1-physicochimie

Faculté de Médecine RTH LAENNEC

PCEM 1

PHYSICOCHIMIE DE L’EAU ET DES SOLUTIONS, TRANSFERTS MEMBRANAIRES

Didier Le Bars CERMEP Janvier 2001

Biophysique des transports membranaires

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I - PHYSICOCHIMIE DE L’EAU ET DES SOLUTIONS ETATS DE LA MATIERE 1-Agitation moléculaire - mouvement Brownien 2-Liaisons intermoléculaires 2-1 Typologie des liaisons a. forces entre charges b. forces entre charges et dipôles c. forces entre dipôles (Keesom) d. forces entre dipôles induits (Debye) e. forces entre dipôles instantanés (London) f. liaison Hydrogène g. interaction hydrophobe h. forces de répulsion - énergie maximale d’interaction i. importance relative des interactions j. tableau récapitulatif

3- Energie totale d’une molécule PHYSICOCHIMIE DE L’EAU ET DES SOLUTIONS 1- Propriétés de l’eau 2- Solutions 3- Dissociation, Equilibres, pH 4- Osmolarité 5- Dissolubilité MACROMOLECULES ET COLLOIDES 1- Etat colloïdal 2- Conformation 3- Propriétés électriques COMPARTIMENTS LIQUIDIENS 1- Compartiment intracellulaire 2- Compartiment extracellulaire 3- Détermination des volumes des compartiments 4- Ions 5- Substances Neutres

Biophysique des transports membranaires

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II BIOPHYSIQUE DES TRANSPORTS MEMBRANAIRES INTRODUCTION LA MEMBRANE 1-Composition Chimique 1.1 lipides 1.2 proteines 1.3 osides

2-Organisation Structurelle 2.1 Monocouche 2.2 Plasticite 2.3 Descrption electrique 2.4 Sites de passage

INTRODUCTION AUX TRANSPORTS: BIOENERGETIQUE 1-Enthalpie 2- Potentiel Chimique TRANSFERTS MEMBRANAIRES PASSIFS 1- Diffusion 1.1 description 1.2 lois de la diffusion 1.3 coefficient de diffusion D

2- Dialyse 2.1 Solubilité dans la membrane 2.2 un cas particulier: transport faciite

3- Filtration 3.1. Relation débit-pression 3.2. transmittance 3.3 exemples : Rein Artificiel

4- Osmose 4.1 osmomètre 4.2. expression des lois 4.3 Cas du sang 4.4 Isoosmolarité / isotonicité 4.5 cryoscopie

5- Ions 5.1 Mobilité des ions 5.2 Flux d’ions 5.3 Lois de Nernst et de Goodman 6- Application: Equilibres de Donnan et Phenomene de Starling

TRANSPORTS ACTIFS Couplages energetiques Biophysique des transports membranaires

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I - PHYSICOCHIMIE DE L’EAU ET DES SOLUTIONS ETATS DE LA MATIERE Les différents états de la matière contiennent les mêmes molécules; la différence de comportement est dûe à des différences de liaisons intermoléculaires: les forces de liaisons intermoléculaires tendent à lier les molécules les unes aux autres, alors que l’agitation thermique et le mouvement brownien tendent à les séparer. 1-Agitation moléculaire - mouvement Brownien Le mouvement brownien est un mouvement incessant, désordonné, aléatoire qui anime les particules et que l’on peut observer au microscope. Ce mouvement est en fait la résultante macroscopique de l’agitation moléculaire, qui témoigne de l’énergie cinétique des molécules prises individuellement. Toute particule, a chaque instant, parcourt une certaine distance ∆l dans une direction quelconque et en fait la résultante de ce déplacement, le libre parcours moyen par unité de temps, est constant (à conditions fixes). D’autre part, on peut démontrer par la théorie cinétique des gaz que l’agitation thermique des molécule (translation) est proportionnelle à la température absolue, avec U l’énergie interne U = 3/2 . R. T pour une mole de gaz parfait (R, constante des gaz parfait 8,32 J.mole-1.°K-1) Pour des molécules plus complexes (diatomiques, polyatomiques) on ajoutera l’énergie des mouvement de rotation et d’oscillation de part et d’autre de leur position d’équilibre. 2-Liaisons intermoléculaires Les forces de forte énergie assurent les liaisons de type covalent; les forces de faible énergie (forces de Van der Waals) assurent des interactions momentanées: - reconnaissance d’une hormone ou d’un médiateur par son récepteur - maintien des structures macromoléculaires (enzymes, acides nucléiques) - interactions reversibles L’ordre de grandeur typique d’une liaison de forte énergie est de 400 à 800 kJ.mol-1; une liaison de faible énergie sera plutôt de1 à 50 kJ.mol-1. 2-1 Typologie des liaisons Les liaisons de faible énergie sont dûes à des forces électrostatiques, liées aux charges et aux dipôles (crées par une dissymétrie de la répartition des charges électriques sur les groupes d’atomes constituant les molécules). On appelle dipôle deux charges égales, de signe opposé, situées à distance d:

•

-q

d

•

µ=q.d

+q

le moment dipolaire est une grandeur vectorielle de module µ=q.d et de direction - vers +; l’unité de dipôle est le C.m (plus courant, le Debye 1d=0,33 10-29 C.m) Biophysique des transports membranaires

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Les dipôles peuvent être permanents ou induits. L’eau est un dipôle permanent:

-q O

α 104,28

m

n 58

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0,0 H

+q

H

µ=1,84 d

A. Forces entre charges: La loi de Coulomb s’applique:

F=

1 q1q 2 4πε 0 εr r 2

ε0 permittivité electrique du vide, εr constante dielectrique (1 pour le vide, très légèrement supérieur à 1 pour les gaz, 2 lipides et protéines, 80 pour l’eau à 20 C) Quand on plonge un cristal de NaCl dans l’eau, F devient 80 fois plus faible, les ions s’écartent d’où dissolution. Cette force est non directionnelle, s’exerce à longue distance; l’énergie de liaison varie en 1/r et est de l’ordre de 5 à 40 kJ.mol-1. B. Forces entre charges et dipôles Les forces peuvent s’exercer entre charge et dipôle permanent ou induit (cf infra); l’exemple typique est la solvatation des ions: plus un ion est petit, plus il s’entoure de molécules d’eau (ex Li 6, Na 5, K 4, Cl 3 ...) ce qui augmente son rayon apparent en solution et influe sur sa mobilité. Les forces entre charges et dipôle sont donc directionnelles, l’énergie mise en jeu varie en 1/r3 C. Forces entre dipôles: Forces de Keesom Un dipôle permanent est constitué par une molécule sur laquelle la répartition des charges est continuellement dissymétrique, ex H2O, CH3OH mais pas CH 4 . Un dipôle crée un champ électrique (de volume très limité), qui influe donc sur tout autre dipôle au voisinage proche. Pour une population de molécules l’énergie potentielle de deux dipôles éloignés de r varie en r-6. Bien sûr l’agitation moléculaire (donc la température) s’oppose à l’alignement des dipôles. D. Forces entre dipôles induits - forces de Debye Une structure stable électriquement neutre, lorsqu’elle est soumise à un champ induit par une charge ou un dipôle, peut voir se modifier la répartition spatiale de ses électrons et devenir elle-même un dipôle. Le moment dépend de la valeur du champ électrique inducteur et de la polarisabilité de la molécule. Importante à courte distance, l’énergie varie en r-6 E. Forces entre dipôles instantanés - forces de London Biophysique des transports membranaires

