1. Recuperacion de Productos

RECUPERACION DE PRODUCTOS (downstream processing) (CONCENTRACION Y PURIFICACION) Dr. Blgo. Carlos Villanueva Aguilar Microbiología Industrial y Biotecnología Microbiana

I. INTRODUCCION: La comercialización de nuevos productos obtenidos a través del empleo de la “biotecnología”, requiere de un coordinado acople de operaciones unitarias a fin de desarrollar un proceso eficiente El objetivo general de este proceso es convertir

materia prima relativamente de bajo costo en

productos de mayor valor comercial. En este sentido la biotecnología se puede definir como “la colección de procesos industriales que involucran el uso de sistemas biológicos”. Un esquema general de un proceso biotecnológico se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Esquema general de un proceso biotecnológico

El punto central de este proceso es el biorreactor . En esta unidad de operación se utilizan catalizadores biológicos (microorganismos, células vegetales ó animales, enzimas, virus, etc.) para la producción de sustancias, alimentos, agentes terapéuticos, etc. de interés. No obstante, el biorreactor no existe aislado, sino que la eficiencia y éxito de la operación depende de un adecuado “upstream processing” (procesado previo) que incluye desde el diseño del medio de cultivo hasta la esterilización del mismo. Por otro lado, la recuperación del producto final requiere una serie de operaciones referidas colectivamente como “downstream processing” (SP). Estas operaciones comprenden todos los tratamientos que requiere el cultivo, una vez finalizado, para la obtención del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas

RECUPERACIÓN: (downstream processing): (CONCENTRACION Y PURIFICACION)

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La recuperación del producto, es un término colectivo, útil para todas las etapas que se requieren a fin de recuperar o separar los productos útiles de cualquier tipo de proceso industrial. • Se debe distinguir los conceptos de concentración y purificación. • Una etapa de recuperación cambia la concentración y/o la pureza de un metabolito. • En el proceso ideal de recuperación se optimizan ambos parámetros.

TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA RECUPERACIÓN DE PRODUCTOS •

En tiempos INICIALES de la Microbiología Industrial las técnicas utilizadas (extracción, destilación, diálisis, cristalización, precipitación, desecación) se tomaron directamente de la Ingeniería Química con un intento aproximado para adaptarlas a los materiales biológicos.

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Para materiales biológicos, había que perfeccionar procesos específicos de purificación ya que los bioproductos son frecuentemente compuestos muy lábiles. Sus estructuras activas pueden sobrevivir solamente bajo condiciones definidas y limitadas de pH, temperatura, fuerza iónica, etc.

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No existe una operación única, ideal o universal, ni secuencias de operaciones que puedan ser recomendadas; las operaciones individuales unitarias deben ser combinadas de la forma más adecuada para cada problema particular.

Figura 3. Metodologías utilizadas en los procesos de SP

ETAPAS DE RECUPERACION A. Separación de las partículas (SEPARACIÓN DE SÓLIDOS DEL LÍQUIDO) •

En muchos casos, es la etapa inicial al final de una fermentación. Es la primera etapa en la recuperación del producto. Se separa la biomasa celular y los ingredientes insolubles del sobrenadante del cultivo

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El producto final deseado puede ser el propio microorganismo, sin embargo, en la mayor parte de los procesos a gran escala el producto deseado es un metabolito que está presente extra o intracelularmente.

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Metabolitos extracelulares: aminoácidos, ácido cítrico, alcohol, algunos enzimas (amilasas y proteasas) y la mayor parte de antibióticos (penicilina, estreptomicina).  Metabolitos intracelulares: ácidos nucleicos, vitaminas, enzimas y ciertos antibióticos (griseofulvina). Si el metabolito a aislar es intracelular, debe ser liberado de las células antes de proceder a las siguientes etapas. Una vez el metabolito ha sido separado de las células, la selección de etapas adicionales de purificación dependerá del producto deseado.

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Metabolitos en las células y en el filtrado del cultivo: encuentran (Ej. vitamina B12).

En pocos casos se

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Existen varios métodos: floculación, flotación, filtración y centrifugación.

1.

