1.laporan Praktikum Bioteknologi-Pembuatan Media

 

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Kultur jaringan tanaman merupakan bagian suatu teknik perbanyakan vegetatif nonkonvensional. Perbedaan teknik ini dibandingkan dengan teknik perbanyakan vegetative konvensional biasanya terletak dalam situasi dan lokasi yang  berbeda. Penerapan teknikkultur teknikkultur jaringan tanaman mensyaratkan kondisi di dalam ruangan (laboratorium) dan sifatnyaaseptik (steril dari patogen). Bermuara dalam kondisi yang aseptic, maka perlu dijelaskan bahwa segala aktifitas yang berkaitan dengan jaringan harus dalam kondisi aseptik. Kondisi ini dimulai dari cara: Penyiapan peralatan (alat tanam  berbahan logam logam ataupun dan ge gelas), las),pemilihan: Pembuatan Pembuatan media penan penanaman, aman, Penanaman (inisiasi a. perbanyakan;  b.perakaran).  b.perakara n). Selain peralatan kultur jaringan, media merupakan salah satu factor utama dalam keberhasilan kultur. Media kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang ditanam. Media kultur jaringan memiliki karakteristik masingmasing. Artinya tidak semua media dapat digunakan pada semua kultur tanaman. Karena beberapa media yang ada memiliki perbedaan kandungan dan konsentrasi zat-zat yang diperlukan atau digunakan pada kultur. Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan  perkembangbiaka  perkem bangbiakan n tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan  pertumbuhan  pertumb uhan dan perkem perkembangan bangan tanaman yang dikulturkan. Media kultur fisiknya dapat berbentuk padat atau cair. Media

 

 berbentuk padat menggunakan menggunakan pemadat media seperti agar. Media kultur yang memenuhi syarat adalah yang mengandung nutrient makro dan mikro dalam kadar dan perbandingan tertentu, sumber energi (sukrosa), serta mengandung berbagai macam vitamin dan ZPT. 1.2 Tujuan a. Untuk m mengetahi engetahi dan mempraktikan cara membuat larutan stok.  b. Untuk mengetahui mengetahui dan mempraktikan mempraktikan cara membuat membuat medium MS(Murashige & Skoog).

 

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1  Macam  –  Macam  Macam Media Untuk Kultur Jaringan   Medium Dasar Murashige dan Skoog (MS) : digunakan untuk hampir semua macam tanaman. Medium ini mempunyai konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3-dan NH4+.    Medium dasar B5 atau Gamborg : digunakan untuk kultur suspensi sel kedele, alfalfa, legume lainnya.   Medium dasar White : digunakan untuk kultur akar. Medium ini merupakan medium dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah.   Medium Vacin end Went (VW) : digunakan khusus untuk medium anggrek. 

  Medium dasar Nitsch dan Nitsch : digunakan untuk kultur

tepung sari(pollen) dan kultur sel.   Medium dasar Schenk dan Hildebrandt : digunakan untuk tanaman monokotil.   Medium dasar Woody Plant Medium : digunakan untuk tanaman yang berkayu.   Medium dasar N6 : digunakan untuk tanaman serealia terutama padi (Daisy,1994). 





2.2 Komposisi Media MS serta Fungsinya a. Sumber Karbon Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa harus ditambahkan ke dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energy bagi  pertumbuhan  pertumb uhan tanaman dan juga sebaga sebagaii bahan pem pembangun bangun untuk memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh. Biasanya sukrosa pada konsentrasi 1  –  5%   5% digunakan sebagai sumber karbon tapi sumber karbon lain seperti glukosa, maltosa, galaktosa dan laktosa juga digunakan.

