11. Analisis Microbiologico de Alimentos

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CONTROLES ANALITICOS DE ALIMENTOS Y SUPERFICIES PARAMETRO

VALOR OBTENIDO

Recuento de colonias aerobias mesófilas

VALOR REFENCIA

1 x 10x ufc/gr

Enterobacterias

1 x 10x ufc/gr

Coliformes totales

1 x 10x ufc/gr

Escherichia coli

1 x 10 ufc/gr

Staphylococcus aureus

1 X 10 ufc/gr

Salmonella - Shigella

Ausencia/ 25gr

Mohos y Levaduras

1 x 10x ufc/gr

Bacillus cereus

1 x 10 ufc/gr

Listeria monocytogenes

1 X 10 ufc/gr

ANÁLISIS DE SUPERFICIE PARAMETRO

VALOR OBTENIDO

VALOR REFENCIA

Control desinfección (aerobios mesófilos)

0-10 ufc/ cm2

Control enterobacterias

0-1 ufc/ cm2

BIBLIOGRAFÍA -

Enviromental sampling for the detection of microorganisms. Laboratory procedure MFLP41A. Health Protection Branch. Ottawa. Canadá. Sep. 1992.

-

Mª del Rosario Pascual Anderson, Vicente Calderón Pascual. “Microbiología Analítica para alimentos y bebidas”. Ediciones Díaz de Santos. 2ª Edición, 2000.

-

Manual Básico de microbiología Cultimed. Panreac Química S.A. 2ª Edición, 1998. 1

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RECOGIDA DE MUESTRAS EN ESTABLECIMIENTOS ALIMENTARIOS 1 OBJETIVOS El objetivo de este protocolo es proporcionar, a las personas que vayan a realizar la recogida de muestras en establecimientos alimentarios, las directrices que deben seguir para que esta se realice en las condiciones higiénico-sanitarias adecuadas y sean representativas del estado higiénico del establecimiento y de las condiciones de producción. 2 MATERIAL NECESARIO 2.1.- Material estéril -

Bolsas de plástico con cierre hermético Envase estéril 100 ml Envase estéril 1500 ml para toma de muestras de agua Placas de contacto con el medio de cultivo: Agar biliado rojo violeta glucosa (Violet Red Bile Glucose: VRBG) Placas de contacto con el medio de cultivo: Agar nutritivo (Plate Count Agar: PCA) Cuchillo, cuchara, etc

2.2.- Material no estéril -

Nevera portátil Contenedores de hielo Bata de algodón blanca Gorro de para el pelo Bolsas cubrezapatos Guantes de latex Mascarilla Rotulador Alcohol 70 % v.v. Papel de un solo uso Bolígrafo Hojas de toma de muestras (2 hojas por empresa visitada)

3 PROCEDIMIENTO UTILIZADO: 3.1 Normas para el personal: El personal que recoge las muestras puede actuar como vector en la transmisión de microorganismos patógenos durante su estancia en el establecimiento, por lo tanto, es importante que dicho personal tenga conocimientos de microbiología y esté instruido para ello. Antes de desplazarse al lugar de recogida de muestras, la persona encargada deberá: -

Conocer la actividad productiva de la empresa que va a visitar Determinar los peligros y zonas de muestreo Tomar del laboratorio el material necesario para ello (ver apartado 2)

Si se va a visitar para la recogida de muestras varias industrias el mismo día, el vestuario será diferente para cada una, con el fin de evitar contaminación cruzada.

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El vestuario se compondrá básicamente de: -

Bata blanca Gorro adecuados que cubran todo el pelo Cubrezapatos de plástico

Se cumplirán las siguientes normas de higiene: -

Empleo del vestuario antes indicado Lavado las manos antes de la toma de muestra Uso guantes No comer ni beber en la zona de trabajo No sonarse la nariz, toser o estornudar, cerca de los alimentos No fumar en las áreas alimentarias No llevar joyas, ni perfumes fuertes No podrán recoger las muestras aquellas personas que padezcan alguna enfermedad infecciosa (respiratoria, dérmica, gastrointestinal, etc) o sean portadores asintomáticos.

3.2 Toma de muestras de superficie Fundamento: El método de toma de muestras de superficies empleado es el contacto de la superficie elegida con un medio de cultivo específico que permita el crecimiento de los microorganismos deseados y comprobar así, el estado higienico-sanitario del establecimiento visitado y verificar el correcto empleo de las técnicas de limpieza y desinfección. También se podrá utilizar torundas para esta recogida de muestras cultivando luego la muestra recogida por la torunda humedecida en los medios de cultivo descritos. Para la toma de muestras de superficies, se utilizarán placas de contacto con medio de cultivo PCA (Plate Count Agar) ó VRBG (Violet Red Bile Glucose) según se quiera saber la contaminación por bacterias aerobias mesófilas (lo llamamos control desinfección) o enterobacterias (lo llamamos control enterobacterias) respectivamente. La composición del medio de cultivo PCA (medio color tostado claro), basada en la peptona de caseina como aportación nutritiva, el extracto de levadura como sustrato vitamínico y la glucosa como fuente energética, favorece el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos, sin precisar de otros aditivos. En el medio VRBG (medio de color rojo-violeta), las sales biliares y el cristal violeta que forman parte del medio inhiben el crecimiento de la flora competitiva. Todas las Enterobacteriaceae fermentan la glucosa con producción de ácido, lo que se pone de manifiesto por un viraje al rojo y la precipitación de las sales biliares alrededor de las colonias. Las colonias de color rojo violeta rodeadas de un halo de precipitación, también violeta, se consideran Enterobacteriaceae. Procedimiento: Con los guantes puestos, se extrae la placa de contacto del blister en el que se encuentra, y cerca de la superficie elegida, se quita la tapa y se deposita la placa por la parte del medio de cultivo sobre la superficie, apretando un poco con la mano, para que entre bien en contacto con el medio de cultivo. Tras un minuto aproximadamente, se vuelve a colocar la tapa sobre la placa, se apunta en ésta con el rotulador el nombre de la superficie y se guarda la placa en el interior de una de las bolsas de plástico con cierre hermético, se cierra y se guarda en la nevera.

