2-Guía de Laboratorio-MA-L8

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PRÁCTICA N°8 MÉTODO CONVENCIONAL PARA LA DETERMINACIÓN DE COLIFORMES Y E. Coli 2.- Introducción Determinar la calidad higiénica sanitaria, y/o el grado de contaminación microbiana de una muestra de agua u otra muestra, es de suma importancia para la prevención de enfermedades infectocontagiosas; para ello, se utilizan organismos indicadores de la contaminación fecal humana o de otros animales de sangre caliente; al respecto (Willey, Sherwood, & Woolverton, 2008) sobre la importancia del análisis de una muestra de agua y de los organismos indicadores señalan lo siguiente: “Debido a la contaminación del agua con residuos fecales humanos y de otros animales ha aparecido un amplio rango de enfermedades víricas, bacterianas y de protozoos. Aunque muchos de éstos patógenos se pueden detectar directamente, los microbiólogos ambientales han utilizado generalmente los organismos indicadores como un índice de posible contaminación del agua por patógenos. Los investigadores están aún buscando el organismo indicador “ideal” para usar en la microbiología sanitaria.” (Willey, Sherwood, & Woolverton, 2008) Actualmente se consideran como organismos indicadores de contaminación fecal a los coliformes y, en esta práctica se realiza las pruebas para detectar coliformes en una muestra de agua y/o suelo. 3. Competencia: Realiza e interpreta los resultados del análisis de coliformes en una muestra de agua de regadío o suelos regados con aguas servidas 4. Fundamento teórico Bacterias Coliformes Según (Willey, Sherwood, & Woolverton, 2008) definen a los coliformes como: “… Estas bacterias representan aproximadamente el 10% de los microorganismos intestinales del ser humano y otros animales y se han usado ampliamente como organismos indicadores. El grupo de coliformes incluye Escherichia coli, Enterobacter aerógenes y, Klebsiella pneumoniae. Los coliformes se definen como bacterias anaerobias,

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Gram negativas, no formadoras de esporas, bacilares que fermentan la lactosa con la formación de gas en 48 horas a 35°C. La prueba original para los coliformes que se utilizó para llegar a esta definición implicaba las pruebas presuntivas, confirmativas y completas… Desafortunadamente los coliformes incluyen una amplia gama de bacterias cuyo origen primario puede no ser el tracto gastrointestinal. Para abordar esta dificultad se han desarrollado pruebas que permitan comprobar en las aguas la presencia de coliformes fecales. Estos son coliformes derivados del intestino de los animales de sangre caliente, que pueden crecer a la temperatura más restrictiva de 44.5 °C.” Según (Atlas & Bartha, 2008) sobre la utilización de los coliformes como indicador de contaminación fecal señalan: “Hay requisitos que, un organismo indicador debería cumplir: estar presente siempre que lo estén los patógenos de importancia; cuando hay peligro real de que los patógenos estén presentes; encontrarse en mayor cantidad que los patógenos para proporcionar un margen de seguridad; debe sobrevivir en el ambiente tanto tiempo como los posibles patógenos; y tiene que ser fácil de detectar, con una alta fiabilidad de identificación, independientemente de que otros organismos se encuentren en la muestra. E. coli cumple mucho de estos criterios, pero hay limitaciones para su uso como organismo indicador, y se han propuesto varias especies más como indicadores de la salubridad del agua complementarios o sustitutos. Probablemente no existe un organismo indicador universal para determinar la calidad del agua.” 5. Materiales y Métodos: 

Autoclave



Estufa esterilizadora



Baño maría



Incubadora



Balanza



Mechero de Bunsen



Lámpara UV de onda larga



45 tubos de ensayo de 16x150 con tapa



45 campanas de Durham



05 pipetas estériles de 10 ml

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

01 frascos de muestreo estéril



01 frasco de dilución con 90 ml de agua peptonada estéril al 0.1%



04 tubos de ensayo de 16x150 con 9 ml de agua peptonada al 0.1%



Caldo Triptosa Lauril (LST)



Caldo de Bilis Lactosa Verde Brillante (BGLB)



Caldo EC más MUG



Agua destilada



Algodón



Etanol farmacéutico

6. Procedimiento El procedimiento se basó según la revisión de: (Instituo-del-agua-y-medio-Ambiente & Omega-Perú, 2002), (HACH, 2000) y, (Dirección-General-de-Salud-Ambiental, 2001) Prueba Presuntiva para detección de bacterias coliformes totales 1.- Añadir 10 ml de muestra de agua o 10 g de suelo a un frasco de dilución con 90 ml de agua peptona al 0.1%, homogeneizar. 2.- Preparar las siguientes diluciones añadiendo 1 ml de la dilución 1:10 a un tubo con 9 ml de agua peptonada (10-2) y así sucesivamente (10-3, 10-4, etc.). 3.- Transferir 1 ml de cada dilución a un juego de 5 tubos con 10 ml. del Caldo Triptosa Lauril Sulfato (LST). 4.- Incubar a 35ºC por 24 a 48 hrs. Reportar como resultados positivos la turbidez y presencia de gas en el vial de fermentación (tubos Durham). En caso de agua potable, leer como positivo la presencia de turbidez. Prueba confirmativa para detección de coliformes totales 1.- De los tubos positivos del Caldo Triptosa Lauril Sulfato (LST), transferir un inóculo a los tubos con 10 ml. de Caldo Bilis Lactosa Verde Brillante (BGLB). 2.- Incubar a 35ºC por 24 a 48 hrs y proceder a reportar sus resultados. 3.- Calcular el número más probable (NMP) con la tabla del anexo Determinación de coliformes fecales (bacterias termo tolerantes) y confirmación de E. coli Agitar suavemente cada tubo de LST que produce gas CO2, puede usarse también tubos de BGLB gas positivo) y transferir una asada al tubo de caldo EC con MUG e incubar a

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44.5 o 45.5ºC por 24 a 48 hrs. y proceder a realizar su lectura con la ayuda de la tabla del NMP. Reportar E. coli los tubos positivos que emiten fluorescencia ante la luz UV. TRABAJO REMOTO: La práctica será demostrativa en una sesión no presencial, para lo

cual

se

mostrará

los

resultados

a

través

del

siguiente

vídeo:

https://www.youtube.com/watch?v=35NG4BUyTlk

Para realizar los cálculos correspondientes del NMP de coliformes totales y coliformes termo tolerantes, se hará una simulación de resultados positivos de una muestra de regadío. 7.- Resultados e interpretación Microorganismo

NMP/100ml

NMP/ 100ml (según normatividad)

Coliformes Totales Coliformes termo tolerantes

8. Discusiones y Conclusión:

9. Bibliografía Atlas, R., & Bartha, R. (2008). Ecología microbiana y Microbiología ambiental (Cuarta edición ed.). PEARSON. Dirección-General-de-Salud-Ambiental. (2001). Manual de análisis microbiológico de alimentos. Lima-Perú. HACH. (2000). Manual de análisis de aguas. Instituo-del-agua-y-medio-Ambiente, & Omega-Perú. (2002). Control de calidad del agua, Efluente y tecnologías de potabilización. Lima Perú. Willey, Sherwood, & Woolverton. (2008). Microbiología de Prescott, Harley y Klein (Séptima edición ed.). Mc Graw Hill.

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