2 Informe Completo de Bioprocesos 2

“Año de la inversión para el desarrollo rural y la seguridad alimentaria” UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

UNIDAD I PRÁCTICA Nº02

: Preparación de medios de cultivo para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126

DOCENTE

: ROMERO USQUIANO, Roger

CURSO

: Bioprocesos II

ESTUDIANTES

:

 CHINCHAY CHINCHAY, Joel  GARCÍA PÉREZ, Carlos  LÓPEZ PÉREZ, Jimmy Breitner  RIVAS SANDOVAL, Walter

CICLO

: VII

Nvo. Chimbote. Mayo de 2013

PRÁCTICA Nº02: Preparación de medios de cultivo para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126

I.

INTRODUCCION

En esta práctica de laboratorio se llevara a cabo la preparación de medio de fermentación, el medio de activación y el medio de mantención con el propósito de evaluar ciertos parámetros importantes y básicos al final de la fermentación. Las levaduras una vez que han estado en un medio de mantención es necesario activarlas en otro medio para producir el inoculo correspondiente que nos permitirá la fermentación, para ellos es necesario producir un medio de activación con nutrientes específicos constituidos de glucosa, extracto de levadura, extracto de malta y solución de sales que deben ser aptos para una activación eficaz, para ello debemos hacer los cálculos necesarios para un determinado volumen , en esta caso será de 20 ml en volumen total del medio de activación, previamente esterilizado en el autoclave, nos brindara la confianza de un buen medio de activación. El medio de cultivo (fermentación) es una solución que proporciona todos los requerimientos para el crecimiento y producción de metabolitos deseados. Dichos requerimientos varían de acuerdo al microorganismo a utilizar, en nuestro caso prepararemos un medio especial para Saccharomyces cerevisiae. El proceso de fermentación se llevara a cabo en un biorreactor, entonces determinados sustratos que componen el medio de cultivo serán transformados por los microorganismos en metabolitos y biomasa. El microorganismo va aumentando en su concentración en el transcurso de la fermentación debido a su reproducción al mismo tiempo que el medio se ira modificando debido al consumo y formación de nuevos productos. El comportamiento de un microorganismo en crecimiento será el resultado de la interacción que se produce entre el mismo microorganismo y el medio ambiente en el reactor, llamados efectores intracelulares y efectores extracelulares. Los efectores internos hacen referencia a su genética y sus mecanismos de regulación metabólica. El comportamiento del microorganismo en el reactor será el resultado de la influencia de parámetros físicos y químicos que constituyen los efectores externos. Los parámetros físicos son las condiciones de operación en los reactores como por ejemplo la temperatura, la agitación, aireación, etc. Los parámetros químicos están representados por los componentes de los medios de fermentación, además del oxígeno molecular.

II.

OBJETIVOS

1-Calcular las proporciones adecuadas de los reactivos y las sales para un volumen de 20ml de medio de activación. 2-Proveer un medio de activación adecuado para la cepa Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 3.-Hacer una curva de calibrado y determinar la ecuación de la recta que tenga el mejor coeficiente de correlación (R2). III.

MARCO TEÓRICO

Activación de la levadura: Como el microorganismo se conserva en tubo inclinado, para transferirlo al medio de cultivo; es necesario activarlo, para esto se utilizan tubos de ensayo tapa rosca con un volumen de 10 mL del medio de cultivo para activación. NOTA: La fuente de carbono utilizada es xilosa. Se toman colonias definidas y aisladas de una caja petri y se lleva a los diferentes tubos con medio previamente preparados y esterilizados, posteriormente se incuban a 38 ° C durante 3 días. Pasado este tiempo, se selecciona uno de los tubos dependiendo de la calidad de la colonia y se siembra en el medio de activacion en una forma de escalamiento, previamente el medio de activacion ha sido preparado considerando las proporciones ya calculados de cada uno de los componentes mencionados a continuacion y llevados al autoclave para su esterilizacion. A continuacion los rectivos necesarios para el medio de activacion: GLUCOSA El crecimiento de los microorganismos en los medios de activación se ve favorecido por la adición de glucosa, pero el pH baja rápidamente y cesa |el crecimiento. Esta caída de pH se debe a una acumulación de ácido láctico, procedente de la fermentación de los azucares, especialmente la glucosa (McCarty 1984). EXTRACTO DE LEVADURA El extracto de levadura consiste en una solucion concentrada de hidrolizado proteico de células de Saccharomyces cerevisiae, producido por una reacción autolitica o plasmodica de dichas células. Es una buena fuente de aminoácidos, carbohidratos y vitaminas especialmente del complejo hidrosoluble B y tiene un bajo contenido en sales. Los carbohidratos principales son glucógeno y trehalosa aunque por hidrólisis enzimática durante el proceso estos carbohidratos pueden fraccionarse en moléculas de glucosa (Bridson 1978).

