza cazeinei se realizează prin cultivare pe diferite medii cu lapte. Laptele, prin conţinutul său în lactoză,

cazeină, vitamine şi săruri minerale, reprezintă un mediu optim pentru dezvoltarea  bacteriilor care pot produce fermentarea lactozei, proteoliza cazeinei sau ambele

transformări. Prin inoculare '"în punct" pe medii solidificate cu agar ce conţin şi 10% lapte şi termostatare în condiţii optime de creştere, coloniile cu activitate cazeinolitică vor  prezenta în jurul lor o zonă clară, comparativ cu restul mediului care este opac. Apariţia zonei clare se datorează hidrolizei cazeinei din imediata vecinătate a coloniilor ca urmare a producerii de proteaze extracelulare de către microorganismele cu activitate cazeinolitică. Mediile conţin drept indicator de pH, purpur de brom crezol, pH la valoarea 7,3. Modificarea culorii indicatorului, caracteristică unui  pH  acid, denotă acidifiere asociată cu coagularea laptelui ca urmare a fermentării lactozei şi formării de acid lactic. Când microorganismele de studiat produc proteoliza cazeinei,  pH-ul rămâne neutru sau devine alcalin, cu modificarea specifică a culorii indicatorului în domeniul alcalin de pH.

În stadii avansate de proteoliza ar e loc peptonizarea laptelui.

46

II.3.3 Metabolismul aminoacizilor

Formarea amoniacului

Amoniacul poate să rezulte în urma dezaminării aminoacizilor prezenţi în mediul de cultură al microorganismului de studiat. Acesta este parţial folosit drept sursă de azot, iar excesul se elimină şi poate fi evidenţiat pe cale chimică. Pentru evidenţierea  producerii de amoniac, drept medii de cultură se recomandă apa peptonată sau un mediu lichid care conţine un aminoacid special (de exemplu, bulion-arginină). Mediul se repartizează în eprubete, se sterilizează şi se inoculează cu celulele aparţinând microorganismului

de studiat. După termostatare în condiţii oprime, producerea de

amoniac este evidenţiată prin reacţia de culoare cu reactivul Nessler (câteva picături), când proba capătă culoare galben-oranj. Producerea de H2S

Sub acţiunea unor microorganisme asupra aminoacizilor ce conţin sulf în moleculă (metionină, cistină, cisteină), prezenţi în mediul de cultură, are loc eliberarea de H2S.

Această proprietate se poate pune în evidenţă prin cultivarea microorganismelor în

mediu de bulion de carne cu peptonă repartizat în eprubete şi sterilizat. După inocularea mediului cu o suspensie de celule, între dopul de vată şi gâtul eprubetei se introduce o  bandă de hârtie sterilă îmbibată în soluţie 10% acetat de plumb, astfel încât să nu atingă suprafaţa mediului. Se recomandă ca dopul eprubetei să se acopere cu o folie din plastic  pentru a evita evaporarea rapidă a gazului care se formează. Durata cultivării este 7-10 zile. Eliberarea de H2S

se evidenţiază prin înnegrirea hârtiei, ca rezultat al formării

sulfurii de plumb (PbS).

O altă metodă de evidenţiere a H2S eliberat de către microorganisme constă în cultivarea acestora pe un mediu specific, care conţine proteine şi sulfat de fier: mediul  peptonă-fier-agar, mediul Mossel, mediul Lingby cu geloză. Mediul cu agar repartizat în eprubete se sterilizează la 0,5 atm. şi se înclină sau se păstrează ca atare, sub formă de tub de gel. Cu firul încărcat cu celule se aplică striuri la suprafaţa mediului (pentru microorganisme aerobe), sau inocularea se realizează în profunzimea tubului de gel drept (pentru microorganisme anaerobe, facultativ anaerobe sau microaerofile). Prin creşterea

47

 biomasei, o dată cu eliberarea de H2S, are loc înnegrirea mediului ca rezultat al formării sulfurii de fier.