Floculación y flotación

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En la floculación se producen grandes agregados que sedimentan mucho más rápidamente ya que la velocidad de sedimentación de una partícula aumenta con su diámetro (ley de Stokes).

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Aplicación: para células aisladas en el rango de tamaño de 1 a 10 µm que sedimentan solo muy lentamente y son difíciles de precipitar incluso con la centrífuga.

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En la mayor parte de los casos se añade un agente floculante, sal inorgánica, polielectrolitos orgánicos o hidrocoloides minerales.

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La floculación depende tanto del agente floculante empleado como de otros factores como la naturaleza de las células, de los constituyentes iónicos así como su concentración.

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La floculación puede ocurrir reversiblemente si las cargas sobre la superficie de la célula pueden neutralizarse por iones de carga opuesta, e irreversiblemente si se forman, entre las células, puentes de moléculas poliméricas cargadas.

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Se utilizar la flotación si no se forma un flóculo suficientemente denso, y es el proceso reverso a la floculación.

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La flotación se consigue introduciendo gas en el líquido. Las pequeñas burbujas de gas adsorben y atrapan a las células y suben a la capa de espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del biorreactor.

2.

Filtración

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Algún tipo de proceso de filtración es lo mas frecuente se lleve a cabo en la primera etapa en el proceso de recuperación.

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Los dos principales tipos de filtros son los filtros en profundidad y filtros en superficie; en ambos casos la fuerza motriz es la presión, sea creada por sobrepresión o por vacío.

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Un filtro en profundidad se construye a partir de una matriz filamentosa, como lana de vidrio o papel de filtro, llevándose a cabo el proceso de filtración debido a que las partículas que han de ser removidas quedan atrapadas dentro de la matriz. Las partículas que van a ser filtradas son frecuentemente más pequeñas que los poros del filtro, pero a pesar de ello son separadas a medida que pasan a través de los intersticios retorcidos del filtro.

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Los filtros en superficie son membranas en las que el tamaño de los poros es más pequeño que las partículas que van a ser filtradas.

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Las partículas son, por consiguiente, separadas sobre las superficies de los filtros.

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Los hongos filamentosos se filtran frecuentemente a través de filtros profundos. Por su parte, los cultivos bacterianos deben ser filtrados en superficie. En cualquier caso, la velocidad de filtración, es decir el volumen de filtrado que puede ser recogido en un tiempo determinado, está influenciada por numerosos factores, como el tamaño de los microorganismos, su morfología, la viscosidad del fluido, temperatura, etc.  Uno de los inconvenientes de la filtración en superficie es la colmatación. Debido a que este proceso de filtración depende estrictamente del tamaño de los poros y del tamaño de las partículas, a medida que el material celular se amontona sobre el filtro se forma una capa que reduce la velocidad de filtración.

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Una mejora considerable en el flujo que pasa por el filtro se consigue por filtración en contracorriente, en la cual los sólidos que no pasen a través del filtro son mantenidos en suspensión mediante un flujo turbulento a través de la membrana o ajustando palas móviles o mediante un impulsor en el interior del filtro. El filtrado pasa a través de la membrana y la biomasa

se separa del filtro y se transfiere con el material que se retiene. Con el método de contracorriente puede obtenerse un aumento de la velocidad de filtración de 100 veces en comparación con la filtración estática.  Dependiendo del tamaño de las partículas que sean filtradas se reconocen tres tipos principales de procesos de filtración: Osmosis reversa, para partículas de 0,0001 a 0,001 µm Ultrafiltración, para partículas de 0,001 a 0,1 µm Microfiltración, para partículas de 0,1 a 10 µm

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Las posibilidades de los procesos de ultrafiltración y ósmosis reversa se dan generalmente en términos del peso molecular del tamaño de corte. La ósmosis reversa implica generalmente a sustancias de pesos moleculares menores de 1.000 daltons y la ultrafiltración a sustancias de pesos moleculares mayores de 1.000 daltons. El proceso de microfiltración concierne principalmente a la separación de células o de fracciones celulares. Se utilizan membranas fabricadas con ésteres de celulosa, polivinilfluoruros, policarbonatos, polisulfonas y celulosa.