 

Ketika sukrosa diautoklaf, terjadi hidrolisis untuk menghasilkan glukosa dan fruktosa yang dapat digunakan lebih efisien oleh tanaman dalam kultur. b. Agar

Umumnya dikulturkan pada media yang dibuat sepertijaringan gel dengan menggunakan agar padat atau  pengganti  pengga nti agar sperti Gelrite atau Phytage Phytagel. l. Konsentra Konsentrasi si agar yang digunakan berkisar antara 0.7  –   1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti Difco BiTek mahal harganya tapi lebih murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan. Pengganti lain seperti gelatin kadang –  kadang  kadang digunakan pada lab komersial. Gel sintetis diketahui dapat menyebabkan hyperhidration (vitrifikasi) yang merupakan problem fisiologis yang terjadi pada kultur. Untuk mengatasi masalah ini, produk  baru bernaman bernaman Agarge Agargell telah diproduks diproduksii ole Sigma. Produ Produk k ini merupakan campuran agar dan gel sintetis dan menawarkan kelebihan kedua produk sekaligus mengurangi problem vitrifikasi. Produk ini dapat dibuat di lab dengan mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar sebagai agen pengental untuk 1 L media. c. pH  pH media biasanya diatur pada kisaran 5.6  –   5.8 tapi tanaman yang berbeda mungkin memerlukan pH yang berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika pH lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2, agar tidak dapat memadat. d. Air

Air distilata biasanya digunakan dalam kultur  jaringan, dan banyak banyak lab mengg menggunakan unakan aquabides aquabides (air destilat destilataa ganda). Beberapa lab, dengan alasan ekonomi, menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol kandungan  bahan organik organik dan non-organ non-organik ik pada media media (Nugr (Nugroho,1996). oho,1996).

 

2.3 Teknik Aseptik dalam Pembuatan Media 

1. Menyuci bersih peralatan dengan detergen dan membilas dengan air dan aquades. 2.Membungkus peralatan dengan kertas coklat/Koran. 3.Mengoven peralatan pinset, gunting, scalpel, jarum ose, dan lain sebagainya selama 4 jam dengan temperatur 160 oC. 4.Memasukkan media ke dalam botol kultur dan menutup dengan kertas alumunium foil dan memanaskan selama 20-30 menit dengan temperature 121oC dengan tekanan 17,5 psi. 5.Mensterilkan bahan tanam dengan mencuci bersih, menggocok, direndam dengan air, dan kemudian membilas (Edi,2007) 2.4 Jenis Kontaminasi Media

Kontaminasi merupakan salah satu gangguan yang umum terjadi pada kultur jaringan. Menurut Santoso dan  Nursandi (2003) tingkat kontaminas kontaminasii media berbandin berbanding g lurus dengan tingkat kekayaan unsur hara dalam media yaitu semakin diperkaya suatu media maka tingkat kontaminasinya  juga semakin besar,dem besar,demikian ikian pula sebalik sebaliknya nya semak semakin in sederhana suatu. Pada media umumnya, maka tingkat kontaminasinya juga semakin kecil kontaminasi karena jenis media disebabkan karena kontaminasi mikroorganisme dari lingkungan luar dan yang berasal dari eksplan. Oleh karena itu, jika mikroorganisme dari lingkungan luar dan eksplan tidak ada maka tidak akan terjadi kontaminasi media dan eksplan. Adapun sumber-sumber kontaminan menurut Santoso dan Nursandi (2003) dapat berasal dari : a)  Udara : kontaminan yang ada di udara dapat berupa spora bakteri atau cendawan dan umumnya banyak terdapat pada daerah yang berkelembaban tinggi.

 