II.4 Studiul metabolismului lipidic

Activitatea lipazică (esterazică) a microorganismelor poate fi pusă în evidenţă  prin: Cultivarea "în punct" pe un mediu solidificat cu adaos de ulei de măsline steril 

(înainte de repartizarea în plăci Petri). În mediu se adaugă 0,006 % albastru de Victo ria. Tulpinile cu activitate lipolitică vor fi puse în evidenţă prin prezenţa în jurul coloniilor a unui precipitat de culoare albastru-deschis, dat de acizii eliberaţi în mediu; Cultivarea "în punct" pe mediu solidificat cu adaos de tributirin  - prin aceasta,

tulpinile lipazo- pozitive

vor prezenta în jurul coloniilor o zonă clară. În acest caz, se pot

utiliza şi variante de mediu de cultură cu adaos de compuşi indicatori. De exemplu, dacă mediul conţine albastru Evans, în jurul coloniilor cu activitate lipazică va apărea o zonă clară, comparativ cu restul mediului de culoare albastră. Dacă în compoziţia mediului de cultură se utilizează un indicator de  pH (de exemplu, roşu de fenol), în jurul coloniilor tulpinilor active va apărea o zonă cu coloraţie galbenă ca urmare a acidifierii produse de acidul butiric format;  Studiul activităţii lecitinazice - se face utilizând un mediu cu gălbenuş de ou.

În

geloză nutritivă obişnuită se adaugă o soluţie (5-10%) de gălbenuş de ou în ser fiziologic steril. Mediul

se repartizează în plăci Petri sterile şi după  solidificare celulele

microorganismelor de studiat se inoculează "în punct" pe suprafaţa mediului. După termostatare în condiţii optime de creştere, tulpinile cu activitate lecitinazică vor prezenta în jurul coloniilor o zonă opacă.

III. STUDIUL ALTOR PROPRIETĂŢI FIZIOLOGICE GENERALE

III.1 Evidenţierea mobilităţii celulelor Mobilitatea celulelor, în special în cazul bacteriilor, se poate evidenţia prin examen microscopic direct (în preparat umed în picătură suspendată) sau prin examen cultural. 48

Pentru examenul cultural se folosesc medii semisolide speciale cu geloză. Pentru studiu, celulele sunt inoculate în mediu cu firul drept, iar după termostatare corespunzătoare mobilitatea se apreciază în funcţie de potenţialul de invadare, mai mare sau mai redus, al mediului de cultură. Se poate utiliza, de asemenea pentru studiul mobilităţii, mediul cu manitol, slab

solidificat, care poate conţine nitraţi şi un indicator de culoare ce permite evidenţierea degradării manitolului prin virajul culorii de la roşu la galben.

III.2

Studiul

comportamentului

microorganismelor

în

medii

hipertonice (halofilia, osmofilia)

Pentru evidenţierea capacităţii unor microorganisme de a se dezvolta în medii cu concentraţii ridicate de sare sau zahăr, se recomandă cultivarea lor în medii lichide sau solidificate, cu adaos de până la 60 % glucoza sau zaharoză (pentru microorganisme osmofile) şi până la 10% NaCl (pentru microorganisme halofile). Capacitatea de dezvoltare pe astfel de medii se verifică după o perioadă de termostatare, la temperatura optimă de creştere, specifică microorganismelor testate. III.3

Stabilirea

domeniului

de

temperaturi

eugenezice

pentru

dezvoltarea microorganismelor Domeniul microorganismelor

general

al

temperaturilor

eugenezice

pentru

majoritatea

cu implicaţii în industria alimentară este situat între 0 şi 75°C şi este

mai extins în limite extreme de - 34...250 °C, în cazul archebacteriilor. Pentru analiză, se prepară un mediu nutritiv lichid, optim pentru creştere, care se repartizează în eprubete şi se sterilizează. În momentul utilizării, se inoculează mai  multe eprubete în paralel, cu aceeaşi concentraţie de celule în stare activă a  microorganismelor de studiat, apoi eprubetele se plasează în termostate reglate la  intervale apropiate de temperaturi în domeniul eugenezic. De exemplu, pentru microorganisme mezofile la: 20; 30; 37; 42; 48°C.

După 48 h de cultivare se analizează turbidimetric gradul de dezvoltare al culturii şi se apreciază cu: 0

= creştere absentă;

+

= creştere slabă; 49

++ = creştere bună; +++ = creştere foarte bună. Aceste rezultate permit stabilirea temperaturii optime

şi a temperaturilor limită

de dezvoltare.