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En los procesos clásicos de purificación utilizados en la industria de antibióticos (micelios de hongos y actinomicetos), la biomasa se separa del filtrado del cultivo sobre un filtro de tambor rotatorio a vacío que consiste en un tambor rotatorio en cuya parte exterior se enrolla un paño y el vacío se produce desde el interior del tambor. Para aumentar la eficiencia del proceso de filtración, se utiliza una ayuda filtrante como tierra de diatomeas. Para mantener la eficiencia de filtración, se utiliza una cuchilla automática para raspar continuamente del filtro la biomasa junto con una fina capa del material de ayuda de filtración. Organizando el tambor en segmentos, la ayuda filtrante puede ser lavada a medida que gira el tambor. Los filtros de tambor a vacío son especialmente buenos para suspensiones que contengan una alta concentración de sólidos (20-60% de volumen de micelio).

3. Centrifugación • Las bacterias son normalmente demasiado pequeñas para ser separadas con filtros sencillos. Su separación por centrifugación también es difícil debido a las pequeñas diferencias en densidad entre las partículas y la suspensión.

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La centrifugación no sólo se utiliza para separar partículas sólidas de la fase líquida sino también para la separación de fluido/fluido.

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Si bien la separación fluido/partícula es de la mayor importancia, la separación fluido/fluido también es importante como es el caso en la producción de penicilina para la separación del solvente que extrae el antibiótico de la fase acuosa mediante una contracorriente continua en dos etapas con acetato de amilo o de butilo a 0-3°C y pH: 2,5-3,0.

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La separación eficiente de las células por centrifugación se ve favorecida por un tamaño grande de las partículas, una gran diferencia entre la densidad de las partículas y el líquido, una baja viscosidad del líquido, un radio elevado del rotor de la centrífuga y una alta velocidad angular. Tanto el tamaño de las partículas, su densidad así como la viscosidad del líquido normalmente no se pueden controlar. Además, el radio del rotor de la centrífuga no puede incrementarse indefinidamente ya que el estrés mecánico incrementa con el cuadrado del radio por lo que los límites de seguridad se alcanzan fácilmente. Por todo esto y cuando se trabaja con grandes volúmenes se debe recurrir a centrífugas de flujo continuo. En este tipo de centrífugas la separación de partículas es más eficiente cuanto más lento sea el flujo de la suspensión a clarificar ya que se incrementa el tiempo que cada partícula está expuesta a la fuerza centrífuga. • Algunos tipos de rotores: cámara tubular, recipiente de cámara múltiple y centrífuga de rotor de discos. Todos los diseños tienen desventajas individuales a las que deben ser añadidas las generales del coste (incluyendo el mantenimiento), consumo de energía y (exceptuando las que incorporan refrigeración) elevación de la temperatura.

B.

Desintegración de los microorganismos (RUPTURA CELULAR)

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Etapa en que los microorganismos son fragmentados por procedimientos químicos, físicos o biológicos, en los casos que se requiera para la recuperación del producto.

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La selección del método depende principalmente de la naturaleza de las células. Aunque las membranas celulares no ofrecen especial resistencia a la ruptura, las paredes celulares varían ampliamente a la rotura.

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Las bacterias Gram + y hongos son mucho más difíciles de romper que las bacterias Gdebido a la composición de la pared celular. Incluso dentro de un mismo microorganismo las células varían significativamente en sensibilidad a la ruptura dependiendo de su estado fisiológico.

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La desintegración no debe destruir el producto de interés. Por ejemplo, pueden utilizarse ácidos para romper muchos microorganismos pero no pueden ser utilizados si el producto es lábil a los ácidos.

1. Métodos químicos •

Incluyen tratamiento con álcalis o ácidos, solventes orgánicos y detergentes.

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La lisis bacteriana con álcalis puede realizarse a gran escala y bajo costeo siempre y cuando el producto sea estable a pH: 10,5-12,5. Por ejemplo, la hormona de crecimiento humano recombinante se libera fácilmente de Escherichia coli por tratamiento con hidróxido sódico a pH: 11.

