1-2.-PROTOZOARIOS

SESION PRACTICA Nº 1 TEMA:

ESTUDIO DE PROTOZOARIOS DE VIDA LIBRE

SESION PRACTICA Nº 2 TEMA: ESTUDIO DE PROTOZOARIOS PARASITOS INTRODUCCION

La palabra "Protozoo" significa etimológicamente "primeros animales" o "animales primitivos". Constituyen un grupo heterogéneo formado por aproximadamente 50000 organismos unicelulares que poseen organelos celulares típicos (eucarióticos) rodeados por una membrana. Puesto que casi todos son móviles y muchos de ellos son heterotróficos, hasta hace algún tiempo se consideraba que este grupo era sólo un Phylum dentro del Reino Animalia: el Phylum Protozoa. En la actualidad se sabe que el grupo está formado por varios phyla unicelulares diferentes, los cuales, junto con la mayor parte de los phyla de algas, pertenecen al Reino Protista. Los Protozoarios como organismos han evolucionado a nivel celular, alcanzando diferenciación protoplasmática y por lo tanto su complejidad se manifiesta en el número y naturaleza de organitos y organelos. Forman un grupo de organismos microscópicos unicelulares, con una gran diversidad en complejidad,

tamaño y comportamiento. Siendo el cuerpo de los Protozoarios formado por una sola célula, manifiesta todas las características inherentes a la materia viviente y por lo tanto realiza las funciones propias de un animal superior. El nivel de organización unicelular es la única característica descriptiva unificadora de los protozoarios, pues en todos los demás aspectos exhiben una diversidad extrema. Además, entre éstos se observan todos los tipos de simetría, una amplia gama de grados de complejidad estructural, y adaptaciones para la vida en todo tipo de ambientes. Como organismos, los protozoarios se han conservado en el nivel unicelular, aunque han evolucionado a lo largo de muchas líneas por especialización de partes del protoplasma (organelos) o de la estructura esquelética. Existen protozoarios donde quiera que haya humedad: en el mar, en todo tipo de aguas dulces y en el suelo; hay especies comensales, mutualistas y muchas parásitas. La locomoción la realizan mediante flagelos, cilios y seudópodos. Su nutrición puede ser

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holozoica, holofítica y saprozoica. Se reproducen sexual y asexualmente. Unos son solitarios y otros coloniales. Aunque casi todos viven como individuos solitarios, existen muchas formas coloniales. Algunas de éstas, como las especies de Volvox, tienen tal grado de interdependencia celular que se aproximan a un verdadero nivel estructural pluricelular. Las especies coloniales o solitarias pueden ser móviles o sésiles. En el estudio de los Protozoarios se utilizan determinadas técnicas microscópicas, estas son: exámenes en fresco, que nos permiten observar la forma, locomoción y otras

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actitudes y reacciones; con colorantes vitales que permiten ampliar las observaciones hacia algunos procesos intracelulares, así como permiten la observación del movimiento ciliar y flagelar; por último las técnicas de fijación y montaje temporal y permanente, en las que se utilizan diversas técnicas de coloración que posibilitan el conocimiento de toda la organización celular de los Protozoarios, haciendo resaltar aquellos caracteres que nos interesan. Para las técnicas en las que se utilizan colorantes existen toda una gama de ellos, de esta manera su empleo permite teñir diversas estructuras, tales como: núcleo, cilios, flagelos, mitocondrias y otras estructuras citoplasmáticas.

COLECTA Y CONSERVACION La colecta de protozoarios en general ofrece pocas dificultades, ya que habitan en casi cualquier tipo de agua; pero la búsqueda de un determinado grupo o especie es difícil y depende del conocimiento de su hábitat y hábitos. Son múltiples los factores que pueden determinar que en cierto lugar habite una determinada población de protozoarios. Los Rizópodos están tipificados por la presencia de seudópodos. Estos son extensiones no permanentes del cuerpo que funcionan como órganos de locomoción y alimentación. La forma de los seudópodos varia considerablemente: pueden ser salientes redondeados (lobopodios), como en la conocida Amoeba o estructuras filamentosas largas y finas