III.4 Evidenţierea capacităţii de sporogeneză a bacteriilor Prezenţa endosporilor bacterieni se poate pune în evidenţă prin pasteurizarea unei suspensii de celule, timp de 10 min, Ia 70...80°C,

când sunt distruse toate formele

vegetative ale bacteriilor, în timp ce endosporii supravieţuiesc prin acest tratament. Creşterea bacteriilor după acest tratament presupune prezenţa sporilor. Se recomandă cultivarea pe medii care induc sporularea, înainte de tr atamentul termic. Evidenţierea endosporilor bacterieni se poate realiza şi prin examen microscopic direct. Sporii bacteriilor, aparţinând genurilor  Bacillus, Clostridium,  prezintă anumite  particularităţi citologice care îi diferenţiază de celula vegetativă. În preparat microscopic sporii se pot evidenţia prin studiul celulelor vii sau prin metode de colorare diferenţială. În frotiurile clasice fixate şi colorate simplu sau după metoda Gram, endosporii nu se colorează, ei putând fi observaţi în celulă sub formă de incluziune necolorată, în timp ce exosporium se colorează. Prin metode speciale de colorare (încălzire în prezenţă de coloranţi) se produce colorarea atât a sporilor cât şi a citoplasmei, iar după spălare cu apă citoplasma se decolorează, în timp ce sporii rămân coloraţi deoarece reţin puternic colorantul.

III.7 Studiul rezistenţei microorganismelor la antibiotice sau la alţi compuşi cu efect inhibitor Rezistenţa microorganismelor faţă anumite antibiotice este un caracter frecvent utilizat în studii de taxonomie şi de asemenea prezintă un interes deosebit pentru industria de biosinteză. Microorganismului testat se cultivă pe un mediu de cultură lichid sau solidificat care conţine antibioticul sau compusul cu acţiune inhibitoare, sterilizat prin filtrare şi adăugat, în momentul inoculării, în mediul de cultură steril. După termostatare în condiţii

50

optime, se apreciază gradul de dezvoltare al culturii şi, în funcţie de acesta, sensibilitatea sau rezistenţa microorganismului. Prin metode semicantitative

se poate evalua gradul de inhibare, precum şi

concentraţia care determină un efect microbiostatic sau microbicid. Mediile de cultură recomandate pentru astfel de determinări au în compoziţie glucoza (0,5%), la care se adaugă şi alte ingrediente, în funcţie de microorga-nismul testat (bacterii, drojdii etc.), iar tehnica se numeşte antibiogramă. III.8

Teste

rapide

pentru

studiul

caracterelor

biochimice

ale

microorganismelor

În prezent, firme specializate comercializează "seturi pachet" de teste pentru caracterizarea

biochimică a microorganismelor, ceea ce permite identificarea la nivel de

specie într -un interval de timp mult mai scurt, comparativ cu metodele clasice.  Exemplu: Sistemul API 20C, format din 20 microtuburi (capsule serie, este

mici) dispuse în

destinat studiului caracterelor biochimice ale drojdiilor şi conţine 20

microtuburi, dintre care: 

8 microtuburi sunt destinate studiilor de fermentaţie, conţinând fiecare câte un

glucid

fermentescibil (glucoza, galactoză, maltoză, zaharoză, lactoză, rafinoză, trehaloză

şi melibioză) şi purpur de brom crezol ca indicator de pH; 

11 microtuburi servesc studiilor de asimilare a glucidelor

(aceleaşi ca la teste de

fermentaţie plus inozitol şi celobioză), precum şi un tub martor pentru interpretarea rezultatelor; 

1 microtub serveşte Ia testarea rezistenţei la actidionă. Celulele de studiat sunt inoculate mai întâi într -un mediu de bază, fără substanţa

test,

apoi o cantitate mică de mediu inoculat se transferă aseptic în fiecare microtub. În

funcţie de caz, analiza rezultatelor se face după 4-48 h. Profilurile biochimice sunt interpretate cu ajutorul unor tabele sau cataloage analitice.

IV. METODE IMUNOLOGICE Imunologia constă

în studiul relaţiilor dintre substanţele străine unui organism

superior (antigeni) şi apărătorii specifici ai acelui organism (anticorpi). Antigenii sunt macromolecule cu compoziţie chimică diferită care au situsuri active. Microorganismele 51

conţin numeroase tipuri de antigeni, de natură bine definită, care caracterizează fiecare specie şi uneori unele varietăţi (serotipuri). În cadrul metodele imunologice de analiză a microorganismelor sunt incluse următoarele categorii de tehnici: 