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Superficies de muestreo: -

suelos, paredes y techos de las áreas de producción (salas de elaboración, cámaras, almacenes, muelles, etc) Utensilios de trabajo: cuchillos, tablas de corte, espumaderas, etc Maquinaria que interviene en el proceso productivo: picadoras, envasadoras, etc Equipos de limpieza-desinfección: lavamanos, lavavajillas, desinfectadores, etc Cualquier superficie con humedad, temperatura y nutrientes que permita el crecimiento de microorganismos.

Nota: Es importante cuando se tomen muestras de superficies rugosas, apretar bien la placa sobre la superficie y aumentar el tiempo en contacto con ésta. 3.3 Procedimiento de toma de muestras de alimentos Para la toma de muestras del alimento, una vez seleccionado este, con guantes y mascarilla, coger el utensilio estéril adecuado, tomar asépticamente una muestra representativa del total del alimento e introducirla en el envase o bolsa de plástico estéril. Rotular con el nombre del alimento y nº lote (en su ausencia fecha de elaboración, recepción, sacrificio, despiece, etc). 3.4 Cumplimentación de la hoja de toma de muestras Una vez finalizada la toma de muestras, y fuera del área de producción, se procederá a la cumplimentación y firma por ambas partes (laboratorio y empresa) de dos hojas de toma de muestras, quedando una hoja en poder de la empresa y la otra se llevará al laboratorio. 3.5 Transporte de muestras al laboratorio El transporte de las muestras al laboratorio, se realizará siempre en el interior de la nevera portátil, para que se mantengan refrigeradas, y se llevará lo más rápido posible de vuelta al laboratorio.

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RECEPCIÓN DE MUESTRAS EN EL LABORATORIO 1 OBJETIVO El objetivo que se persigue con este protocolo, es que cualquier trabajador del laboratorio, conozca los pasos que tiene que seguir en el momento que se reciba una muestra en el laboratorio. 2 MATERIAL NECESARIO -

Libro de registros Rotulador Bolígrafo Frigorífico Congelador Ordenador con programa de procesado de textos

3 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: Paso 1.- Codificación de las muestras Cuando se reciben las muestras en laboratorio, se procede al registro y codificación de las mismas. Para ello, se toma el Libro de registros, y en la primera fila que esté en blanco, se inscribe una de las muestras recepcionada, destinando una fila completa a cada muestra. Para cada muestra se rellenan todas las casillas que aparecen en la fila: -

Fecha de entrada

-

Código de la muestra: el cual está comprendido por 7 números, de los cuales los 2 últimos estan separados por una barra del resto, y corresponden a las dos últimas cifras del año. De los cinco numeros que preceden a la barra, los 3 primeros son correlativos al número de referencia de la muestra anterior, de modo que si los tres primeros números del código anterior son 123, en esta muestra serán 124. Los 2 números siguientes corresponderán al mes del año en que nos encontremos. Así si la muestra se recepciona en febrero de 2001, el código completo de la muestra será 12402/01.

-

En el caso de la recepción de muestras de superficie, se intercalará una “S” entre el tercer y cuarto número.

-

Procedencia. Dirección. Ciudad. Teléfono

-

Tipo de muestra

-

Observaciones: esta casilla se destinará a poner el tipo de análisis que se le va a hacer a la muestra, fisico-químico, microbiológico, algún parámetro en concreto.

-

Las casillas número de informe y fecha de salida se rellenarán cuando se termine el análisis de la muestra y se elabore el informe. El Nº informe: será el mismo que el código de la muestra, pero intercalando una “I” entre el tercer y cuarto numero.

En la hoja de toma de muestras se anotará el código de la/s muestra/s que este/n detallada/s en ella, y se guardará en la carpeta destinada a tal efecto. En la bolsa o envase de plástico, si es una muestra de alimento, o en la tapa de placa de contacto si es una muestra de superficie, con el rotulador, se pondrá el nº de referencia asignado a la muestra/s.

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Paso 2.- Conservación de las muestras hasta el análisis Una vez codificada la muestra se conservará en el frigorífico si se trata de una muestra refrigerada, o en el congelador si se trata de una muestra congelada, hasta el momento del análisis, siendo éste tiempo de conservación lo más corto posible. En el caso de muestras refrigeradas el tiempo de conservación será siempre inferior a 24 horas. En el caso de las muestras de superficie, ver paso nº 4. Paso 3.- Elaboración de las fichas de análisis: Mediante el ordenador se elaborará la Ficha de análisis de cada muestra, con los siguientes datos: nº referencia de la muestra, fecha de entrada, tipo de muestra, fecha de salida, parámetro investigado, valor obtenido, valor de referencia según la legislación vigente correspondiente al alimento analizado, nombre de la reglamentación seguida y casilla para la firma del técnico de laboratorio que realiza el análisis y del director técnico. Ejemplo: FICHA MUESTRA FECHA ENTRADA: FECHA SALIDA:

PARAMETRO

Nº REFERENCIA: TIPO:

VALOR OBTENIDO

VALOR REFENCIA

Legislación correspondiente vigente Técnico Laboratorio

Dirección Técnica

Paso 4.- Procesado de las muestras de superficie: Las placas de contacto correspondientes a las muestras de superficies, tras su registro y codificación, se introducen en la estufa de 37 ºC, incubando dichas placas durante 24 horas. Si lo que se recepcionan son torundas éstas se pasan por medios de cultivo y éstos se introducen en estufa igual que los descritos anteriormente Transcurrido el tiempo de incubación: -

En las placas con el medio de cultivo Agar nutritivo PCA (Plata Count Agar): se cuentan las colonias marcándolas con un rotulador para evitar que sean contadas de nuevo. El número total de colonias contadas da como resultado el recuento total de microorganismos mesófilos por cm2 de la muestra analizada.