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Une structure globalement neutre, non soumise à un dipôle ou une charge, possède cependant des électrons en mouvement et chaque position peut être considérée comme un dipôle instantané. Entre ces dipoles s’exercent les forces de London, orientées, de faible distance, dont l’énergie varie en r-6. F. Liaison Hydrogène La liaison hydrogène se produit lorsqu’un atome d’hydrogène lié à un atome électronégatif (O-H, N-H) se trouve à proximité d’un autre atome électronégatif (par exemple RR’NH...O=CRR’). Il se forme une interaction électrostatique charge-dipôle et dipôle-dipôle, d’énergie assez importante; cette liaison peut être intramoléculaire aussi bien qu’intermoléculaire.Le rôle des liaisons hydrogène en chimie et en biochimie est très important, en particulier dans les propriétés de l’eau et dans le maintien de la structure des macromolécules (ADN, protéines...) G. Interactions hydrophobes Les molécules non polaires et peu polarisables tendent à se regrouper, ce qui crée une force de liaison hydrophobe. H. Forces de répulsion - énergie d’interaction Le rapprochement des molécules par les forces d’attraction, d’énergie globalement en -1/r6 définies ci-dessus est limité par les forces de répulsion s’exerçant à très courte distance, résultant des forces répulsives qui existent entre les électrons des cortèges qui ne peuvent s’interpénetrer (Pauli), et dont l’énergie varie en r-12 . L’interaction de deux molécules est donc caractérisée par l’energie potentielle de Lennard-Jones, telle que Ep=k1/r12 -k2/r6 et qui définit une distance r intermoléculaire d’énergie de liaison maximale: Ep

forces répulsives k1/r

12

r0

x k1/r

12

6

- k2/r

EL

6

forces attractives -k2/r

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I. Importance relatives des interactions L’importance relative des interactions dépend du type de molécule considérée; ainsi l’argon ne connait que des forces entre dipôles instantanés, alors que dans le cas de l’ammoniac et plus encore pour l’eau le dipôle permanent provoque des forces de Keesom plus importantes. Moment Dipolaire (d)

Interaction de Keesom %

Interaction de Debye %

Interaction de London %

Argon

0

0

0

100

CO

0,12

0,4

0,9

98,7

HBr

0,78

3,1

2,2

94,7

NH3

1,5

45

5,2

49,8

H2O

1,84

77

4

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J. Tableau récapitulatif

NOM

Energie

Covalente

Ordre de Grandeur kJ.mol-1 400 a 800

Exemple

Importance

H-O-H, HC=C,

Structure des molécules

Ionique

Loi Coulomb, varie en 1/r

5 à 20

-COO- +H3N-

Electrolytes

Charge-dipôle permanent

varie en 1/r3

1à5

Na+...H2O

Solubilité et hydratation des ions

Dipôle permanent-Dipô le permanent

varie en 1/r6

2 à 10

-C=O...H-N

Forces de Keesom

Dipôle permanent-Dipô le induit

varie en 1/r6

1à5

Forces de Debye

Dipôle instantanéDipôle instantané

varie en 1/r6

1à5

Forces de London

Hydrogène

8 à 40

structure 2 des protéines, appariement des bases nucléiques

Hydrophobe

4 à 30

entre groupes non polaires

structure 3 des protéines

3 Energie totale - états de la matière L’énergie totale d’une molécule est la somme des énergies de liaison, de translation, de rotation et de vibration; les deux premières énergies sont de loin les plus importantes, et c’est l’importance relative de ces deux énergies qui gouverne le comportement macroscopique de la population de molécules considérée. Si l’énergie de translation est grande, les liaisons intermoléculaires vues précedement peuvent être rompues et les molécules initialement liées de séparent; statistiquement, on peut atteindre une situation ou toutes les molécules sont indépendantes, c’est l’état gazeux: les molécules libres occupent par le mouvement brownien tout l’espace qui leur est offert. Le gaz est parfait lorsque les molécules sont faiblement concentrées, considérées comme ponctuelles et sans interactions; il répond alors à la loi des gaz parfaits, P.V=n.R.T. Le gaz réel s’éloigne bien sûr de ces conditions, et on corrige alors cette loi du volume occupé par Biophysique des transports membranaires

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les molécules et des interactions intermoléculaires (P+ a/V2).(V-b)=n.R.T (équation de Van der Waals) . Si l’énergie de liaison intermoléculaire l’emporte sur l’énergie de translation, les molécules restent liées les unes aux autres et on ne peut que difficilement modifier l’édifice constitué; on a affaire à un solide, dont l’exemple parfait est le cristal dans lequel les atomes occupent des positions connues et régulières dans l’espace. Entre les deux situations se situe l’état liquide, qui offre une résistance partielle à la déformation, mais est incompressible. Au plan microscopique, les molécules sont liées les unes aux autres mais on peut cependant les déplacer; il existe un ordre à courte distance, mais le désordre à grande distance. Les changements d’état se réalisent par apport ou retrait d’énergie, dont la forme la plus simple est la chaleur, expression macroscopique de l’agitation moléculaire. L’unité de chaleur est la calorie, énergie nécessaire pour porter un gramme d’eau de 14,5 à 15,5 degrés Celsius (4,18 Joules).

N IO

AC

AT

EF

R

U AP

N

O

TI

EV

N

SA

IO

EN

O

D

AT

IM

N

Q

BL

O

C

LI

SU

TI

O

N

GAZ

FUSION

LIQUIDE

SOLIDIFICATION

SOLIDE

La majorité des phénomènes biologiques s’effectuent à l’état liquide, dans l’eau qui représente les trois quarts de l’organisme.

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PHYSICOCHIMIE DE L’EAU ET DES SOLUTIONS 1- Propriétés de l’eau Les propriétés remarquables de l’eau (par comparaison à des analogues de structure comme H2S, gazeux) s’expliquent par la formation de liaisons hydrogène de chaque molécule avec ses 4 voisines, ce qui forme une structure pseudo-cristalline. La masse spécifique est de 1000 kg.m-3 à 4°C alors qu’à l’état solide, celle-ci est de 910 kg.m-3. L’énergie de liaison est élevée (50 kJ.mol-1); la quantité de chaleur nécessaire pour faire fondre la glace ou pour évaporer l’eau liquide est importante en raison des liaisons hydrogène à rompre, et joue un grand rôle dans la régulation thermique (1 g d’eau évaporée par la sueur permet d’éliminer 2245 J). La constante dielectrique est très importante, permettant de diminuer les forces d’interaction des molécules dissoutes. L’eau est un excellent solvant des substances polaires (sucres, acides aminés,...) mais n’a qu’une faible affinité pour les lipides, ce qui contribue à la stabilisation des membranes biologiques. La forte constante diélectrique et la polarité de l’eau entrainent la dissolution des cristaux ioniques, ainsi que la solvatation des ions qui attirent les dipôles de l ‘eau et s’entourent d’une gaine d’hydratation (forces entre charges et dipôle)

2- Solutions Tout mélange d’au moins deux substances, tel que les molécules constituant le mélange soient réparties de façon entièrement homogène. Il existe des solutions solides mais en pratique le terme désigne le mélange de composés (les solutés - gaz, liquide ou solide) dans un liquide, le solvant. Les proportions relatives de soluté et solvant sont exprimés par: - concentration pondérale, masse de soluté par unité de volume de solution, à utiliser de préférence lorsque le soluté ne possède pas une structure bien définie (ex protéines dans le sérum 70 g.l-1) - concentration molaire, plus intéressante pour les phénomènes biologiques où le nombre de moles réactives est important. L’unité usuelle est alors la mole par litre, mol.l-1; l’unité SI nécessaire dans les calculs est la mol.m-3 (ex albumine, protéine bien définie de masse moléculaire 65000, dans le sérum 0,7 mmol.l-1 plutôt de 45 g.l-1) - concentration molale, la plus précise, en mol.kg-1 de solvant, et qui tient compte alors du volume des espèces en présence, de la température (ex 1 litre de plasma n’a pas une masse d’un kilogramme) - fraction molaire, rapport du nombre de mole d’un composé au nombre total de moles en présence - La concentration équivalente permet de connaitre le nombre de charges électriques d’une espèce présente, provenant d’une molécule dissociable, par unité de volume de solution. Si l’ion considéré porte la charge z, la concentration équivalente vaut Ceq=|z|.C mol.l-1. Par exemple, une solution 0,1 M de CaCl2 fournit 0,2 Eq.l-1 de Ca ++ et 0,2 Eq.l-1 de Cl -. Il y a Biophysique des transports membranaires