Tehni ci pr inci   pale de analiză



Tehni ci imu no-enzimati ce

Principiul metodelor imunologice

Atunci când un antigen pătrunde în organismul gazdă, induce formarea anticorpilor

specifici (puterea antigenică). Această reacţie se produce in vivo dar şi in

vitro. Manifestările unei astfel de reacţii sunt variabile: 

un antigen molecular (element microbian sau toxi nă)

reacţionează cu un anticorp

 printr-o reacţie de precipitare sau neutralizare; 

 bacterie, care conţine un ansamblu de antigeni, reacţionează cu anticorpii  printr-o

reacţie de precipitare. Reacţia antigen-anticorp realizată in vitro  permite, în cazul unor analize, să se identifice antigenul, deci un microorganism necunoscut, cu ajutorul anticorpului cunoscut

sau să se identifice un anticorp necunoscut, în cazul unei îmbolnăviri, şi microorganismul responsabil de aceasta cu ajutorul antigenilor cunoscuţi. Aceste reacţii sunt utilizate şi în taxonomia microorganismelor şi pentru realizarea

unor analize microbiologice. De obicei, se pun în evidenţă antigenii, utilizând

fie anticorpi

"naturali" policlonali (obţinuţi de la animale: iepure, cal ş.a), fie anticorpi

monoclonali, cu specificitate înaltă, obţinuţi prin inginerie genetică (hibridoame).

IV.1 Tehnici principale de analiză  Precipitarea sau aglutinarea în mediu lichid se  bazează pe reacţii

care au loc în

 prezenţa antigenilor şi anticorpilor specifici, prin interacţiunea dintre situsurile active. Precipitarea are loc în cazul unor antigeni moleculari (de exemplu toxine). Aglutinarea are loc în cazul unei legături dintre anticorp şi un antigen particular (aglutinare simplă sau directă, numită şi aglutinare activă sau omogenă).

52

 Reacţia în tub sau test inel (ring - test)

utilizează un tub capilar care conţine un

ser (anticorp), la care se adaugă antigenul. În zona de contact se formează un precipitat floconos (în formă de inel). Testul anticorp Brucella utilizează antigen colorat (fig. a)  Reacţia pe lamă sau placă.

Reacţiile de precipitare sau aglutinare se pot realiza

 pe lamă sau pe microplacă de titrare (fig. b). Citirea se poate face vizual sau automatizat. Microplăcile sunt folosite pentru evidenţierea şi dozarea anticorpilor şi toxinelor prin utilizarea diluţiiior. Pentru evidenţierea celulelor se folosesc lame sau microplăci care  permit efectuarea de teste multiple cu o serie de anticorpi.

Reacţii imunologice de bază a -

test):

reacţia în tub (ring-

test simplu în capilar (1); test

cu antigen colorat (2); b -

reacţia pe lamă (se

observă o aglutinare în picătura din dreapta); c - tipuri de anticorpi utilizaţi:

anticorpi

anticorpi nemarcaţi (1); marcaţi

direct

(2);

anticorpi marcaţi indirect (3); d

-

hemaglutinare:

inhibiţie

prin

hematie şi antigen

(1); competiţie faţă de anticorpi între antigenii purtaţi de hematii şi antigenii de detectat (2).

IV.1 Tehnici principale de analiză  Reacţia în eprubetă. Se amestecă antigenii cu anticorpii în eprubete şi se observă

apariţia unei precipitări sau aglutinări. Pentru dozări cantitative de antigeni sau anticorpi se realizează diluţii şi se analizează probele turbidimetric sau nefelometric (λ = 350-400 nm).

53

. Atunci Sisteme particulare 

când se utilizează un suport pe care se fixează

anticorpul are loc o precipitare sau aglutinare pasivă. Suportului are natură diferită (bile de latex, hematii, particule magnetice). De exemplu, testul de aglutinare "Spectate" (RP Diag,

Rhône-Poulenc)  permite evidenţierea prezenţei bacteriilor din genul

Salmonella.

Anticorpii sunt imobilizaţi pe  microbile de latex care se colorează diferit în funcţie de tipul de anticorpi. Rezultatele

sunt interpretate în funcţie de culoarea obţinută. Teste

similare, de aglutinare pe latex, sunt utilizate pentru confirmarea prezenţei bacteriilor   din genurile: Staphylococcus, Escheri chi a, Lister ia, Campylobacter , L egionell a.