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El tratamiento con solventes orgánicos es un tratamiento sencillo y barato utilizado en el aislamiento de enzimas en levaduras. No obstante, existe el riesgo que el tratamiento desnaturalice las proteínas por lo que se debe chequear con antelación.

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Los detergentes permeabilizan las células bacterianas al solubilizar las membranas celulares. Asi se originan agujeros por donde salen al exterior proteínas y otras moléculas. Sin embargo los detergentes son caros, desnaturalizan la mayoría de las proteínas y a menudo aparecen como contaminantes en el proceso subsecuente de purificación.

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Para la extracción de células de levadura se utiliza la plasmólisis que se consigue mediante la adición de una concentración alta de cloruro sódico.

2. Métodos biológicos •

Se utiliza la lisis enzimática. Por ejemplo:

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La pared celular de las bacterias Gram + se hidroliza con el enzima lisozima que se aisla de la clara de huevo. La pared celular de las bacterias Gram - se hidroliza con lisozima y EDTA.

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La pared celular de las levaduras se hidroliza con una combinación de uno o más de los enzimas  (1,3)-glucanasa,  (1,6)-glucanasa, mananasa y quitinasa.

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Los tratamientos enzimáticos son muy específicos y las condiciones para la lisis son suaves.

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En la actualidad, los costes limitan el uso de los enzimas como agentes líticos celulares en la industria.

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Una variante que se utiliza en levaduras es la autolisis en la cual los enzimas autolíticos endógenos de las levaduras llevan a cabo la destrucción de su propia pared celular. La adición de cloruro sódico, acetato de etilo o cloroformo y la incubación durante 24h a 45°C aumenta la velocidad del proceso autolítico.

3.- Métodos físicos

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La desintegración por ultrasonidos se utiliza ampliamente en el laboratorio, pero debido a su alto coste no es adecuada para procesos a escala industrial.

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Otro método físico incluye repetidos ciclos de congelación y descongelación pero en este caso muchas de las células permanecen intactas. Industrialmente los métodos físicos más empleados de desintegración celular suponen la acción mecánica.

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Los molinos de bolas llevan a cabo la ruptura de las células mediante la acción de bolas de vidrio. Las células y las bolas de vidrio se mezclan juntas y se someten a una alta velocidad de mezclado en una vasija de reacción. La ruptura se produce cuando una bola de vidrio fuerza una célula contra las paredes de la vasija. Con este método se consigue una velocidad máxima de ruptura de aproximadamente el 80% de las células.

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Otro enfoque es el uso de homogeneizadores. En tales artilugios el material biológico se coloca bajo una fuerte presión hidrostática (alrededor de 500 atmósferas) y la presión se libera bruscamente permitiendo que el líquido salga por una válvula, lo que ocasiona la lisis celular.

C. Métodos de aislamiento (SEPARACIÓN DE RESTOS CELULARES) •

Una vez lisadas las células, los restos celulares se retiran por centrifugación de gran capacidad a baja velocidad o por filtración en membrana.

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Al final obtenemos un líquido libre de células que es el que sufre los tratamientos posteriores para aislamiento y en su caso purificación del producto de interés.

D. Concentración y Purificación del producto 1. Cromatografía •

El uso de métodos cromatográficos implican unas de las etapas más caras en la recuperación del producto

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Tales métodos son de especial valor para la purificación de materiales biológicos sensibles y encuentran un amplio uso en la preparación de materiales farmacéuticos, reactivos de diagnóstico y reactivos para investigación.

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Los distintos métodos cromatográficos que existen según su mecanismo de separación son: filtración en gel (peso molecular), cromatografía de adsorción (interacciones hidrofóbicas), cromatografía de intercambio iónico (carga), cromatografía de afinidad (actividad biológica) y electroenfoque (punto isoeléctrico).

2. Extracción •

Cuando se aplica a los bioproductos, tiene función de separación y concentración.

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El caldo acuoso de fermentación que contiene el producto deseado se mezcla con un solvente inmiscible en el que se disuelva preferentemente y del que pueda ser más fácil y específicamente recuperado.