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autant d’équivalents d’ions négatifs que d’équivalents d’ions positifs, pour respecter l’électroneutralité. Cette concentration équivalente permet également de définir la normalité d’une solution en acide ou base, CN = |z|. CM (ex: H 2SO 4, 1 mole libère 2 moles de H+ , z = +1 donc une solution 1 M est 2 N) 3/ Constante de dissociation, loi de dilution d’Ostwald, pH Soit un sel AB qui se dissocie en ses ions A- et B+: AB A- + B+ K= [A-].[B+]/[AB] Si on a introduit C moles de AB, après dissociation il en reste C-[A-]; comme [A-]=[B+] on a alors K = [A-]2 / C-[A-] En appelant α la proportion de soluté dissocié, α=[A-]/C et [A-]=α.C K= α 2.C/1-α Si l’on applique cette dissociation à l’eau, on a dissociation de H2O en OH- et H+ (en réalité H3O+) On sait par la mesure que KH2O ([H+].[OH-]/[H2O]) est très faible, de l’ordre de 1,8 10-16 . La concentration molaire en eau est de 1000/18=55,5 mol.l-1, d’où la définition du produit ionique de l’eau: Ke = [H+].[OH-] = KH2O .[H2O] = 1,8 10-16 x 55,5 = 10-14 à 25°C On définit le pH par pH=-log[H+] Ce qui donne donc une valeur de 7 pour le pH de l’eau, soit 100 nmol H3O + .l-1. Le pH du sang veineux est de 7,35, soit 44,7 nmol.l-1, celui du sang artériel 7,45 soit 25,5 nmol.l-1. De la même façon, on peut appliquer ces définitions aux équilibres de dissociation des acides et des bases: les constantes d’équilibre KA (KA =[A-].[H+]/[AH]) et KB expriment la force des couples acide AH/A- et base B/BH+ (ou A-/AH) par rapport à l’eau, et on utilisera le pK (-logK) pour caractériser ces équilibres. [H+] apparaissant dans ces équilibres, on pourra relier le pH de la solution à son pK . En négligeant la dissociation de l’eau, et en considérant le coefficient de dissociation α des acides et bases faibles petit devant 1, on a: Solution neutre pH=7 Acide fort: pH=-log CN Base forte: pH=14 + log CN

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Acide faible: pH=1/2 ( pKa-log CM ) Base faible: pH=14-1/2 (pKb-logCM ) Acide faible + base forte (ou sel de base forte): pH=pKa + log([sel]/[acide]) Base faible + acide fort (ou sel d’acide fort): pH=14 - (pKb + log([sel/base])) 4- Osmolarité Dans le cas des phénomènes d’osmose, c’est le nombre d’unités cinétiques de la solution qui est important; dans le cas d’une solution de molécules non dissociables, une mole est équivalente à une osmole. Dans le cas de sels ou de molécules dissociables (acides, bases,...), il faut calculer le nombre d’unités en présence. 5- Dissolubilité La liaison des molécules d’eau avec les corps en solution trouve son expression macroscopique dans les phénomènes de solubilisation. Le corps peut comporter des groupes hydrophiles (COOH, OH, NH2...), polarisés et capables de se lier avec le dipôle de l’eau, et des groupements hydrophobes (CH3, C nH2n...) avec lesquels l’eau est faiblement liée. Dans une solution, trois types de forces sont à considérer: forces eau-eau, soluté-soluté, eausoluté. Si les forces de liaison eau-soluté sont plus importantes que les liaisons eau-eau et soluté-soluté, le corps sera soluble et à l’occasion de la dissolution, les variations d’énergie de liaison se traduiront par une chaleur molaire de dissolution. La solubilité d’un corps dépend de l’abondance relative des groupes hydrophobes et hydrophiles: les sucres, riches en fonction alcool OH, sont solubles alors que les acides gras sont de moins en moins solubles au fur et à mesure de l’élongation de la chaine hydrocarbonée. Biologiquement, pour éliminer certaines molécules, l’organisme adjoint des groupes hydrophiles sur certains sites pour les rendre la molécule plus hydrosoluble (ex glycuroconjugaison par le foie). Beaucoup de corps sont partiellement solubles dans l’eau et partiellement solubles dans des milieux hydrophobes (huile). Un équilibre de concentration s’établit alors entre les deux phases, et le quotient des concentrations du corps dissous s’appelle le coefficient de partage. La solubilité des solides est très variable, la solubilisation de certains produits est limitée; au delà d’une concentration maximale, la solution est saturée et le surcroit de soluté change de phase. Certains liquides sont solubles en toutes proportions, d’autres forment deux phases au delà d’une certaine concentration (démixion). Enfin la solubilité des gaz suit la loi de Henry, V=s.p (V volume dissous, s coefficient de solubilité dépendant de la température, p pression partielle du gaz); par exemple, le CO2 est 25 fois plus soluble dans les milieux biologiques que l’oxygène. Biophysique des transports membranaires

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Macromolécules et Colloides

10 Å SOLUTIONS Microscope electronique

100 Å

COLLOIDES

Grosses protéines

1Å

Ovalbumine

• UREE

• EAU

Les colloïdes sont des solutions de macromolécules (M>5000) dont le comportement physico-chimique est très différent des solutions normales (dites micro-moléculaires); les colloïdes biologiques sont aussi appelés biopolymères.

1000 Å SUSPENSIONS Microscope optique

1- Etat colloïdal L’état colloïdal est en fait assez mal défini, intermédiaire entre la solution vraie et la suspension; on distingue quelquefois: - colloïdes lyophobes, peu d’affinité avec le solvant, très fines particules insolubles en suspension (ex métaux colloïdaux), en général instables. - colloïdes lyophiles, forte activité pour le solvant, molécules solubles (ex collagène gélatine), en général stables. - colloïdes amphilyophiles, constitués de micelles plus ou moins régulières. Les colloïdes forment des gels, réseaux moléculaires plus ou moins rigides (dont les interstices laissent passer solvant et petites molécules) ou des sols, lorsque les mailles de ce réseau sont extrêmement lâches. Le passage sol-gel est le plus souvent très dépendant de la température (ex gélatine). Les gels colloïdaux ont une grande importance (gelatine dispersant des sels d’argent en photographie, gels de silice pour les séparations chromatographiques). Dans le cytoplasme des cellules, on peut considérer que les protéïnes sont en concentration élevée et constituent en fait un gel. Les macromolécules typiques des systèmes vivants sont - les protéines, formées à partir des 20 acides aminés liés par une liaison peptidique - les acides nucléiques, formés de nucléotides (ensemble d’une base, d’un ose et d’un acide phosphorique) - les polyosides (motifs osidiques variés, ex amidon, glycogène, cellulose à partir de glucose, mucopolysaccharides, pectines, xylanes...) - autres associations, lipoprotéines, glucoprotéines, chromatine. Ces divers systèmes colloidaux ont en commun une diffusion lente en phase aqueuse, une pression osmotique faible, des propriétés optiques particulières, et une très grande surface de contact en solution. Ils sont d’autre part très instables et peuvent floculer sous l’effet de nombreux agents, transformant la solution colloidale monophasique en une solution Biophysique des transports membranaires

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biphasique. 2-Conformation Chaque macromolécule possède en solution une structure tridimensionnelle caractéristique, d’où découle des propriétés physoco-chimiques. les cas les plus extrêmes sont les formes globulaires, les molécules sont repliées sur elles-même et apparaissent sphériques, ou les formes linéaires qui ressemblent à des fibres. En ce qui concerne les protéines, on définit quatre structures successives: - primaire: composition en AA, liés par la liaison peptidique covalente. On atteint des macromolécules de plusieurs milliers de dalton (1 dalton = MM de 1H) - secondaire: repliement sur elle-même de la protéine, avec création de liaisons hydrogène, pour former une structure α en hélice, ou β chaine / feuillet plissé - tertiaire: repliement des brins dans l’espace, création de liaisons de type Van der Waals intramoléculaires, pour aboutir à la forme responsable de l’activité biologique. La moindre modification des conditions change cette conformation et peut détruire l’activité biologique. - quaternaire: ponts disulfures entre AA soufrés (cystéine...), rassemblement de sous-unités dissociables (protomères). Les acides nucléiques sont aussi des macromolécules biologiques, support du code génétique, dont la structure est bien connue: squelette sucre, phosphate, base, deux brins couplés par liaisons Hydrogène, enroulement en double hélice.