IV.1 Tehnici principale de a naliză  Imunofluorescenţa. Marcajul fluorescent al anticorpului permite vizualizarea

antigenului. Metoda directă utilizează antigen şi anticorp marcat specific. Metoda indirectă utilizează un anticorp specific şi o antiglobulină. În cazul utilizării microscopului

cu epifluorescenţă, preparatul se colorează cu ajutorul unui marker

specific fluorescent. Astfel, se pot distinge cu uşurinţă celulele fluorescente de altele. Această metodă permite evaluarea cantitativă a celulelor aparţinând unei tulpini sau evidenţierea

contaminanţilor. Derivat de la această metodă de analiză au fost puse la

 punct tehnici de înaltă performanţă, şi anume: FPIA -

Fluorescence Polarization

I mmu noassay, FETI - F lu orescence Excitati on Tr ansf er I mmun oassay ş.a.

igenilor şi anticorpilor . Pentru separarea antigenilor Tehnici de separar e a ant 

sau anticorpilor se apelează în prezent la tehnici de imuno-afinitate. Există sisteme comerciale pentru analize de înaltă specificitate. De exemplu, sistemul RP Diag (RhônePoulenc) permite detectarea

şi extracţia aflatoxinelor şi ochratoxinei prin utilizarea

anticorpilor monoclonali, reţinuţi pe coloană (Aflascan. Aflaprep, Ochraprep). Metodele de extracţie şi solvenţii utilizaţi variază în funcţie de produs, şi anume: metanol : apă  pentru lapte: cloroform -  pentru

produse solide ş.a. Detectarea se face în UV, prin

fluorescenţă. Alte tehnici: tehnica ELIFA - En zyme L in ked I mmun ofi ltr ation Assay - pentru separarea antigenilor; separare prin utilizarea particulelor magnetice  —   sistemele Vicam, Dynal ş.a.

54

IV.2 Tehnici imuno-enzimatice

Sunt în prezent cele mai moderne tehnici de analiză utilizate  pentru identificarea microorganismelor. M etoda EL I SA  (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) este

metodă modernă,

 precisă, uşor de utilizat, care are la bază tehnici imuno-enzimatice.

Principiul metodei ELISA şi variante Anticorpul se fixează pe un suport solid (microplacă, bile, tub), analiza putânduse realiza în 2 sisteme: a) în sistem heterogen, când anticorpul se imobilizează pe suport;  b) în sistem omogen, când reacţia antigen-anticorp se opune reacţiei enzimatice.

Metoda ELISA în sistem heterogen

(a, b, c, d)

şi omogen (e)

55

a - tehnica directă simplă (anticorpi marcaţi); b - tehnica indirectă simplă

(anticorpi + anticorpi antianticorpi marcaţi); c - tehnica tip sandwich (directă); d tehnica prin competiţie; e - tehnica in sistem omogen, reacţia antigen-anticorp se opune reacţiei enzimatice.

Sisteme ELISA de identificare a microorganismelor Sistemul Tecra 3M

Utilizează metoda tip sandwich. În capsulele în care se află anticorpii se introduce un eşantion de probă, tratat termic 15 min la 100°C, pentru extracţia antigenilor.

După termostatare şi spălare se adaugă anticorpul conjugat unei enzime (de exemplu, peroxidază); urmează din nou spălare, adăugarea substratului şi o nouă termostatare.

Testul este pozitiv, în cazul prezenţei antigenilor, prin apariţia culorii verde. Acest sistem se utilizează pentru identificarea serotipurilor de Listeria şi Salmonella. Sistemul Kit HEC

Utilizează o combinaţie între testul ELISA şi detectare pe Petrifilm. Tehnica  permite identificarea serotipurilor enteropatogene de E. coli 0157 H7.

Metoda se bazează pe utilizarea unei membrane active ELISA care este pusă în contact timp de 2 min. cu un Petrifilm, care a fost termostatat timp de 18 h. Testul este  pozitiv când pe membrană apar pete de culoare gri. Exemple de sisteme ELISA de identificare a microorganismelor

Sistemul Organon-Teknika (AES), Sistemul Transia şi Sistemul VIDAS Sistemul Organon-T ekni ka (A ES) este utilizat pentru identificarea serotipurilor

 bacteriilor din genurile  Listeria (Listeria

Tek ELISA) şi Salmonella (Salmonella Tek

Elisa). Identificarea se realizează datorită unei peroxidaze conjugate, prin utilizarea ca substrat a tetrametilenbenzidinei (TMB).