-

En las placas con el medio de cultivo Agar biliado rojo violeta glucosa VRBG (Violet Red Bile Glucose): se cuentan las colonias de color rojo violeta rodeadas de un halo de precipitación, también violeta, marcándolas con un rotulador para evitar que sean contadas de nuevo. El número total de colonias características contadas da como resultado el recuento total de enterobacterias por cm 2 de la muestra analizada. 6

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PREPARACION DE MUESTRAS 1 OBJETIVO Con esta técnica se persigue una correcta homogeneización y representatividad de la muestra. Es decir que la fracción de alimento destinada al análisis microbiológico, sea representativa de la totalidad de la misma y su posterior procesado permita su buena homogeneización. 2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO -

Material estéril (cuchillo, espátula, pinzas) Probeta estéril Bolsas stomacher Stomacher Diluyentes: Agua de triptona, Solución de Ringer ¼, Agua de peptona tamponada (según determinaciones posteriores) Pipetas estériles de 1ml con divisiones de 0.1 ml.

3 FUNDAMENTO DEL METODO La característica principal del diluyente, es que no produce modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la flora de los alimentos que van a ser analizados, es decir que la mantiene sin suprimirla ni favorecer su desarrollo. 4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA Paso 1.- Toma de muestra La muestra analítica debe estar constituida, aproximadamente por 200 g de la misma. Para la puesta en marcha de las distintas determinaciones se tomarán de 25 a 100 g de muestra, dependiendo de la naturaleza de la misma. Lo que sobre, servirá de reserva por si es necesaria una repetición. El tamaño de la muestra será todo lo voluminosa que permita una buena trituración y homogeneización. Si el alimento está integrado por distintos componentes, se tomarán fracciones representativas de cada uno de ellos en superficie y profundidad. La toma de muestra se hará bajo condiciones estrictamente estériles, para lo que se utilizará material previamente esterilizado en autoclave y cámara de flujo laminar. Esta operación se realizará siempre en las proximidades de la llama del mechero bunsen. Paso 2.- Pesada de la muestra -

Tarar el recipiente estéril donde vaya a pesarse la muestra y posteriormente triturarse. Introducir, asepticamente, una porción adecuada y homogenea de la muestra en dicho recipiente. Pesar de nuevo para determinar el peso neto del alimento. Con una probeta graduada estéril, se añadirá la cantidad de diluyente correspondiente al peso neto de la muestra multiplicado por 9. De esta manera obtenemos una Dilución Madre de 1:10, a partir de la cual iremos preparando el resto de las diluciones.

Nota: si se sospecha una contaminación alta del alimento a analizar, deberemos hacer diluciones como mínimo de 10-5

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Paso 3.- Trituración de la muestra Durante el triturado es importante evitar la destrucción de los microorganismos por rotura de su membrana o por un calentamiento excesivo. Con esta etapa, se persigue obtener una mezcla homogénea para lograr la distribución adecuada de los microorganismos y sus toxinas. El procedimiento utilizado es el triturador de paletas o Stomacher, el cual actúa golpeando ritmicamente la mezcla de alimento y diluyente que ha sido introducida previamente en una bolsa de plástico estéril. Los choques producidos por las paletas dislacerán el alimento y ponen a las bacterias en suspensión. Paso 4.- Preparación de las diluciones decimales La preparación de las diluciones decimales a partir de una muestra tiene por objeto efectuar diluciones progresivas de dicha muestra, para poder realizar recuentos microbianos posteriores. A un tubo que contenga 9 ml de diluyente se transfiere con pipeta estéril 1ml de la suspensión madre, obteniendo la dilución 1/ 100. Se toma otra pipeta y de esta última dilución se transfiere otro ml a un tubo con otros 9 ml de diluyente, obteniendo la dilución 1/1000. Es importante mezclar bien la dilución una vez preparada. Esta técnica se repetirá tantas veces como nº de diluciones se quieran preparar. De esta forma se obtiene la serie de diluciones decimales que servirá para iniciar las determinaciones en las que sea necesario obtener recuentos. Los tubos de la serie, se mantendrán en frigorífico hasta el comienzo del análisis, el cual, aún en condiciones de refrigeración, no deberá demorarse más de dos horas a partir del momento en el que se haya preparado la serie de diluciones.

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RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS (31+/-1ºC) 1 OBJETIVOS Se persigue la estimación de la calidad sanitaria de los productos analizados indicando, además de las condiciones higiénicas de la materia prima, la forma de manipulación que sufrieron durante su manipulación. En general, el recuento de la flora aerobio mesófila es una prueba para conocer las condiciones de salubridad de algunos alimentos. 2 MATERIAL MEDIOS DE CULTIVO -

Pipetas estériles de 1 ml, con divisiones de 0.1 ml. Placas petri estériles de 90 mm de diámetro. Estufa de incubación, 30º +/ - 1º C Agar nutritivo de recuento (Métodos Estándar Agar, APHA)