EXTRACTO DE MALTA El extracto de malta es un extracto soluble en agua de cebada de malta que se obtiene por secado y molido del grano de cebada germinado y posterior extracción con agua caliente lo que permite conservar el nitrógeno y los carbohidratos constitutivos. Los constituyentes principales del extracto son los carbohidratos (90%), (principalmente glucosa, fructosa, maltosa) y compuestos nitrogenados (4%), en menor proporción incluye lípidos, compuestos sulfurados e inorgánicos. Es un extracto muy utilizado para el cultivo de hongos filamentosos y levaduras (Bridson 1978). SOLUCION DE SALES: Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl-) y de cationes para la célula. Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K +, Mg++, Ca++, Fe++. participa en muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como citocromos y ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe-S);interviene como cofactor en ciertas enzimas. Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las bacterias necesitan minúsculas cantidades de otros elementos (oligoelementos), a los que también se denomina como micronutrientes o elementos traza(Bridson 1978). Curva de calibrado La curva de calibrado es un método de química analítica empleado para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar (concentración). Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibración, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del analito. Las curvas de calibración suelen poseer al menos una fase de respuesta lineal sobre la que se realiza un test estadístico de regresión para evaluar su fiabilidad.

IV.

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES: -matraz 125ml

-espatulas

-pipetas 10ml

-balanza analitica

-agua destilada

-tampones

-capachos

-autoclave

V.

PROCEDIMIENTO

A. PREPARACIÓN DE TUBOS DE MANTENCIÓN

referencia de composicion de medio de mantencion para sacharomyces cerevisae ATCC 4126 nutriente extracto de levadura peptona extracto de malta agar glucosa        

concentracion g/l concentracion g/20ml de solucion V=20 ml W= … g 3 5 3 20 10

0,06 0,1 0,06 0,4 0,2

0,06 0,1 0,06 0,4 0,2

Pesar los reactivos y adicionar al matraz Añadir agua hasta completar volumen de solución Calentar mezcla y llevarlo a ebullición con agitación constante Hervir 1-2 min a fin de disolver totalmente Distribuir en caliente en 3 tubos de ensayo con tapa (6,3 ml aproximadamente c/u) Esterilizar en olla a presión, (a partir de primera burbuja 10 – 15 min) Enfriar y dejar vapor de la autoclave Dejar reposar 1 hora o toda la noche los tubos inclinados con la tapa asegurada.

Se usa dos o tres tubos de mantención para asegurar que las levaduras se reproduzcan.

B. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN

MEDIO

ACTIVACION

NUTRIENTE Glucosa Extracto levadura Extracto de malta Solucion de sales

CONCENTRACION g/L 10g de 3g 5g 5ml/L

CONCENTRACION g/20ml SOLUCION 0.2g 0.06g 0.1g 0.1ml

Se hacen los calculos según las proporciones que se requiere según el cuadro nro.1 para determinar los pesos en gramos de cada reactivo, luego se procede a pesar en la balanza analitica previamente calibrada y haciendo uso de los respectivos capachos y de las espatulas y pinzas llenando la glucosa en el matraz , el extracto de levadura y el extracto de malta iran juntas en un tubo de ensayo , asi como tambien las sales en otro.

C. PREPARACION DE LAS SALES Composicion de las sales ultilizadas en los medios de cultivo en g / L.

Gramos / medio litro

Gramos / Litros

Compuesto

0,56 0,055 0,03 0,025 0,005 0,00025 0,0135

1,12 0,11 0,06 0,05 0,01 0,0005 0,027

CaCl2 . 2H2O ZnSO4 . 7H2O FeSO4 . 7H2O CuSO4 . 5H2O CoCl2 . 6H2O MoO3 MnCl

0,28

NaCl

0,14

Condiciones de cultivo: 35 °C, velocidad de agitacion: 150 rpm en el shaker

D. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMETACIÓN

E. ELABORACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRADO Método del DNS (ácido dinitrosalicílico) Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 20 ml de agua, paralelamente se disuelve el DNS en pequeñas cantidades con ayuda de un agitador magnético y calentando. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 50 mL y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta 50 mL

Se precisa realizar los siguientes pasos para la realización de la curva de calibrado:

Tabla nº01: Preparación de las soluciones Estándar de glucosa 2 g/l (100 ml) Nº tubo ensayo

glucosa

Agua

glucosa

Absorbancia

(mL)

(mL)

(g/L)

( ƛ=540 nm)

1

1.0

0.0

2

2

0.8

0.2

1.6

3

0.6

0.4

1.2

4

0.4

0.6

0.8

5

0.2

0.8

0.4

6

0.0

1.0

0.0

1. Se añade 0.5 mL de reactivo DNS a 0.5 mL de muestra a analizar. 2. Se mantiene la mezcla en baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego enfriar con agua helada por un tiempo de 3 minutos. 3. Se añaden 5 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos, pasados estos, agitar hasta homogenizar la solución obtenida. 4. Se lee la absorbancia de todas las muestras a una longitud de onda de 540 nm, utilizando agua como blanco. 5. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestra de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.