56

Sistemul Transia utilizează

microplăci sau tuburi. Antigenii sunt extraşi prin

încălzire la 100°C, timp de 10-20 min. Pentru identificarea bacteriilor din genurile  Listeria

şi Salmonella se foloseşte metoda sandwich. Anticorpul conjugat este legat de o

 peroxidază, iar substratul este tetrametilenbenzidina (TMB). Pentru îmbogăţire, înainte de testarea imunologică, se recomandă precultivarea pe mediul UVM sau Oxford , pentru  bacteriile din genul  Listeria,

şi în apă peptonată tamponată urmată de o cultivare pe

mediul Rappaport-Vasiliadis, pentru bacteriile din genul Salmonella. Sistemul

VI DAS  este

utilizat

pentru

identificarea

bacteriilor:  Listeria

monocytogenes, Salmonella, Escherichia coli 0157, Campylobacter şi  a enterotoxinelor stafilococice. Teste ELISA

pentru identificarea toxinelor şi a altor metaboliţi

Pentru majoritatea toxinelor şi a altor metaboliţi produşi de microorganisme, în  prima etapă se impune extracţia acestora prin metode complexe. Firme specializate produc şi comercializează kituri pentru identificarea: enterotoxinelor stafilococice A, B, C1, C2, C3, D, E; aflatoxinelor B1, G1, G2, M1;

zearenonei; ochratoxinei A; antibioticelor ş.a. V. ALTE METODE DE IDENTIFICARE A MICROORGANISMELOR 

Studiul potenţialului patogen al microorganismelor Sunt analizate enzimele care produc patogenitate

şi se evidenţiază pericolul

toxicogen al microorganismelor.  Studiul enzimelor care determină patogenitatea. Enzimele care produc

 patogenitate sunt de mai multe tipuri. Hemolizinele sunt

enzime care produc liza hematiilor. Ele sunt puse în evidenţă

 prin cultivarea microorganismelor pe medii solidificate cu sânge (de miel sau de cal). În mediul cu geloză se adaugă 20-25 picături de sânge, apoi se omogenizează, se repartizează în plăci Petri şi, după solidificarea microorganismului, se inoculează în strii. După termostatare corespunzătoare, se analizează aspectul suprafeţei din jurul coloniilor, care poate fi: 

zonă verzuie, dată de methemoglobină (hemoliză α); 57



zonă clară, ca urmare a eliberării hemoglobinei (hemoliză β);



fără modificări (absenţă hemoliză).

Studiul enzimelor care determină patogenitatea Coagulazele sunt

enzimele care coagulează plasma şi împiedică fagocitoza.

După cultivarea microorganismelor, pe medii specifice (de exemplu, pentru bacterii din genurile Staphylococcus, Streptococcus), timp de 24 h, se recoltează 0,5 cm

3

cultură, care

se transferă într -o eprubetă de hemoliză, după care se adaugă 0,5 cm3  plasmă de iepure diluată (1:5). Amestecul se termostatează la 37°C şi se examinează din oră în oră, timp de 3

24 h. Coagularea se examinează comparativ cu o probă martor (0,5 cm

cultură + 0,5 cm3

ser fiziologic steril). ADN-azele

(enzime care distrug materialul nuclear al celulelor) se evidenţiază

 prin cultivare pe un mediu specific care conţine ADN. Mediul se repartizează în plăci Petri şi se inoculează "în punct" cu celulele de studiat. După termostatare corespunzătoare, hidroliza ADN-ului este evidenţiată prin  vaporizare cu acid clorhidric 1N. Prezenţa unei zone clare în jurul coloniilor certifică un test pozitiv. Acidul poate fi înlocuit cu o soluţie de albastru de toluidină 0,1% şi în acest caz developarea unei zone de culoare roz în jurul coloniilor certifică un test ADN-ază pozitiv.

Evidenţierea producerii de toxine Pentru evidenţierea potenţialului toxicogen al microorganismelor sunt utilizate mai multe metode. M etode chi mi ce

se aplică în special pentru evidenţierea toxinelor cu greutate

moleculară redusă, specifice microorganismelor eucariote.  presupun în M etode gener ale  identificarea

primă fază extracţia şi purificarea toxinelor. Pentru

şi dozarea lor se apelează la metode cromatografice, chimice sau prin

fluorescenţă. De exemplu, pentru dozarea aflatoxinelor se realizează mai întâi extracţia cu soluţie metanolică, urmată de separare prin  cromatografie de afinitate cu anticorpi monoclonali (anti B1, B2, G1). După eluţie cu metanol, dozarea aflatoxinelor se realizează

 prin măsurarea fluorescenţei, după reacţia cu SFB

(Solution Fluorometry with

Bromine).