3 FUNDAMENTO DEL METODO La composición del medio basada en la peptona de caseina como aportación nutritiva, el extracto de levadura como sustrato vitamínico y la glucosa como fuente energética, favorece el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos, sin precisar de otros aditivos. 4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: METODO DE RECUENTO EN PLACA Se utiliza para determinar el número de microorganismos por gramo o mililitro del alimento en estudio, partiendo de la serie de diluciones decimales, mediante el empleo de técnicas en placas de agar. TECNICA: Paso 1.- A partir de la serie de diluciones decimales y por duplicado, depositar con pipeta estéril, 1 ml de cada dilución en otras tantas placas de Petri estériles de 90 mm de diámetro. Paso 2.- Añadir a cada placa unos 15 ml de agar de APHA previamente licuado y atemperado a 47 º C. El tiempo transcurrido entre depositar las distintas diluciones en la placa y el posterior vertido del medio de cultivo sobre las mismas, no debe de exceder de 10 minutos. Así mismo, el tiempo total transcurrido entre la elaboración de las diluciones decimales y el vertido del medio sobre la última placa, no deberá ser superior a 20 minutos. Paso 3.- Mezclar perfectamente medio e inóculo, lo cual se consigue moviendo la placa sobre la superficie de la mesa en círculos y en forma de cruz, evitando que el medio llegue a impregnar la tapa de la placa. Dejar solidificar el agar en las placas sobre una superficie horizontal. Una vez solidificado el agar, las placas se invierten y se introducen en la estufa de cultivo a una Tª de 31º +/ - 1º C, durante 72 h. Paso 4.- Transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias en aquellas placas que muestren entre 30 y 300 colonias aisladas. Las colonias contadas serán marcadas con rotulador, para evitar ser contadas de nuevo. El número total de colonias contadas, multiplicado por el factor de dilución de la placa elegida, da como resultado el recuento total de microorganismos por gramo o ml de la muestra analizada. 9

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INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE TOTALES EN MEDIO SÓLIDO CON REVIVIFICACIÓN 1 OBJETIVOS Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son gérmenes de forma bacilar, gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, móviles o inmóviles, que fermentan la glucosa, reducen nitratos a nitritos, son citocromo-oxidasa negativos y crecen en medios que contienen sales biliares. Las Enterobacteriaceae son indicadoras de contaminación fecal, y su uso como índice ha adquirido gran aceptación en Europa. Se utilizan preferentemente, para señalar la calidad sanitaria de alimentos procesados. Su presencia a niveles altos en estos productos indica elaboración poco higiénica, contaminación posterior a su fabricación o ambas cosas. 2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO -

Pipetas estériles de 1 ml con divisiones de 0.1 ml. Placas de Petri estériles de 90 mm de diámetro. Estufa de incubación a 37º +/ - 1º C Asas de siembra Caldo triptona-soja (Trytone Soy Broth: TSB) Caldo EE de Mossel simple Agar biliado rojo violeta glucosa (Violet Red Bile Glucose: VRBG) Reactivo prueba citocromo-oxidasa: CO Medio Kligler Agar nutritivo (Plate Count Agar: PCA)

3.- FUNDAMENTO DEL METODO: Caldo triptona-soja (TSB): Es un medio líquido de uso general para el cultivo de todo tipo de microorganismos, incluidos los muy exigentes. Se utiliza para lograr la revivificación de las Enterobacteriaceae, así se incrementa su vitalidad y adquiere las condiciones fisiológicas adecuadas para su perfecto desarrollo. Caldo EE de Mossel simple: Este medio tiene por objeto permitir el crecimiento de todas las Enterobacteriaceae e inhibir el de otros microorganismos. Por la presencia de la Bilis de buey y del verde brillante se inhibe la flora indeseable. A su vez la glucosa permite el crecimiento de todas las Enterobacteriaceae, tanto lactosa + como lactosa -. La mezcla de fosfatos tampona el medio y evita que por el efecto del descenso del pH se pudieran frenar los crecimientos. Agar biliado rojo violeta glucosa: Las sales biliares y el cristal violeta que forman parte del medio inhiben el crecimiento de la flora competitiva. Todas las Enterobacteriaceae fermentan la glucosa con producción de ácido, lo que se pone de manifiesto por un viraje al rojo y la precipitación de las sales biliares alrededor de las colonias. Hay que tener en cuenta que esta misma reacción la dan en este medio las Aeromonas. Las colonias de color rojo violeta rodeadas de un halo de precipitación, también violeta, se consideran Enterobacteriaceae Prueba de citocromo-oxidasa: prueba para la detección de la enzima citocromo-oxidasa. Las Enterobacteriaceae son citocromo oxidasa negativas. Hierro de Kligler, Agar: a través de este medio se diferencian los bacilos entéricos gram (-) tanto por la capacidad de fermentar la lactosa y/o glucosa como por la de producir hidrógeno sulfuro. La acidificación del medio a causa del proceso fermentativo se pone de manifiesto con un cambio de color del rojo de fenol que pasa de rojizo a amarillo.

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Los microorganismos que sólo fermentan glucosa como Salmonella y Shigella, que se encuentra en una concentración 10 veces inferior a la lactosa, aunque aparece el color amarillo, sólo lo hace en la columna vertical del medio (base del tubo), mientras que en la superficie inclinada se restablece el color rojo por oxidación del ácido. Cuando el color amarillo obtenido en la acidificación del medio, es producido por la fermentación de la lactosa, es persistente de manera que la superficie inclinada se mantiene amarilla. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar Hierro III Sulfuro, presentan el característico precipitado negro. La producción de gas se observa por la aparición de burbujas de aire e incluso por rotura del propio gel. 4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA Paso 1.- Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo En esta etapa se logra la revivificación de las Enterobacteriaceae, se incrementa su vitalidad y se adquieren las condiciones fisiológicas adecuadas para su perfecto desarrollo. Se pesan asépticamente, 10 gr de muestra y se añaden 90 ml de medio TSB, homogeneizar en Stomacher y dejar a temperatura ambiente durante 2 horas, agitando de vez en cuando. Paso 2.- Enriquecimiento en medio líquido selectivo En esta etapa se estimula y favorece el crecimiento de las Enterobacteriaceae y se restringe la proliferación de la flora competitiva. A partir del cultivo de preenriquecimiento (dilución 1:10) se hacen diluciones al 1:100 y 1: 1000, utilizando como diluyente caldo TSB. Se preparan 3 series de 3 tubos, conteniendo cada uno de ellos 10 ml de caldo de enriquecimiento EE de Mossel simple. A partir de las diluciones decimales, tomar 1ml de cada una de ellas, y añadirlo a los tubos con 10 ml de medio EE de Mossel simple. De esta manera tendremos una serie de 9 tubos dispuestos de tres en tres en una gradilla, de manera que a los tres primeros le añadimos 1 ml de la dilución 1/10, a los tres segundos 1 ml de la 1/100 y a los tres últimos 1ml de la 1/1000. Agitar para mezclar e incubar todas las series a 37 ºC durante 24 horas. Paso 3.- Identificación de colonias típicas en medio sólido A partir del medio líquido selectivo, agitándolo bien para mezclar bien el contenido de los tubos que presenten crecimiento bacteriano, sembrar con asa sin recargarla demasiado, sobre superficie bien seca del medio VRBG contenido en placas de Petri. Incubar en estufa a 37º C todas las placas sembradas, durante 24 h. Las colonias de color rojo violeta rodeadas de un halo de precipitación, también violeta, se consideran Enterobacteriaceae. Paso 4.- Pruebas confirmativas Se seleccionan, como mínimo, 2-3 colonias de cada placa VRBG donde aparezca un crecimiento colonial característico. Las colonias seleccionadas se siembran, individualmente en agar PCA. Incubar a 37º C durante 24 h. Partiendo de este medio de cultivo se realizan las siguientes pruebas confirmativas:

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Prueba de la citocromo-oxidasa: Para la detección de esta enzima, se coloca un trozo de papel Whatman de unos 5 cm2 en una placa de Petri vacía. En el centro del papel se depositan 3 gotas del reactivo. Con una pipeta Pasteur con la punta cerrada, se toma una porción del cultivo obtenido sobre agar nutritivo y se extiende sobre el papel impregnado de reactivo, en una zona de 4-5 mm. En la reacción positiva aparece un color violeta oscuro en la extensión del cultivo. Las Enterobacteriaceae son citocromo-oxidasa negativas. Siembra de colonias en medio Kligler: Tomar una colonia bien diferenciada de cada placa y sembrarla en picadura sobre el medio, de manera que también se siembre el pico de flauta. Todas las Enterobacteriaceae fermentan la glucosa, por lo tanto el crecimiento en medio Kligler será: Superficie inclinada: roja / amarilla Base: amarilla Gas: +/H2 S: - / + Lectura de resultados: Se calcula el número de Enterobacteriaceae totales por gramo o mililitro de alimento consultando la Tabla del NMP de tres series de tres tubos, en los tubos que muestren crecimiento en caldo EE de Mossel simple, los gérmenes sean Citocromo-oxidasa negativos y el crecimiento sobre agar Kligler corresponda al de las Enterobacteriaceae.

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INVESTIGACION Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI 1 OBJETIVOS La determinación de E. coli en los alimentos, tiene como finalidad servir de índice de contaminación fecal de los mismos. E. coli es Debido a contrario, alimentos

huesped constante del intestino del hombre y de los animales de sangre caliente. su especificidad, es considerado un buen índice de contaminación fecal. Por el vive poco tiempo en un ambiente extraentérico, por lo que su presencia en los es indicativa de una contaminación reciente.

Se destruye a temperatura de pasteurización y también durante su almacenamiento en frío, sobre todo a temperatura de congelación. Su escasa resistencia hace que no sea un buen indicador de flora patógena, ya que en algunos casos como la Salmonella, es mucho menos resistente a las condiciones ambientales y a la acción del frío. Pertenecen a la familia de las enterobacteriaceae y dentro de ellas al grupo de los coliformes ya que son capaces de fermentar la lactosa en presencia de sales biliares con formación de gas y ácido a Tª de 30º C y hasta más de 44º C. Otra característica bioquímica de E. coli, es su capacidad para producir Indol en Agua de triptona incubada a 44.5ºC durante 48h. 2.- MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO -

Pipetas estériles de 1 ml con divisiones de 0.1 ml. Placas de Petri estériles de 90 mm de diámetro. Estufa de incubación de 44.5º +/ - 1º C Asas de siembra Tubos de ensayo Campanas Durham Agua de Triptona Caldo Lactosado biliado verde brillante (BGBL) Caldo EC Agar de Levine (Eosina Azul de Metileno, Agar) Bateria API Reactivo de Kovacs Medio Kliger

3.- FUNDAMENTO DEL METODO: Caldo Lactosado Biliado Verde Brillante: el objetivo de este medio es el de poder inhibir el crecimiento de los microorganismos distintos de los coliformes, al tiempo que éstos puedan crecer sin restricción. Con la presencia de la Bilis de Buey y del Verde Brillante, se consigue la inhibición de casi la totalidad de los microorganismos gram-positivos y de los gram-negativos distintos de los del grupo de los coliformes. Es importante conocer que la concentración de Verde Brillante es crítica para evitar el crecimiento de microorganismos anaerobios capaces de fermentar la lactosa a 44º C, lo cual podría falsear los resultados. Caldo EC: la presencia de sales biliares determina la inhibición de las esporas y los estreptococos fecales. La mezcla de fosfatos regula el pH del medio. La Triptosa es el elemento nutritivo y el sodio cloruro aporta la salinidad necesaria para el buen crecimiento de los gérmenes. La Lactosa favorece el crecimiento de los coliformes, y su consumo se manifiesta con la aparición de gas en las campanas durham.