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Una vez se ha concentrado el producto deseado en la fase solvente puede ser adicionalmente purificado.

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La extracción con solventes ha sido utilizada ampliamente en la industria de antibióticos (penicilina) utilizando solventes (acetato de amilo o de butilo).

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Para la separación de enzimas en estado activo no pueden ser utilizados los solventes orgánicos pero sí pueden ser utilizados sistemas acuosos en fase múltiple preparados en una solución de

sales con polímeros hidrofílicos (polietilenglicol-dextrano). En ambas fases el agua es el componente principal, pero ambas fases no son miscibles por lo que los enzimas pueden separarse fácilmente sin pérdida de actividad.

3. Precipitación, Cristalización y/o Desecación: Ultimas etapas: Cristalización y precipitación • •

La cristalización a baja temperatura es una forma muy suave de purificación. Se utiliza principalmente para la purificación de compuestos de bajo peso molecular (antibióticos). Por ejemplo, la Penicilina G es generalmente extraída del caldo de fermentación con acetato de butilo y cristalizada por adición de acetato potásico en solución etanólica.

Desecación •

Secado del material biológico. Es en muchos casos el método final. Los productos son llevados a una forma estable adecuada para su manejo y almacenamiento.

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La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos biológicos significa que los únicos métodos que pueden ser utilizados son los que conducen a la eliminación de agua con elevación mínima de la temperatura.

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La termoestabilidad de los productos (enzimas o preparaciones farmacéuticas) en algunos casos, es mejorada por la adición de azúcares u otros estabilizantes inertes.

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La liofilización es el método de desecación más suave debido a que el agua es sublimada a partir de una masa congelada. Muchos productos farmacéuticos son liofilizados (vacunas, fracciones de plasma, hormonas y preparaciones de enzimas, así como ingredientes muy lábiles y caros para diagnosis). También se liofiliza cultivos microbianos vivos (cultivos para inoculación en las industrias lácteas).

E. Rendimiento Las pérdidas en la recuperación dependen de la sensibilidad de las sustancias al proceso y del número de etapas de purificación. El promedio de pérdidas atribuidas a la purificación está en torno al 20% pero en casos extremos, con ciertos tipos de metabolitos intracelulares, puede llegar a ser el 90%. El rendimiento final es solamente un factor, ya que el coste de los productos químicos, el equipo y los salarios deben ser considerados en el cálculo global. Los productos que resultan de los proceso biotecnológicos pueden ser muy variados. La variedad estará dada por:

a. La naturaleza química del mismo: sustancias simples (alcoholes, ácidos orgánicos); proteínas, sustancias con actividad terapéutica (antibióticos, hormonas) etc.

b. El volumen de producción y la concentración del producto en el caldo de fermentación: los llamados “commodities” (etanol, ácido cítrico, etc.) se obtienen de a cientos o miles de ton./año y en altas concentraciones en la fermentación. Mientras que los agentes terapéuticos de última generación (hormonas, factores de coagulación, etc.) se producen sólo algunos kg/año y su concentración en la producción es baja. Esto determina la escala de producción.

c. Los requerimientos de pureza del producto final. Las moléculas a ser utilizadas en salud humana requerirán una pureza final muy diferente a las enzimas a ser utilizadas en los polvos para lavar ó de un acidulante para alimentos. Con estos criterios podemos agrupar a los productos tal como se muestra en la Tabla 1 Tabla 1. Características de algunos productos biotecnológicos

En la Tabla 2 vemos los volúmenes de producción de ciertos productos. Tabla 2.

Producción mundial aproximada de algunos productos biotecnológicos

En la Tabla 3 vemos las concentraciones de productos en los caldos luego de la etapa de producción. Tabla 3. Concentraciones típicas de algunos productos Biotecnológicos a la salida del Biorreactor

En la Fig. 2 vemos como tanto volumen (2.a) como concentración (2.b) inciden en los precios finales de estos productos. Por supuesto la ubicación de un producto en este gráfico no es fija. El mejor ejemplo son los antibióticos. La concentración de los mismos en los caldos fue incrementándose a medida que se conocía más del producto, se mejoraba la productividad de las cepas, se desarrollaban nuevas metodologías de producción y así fue aumentándose el volumen y bajando los precios.