3- Propriétés électriques des colloïdes La plupart des macromolécules portent des charges électriques; en particulier, le pHi des protéines s’échelonne de 4,8 pour les albumines à 6 pour les globulines. Au pH physiologique de 7,4 les protéines portent donc une charge nette négative. Cette propriété est exploitée par les techniques d’électrophorèse: on soumet un colloïde chargé en solution à une différence de potentiel et on étudie son déplacement dans le champ électrique créé. Cette méthode permet d’identifier et de fractionner les macromolécules, voire de les isoler puisqu’elles ne sont pas dégradées lors de laur migration. L’électrophorèse sur support est la plus employée.

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COMPARTIMENTS LIQUIDIENS L’eau dans l’organisme représente la majeure partie en masse de tous les constituants: un homme de 70 Kg possède - eau 42 Kg, - graisse 8 Kg, - sels minéraux (squelette) 7 Kg, - protéines 13 Kg dont 7 de muscles). L’eau se repartit dans l’organisme en compartiments intracellulaire et extracellulaire, lui-même divisé en compartiment plasmatique et intersticiel. 1- Compartiment intracellulaire Ensemble très hétérogène puisque c’est l’eau incluse dans les cellules de l’organisme; il représente 35 à 45 % du poids du corps. Le milieu intracellulaire est séparé du liquide extracellulaire par les membranes qui assurent les échanges par des phénomènes passifs (osmose) ou actifs, alors consommateurs d’énergie. 2- Compartiment extracellulaire Divisé en secteur plasmatique ou vasculaire (plasma sanguin, 4,5 % du poids du corps) mû par la pompe cardiaque et en secteur intersticiel, eau qui baigne les tissus et qui ne circule que très lentement. Entre les deux secteurs se trouvent la membrane endothéliale des capillaires, membrane dialysante (laisse passer eau et petites molécules). Dans le compartiment vasculaire, la répartition de l’eau entre le milieu cellulaire (éléments figurés) et le milieu extracellulaire (plasma) est mesuré par l’hématocrite, rapport du volume des éléments figurés au volume total d’un échantillon de sang. La valeur normale de l’hématocrite est de 0,46± 0,06 chez l’homme et 0,42 ± 0,06 chez la femme. A noter qu’il existe des espaces hors compartiments intra et extracellulaire, comme le liquide céphalorachidien, les liquides digestifs, les cavités séreuses (plèvre, péritoine, synovie); ces espaces sont séparés du milieu plasmatique par des cellules épithéliales. 3- Détermination des volumes des compartiments La détermination des volumes repose sur les méthodes de dilution: si dans un volume inconnu V on dissout une masse m de substance, après homogénéisation on mesure une concentration C qui est par définition C = m/V d’où il est facile de tirer V. L’eau totale est mesurée par une substance qui diffuse librement à travers toutes les barrières endothéliales et membranaires, comme l’eau deutériée (eau lourde) ou eau tritiée. La mesure du volume plasmatique est réalisée à l’aide d’une molécule qui ne traverse pas les barrières endothéliales, comme l’albumine marquée par un isotope radioactif. La connaissance de l’hématocrite permet ensuite de déterminer le volume plasmatique. L’espace extracellulaire se mesure avec une substance qui passe les endothéliums sans diffuser à travers les membranes; on utilise le soufre, les sulfates ou le sodium radioactif. Pour fixer les idées, chez un homme de 70-80 kg on trouvera 60 % d’eau totale, 45 % d’eau Biophysique des transports membranaires

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intracellulaire, 15 % d’eau extracellulaire répartie en 11 % d’eau intersticielle et 4 % d’eau plasmatique. Ces chiffres varient avec le sexe (55 % eau totale chez la femme), la proportion de tissu adipeux (% eau totale plus faible) et l’age (le % diminue chez le vieillard). Il existe des formules anthropométriques telle les formules de Watson: Eau totale Homme (litres)=Taille(cm)*0,1074+Poids(Kg)*0,3362-Age(ans)*0,09516+2,447 Eau totale Femme (litres)=Taille(cm)*0,1069+Poids(Kg)*0,2466-2,097

4- Ions et sels minéraux L’équilibre électrolytique est également un paramètre essentiel. Les deux ions principaux sont le sodium et le potassium. -Sodium Essentiellement extracellulaire, le stock est de l’ordre de 60 mmol.kg-1 soit 4,5 moles pour 75 kg. 45 % appartiennent au squelette, 50 % au liquide extracellulaire et 5 % est intracellulaire. On distingue classiquement le sodium échangeable (42 mmol.kg-1), en équilibre de diffusion avec le sodium plasmatique, mobilisable pour compenser une perte ou un excès, et le sodium non échangeable (sodium osseux en partie, LCR). -Potassium Intracellulaire à 85 % (fixation osseuse) , stock normal de 42 mmol.kg-1. Le K+ est presque totalement échangeable, et la mesure de la kaliémie n’est pas toujours un reflet fidèle des stocks en raison de mécanismes variés. Une kaliémie anormale entraine des troubles sévères: asthénie, troubles du rythme cardiaque, troubles nerveux. -Calcium 1,5 kg (37,5 moles) dans l’organisme, essentiellement osseux. En solution, presque exclusivement extracellulaire, concentration plasmatique à 2,5 mmol.l-1. Le taux intracellulaire est très faible mais ses mouvements influent sur la régulation d’un grand nombre de phénomènes liés à l’activation de la cellule (contraction de la cellule cardiaque, inhibition d’enzymes, activation de la glycogènolyse...). -Autres ions Magnésium, surtout intracellulaire, environ 12 mmol.kg-1; chlore, à 70 % extracellulaire, 33 mmol.kg-1; bicarbonates 10 mmol.kg-1, essentiel dans la régulation de l’équilibre acidobasique; phosphates, 2,5 kg fixés dans les os. Composition en ions Corps entier Plasma mmol.kg-1 mmol.l-1 Na+ 60 142 K+

42

4

Ca ++ Mg ++

550

2,5

12

1,5

Cl -

33

103

HCO 3-

10

27

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H2PO 4-

350

1

SO 4-

0,5

Protéines

1

5- Substances neutres Seuls glucose et urée sont quantitativement importants. L’urée traverse comme l’eau les parois cellulaires et se répartit à une concentration de 5 mMol dans tous les compartiments liquidiens. L’urée n’est pas osmotiquement efficace. Le glucose traverse librement la paroi des capillaires (soluté micromoléculaire) mais ne peut entrer dans les cellules qu’en présence d’insuline qui provoque la synthèse des protéines transporteuses de glucose (Glut, transport facilité). Dans les conditions physiologiques, la glycémie est de 5 mmol.l-1; la différence de concentration entre les compartiments liquidiens n’induit une pression osmotique importante qu’en cas de carence insulinique (diabète sucré décompensé).