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Agar de Levine: la Eosina y el Azul de metileno, son productos que inhiben parcialmente el crecimiento de microorganismos gram positivos, entre ellos los Estreptococos fecales. Además la combinación de ambos componentes, permite la diferenciación entre los microorganismos lactosa – positivos de los lactosa – negativos. Los coliformes dan colonias violeta oscuro, con centro más oscuro. E. coli, presenta unas colonias muy características ya que van del púrpura al verde, con brillo metálico. Hierro de Kliger, Agar: a través de este medio se diferencian los bacilos entéricos gram (-) tanto por la capacidad de fermentar la lactosa y/o glucosa como por la de producir hidrógeno sulfuro. La acidificación del medio a causa del proceso fermentativo se pone de manifiesto con un cambio de color del rojo de fenol que pasa de rojizo a amarillo. Los microorganismos que sólo fermentan glucosa como Salmonella y Shigella, que se encuentra en una concentración 10 veces inferior a la lactosa, aunque aparece el color amarillo, sólo lo hace en la columna vertical del medio (base del tubo), mientras que en la superficie inclinada se restablece el color rojo por oxidación del ácido. Cuando el color amarillo obtenido en la acidificación del medio, es producido por la fermentación de la lactosa, es persistente de manera que la superficie inclinada se mantiene amarilla. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar Hierro III Sulfuro, presentan el característico precipitado negro. La producción de gas se observa por la aparición de burbujas de aire e incluso por rotura del propio gel. 4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) Paso 1.- Siembra en medio BGBL A partir de las diluciones decimales, tomar 1ml de cada una de ellas, y añadirlo en tubos con 10 ml de medio BGBL. De esta manera tendremos una serie de 9 tubos dispuestos de tres en tres en una gradilla, de manera que a los tres primeros le añadimos 1 ml de la dilución 1/10, a los tres segundos 1 ml de la 1/100 y a los tres últimos 1ml de la 1/1000. Comprobar que cada uno de los tubos contiene una campana durham. Incubar a 31º C durante 48 h. Al cabo del tiempo de incubación, comprobar la presencia de tubos positivos: turbidez del medio con leve virage a amarillo y producción de gas en la campana. Comprobar el NMP en las tablas y anotarlo. Paso 2.- Siembra en Caldo EC De cada tubo positivo en BGBL, tomar 1ml y añadirlo en un tubo con 10 ml de Caldo EC y campana. Incubar a 45º C durante 24-48 h. Los tubos positivos presentan turbidez y gas en la campana. Hacer recuento de los mismos, comprobar el NMP y anotarlo. Paso 3.- Siembra en Agar de Levine Sembrar de cada tubo positivo en Caldo EC, dos placas con Agar de Levine. La siembra se hará con asa de platino procurando evitar el acúmulo de colonias que no nos permita observar el característico color verde metálico de las mismas.

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Paso 4.- Confirmación de las colonias Prueba del Indol: de cada 1-2 colonias se siembran tubos con agua de triptona y se incuban en baño maría durante 24 h a 44.5º C. Transcurrido este tiempo adicionan 0.5 ml de reactivo de Kovacs y se observa la aparición de un anillo rojo bermellón en la superficie del medio (prueba positiva) o amarillento (prueba negativa). Paso 5.- Recuento de colonias Cuando coincide crecimiento positivo (gas) en caldo EC a 44.5º C, producción de indol y crecimiento característico sobre Agar de Levine, se hace la lectura en la tabla de NMP para obtener el nº de E. coli por gramo o ml de muestra. Paso 6.- Otras pruebas confirmativas: Siembra de colonias en medio Kliger: tomar una colonia bien diferenciada de cada placa y sembrarla en picadura sobre el medio, de manera que también se siembre el pico de flauta. E. coli va a presentar las siguientes características: Superficie inclinada: amarilla Base: amarilla Gas: + H2 S: Siembra en bateria API: batería proporcionada comercialmente, en la que se encuentran varias pruebas bioquímicas a modo de pocillos donde se realiza la siembra. Posteriormente los resultados se leen en tablas que nos darán el nombre de la especie analizada.

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INVESTIGACION DE SALMONELLA 1 OBJETIVOS Son las principales productoras de toxiinfecciones alimentarias y su presencia en los alimentos puede ocasionar graves trastornos gastrointestinales en el hombre, que incluso le lleven a la muerte. Los alimentos en los que pueden aparecer con mayor asiduidad son: carnes, sobre todo picadas, productos de charcutería, huevos y ovoproductos, helados, cremas pasteleras, moluscos, frutas. La transmisión de la salmonelosis, se hace a partir de los alimentos de origen animal contaminados, al hombre. También es posible la transmisión directa de hombre a hombre y la de portadores asintomáticos a alimentos y posteriormente a hombre. La infección se produce por la ingestión junto con los alimentos contaminados, de organismos vivos. Esta contaminación llega hasta el alimento a través de manipulaciones higiénicas incorrectas que incluyen el no aseo de manos o utensilios que hayan estado en contacto con heces de animales o humanos. El género Salmonella, pertenece a la familia de las Enterobacteriaceae y está integrado por microorganismos que forman colonias típicas sobre medios selectivos sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas definidas. Tienen la morfología de enterobacterias, casi siempre móviles, gram (-), fermentan la glucosa con formación de gas, pero no fermentan la lactosa. 2.- MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO -

Estufa de incubación a 37º +/ - 1º C Asas de siembra Caldo TSB Caldo Selenito Cistina Agar Hektoen Agar Salmonella-Shigella Bateria API Medio Kliger

3 FUNDAMENTO DEL METODO 3 Caldo selenito Cistina: el Sodio Hidrógeno Selenito inhibe el crecimiento de Coliformes y Enterococos, por el contrario Salmonella, Proteus y Pseudomonas no son inhibidos. La cistina actúa como factor de crecimiento para la Salmonella. El efecto inhibidor del Selenito desaparece a partir de la 18-24 h de incubación y el crecimiento de la flora acompañante puede dificultar el de Salmonella. Agar Hektoen: por la presencia de los dos indicadores se diferencian los microorganismos lactosa (+) de los (-). Las positivas toman un color amarillo anaranjado y las segundas un azul verdoso. La presencia de sacarosa y salicilina evita la formación de patógenos falsamente positivos.Con el Sodio Tiosulfato y el Amonio Hierro III Citrato, se detectan los productores de Hidrógeno Sulfuro por el precipitado negro de Hierro Sulfuro que presentan en el centro de las colonias. La presencia de sales biliares inhibe el crecimiento de una gran parte de flora acompañante. Las colonias de Salmonella presentan un color verde azulado con centro negro o sin él. Agar Salmonella-Shigella: por la presencia de las sales biliares, verde brillante y citrato, se consigue la inhibición de las bacterias gram (+). Por el mismo citrato conjuntamente con el tiosulfato se frena notablemente el desarrollo de Coliformes y Proteus que podrían acabar cubriendo todo el cultivo.