Lo mismo puede ocurrir con los agentes terapéuticos de última generación.

Por ello hablar de SP (downstream processing) en Biotecnología no es referirnos a algo invariable. Las etapas y metodologías a emplear están determinadas por todo lo dicho, pero de cualquier manera se puede trazar un esquema general que sea aplicable a cualquier proceso. El esquema puede simplificarse como se muestra en la Figura 3

Estrategias de diseño de procesos de SP Para todos aquellos productos de la Biotecnología tradicional hay un gran conocimiento tecnológico y de las propiedades básicas de las moléculas a purificar tanto como del entorno en que se encuentran luego de la etapa de producción. No ocurre lo mismo con los productos de última generación ya que, por las necesidades comerciales para aprovechar la baja competencia, el elevado precio, y dada la baja escala actual de producción, la estrategia es llegar rápido con el producto al mercado con la tecnología de SP que se posea (por lo general la desarrollada a escala de laboratorio). Esta estrategia posibilita un buen posicionamiento en el mercado que permite, posteriormente, el desarrollo de nuevas tecnologías de cambio de escala y SP. Otra vez el ejemplo de este tipo de evolución son los antibióticos. Las estrategias de diseño de procesos de SP para los productos conocidos pueden resumirse en:

1.

Conocer las propiedades físicas y químicas básicas del principio activo y características del producto final (por ejemplo definir pureza requerida). El uso determina la pureza. Para agentes terapéuticos se requiere un alto grado de pureza del principio activo. Se tolera un máximo de 100 ppm de impurezas ó de 10 pg/dosis, además de estar libre de pirógenos.

2.

Definir perfectamente el material de partida. En la Tabla 4 se muestra un ejemplo de caracterización de material de partida para la purificación de un producto. Muchas veces la metodología de SP condiciona etapas de producción. Por ejemplo, pueden existir componentes del medio de cultivo (por lo general subproductos como agua de hidrolizado de maíz, extracto de malta, sueros animales, albúmina ú otros) que posean sustancias muy similares al producto final que, por lo tanto, interfieren en la purificación del mismo. En este caso se debe eliminar ese componente del medio de cultivo. Tabla 4. Características generales del material de partida para realizar SP

3. piloto.

Trazar diferentes esquemas tentativos de SP y llevarlos a etapas de laboratorio y

Algunas reglas que se siguen para ello son:

a.

Elegir en etapas sucesivas procesos basados en diferentes propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo si una primera etapa es cromatografía de intercambio iónico (propiedad: carga) se puede seguir con una cromatografía de filtración por geles (propiedad: tamaño).

b.

Separar las impurezas que están en mayor proporción en las primeras etapas. Por esta causa la etapa de separación siempre finaliza en una concentración, ya que el agua es por lo general la impureza mayoritaria (mayor del 90% en cualquier proceso fermentativo).

c.

Luego de la concentración usar en las primeras etapas de purificación propiamente dicha un método de alta resolución (por ejemplo cromatografía de afinidad). Estos métodos poseen un alto rendimiento aunque no brinden la mayor pureza. En cierta medida lo que se hace es seguir concentrando para reducir la cantidad de muestra a tratar en las etapas posteriores.

d.

Dejar el proceso más complejo (y por lo general más caro) para el final. Se usan estos métodos cuando tenemos la sustancia a purificar concentrada y pre-purificada. Volviendo al diagrama original de SP en la Figura 3 podemos ver algunos métodos usados en cada una de esas etapas. Figura 3 . Metodologías utilizadas en los procesos de SP

Como podemos observar, la economía de los procesos biotecnológicos depende en gran medida de las operaciones de bioseparación que involucran, de tal manera que la correcta selección de estas operaciones tiene un fuerte impacto en el éxito del proceso.

Referencias bibliográficas

1. Biotecnología - Bioprocesos II. Introducción a los procesos biotecnológicos Separación y purificación en Biotecnología (“Downstream processing”)