 b)  Bahan tanam (eksplan) : untuk eksplan yang berasal dari tanah umumnya lebih banyak mengandung bahan kontaminan dibanding eksplan yang ada di permukaan atau pucuk. Kontaminan yang berada di permukaan eksplan dapat dibersihkan menggunakan air dan larutan pensteril. Sedangkan untukditangan kontaminan yang  berasal dari dalam eksplan ditangani i denga dengan n  penggunaan  penggu naan antibiotika. antibiotika. c)  Manusia atau pekerja : kontaminan yang berasal dari manusia dapat terbawa melalui pakaian yang dikenakan, anggota badan dan pernapasan. d)  Alat-ala Alat-alatt yang digunakan : kontaminan dapat berasal dari peralatan yang digunakan dalam kegiatan  penanaman  penanama n karena prose prosess sterilisas sterilisasii yang kurang sempurna sehingga kontaminan masih melekat dalam  peralatan. e)  Aquades (air steril) Menurut Gunawan (2007) untuk mengurangi kontaminasi yang berhubungan dengan media maka sebaiknya menggunakan media ½ MS. Kontaminasi sangat beragam mulai dari jenis kontaminannya (bakteri, jamur, virus, yeast, kapang),waktu terjadinya kontaminasi (cepat, dalam hitungan  jam; sedang, dalam hitungan hari; lambat, dalam hitungan minggu dan bulan), dan apa yang terkontaminasi (media atau eksplan). Jenis kontaminasi ada dua yaitu kontaminasi eksternal dan kontaminasi internal. Kontaminasi eksternal dapat disebabkan oleh jamur dan bakteri, sedangkan kontaminasi internal umumnya disebabkan oleh bahan eksplan itu sendiri. Untuk mengatasi kontaminasi internal dapat digunakan HgCl2 karena dapat menurunkan laju kontaminasi bakteri internal tanpa merusak jaringan. Selain itu juga dapat dilakukan dengan penggunaan fungisida, HgCl2 dan klorin klorin karena dengan penggunaan kombinasi bahan sterilan tersebut merupakan upaya sterilisasi berlapis untuk mereduksi resiko kontaminasi baik yang berasal dari cendawan, bakteri maupun kotoran-kotoran lain yang menempel pada permukaan

 

eksplan.Sedangkan untuk pencegahan kontaminasi eksternal dapat dilakukan dengan sterilisasi kontak (Gunawan, 1987).  1987). 

2.5 Ciri-Ciri Media yang Sesuai untuk Pertumbuhan Eksplan

Ciri  –   ciri media yang baik untuk media kultur yaitu menyediakan unsur hara baik makro maupun mikro, sumber vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa, ekstrak buah dll, bahan pemadat: agar-agar dan gelrite dan  juga menye menyediakan diakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman. Unsur hara makro dan mikro diberikan dalam bentuk garam-garam anorganik. Pada umumnya biasa diberikan dalam komposisi tertentu seperti komposisi media MS, WPM, B5, White, dan lain-lain tergantung dari jenis tanaman yang akan dikulturkan. Vitamin yang banyak digunakan adalah vitamin

B12

(thiamin),

Nicotinic

Acid,

vitamin

B6

(pyridoxine), dan vitamin E atau C yang digunakan sebagai antioksidan. Asam amino dipakai sebagai sumber N organik, yang biasa digunakan adalah glycine, asparagin, glutanin, alanin, dan threonin. Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) sangat penting dalam  pembutan media kultur jaringan. Zat pengatur tumbuh adalah

 

suatu persenyawaan organik yang dalam jumlah sedikit (1 mM) dapat merangsang, menghambat atau mengubah pola  pertumbuhan  pertumb uhan dan perkem perkembangan bangan tanaman.Dal tanaman.Dalam am kultur  jaringan ZPT penting: sitok sitokinin inin (Kinetin, BA, Zeatin, 2iP, Thidiazuron), auksin (IAA, NAA, IBA, 2.4-D, 2.4.5-T, Dicamba, Picloram). ZPTsitokinin ini mempunyai fungsi masing-masing yang Kedua berbeda, mempengaruhi  pembelahan sel serta pembentukan pembentukan organ seperti pucuk dan  pembentukan  pembentuk an embrio som somatik. atik. Auksin dipakai untuk menginduksi, pembentukkan sel dan akar. Kombinasi antara auksin dan sitokinin berfungsi untuk menginduksi  pertumbuhan  pertumb uhan kalus. Selain auksin dan sitokinin digunakan digunakan  juga giberelin(m giberelin(menginduk enginduksi si pemanjang pemanjangan an tunas dan  perkecambahan  perkecam bahan embrio, dan mengham menghambat bat pengakaran) pengakaran) dan retardan (untuk menghambat pertumbuhan tunas) seperti  pachlobutrazol.  pachlobutra zol. Senyawa organik sering ditambahkan ke dalam media sebagai sumber pembentuk asam amino dan vitamin. Senyawa organik yang sering ditambahkan adalah air kelapa, ekstrak ragi, ekstrak buah, dan casein hydrolisat. Sebagai sumber energi ditambahkan dari senyawa-senyawa yang merupakan sumber karbohidrat, seperti sukrosa (paling baik pada tanaman umumnya), glukosa, fruktosa, dam maltosa. Penambahan arang aktif berfungsi untuk mengarbsorbsi senyawa-senyawa fenolik dan untuk merangsang pertumbuhan akar. Selain ditambahkan oleh senyawa-senyawa tersebut, media yang baik harus selalu berada dalam PH yang optimal yaitu 5,5-5,8. selain itu, harus dibuat dalam tempat yang steril. Autoclave sering dipakai untuk sterilisasi dalam pembuatan media kultur jaringan. (Skoog & Miller, 1975)