VI.

RESULTADOS

PESADO Y USO DE LOS REACTIVOS

MEDIO DE ACTIVACION FINAL

PREPARACION DE SALES:

MEZCLADO DE LOS REACTIVOS

Tabla nº02: Absorbancia de las soluciones Estándar de glucosa preparadas a diferentes concentraciones. Nº tubo ensayo

glucosa

Agua

glucosa

Absorbancia

(mL)

(mL)

(g/L)

(ƛ=540 nm)

1

1.0

0.0

2

0.277

2

0.8

0.2

1.6

0.206

3

0.6

0.4

1.2

0.297

4

0.4

0.6

0.8

0.201

5

0.2

0.8

0.4

0.101

6

0.0

1.0

0.0

0.0

y = 0.1203x + 0.0415 R² = 0.8568 0.3 0.277 Absorbancia (nm)

0.25 0.2

0.206

0.201

0.15 0.1

0.101

0.05 0

0 0

0.5

1

1.5

2

Glucosa (g/L)

Gráfica nº01. Relación entre las concentraciones de glucosa y las absorbancias-Curva de calibración.

2.5

VII.

DISCUSIÓN

Los medios de cultivo para el aislamiento se vierten en tubos inclinados. Los cuales a pesar de tener una superficie reducida ofrecen seguridad en su manipulación y buena resistencia a la deshidratación y a la contaminación. Se utilizan para conservar cultivos por tiempo más o menos prolongado. Los medios se seleccionan en base al tipo de muestra que queremos reproducir. (Cañedo, V. 2004). Por tales cualidades se eligió aislar en tubos inclinados, los cuales contenían un medio adecuado para Saccharomyces cerevisiae. Los resultados obtenidos en la obtencion del medio de activacion nos muestran un medio apto para la activacion ya que se cumplieron con todas las normas que lo establecen los protocolos establecidos, asi como tambien dicho medio de activacion es el 10% del volumen del medio de cultivo como lo contempla : RAMIREZ L., Gladys. Manual de laboratorio de Bromatología. Medellín, Enero de 1999. Con respecto a la curva de calibración se hicieron algunas modificaciones en la práctica, se trabajó con 0.5 ml de solución de glucosa y con 0.5 ml de DNS, siendo 1 ml el volumen más adecuado para ambos de acuerdo a los protocolos sobre curvas de calibrado con DNS. Asimismo en los resultados obtenidos se obtuvo que la concentración de glucosa de 1.2 g/L presentó una absorbancia de 0.297, mayor que las concentraciones de 1.6 g/L y 2 g/L, lo cual no es correcto debido a que las absorbancias son directamente proporcionales a las concentraciones, esto puede haberse dado debido a un error al momento de hacer reaccionar las soluciones de glucosa con el DNS, las cuales no se dieron en un medio acuoso en ebullición por 5 minutos, sino en un medio acuoso de 93ºC por 6 minutos, además otra posible causa del resultado puede haberse dado debido a la falta del calibración del espectrofotómetro utilizado. Así también el coeficiente de correlación obtenido (R² =0.8568) muestra que los puntos obtenidos de la relación entre la solución de glucosa y la absorbancia no están del todo alineados.

VIII.

CONCLUSIONES

1- Se calculo la cantidad necesaria de medio de activacion con las respectivas proporciones de los reactivos y la solucion de sales sales de tal manera que cumple con ser el 10% del medio de cultivo. 2- De esta manera se Provee un medio de activación adecuado para la cepa Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 3- La curva de calibrado permite determinar de forma aproximada las cantidades de glucosa presentes en las soluciones, en base a sus absorbancias. 4- A partir de la ecuación de la recta obtenida (y = 0.1203x + 0.0415) se puede determinar las cantidades de glucosa presentes en las soluciones, en base a sus absorbancias.

IX.

RECOMENDACIONES

1-Se recomienda usar pinzas al momento de pesar el la balanza analitica para evitar variaciones en el peso. 2-Se recomienda hacer el pesaje en el menor tiempo posible ya que los reactivos son higroscopicos y absorven agua de la humedad del ambiente , variando significativamente el peso de los reactivos. 3- Sería bueno que en el laboratorio se contara con dos balanzas analíticas para poder avanzar en el pesado de las sales y demás compuestos quimicos necesarios para las prácticas.

X.

MATERIAL DE REFERNCIAS

XI.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1-POTTER, Norman N. La ciencia de los alimentos. Ed. Harla, México. (1978). Pág. 359-376. 2-JAGNOW, G. Y David W.Bioctenología: inducción con experimentos modelos. Ed.Acribia, Zaragoza-España (1991). 3-RAMIREZ L., Gladys. Manual de laboratorio de Bromatología. Medellín, Enero de 1999. 4- Cañedo V. (2004). Manual de Laboratorio para el Manejo de Hongos. Lima, Perú.