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II - BIOPHYSIQUE DES TRANSPORTS MEMBRANAIRES INTRODUCTION • Structures omniprésentes dans le vivant (pas de vivant sans membrane, un virus a au moins une membrane) • Les membranes permettent la communication entre les différents milieux, les transferts sélectifs, les échanges étant la condition de la vie • Compartiments (ensemble qui présente un comportement (concentration, transferts...) similaire au cours du temps): - Intracellulaire, la membrane cellulaire (“sélective”) permet certains échanges (passifs et actifs) entre milieu cellulaire ≠ extérieur - Extracellulaire, divisé en secteur plasmatique et secteur intersticiel qui baigne les cellules; la séparation entre les deux est assurée par l’endothélium des parois vasculaires, qui laisse passer eau, ions, molécules de petite taille (“dialysant”) • D’autres “secteurs” existent, comme les liquides des cavités séreuses (plèvre, synovie) ou le liquide céphalo-rachidien (protégé par la barrière hématoencéphalique). Ces liquides de composition particulière sont séparés du milieu plasmatique par des cellules épithéliales. A l’intérieur de la cellule: les membranes individualisent les organelles intracellulaires (ex noyaux, mitochondries, appareil de Golgi, réticulum endoplasmique, lysosomes, vésicules synaptiques…) -> une membrane peut être “simple” , par exemple la paroi d’une cellule ou complexe, assemblage de plusieurs cellules. • Structure loin d’être fixe: active, fluide, modelable, réactive Membranes => Vie (situation thermodynamique de non-équilibre): Les membranes ne sont pas des barrières qui isolent la cellule mais des structures qui permettent un transfert sélectif de molécules d’un milieu vers un autre. Leur étude repose sur des techniques physiques variées: ◊ microscopie électronique ◊ RPE résonnance para electronique ◊ fluorescence ◊ radioisotopes (transports) ◊ mesure de ddp ◊ biochimie des constituants

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LA MEMBRANE 1- COMPOSITION CHIMIQUE DE LA Membrane cellulaire La détermination de la composition chimique des membranes cellulaires nécessite un certain nombre d’étapes: - séparation des tissus - homogénéisation - centrifugation - extraction - analyse: chromatographie, diffraction X… Les membranes sont constituées par l’assemblage de - lipides, squelette - protéines, assurant la spécificité et modulant l’activité - composés osidiques 1.1 LIPIDES (extraction par solvants hydrophobes) phospholipides (30 à 40 % du total membrane) et cholestérol (15 %) phospholipides: alcool (glycerol C3) + ester phosphoré + acide gras ex lécithine O O-

CH3 CH3

O

N+

O P

n

O O

O

m

O

CH3

HYDROPHILE

HYDROPHOBE

une partie hydrophile, polaire + une hydrophobe, apolaire : amphilyophiles

HYDROPHILE

HYDROPHOBE

L’acide gras peut comporter ou non des liaisons insaturées: acides caprique C10:0, stéarique C18:0, oléique C18:1, linoléique C18:3. Glycolipides: un sucre remplace l’alcool (ex galactose, inositol) Sphingolipides: construit sur la sphingosine au lieu de glycerol Biophysique des transports membranaires

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HO O-

CH3 CH3

(CH2) 12-CH3

O

N+

O P O

CH3

N

O

n

H

Stérols, en particulier cholestérol

HO

Les stérols modulent la fluidité de la membrane (fluidité qui dépend aussi de la composition en acides gras) 1.2 PROTEINES Environ 50 % de la membrane (> si activité métabolique +++) Extraction par modifications de pH, force ionique si protéines extrinsèques; détergents, enzymes si intrinsèque Séquences d’acides aminés enchainés par liaison peptidique R-NH-CO-R’: dans la membrane, on trouve du peptide jusqu’à la macromolécule - intrinsèque: partie intégrante de la membrane - extrinsèque: peu liée à la membrane On distingue différents types de structures protéiques cf supra. Ces protéines, caractéristiques des différentes membranes sont responsables des activités enzymatiques, des transports actifs ou facilités, des récepteurs… 1.3 COMPOSES OSIDIQUES ~10 % de la membrane Dérivés du glucose et du galactose, aminés ou acétylés, fixés sur protéines ou lipides: - Glycoprotéines, responsables de propriétés antigéniques - Glycolipides, responsables des propriétés de groupe sanguin (A & B), captation et reconnaissance des médiateurs chimiques, adhésion intercellulaire.

2- ORGANISATION STRUCTURELLE DE LA MEMBRANE 2.1 BICOUCHE LIPIDIQUE Les phospholipides dans l’eau s’étalent spontanément en monocouche, pôle hydrophile vers l’eau et pôle hydrophobe hors de l’eau.

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Eau

Entre deux compartiments contenant des phospholipides en suspension dans l’eau et séparés par un orifice, il se forme spontanément une double couche lipidique (épaisseur ~ 5 nm) à l’interface: Suspension aqueuse de phospholipides

En suspension dans l’eau, ils forment spontanément des micelles, vésicules fermées composées d’une double couche, très proche des membranes naturelles (Résistance élevée, Capacité élevée, passage “facile” de l’eau et médiocre des gros ions) Selon l’agitation, on peut obtenir des vésicules emboitées “en pelure d’oignon”, ou par ultrasons, des vésicules de 25 nm formées d’une seule double couche:

5 nm

25 nm VESICULE EMBOITEE

LIPOSOME

Cette propriété est utilisée pour la création de liposomes, vésicules lipidiques vectrices de médicaments (mais sont détruites par le foie) ou de produits de cosmétologie.

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Incorporation des protéines et du cholesterol: protéine extrinsèque

protéine intrinsèque

cholestérol bicouche lipidique

En ce qui concerne les protéines, on les qualifie de bitopiques si la chaine polypeptidique traverse la membrane une seule fois ou de polytopiques: masse importante au sein de la membrane, traversées multiples (cas des récepteurs) 2.2 PLasticité de la membrane La membrane n’est pas une structure fixe, de nombreux phénomènes dynamiques s’y produisent continuellement: 1 3

4

5

2

Diffusion latérale et rotation des protéines 1,2 Diffusion transversale des phospholipides 4: τ= 10-2 s Torsion des chaines: τ= 10-4 s Bascule (flip-flop, 5): τ= 105 s Biophysique des transports membranaires

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Cette plasticité joue un grand rôle de modulation des réactions enzymatiques, de transport, récepteurs…Elle dépend de la composition de la membrane (cholestérol) mais aussi de la température, de la présence d’alcool, d’anesthésiques. Modèle de Singer et Nicholson “mosaïque fluide”(1972): la membrane est une sorte de solution à deux dimensions, formée de protéines globulaires intrinsèques dispersées dans une matière lipidique fluide. La topographie des protéines est en fait très organisée, selon leur rôle de canal ou de synthèse enzymatique, par exemple dans la connection synaptique.

2.3 Description électrique de la membrane cellulaire Au repos, la différence de potentiel Vint-Vext d’une cellule est de l’ordre de -70 mV; l’épaisseur de la membrane étant faible, le champ électrique transmembranaire est donc très élevé, de l’ordre de 100000 V.cm-1 (ddp 50 mV, épaisseur 5 nm). Lors de la dépolarisation, cette tension s’inverse pour atteindre ~ +30 mV. La membrane permet l’écoulement d’un courant électrique, mais avec une certaine résistance Rm à ce passage. Un circuit électrique équivalent comporte en fait cette résistance Rm, la résistance Ri du milieu cellulaire, et une capacité C puisque les deux couches lipidiques de la membrane se comportent comme les couches isolantes d’un condensateur électrique. Il est important de noter que le déséquilibre de charges induit par cette différence de potentiel est minime, et qu’en termes de concentrations l’électroneutralité est maintenue. Les pompes ioniques qui créent la différence de potentiel électrique transmembranaire assurent le transfert de moins de 0,02 % des charges positives et négatives présentes dans la cellule.