58

M etode imun ologice

se utilizează tehnica ELISA sau tehnica de aglutinare în

mediu lichid.

Tehnicile actuale de evidenţiere a patogenităţii microorganismelor utilizează sondelor moleculare sau studiul secvenţelor de cromozoni şi al plasmidelor implicate în imprimarea acestui caracter.

VI. STUDIUL SENSIBILITĂŢII MICROORGANISMELOR FAŢĂ DE FAGI (LIZOTIPIA)

Studiul acestui caracter prezintă un deosebit interes, mai ales în cazul bacteriilor. În funcţie de caracterele lor, unele bacterii sunt sensibile la bacteriofagi (de exemplu:  bacterii ale genurilor: En ter obacter , Vi bri o, Pseudomonas, Bacill us, L actobacillus

ş.a),

care le atacă în mod specific, producând liza celulelor. Lizotipia

reprezintă capacitatea bacteriofagilor de a ataca în mod specific

anumite biotipuri (tulpini) aparţinând unor specii de bacterii (lizotipuri). Cercetările de acest tip sunt realizate de laboratoare specializate, iar tehnica de studiu cea mai utilizată este tehnica dublului strat.

Pe suprafaţa unui mediu solidificat, în prealabil inoculat cu microorganismul de testat, se etalează o suspensie ce conţine bacteriofagi. Prezenţa unor zone de liză a celulelor, după o perioadă de termostatare, denotă o reacţie pozitivă faţă de bacteriofagi specifici.

VII. TEHNICI GENETICE PENTRU IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR VII.1 Determinarea dimensiunii genomului

Dimensionarea genomului poate fi realizată fie direct, prin extracţia ADN-ului şi dozarea sa pe cale chimică sau biochimică, fie indirect, în urma studiului denaturării/renaturării moleculei de ADN. Reacţia de refacere a moleculei de ADN respectă o cinetică de ordinul al doilea, conform relaţiei:

59

în care: C0 est e concentraţia iniţială de ADN; C - concentraţia de ADN la timpul t; t -

timpul de analiză. Se consideră că există o corelaţie între factorul C 0t şi mărimea

genomului.

Această metodă se utilizează pentru identificarea bacteriilor şi a virusurilor.

VII.2 Compoziţia acizilor nucleici Compoziţia în nucleotide poate reprezenta un criteriu taxonomic important  pentru caracterizarea şi identificarea microorganismelor. Raportul AT/GC permite caracterizarea la nivel de specie. După liza celulelor se extrage ADN -uI, se purifică, iar după hidroliză, bazele azotate sunt dozate prin metode chimice, biochimice sau cromatografice.

VII.3 Determinarea cariotipului (CFP - Chr omosome F i nger Pri nti ng) Cariotipul

direct, prin examen

defineşte natura şi numărul de cromozomi. El se poate determina microscopic, în timpul diviziunii celulare, după colorarea celulelor

(lucru destul de dificil de realizat în cazul microorganismelor), precum şi prin extracţia materialului nuclear şi analiza lui în câmp pulsant, pe gel de agaroză (tehnica CHEF–  Clamped  Homogeneous Electric Field). Acest tratament permite separarea cromozomilor

în funcţie de dimensiuni, apoi ei sunt vizualizaţi cu ajutorul razelor UV, după tratare cu  bromură de etidium. VII.4 Hibridarea ADN-ului. Variante A. U ti li zarea sondelor genetice 

Stabilirea omologiei ADN/ADN bazată pe hibridare constituie o metodă eficientă

 pentru identificarea microorganismelor la nivel de specie. În funcţie de gradul de omologie, se poate stabili apartenenţa microorganismelor după cum urmează: 

>80% - biotipuri ale aceleiaşi specii;



30-80% - specii care aparţin aceluiaşi gen;



< 30% - microorganisme încadrate în genuri diferite.

Pentru a realiza identificarea microorganismelor pe această cale se apelează la mai multe tehnici, şi anume: 

Tehnica de bază, care utilizează filtru de celuloză;



Hibridarea în soluţie;

60