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Las bacterias que no fermentan la lactosa dan colonias incoloras, mientras que las que fermentan hacen virar el rojo neutro por la producción de ácido y quedan claramente diferenciadas. También se diferencian los microorganismos productores de Hidrógeno Sulfuro que dan un precipitado negro de Hierro II Sulfuro, observándose en el centro de la colonia. Las colonias de Salmonella son incoloras y con un punto negro en el centro. 4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA Paso 1.- Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo En esta etapa se logra la revivificación de las Salmonellas lesionadas, se incrementa su vitalidad y se adquieren las condiciones fisiológicas adecuadas para su perfecto desarrollo. Se pesan asepticamente, 25 gr de muestra y se añaden 225 ml de medio TSB o de agua de peptona, homogeneizar en Stomacher e incubar a 37º C durante 16 – 20 h, agitando de vez en cuando. Paso 2.- Enriquecimiento en medio líquido selectivo En esta etapa se estimula y favorece el crecimiento de las Salmonella y se restringe la proliferación de la flora competitiva. Agitar el cultivo de preenriquecimiento y añadir 10 ml del mismo a 100 ml de Caldo Selenito Cistina. Incubar a 37º C durante 18 – 24h. Paso 3.- Aislamiento diferencial sobre medio sólido selectivo En esta etapa se restringe aún más el crecimiento de la flora competitiva y se estimula el de la Salmonella. A partir del medio líquido selectivo, sembrar con asa sin recargarla demasiado, en 2 placas con medio Hektoen y en 2 placas con medio Salmonella-Shigella. Incubar en estufa a 37º C todas las placas sembradas, durante 24 – 48 h. Paso 4.- Pruebas confirmativas Se seleccionan, como mínimo, 2-3 colonias de cada placa donde aparezca un crecimiento colonial característico. Las colonias seleccionadas se siembran, individualmente en agar PCA. Incubar a 37º C durante 24 h. Siembra de colonias en medio Kliger: tomar una colonia bien diferenciada de cada placa y sembrarla en picadura sobre el medio, de manera que también se siembre el pico de flauta. Salmonella va a presentar las siguientes características: Superficie inclinada: roja Base: amarilla Gas: + H2 S: - / + Siembra en bateria API: batería proporcionada comercialmente, en la que se encuentran varias pruebas bioquímicas a modo de pocillos donde se realiza la siembra. Posteriormente los resultados se leen en tablas que nos darán el nombre de la especie analizada.

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INVESTIGACION Y RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1 OBJETIVOS Es una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes. Su presencia o la de sus toxinas en los alimentos es signo evidente de falta de higiene. Estas toxinas, al ser ingeridas por el hombre, pueden ser causa de intoxicación. Son anaerobios facultativos. En general un nº elevado de S. Aureus en un alimento, refleja una higiene defectuosa por mala manipulación. Si además los S.Aureus aislados son cepas enterotoxígenas, suponen un riesgo para la salud. Puede ocurrir que no se detecte S. Aureus en un alimento, pero si exista cantidad detectable de su enterotoxina. En este caso los microorganismos han ido descendiendo en nº e incluso desapareciendo, mientras que la toxina por su mayor resistencia, pemanece en el alimento. 2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO -

Tubos de ensayo Pipetas de 1 ml estériles Estufa de cultivo Asa de siembra Placas de Petri de 90 mm de diámetro Caldo de enriquecimiento Giolitti Cantoni Medio sólido selectivo Baird – Parker Caldo cerebro corazón (BHI) Agar desoxirribonucleasa (Agar Dnasa)

3 FUNDAMENTO DEL METODO Caldo de enriquecimiento Giolitti Cantoni: la presencia de Manita, Sodio Piruvato y Glicina, favorecen el crecimiento del S. Aureus. A su vez por la presencia del Litio Clururo se inhibe el crecimiento de los microorganismos gram (-) y por la del Potasio Telurito y la Glicina, la de los gram (+) a excepción de S. Aureus y alguna especie de Micrococcus. Los dos extractos y la triptona, aportan los elementos nutritivos y el Sodio Cloruro la salinidad adecuada. Medio sólido selectivo Baird-Parker: a este medio hay que añadirle Yema de huevo y Potasio telurito. También se puede añadir Sulfametacina para inhibir el crecimiento de Proteus. Por la presencia del Litio Clururo y el Potasio Telurito, se inhibe el crecimiento de microorganismos no deseados. Por la presencia del Sodio Piruvato y la Glicina, se favorece el crecimiento de los Estafilococos. A su vez el Potasio Telurito combinado con la yema de huevo, permite diferenciar los Estafilococos. El S. Aureus da colonias negras, por la reducción del Potasio Telurito a Teluro, rodeadas de un halo de transparencia debido a la actividad lecitinasa. Existe un paralelismo importante entre los coagulasa (+) y la reacción descrita con el Potasio Telurito y la Yema de huevo; es por lo que estas características se utilizan como indicativo de esta actividad. Caldo cerebro corazón (BHI): la peptona, infusión de cerebro de ternera e infusión de corazón de res, son los nutrientes básicos de este medio. La glucosa se emplea para la fermentación y el fosfato como tampón. Lo emplearemos como paso intermedio en la prueba de la Dnasa. Agar desoxirribonucleasa (Agar DNasa): los microorganismos productores de Dnasa despolimerizan al ácido desoxirribonucleico que contiene el medio, dando lugar a unas zonas de transparencia alrededor de las zonas sembradas, despues de inundar la placa con ac. Clorhídrico 1 N. La acidificación provova la precipitación de ADN quedando el medio turbio, excepto alrededor de las colonias DNasa (+).