2.4 Sites de passage des molécules: LES DEUX TYPES DE TRANSPORTS La situation est différente selon qu'il s'agit d'un passage à travers la paroi d'un vaisseau, assimilée alors à une membrane, et le passage à travers la membrane cellulaire, bicouche phospholipidique. Parmi les vaisseaux, seuls les capillaires permettent des échanges entre compartiments liquidiens; la paroi des veines et artères est imperméable à l’eau et aux solutés. Il existe ainsi une possibilité de transport à travers l’espace entre les cellules des endothéliums capillaires (et la paroi du capillaire est alors défini comme une membrane), assimilable à des pores dont la taille varie d’un capillaire à l’autre: très faible au niveau cérébral (0,7 nm), plus grande pour le capillaire musculaire (4,5 nm), glomérulaire du rein (5 nm) et pulmonaire (10 nm). Ne passent que les solutés de petite taille (micromoléculaire, sodium, glucose) mais pas les protéines . La membrane, par sa structure de bicouche lipidique est en fait peu perméable aux ions et aux petites molécules; à coté des ces mécanismes fondamentaux “transferts passifs” de Biophysique des transports membranaires

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diffusion, filtration, différence de potentiel, d’autres mécanismes “transports actifs” entrent en jeu et on distingue donc a- TRANSPORTS PASSIFS Le transport passif correspond au passage d’un soluté à travers la membrane de façon spontanée dans le sens du gradient de potentiel chimique ou électrochimique, ∆G < 0. Ce transport peut se faire à travers la partie lipidique ou par l’intermédiaire d’une protéine membranaire. - si le transfert a lieu à travers la bicouche lipidique, on parle de diffusion passive - si le transfert a lieu par l’intermédiaire d’une protéine, on parlera de diffusion facilitée; les protéines impliquées sont soit des transporteurs (solutés) soit des canaux (ions) b- TRANSPORTS ACTIFS Le transport actif correspond au passage d’un soluté à travers la membrane contre son gradient de potentiel chimique ou electrochimique. Ce transport nécessite la fourniture d’énergie et ne peut être spontané (∆G > 0). Le transport du soluté à travers la membrane est couplé à un système fournissant de l’énergie, transformation spontanée fournissant de l’énergie et élément de couplage (pompe). Selon le type de couplage, on parlera de couplage chimio-osmotique, osmo-osmotique, osmo-chimique. Les transports actifs ne seront abordés ici qu'à titre d'introduction aux cours de biologie.

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INTRODUCTION AUX TRANSPORTS: RAPPELS de BIOENERGETIQUE Dans tous les cas de transports, au niveau énergétique, les différents phénomènes mettent en jeu un travail (variation d’enthalpie libre). Le travail W met en jeu le déplacement du point d’application d’un force, c’est une forme ordonnée de l’énergie. La chaleur est une autre forme d’énergie, non ordonée, dûe à l’agitation moléculaire. Une solution est caractérisée au niveau énergétique par son volume, sa température et le nombre de mole de composé qu’elle contient, qui définit la notion de potentiel chimique. 1- Définition de l’enthalpie L’enthalpie H d’un système représente la totalité de l’énergie contenue dans ce système. L’échange de cette énergie avec le milieu extérieur ne peut se faire que sous forme de chaleur ou de travail. La partie de l’enthalpie H qui peut être échangée sous forme de travail avec le milieu extérieur à pression constante s’appelle l’enthalpie libre G. G représente l’énergie potentielle du système, et tout système évolue spontanément vers l’état où son énergie potentielle est minimale. Si G1 est l’enthalpie libre initiale du système et G 2 son enthalpie après une évolution spontanée, alors G 2 3 Osm En toute rigueur, il faut utiliser des concentrations molales et osmolales en mol.kg-1 plutôt que des molarités en mol.l-1; si pour des solutions aqueuses les deux notions peuvent se confondre, c’est moins vrai pour la plasma qui ne contient que 94 % d’eau. Dans tous les cas, l’osmose dépend du type de membrane qui doit être spécifiée, puisque Biophysique des transports membranaires

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c’est elle qui déterminera les espèces qui passent à travers la membrane ou non. Membrane dialysante : perméable à l’eau, aux petits ions et molécules PM < 1000 Membrane semiperméable (ou hémiperméable): strictement perméable à l’eau La membrane du capillaire se rapproche de la membrane dialysante alors que la membrane cellulaire se rapproche de la membrane semiperméable (les transports sont le plus souvent actifs). Une application des lois de l'osmose est le déssalement de l'eau de mer, ou une pression importante va permettre d'inverser le flux d'eau pure. La technique est limitée par les fortes pressions engagées et la difficulté d'obtenir une membrane semiperméable résistante.

4.3 Cas du sang Quelles sont les espèces qui participent à la pression osmotique ? -

HCO3 27 mEq + Divers +

Na 142 mEq

+

++

K , Ca

-

Cl 103 mEq

Urée

Protéines π oncotique

Les protéines ne passent pas les membranes dialysantes et sont donc responsables sur celles-ci d’une pression appelée pression oncotique, qui vaut environ 28 mmHg. L’osmolarité totale du plasma est de 300 à 310 mOsm/l mesurée sur une membrane strictement semiperméable.

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4.4 Isotonicité - Isoosmolarité L’isotonicité≠isoosmolarité: l’isoosmolarité se juge par rapport à une membrane strictement semipérméable, deux solutions sont iso-osmotiques si elles ont la même osmolarité. L’isotonicité est la pression osmotique réelle vis-à-vis des membranes biologiques, qui ne sont pas strictement hémiperméables mais sélectives: ex du globule rouge (et des cellules en général) dont la membrane laisse passer urée, glucose (si une activation insulinique a permis la synthèse de transporteurs),... L’isotonicité n’implique pas forcément la même concentration osmolaire. Exemple sur la membrane de l’hématie: Si l’hématie est plongée dans un milieu hypertonique, le volume de l’hématie diminue, par perte de l’eau interne. Dans un milieu hypotonique: le volume de la cellule augmente, l’hématie peut éclater (hémolyse) quand la pression développée est supérieure à la résistance de la membrane. Ce phénomène apparait vers 150 mOsm.l-1 pour une hématie normale. Conséquence pratique: les solutions injectables doivent être isotoniques, ou être injectées très lentement pour arriver diluées au contact du globule rouge. Dans la maladie de Minkowski-Chauffard (anémie hémolytique), les hématies sont fragilisées et s’hémolysent dès 250 mOsm; à 150 mOsm (seuil d’hémolyse des hématies normales), les globules rouges anormaux sont eux hémolysés à > 50 %.

4.5 Cryoscopie Une autre propriété colligative se retrouve dans le phénomène d’abaissement du point de congélation d’une solution par rapport au solvant pur: à 0°C, un cristal de glace ne fond pas, il est à l’équilibre avec de l’eau pure; mais il fond si on le place dans une solution. Cet abaissement cryoscopique ∆θ est donné par la loi de Raoult, ∆θ = Kc . n n est l’osmolalité totale de tous les solutés (donc le nombre d’unités cinétiques) et Kc est la constante cryoscopique caractéristique du solvant , -1,86 °C.mol-1 pour l’eau. Pour le plasma, on trouve un abaissement cryoscopique de -0,56 °C soit une osmolarité de 0,301 osm.l-1. Dans ce phénomène, c’est l’interface glace-liquide qui joue le rôle de la membrane hémiperméable: l’échange des molécules de solvant entre liquide et solide est déséquilibré par la présence de molécules de soluté, ce qui correspond à un flux net de solvant à travers l’interface glace-eau et fonte du solide. Osmométrie et cryoscopie, de même nature théorique, ont des domaines d’application très différents. L’osmométrie est difficilement utilisable pour des solutions contenant des micromolécules (faible masse moléculaire), car il est pratiquement impossible de trouver des membranes strictement hémiperméables pour ces molécules, et les pressions osmotiques sont énormes. Ces concentrations sont facilement mesurables par l’abaissement de Biophysique des transports membranaires

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température de fusion qu’elle provoquent (et classiquement en pratique c’est la méthode utilisée pour la détermination de la pression osmotique des liquides biologiques tels que plasma et urine). Par exemple, une solution de NaCl 0,1 M à 27 °C développe 498000 Pa, soit une hauteur d’eau équivalente de 50 m. En cryoscopie, on mesurera facilement un abaissement de température de 0,37 °C. L’osmométrie est très utilisée pour les solutions macromoléculaires, où en raison de l’importante masse moléculaire des protéines, la concentration osmolaire est faible.