 

BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan

a. Alat : Gelas Stirer Microwave Stopwatch Botol Kultur Plastik Autoclave

Pipet Timbangan

: untuk tempat mencampur bahan : untuk mengaduk mengaduk larutan secara cepat :untuk mensterilkan, glatilisasi/pengentalan : untuk mengatur waktu : untuk tempat media MS : untuk menutup botol kultur : untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan : untuk mengambil cairan : untuk menimbang bahan

 b. bahan 1. Aquades

: untuk membersihkan alat yang digunakan 2. Sukrosa : sebagai sumber energi utama/cadangan makanan 3. Agar (swallow) : untuk memadatkan media MS agar mudah menanam eksplan 4. UnsurMakro  NH   4 NO3   KNO3 Sebagai pembuat 300 ml  MgSO47H2O media kultur larutan makro  KH2PO4   CaCl22H2O : Untuk media kultur 3 ml 









 

5.UnsurMikro A  H3BO3  MnSO44H2O  ZnSO47H2O 



Untuk pembuatan 300 ml media kultur diambil 3 ml



6. UnsurMikro B  KI  Na   2MoO47H2O  CuSO45H2O  CoCl6H2O 





Untuk pembuatan 300 ml diambil larutan 0,3 ml



7. FeEDTA  FeSO47H2O  Na   2EDTA 



8. Vitamin  TiaminHCl  PeridoksinHCl  AsamNikotinat  Olycine

Untuk pembuatan 300 ml diambil larutan 3 ml









Untukpembuatan 300ml diambil 0,3 larutan vitamin

 

3.2 Cara Kerja

Bilas gelas dengan aquades ↓  Isi gelas dengan aquades ± 50 ml ↓  Tambahkan unsur yang sudah distok (Makro 30ml, Mikro A 3ml, Mikro B 0,3ml, FeDTA 3ml, Vitamin 0,3ml, CaCl2 3ml) ↓  Tambahkan aquades hingga ˂ 300ml   ↓  Stirer + ukur pH   pH terlalu asam (˂ 5,5), ditambah  pH ditambah NaOH    pH terlalu basa (˃ 5,8), ditambah  pH ditambah HCl  



↓  Masukkan sukrosa dan agar   Sukrosa 9 gram   Agar 2,1 gram ↓  Stirer ↓  Microwave selama 5 menit (1500 C) ↓  Tuangkan kebotol kultur (tutup plastic) ↓  Autoclave 



3.3 Analisa Perlakuan Dalam praktikum bioteknologi pertanian dalam materi  pembuatan media ms perlakuan yang kami lakukan diantaranya yang pertama adalah mempersiapkan alat dan  bahan. isi gelas tersebu tersebutt dengan aquades sebanyak ± 50 ml. Tambahkan unsur makro yang telah disiapkan. Unsur-unsur makro itu diantaranya yaitu Makro,Miko A,Mikro B,FE EDTA,Vitamin dan CaCl2.

 

  Pemberian unsure ini diberikan dengan menggunakan  pipet.Kemudian  pipet.Kem udian tambahkan aquades aquades hingga 300 ml. stirer dan ukur ph nya.Masukkan sukrosa dan agar secara bertahap dan hati-hati. Lakukan pengadukan dengan stirrer. Kemudian masukkan kedalam microwave selama 5 menit.Dan tuangkan kedalam botol ke kultur, sampai agar mulai mengeras dan masukkan dalamdiamkan autoclave.