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4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA Paso 1.- Siembra sobre medio de enriquecimiento Se parte de la suspensión madre del producto a analizar, sembrando, por duplicado, 1 ml de dicha suspensión que contengan 19 ml de caldo Giolitti Cantoni. Cubrir la superficie con parafina estéril, para evitar el crecimiento de Micrococus. Incubar en estufa a 37º C durante 18 – 24 h. Se consideran positivos los tubos que presenten ennegrecimiento. Paso 2.- Siembra en medio sólido selectivo De los tubos positivos, se resiembra 0.1 ml por diseminación con asa de platino estéril, sobre placas con medio selectivo Baird-Parker. Incubar las placas en estufa a 37 ºC durante 48 h con lectura a las 24h. El aspecto de las colonias de S. Aureus sobre medio Baird Parker es el siguiente: redondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de diámetro, húmedas, brillantes, negras, con un borde blanco fino, rodeadas de una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm. El medio de cultivo es opaco debido a la adición de la Yema de huevo. El S. Aureus elabora una lipasa que, al actuar sobre la lipoproteína de la yema de huevo, produce un aclaramiento alrededor de las colonias y una zona opaca como consecuencia de la formación de un precipitado de las sales de calcio y magnesio, insoluble en ácidos grasos. Esta zona opaca se hace visible a partir de las 24 horas de incubación. Paso 3.- Prueba de confirmación: termonucleasa (DNasa)

investigación

de

la

desoxirribonucleasa

o

A partir de las colonias típicas crecidas sobre medio Baird – Parker, se siembra, es estrías radiales o en una sola estría, sobre la superficie de agar Dnasa. Se incuba a 37ºC durante 1824 h. Sobre el crecimiento se vierte ac. Clorhídrico 1N y se esperan unos minutos a que se produzca una zona transparente alrededor de la zona de crecimiento.

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RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS 1 OBJETIVOS Estudio de la presencia de mohos y levaduras que están presentes en una muestra de alimento. De la amplia dispersión de los hongos en todos los estratos bióticos e inertes se desprende su fácil y frecuente aparición como contaminantes en productos alimentarios, ya que éstos, constituidos por sustancias inorgánicas y orgánicas más o menos complejas, constituyen excelentes medios para la sustentación y reproducción de un gran número de especies fúngicas. El significado de la contaminación fúngica de los alimentos, especialmente por mohos, viene no solo del potencial de los hongos para deteriorarlos, sino también del potencial de muchos de ellos para producir una gran variedad de micotoxinas a las que el hombre tiene susceptibilidad, así como su capacidad para provocar infecciones e incluso, reacciones alérgicas en personas hipersensibles a antígenos fúngicos. Existe un riesgo potencial en la contaminación fúngica de los alimentos y, por ello, para conocer la calidad microbiológica de diversos productos, se procede a la evaluación de su tasa de contaminación por mohos y levaduras. En cuanto a su significado para la salud del consumidor, la acción de las levaduras es meramente infectiva, mientras que el mayor problema originado por los mohos se refiere a su gran capacidad de elaboración de micotoxinas. No obstante, ciertos mohos pueden ser tanto agentes de micosis como responsables de intoxicaciones. 2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO -

Material estéril Etanol 96% v/v Bolsas stomacher Stomacher Pipetas estériles de 1ml con divisiones de 0.1 ml. Diluyentes: Agua de triptona, Solución de Ringer ¼, Agua de peptona tamponada (según determinaciones posteriores) Agar Saboreaud

3 FUNDAMENTO DEL METODO Agar Sabouraud: la peptona es la fuente nitrogenada para el crecimiento de hongos y levaduras, el carbonato es la fuente energética. El crecimiento selectivo de los medios que no contienen antibiótico, depende exclusivamente del pH ácido de estos medios. 4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: METODO DE RECUENTO EN PLACA Se utiliza para determinar el número de microorganismos por gramo o mililitro del alimento en estudio, partiendo de la serie de diluciones decimales, mediante el empleo de técnicas en placas de agar Sabouraud. TECNICA: Paso 1.- A partir de la serie de diluciones decimales y por duplicado, depositar con pipeta estéril, 1 ml de cada dilución en otras tantas placas de Petri estériles de 90 mm de diámetro. Paso 2.- Añadir a cada placa unos 15 ml de agar Sabouraud previamente licuado y atemperado a 47 º C.

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CETECAL Auxiliar de Laboratorio de Industrias Alimentarias El tiempo transcurrido entre depositar las distintas diluciones en la placa y el posterior vertido del medio de cultivo sobre las mismas, no debe de exceder de 10 minutos. Así mismo, el tiempo total transcurrido entre la elaboración de las diluciones decimales y el vertido del medio sobre la última placa, no deberá ser superior a 20 minutos. Paso 3.- Mezclar perfectamente medio e inóculo, lo cual se consigue moviendo la placa sobre la superficie de la mesa en círculos y en forma de cruz, evitando que el medio llegue a impregnar la tapa de la placa. Dejar solidificar el agar en las placas sobre una superficie horizontal. Una vez solidificado el agar, las placas se invierten y se introducen en la estufa de cultivo a una tª de 25ºC +/ - 1º C, durante 5 días, realizando un primer contage de colonias al tercero (se hace para observar el crecimiento de micelios aéreos invasores) Paso 4.- Transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias en aquellas placas que muestren entre 0 y 50 colonias aisladas. Las colonias contadas serán marcadas con rotulador, para evitar ser contadas de nuevo. El número total de colonias contadas, multipilcado por el factor de dilución de la placa elegida, da como resultado el recuento total de mohos y/o levaduras por gramo o ml de la muestra analizada.

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