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5 LES IONS Les ions étant des particules dissoutes chargées seront soumis aux phénomènes de diffusion, de filtration mais également aux forces dûes aux différences de potentiels. 5.1 Mobilité des ions En solution les ions ne sont pas nus, il y a solvatation ou hydratation ionique, les molécules d’eau sont attirées et orientées. H2O ION

L’ion solvaté est un édifice qui se conserve lors des déplacements (diffusion, dialyse, mobilité ionique); le nombre de molécules d’eau de solvatation dépend de la taille de l’ion (ex sodium 8 H2O, potassium 4 H2O) Mobilité ionique: les ions sont accélérés par le champ électrique mais atteignent une vitesse limite due aux frottements dans le milieu

r r v = u.E u est la mobilité ionique (typiquement 100 nm.s-1 dans un champ de 1 V.m-1) et dépend du coefficient de friction f dans le milieu u=

z.e f

5.2 Flux des ions La loi qui régit le transport des ions induit par une différence de potentiel est très similaire à la loi de Fick, puisqu’on a:

Ji = −u.Ci

∆V ∆x

et, comme D=kT/f

Ji = −D

zF ∆V Ci RT ∆x

Le transport total d’ions sous l’influence de la diffusion et d’une ddp est la somme des deux flux, soit

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Jtot = JD + Ji = −D

 ∆C zF ∆V  + C  ∆x RT i ∆x 

5.3 Loi de Nernst et de Goldman La loi de Nernst permet d’obtenir le potentiel d’équilibre pour un ion donné, existant des deux cotés d’une membrane à des concentrations différentes: à l’équilibre, on peut écrire que le travail de concentration

Wc = R.T.Ln

C1 C2

est égal au travail électrique We = z.F (V2-V1) soit

V2 − V1 = −

RT C 2 Ln zF C1

F constante de Faraday (N fois la charge de l’électron), z charge, R Cte des gaz parfaits, T t° absolue. On peut également établir la loi de Nernst à partir des potentiels électrochimiques: à l’équilibre, le potentiel électrochimique de l’ion considéré est identique des deux cotés de le membrane soit ~ ~ µ x 1 = µx 2 en remplaçant le potentiel électrochimique par sa valeur (cf 4.1) µx 1 + zFV1 = µx 2 + zFV2 soit µx 2 - µx 1 = zF(V1-V 2) et comme on a µx =µ0x + RT Ln [C x ] zF(V1-V 2) = RT (Ln [Cx 2]-Ln [Cx 1]) donc RT C 1 V1 − V2 = − .Ln x zF Cx 2 ou encore RT C 2 V2 − V1 = − .Ln x zF Cx 1

D’autre part, la règle d’électroneutralité s’applique: dans chacun des compartiments la somme des charges électriques portées par les ions positifs est égale à la somme des charges électriques portées par les ions négatifs. Biophysique des transports membranaires

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La loi de Nernst exprime la valeur de la différence de potentiel qui apparait à l’équilibre (c’est à dire quand les flux dans les deux sens à travers la membrane sont égaux [voire nuls] pour l’ion considéré) lorsqu’une membrane sépare deux milieux contenant une espèce ionique à des concentrations différentes.C’est encore la ddp qui compense exactement les effets de diffusion liés à un rapport de concentration donné. Si plusieurs ions sont en équilibre , l’égalité est vérifiée pour chacun d’entre eux

RT Na +2 RT Cl−2 V 2 − V1 = − Ln + = Ln − F Na1 F Cl1 Dans le cadre de la cellule, la loi de Nernst explique bien le comportement de l’ion Cl- , est relativement exacte pour K+ mais ne l’est plus du tout pour le Na+ . Une meilleure approche fait entrer en compte les perméabilités membranaires qui sont différentes pour les ions qui nous intéressent: PK>PCl >>>PNa On applique la loi de Goldman qui permet de rendre compte la majorité des résultats expérimentaux:

RT PNa .Na 1+ + PK .K+1 +P Cl.Cl −2 V1 − V2 = − Ln F PNa .Na +2 + PK .K+2 +P Cl.Cl1− P est le coefficient de perméabilité de la membrane pour l’ion considéré, avec au repos PNa/PK=0,04 et PCl /PK=0,45. Lorsque la membrane est excitée, PNa/PK devient 500 fois plus élevé (P Na/PK=20) alors que PCl /PK ne change pas. Dans le cas de la cellule, l’explication exacte des mouvements d’ions prend en compte les autres mécanismes qui entrent en jeu tels que les pompes ioniques; le fonctionnement de celles-ci crée une ddp stable et donc un état stationnaire où la concentration des ions demeure constante dans chaque compartiment. Cette ddp est dûe à un léger déséquilibre des charges et contrôle les flux ioniques ultérieurs de diffusion et de gradient electrique, pour obtenir un flux net nul. On a alors un état stationnaire (dû à des phénomènes actifs) et non plus d’équilibre (passif).

Conclusion: expression générale des flux (passifs) Le flux de substance J pour une espèce chimique donnée à travers une surface dépend du gradient de concentration, du gradient de pression et du gradient de potentiel: J = −D.

∆P z.F ∆Ψ   ∆C v + .C. + .C.  ∆x RT ∆x RT ∆x 

J flux, D coefficient de diffusion, c concentration, R cte gaz parfaits, T température absolue, x distance, v volume partiel, P pression, z charge, F cte de Faraday, Ψ potentiel. Le flux de substance J est la résultante des forces de concentration, de pression et de potentiel électrique. Biophysique des transports membranaires

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6- APPLICATION: Equilibre de Donnan (Equilibre de membrane) Cet équilibre se retrouve lorsque dans un compartiment une protéine (ou macromolécule) chargée ne peut pas diffuser vers un autre compartiment; c’est le cas des protéines à l’intérieur d’une cellule ou d’un capillaire par rapport à l’espace intersticiel. Pour l’ expliquer, on peut considérer 3 cas de plus en plus complexes, dans deux compartiments séparés par une membrane dialysante: 1/ Petits ions diffusibles Electroneutralité (ddp anions=ddp cations) égalité de concentration ddp nulle pas de π osmotique 2/ Petits ions diffusibles, macromolécule neutre Electroneutralité égalité de concentration ddp nulle π osmotique due à la macromolécule 3/ Petits ions diffusibles, macromolécule chargée: EQUILIBRE DE DONNAN Electroneutralité inégalité de concentration ddp non nulle π osmotique due à la macromolécule chargée + excès d’ions de signe contraire attirés Exemple: NaCl des deux cotés, protéine RNa z du coté 1 La macromolécule du coté 1 RNaz se dissocie en Rz- et zNa+ L’électroneutralité de chacun des cotés s’écrit [Rz-]1 + [Cl -]1 = [Na+ ]1 &

[Cl-]2 = [Na+ ]2

Il y a donc une inégalité de concentration en ions diffusibles des deux cotés, d’où une différence de potentiel; la loi de Nernst décrit le potentiel d’équilibre pour chacun des ions

RT Na + 2 RT Cl− 1 V2 − V1 = − Ln = Ln − zF Na + 1 zF Cl 2 ce qui permet d’obtenir la relation de Donnan, [Cl-]1 . [Na+ ]1= [Cl-]2 . [Na+ ]2 ou encore, en introduisant r, rapport de Donnan