 

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Pembahasan

Pada praktikum pembuatan media kultur, kami menggunakan menggunakan media murashige dan skoog. Menurut (Hendaryono, 2014) Media Murashige dan Skoog merupakan perbaikan komposisi media skoog terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukungpertumbuhan optimum kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mMN dalam bentuk NO3 dan 29 mNN dalam bentuk  NH4+. Keistimewaan media MS menurut (Wetter dan Constabel, 1991) yakni kandungan nitrat, kalium dan amoniumnya yang tinggi. Senyawa anorganik yang penting untuk pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan ada yang mikro dan makro.Unsur hara makro yang dibutuhkan adalah  N,P,K Ca, Mg, S dan CHO serta unsur mikro yang dibutuhkan, adalah iodine (I), boron (B), mangan (Mn), zinc (Zn), molybdenium (Mo), tembaga (Cu), kobalt (Co), dan besi (Fe). Vitamin yang banyak digunakan adalah thiamin,  piridoxin, dan asam nikotinat. sedangk sedangkan an supleme suplemen n organik yang biasa digunakan adalah asam amino, peptone, ekstrak malt, dan ekstrak khamir. Zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam media tergantung kebutuhan kultur. Hal-hal lain yang  penting dalam media adalah kompos komposisi isi agar, pengaturan pengaturan pH, dan air (Yuwono 2008). Komposisi media yang digunakan tergantung dengan  jenis tanaman yang akan diperbany diperbanyak. ak. Media yang digunakan  biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh yang ditambahkan juga  bervariasi,  bervarias i, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Zat  pengatur tumbuh yang diberikan dalam media MS adalah

 

auksin (IAA) dan sitokinin (kinetin). Kedua homon ini mempengaruhi pertumbuhan akar, tunas, dan kalus  berdasarkan  berdasark an keseim keseimbangan bangan konsentra konsentrasi si dari kedua ZPT tersebut yang terkandung dalam media. Pada konsentrasi yang hampir tepat sama antara auksin dan sitokinin akan menghasilkan kalus.tunas, Apabila sitokininkonsentrasi lebih besarauksin dari auksin akan menginduksi sedangkan lebih  besar dari sitokinin akan mengindu menginduksi ksi perakaran yang lebi cepat (Trigiano and Gray 2000). Menurut Shintiavira,2012 bahwa pertumbuhan eksplan dipengaruhi oleh media kultur yang digunakan. Jenis media kultur dan konsentrasi nutrisi berpengaruh terhadap kecepatan pertumbuhan in vitro pemajangan dan kualitas morfogenesisnya. Penggunaan media MS mempengaruhi pertumbuhan daun tercepat dibandingkan penggunaan alternative pupuk majemuk Hyponex dan Growmore. Proporsi nitrogen dan fosfor yang lebih tinggi pada media MS menyebabkan  pertumbuhan  pertumb uhan jumlah daun terbanyak terbanyak pad padaa mingg minggu u ke -8.

 

BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan

perbanyakan dansecara perkembangbiakan tanamanKeberhasilan dengan metode kultur jaringan umum sangat tergantung pada jenis media. Media MS mengandung 40 mM  N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Dan Media MS inilah yang paling banyak digunakan untuk  berbagai tujuan kultur pada tahun-tahu tahun-tahun n sesudah penemuan penemuan media MS. Dari praktikum yang telah dilakukan yaitu pembuatan media MS, hasil yangdi dapatkan adalah media berhasil dibuat dan dapat digunakan untuk menanam eksplan dalam  praktikum kultur jaringan. jaringan.

 

DAFTAR PUSTAKA Daisy P. Dkk. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta : Kanisius.

Edi, syahmi., 2007, Penuntun Praktikum Kultur Jaringan Tanaman, Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Medan, Medan. TeknikKulturIn Vitro Gunawan, L. W., 1995,  DalamHortikultura. PT. PenebarSwadaya, Jakarta

 Nugroho, Arinto, Heru Sugito, 1996, Pedoman  Nugroho, Pedoman Pelakasana Pelakasanaan an Teknik Kultur Jaringan.Jakarta : Penebar Swadaya. Santoso

U,

Nursandi

F.

2003.

 KulturJaringanTanaman.Malang: UniversitasMuhammadiya Malang Press.

Skoog, F dan Miller, C.O. 1975. Chemical Regulation of Growth and Organ Formation in Plant Tissue Cultured In vitro.Symp. Soc. Exp. Biotech11: 118 –  131