Na2+ Cl1− = =r Na1+ Cl2− Biophysique des transports membranaires

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On peut écrire aussi d’après les équations précédentes [Cl-]1 < [Cl-]2 = [Na+ ]2 < [Na+ ]1 L’ion non diffusible [Rz-]1 repousse les ions de même signe et attire les ions de signe opposé, soit r < 1; l’ion non diffusible [Rz-]1 impose à son compartiment un potentiel de même signe que sa charge. r vaut 1 si la concentration de macro-ion est nulle ou si on travaille au pH isoélectrique de la protéine. Les conséquences de cet équilibre, qui peut se généraliser pour les nombreux ions et protéines du vivant, sont: • Un excès d’ions diffusibles du coté d’une protéine chargée qui ne diffuse pas: la protéine chargée repousse les ions de même signe et attire les ions de signe opposé, le total des petits ions du coté de la protéine est supérieur au total des ions de l’autre coté. • création d’une ddp puisqu’il y a inégalité de concentration ionique: par exemple dans la cellule, création d’une ddp ~-10 mV) • La concentration globale est plus grande du coté de la protéine; il se développe donc une pression osmotique plus importante que prévue par la concentration en macro-molécule, appelée pression oncotique, très importante dans les échanges capillaires (phénomène de Starling). Phénomène de Starling La pression de Starling provoque un appel d’eau du milieu interstitiel (pauvre en protéines) vers le plasma à travers l’endothélium des capillaires:

Artériole

Veinule

Glucose H2O,O2

π

Lactate H20, CO2

Pv π

Pa

La membrane du capillaire peut être considérée comme dyalisante, elle permet un passage d’eau et de petites molécules. Dans le milieu intersticiel, le contenu en protéine est très faible et la pression osmotique est due en majorité aux protéines du plasma (y compris le Biophysique des transports membranaires

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phénomène de Donnan, vide supra ), π= 28 mmHg. Il existe d’autre part une différence de pression entre le milieu intersticiel et la lumière du capillaire, dûe essentiellement à la pression sanguine. Celle-ci diminue de l’artériole à la veinule du fait de la perte d’énergie dans le capillaire (cf hémodynamique). Au pôle artériel de l’anse capillaire la pression artérielle (32 mmHg) est toujours supérieure à la pression oncotique dûe aux protéines du plasma (28 mmHg) et permet une sortie de l’eau et des petites molécules vers l’intersticium. Au pôle veineux, la pression veineuse n’est plus que de 12 mmHg, donc inférieure à la pression oncotiquece qui permet la resorbtion des métabolites. A l’état normal, les deux flux sont équivalents et il n’y a pas d’accumulation de fuide dans les tissus, c’est l’équilibre de Starling. On peut expliquer (approximativement) la formation d’œdèmes (surcharge hydrique du tissu intersticiel) si: - P veineuse augmente, suite à une insuffisance cardiaque - π oncotique diminue, par baisse de la protidémie (principalement albumine) en cas de malnutrition, syndrôme néphrotique (protéinurie), hépatite (synthèse protéique diminuée).

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TRANSPORTS ACTIFS Les mécanismes de diffusion, de filtration sont des mécanismes relativement lents et surtout peu spécifiques; des protéines membranaires spécialisées vont permettre des transports de molécules neutres, d’ions ou des interactions (réponse à un stimulus élecrique ou chimique) beaucoup plus rapides et spécifiques, à l’aide de couplages énergétiques. Un couplage energétique associe une transformation spontanée (une molécule diffusant d’un endroit à haute concentration vers un endroit à basse concentration, une charge positive se déplace dans le sens des potentiels électriques décroissants, une réaction chimique...) à une seconde transformation non spontanée, utilisant le travail libéré par la première pour stimuler la seconde. On peut ainsi trouver: - une réaction chimique spontanée (ATP > ADP + Pi, transfert d’électrons...) permettant le transport actif d’ions ou de solutés, couplage chimio-osmotique - un transport spontané d’un soluté (ion le plus souvent), couplé à une réaction chimique non spontanée, couplage osmo-chimique - un transport spontané de soluté couplé à un second transport non spontané, couplage osmo-osmotique Ces couplages sont assurés au niveau des membranes de la cellule, des mitochondries par des complexes protéiques. Couplage chimio-osmotique: Certaines protéines membranaires sont capables de coupler une réaction chimique energétique (hydrolyse ATP, oxydoréduction) à un transport actif non spontané d’ions variés (H+ , Na+ ,K+ ,Ca++ …). Si le fonctionnement de ces pompes ioniques s’accompagne d’une création de charges, on parle de pompes electrogènes (ex ATPase Na+ /K+ , qui transfère 3 Na+ pour 2 K+ ). Si les charges sont conservées on parle de pompes électroneutres (ex ATPase gastrique H+ /K+ ) Au niveau de la mitochondrie, l’énergie nécessaire pour les différents travaux cellulaires est obtenue à partir de l’oxydation des combustibles cellulaires, glucose par exemple: C 6H12 O 6 + 6 O 2 6 CO 2 + 6 H 2O, ∆G°= -2880 J.mol -1 Dans les conditions physiologiques, l’oxydation du glucose se fait sans participation d’oxygène, les accepteurs d’électrons sont des coenzymes sous forme oxydée NAD+ et FAD qui se transformeront en coenzymes réduits NADH et FADH2; ce sont ces coenzymes réducteurs qui seront donneurs d’électrons à l’oxygène moléculaire, transfert catalysé par la chaine membranaire de transfert d’élecrtrons de la membrane interne de la mitochondrie (dans le cas des membranes photosynthétiques, le donneur initial d’électrons sera un chromophore (chlorophylle) excité par une absorption de lumière). Le transfert des protons en dehors de la mitochondrie permet les couplages osmochimiques décrits ci-dessous.

Biophysique des transports membranaires

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Dans la cellule, le rôle de l’ATPase Na+ /K+ est multiple: conservation d’un faible taux intracellulaire de sodium, régulation du volume intracellulaire, formation d’une différence de potentiel électrique transmembranaire permettant le potentiel d’action des cellules excitables, formation d’une ddp électrochimique de sodium permettant des transports actifs de solutés par couplages osmo-osmotiques. Couplage osmo-chimique: Réalisé par des protéines de la membrane mitochondriale, ce couplage utilise le travail fourni par la diffusion spontanée du proton qui retourne de l’extérieur vers l’intérieur (secondaire à un couplage chimioosmotique entre une oxydoréduction spontanée et un transport actif vers l’extérieur du H+ ) pour réaliser la synthèse d’ATP à partir d’ADP et de Pi. En moyenne, le retour de trois protons est nécessaire pour créer un ATP. Ce mécanisme est responsable de la synthèse de la majeure partie de l’ATP cellulaire chez les eucaryotes, synthèse qui atteint 50 à 75 kg d’ATP/jour. Couplage osmo-osmotique D’autres protéines permettent une diffusion facilitée couplée à un transport actif d’autre molécule: la protéine membranaire (= transporteur) reconnait deux solutés, un ion “moteur” et un soluté. On a un co-transport si les deux solutés vont dans le même sens, un contretransport dans le cas contraire. Ce mécanisme complexe permet une accumulation de solutés (sucres, acides aminés, nucléotides...) au delà des valeurs de la concentration externe, ce qui ne serait pas possible dans les cas de diffusion simple ou de transport passif. Un exemple type est le système D-glucose/Na + des membranes de cellules intestinales, qui couple la diffusion facilitée du Na+ (de l’extérieur vers l’intérieur) au transport actif secondaire du glucose. On connait aussi des translocases ADP/ATP mitochondriales.

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EXTERIEUR

S

Na+

Na+

K+

Na+

H+

ADP ATP Na+

MEMBRANE CELLULAIRE

Na+ K+ Na+

S

H+

CYTOPLASME COUPLAGE OSMO-CHIMIQUE H+ S

H+ ATP ADP

H+

S

H+

ADP H+

H2A+1/2 O2 GLYCOLYSE KREBS (Photosynthese)

ATP ADP

COUPLAGE CHIMIO-OSMOTIQUE COUPLAGE OSMO-OSMOTIQUE

A + H2O H+

MITOCHONDRIE

Références Biochimie et biophysique des membranes; aspects structuraux et fonctionnels, E. Shechter, Masson Ed, 1990 Phénomènes de transport en biologie, A. Syrota, Ed Paris sud, 1990 Biophysique PCEM, Grémy, Ed Flammarion Médecine

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