(filopodios), y en ciertas especies, los seudópodos poseen túbulos axiales (axopodios). La diversidad de los Protozoos Rizópodos en las subdivisiones que presenta el grupo. Amoebinos comprende organismos desnudos, normalmente con lobopodios; los Testáceos y los Foraminíferos poseen una concha externa consistente, o testa, y seudópodos de tipo Rizópodo o filopodios; los Heliozoos carecen de testa externa, pero sus seudópodos presentan ejes rígidos (axopodios); y los Radiolarios tienen una cápsula silícea interna que proporciona soporte esquelético al cuerpo, a la vez que exhiben numerosos seudopodios filamentosos. La testa puede ser una

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estructura débil formada por la adherencia de partículas orgánicas o inorgánicas en la superficie del organismo, como ocurre en muchos Testáceos, o bien puede consistir en una sólida concha constituida por material orgánico o inorgánico que inpone al organismo una forma rígida. Las testas calcáreas de algunos Foraminíferos y las conchas silíceas de muchos Radiolarios presentan una enorme complejidad arquitectónica y son de gran belleza. Los Mastigóforos comprenden aquellos Protozoos comunmente denominados "Flagelados". Todos ellos poseen uno o más flagelos, que utilizan principalmente para la locomoción, aunque también contribuyen en la alimentación. El Grupo se subdivide en dos: Fitomastiginos y los Zoomastiginos. Los primeros se caracterizan por la presencia de un pigmento fotosintético, la clorofila, y normalmente poseen uno o dos flagelos. En cambio, los zoomastiginos no tienen clorofila, dependiendo del medio extreno para obtener partículas alimenticias. Además los zoomastiginos pueden poseer muchos flagelos, algunos de los cuales forman órganos más complejos. Entre los fitomastiginos más conocidos figuran Euglena y Chlamydomonas, solitarios; el colonial Volvox y los dinoflagelados Ceratium y Noctiluca. Los organismos patógenos del género Trypanosoma, de gran importancia médica pertenecen a los

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Zoomastiginos. Los Protozoos flagelados se encuentran en todos los tipos de hábitat, ya sea en el mar, en las aguas dulces o en el suelo. Pueden ser de vida libre, solitarios o coloniales, y también parásitos. Los Esporozoos son exclusivamente endozoicos, es decir, todos ellos viven en la cavidad corporal o en los tejidos de un animal hospedador. Los miembros del grupo tienen ciclos vitales complejos, y reciben su nombre del proceso de formación de esporas (esporogonia) que forma parte del ciclo vital. En la mayoria de los Esporozoos dicho ciclo incluye un estado intracelular, con muchas especies de importancia médica.

Los Ciliados, como indica su nombre, se caracterizan por la presencia de cilios en la superficie corporal. Esta condición es patente en los conocidos Paramecium y Tetrahymena, cuyo cuerpo está cubierto por "una capa de finos cabellos". La forma corporal es muy variable, así como la disposición de los cilios, que pueden aparecer modificados como orgánulos complejos. Como ocurre con los Flagelados, los Ciliados son muy comunes y se encuentran en todo tipo de hábitats. Muchos son de vida libre, pero hay formas unidas al substrato por un pedúnculo y formas parásitas.

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Ciliados, flagelados y rizópodos se pueden encontrar en cualquier muestra de agua, aunque algunos grupos se desarrollan en condiciones particulares. Así, por ejemplo, en la superficie de los estanques y de los lagos o de los arroyos de aguas tranquilas, y a profundidades que pueden variar desde la superficie hasta 30 cm, existen la mayor parte de los flagelados con clorofila, tales como, Euglena. Este género habita en aguas dulces, donde la vegetación flotante y las superficies espumosas casi siempre delatan su presencia. En estos sitios, la colecta se hace desplazando por la superficie del agua un frasco de boca ancha. Se recomienda usar redes de plancton de 200 millas por pulgada cuadrada para colectar Euglenas, tomando muestras entre 25 a 60 cm de profundidad, además de las muestras superficiales y del fondo. Muchas especies de rizópodos, entre ellas las amibas o géneros como Arcella, Pelomyxa y Difflugia se encuentran en las aguas estancadas obscuras o sombreadas. Se desplazan sobre los fondos lodosos cubiertos de vegetación muerta o de materia orgánica en descomposición. El material colectado debe ponerse en frascos limpios y llevarse al laboratorio. Los Protozoarios marinos abundan también en gran cantidad y casi todos comprenden especies cuya distribución es muy amplia. Se pueden encontrar a cualquier profundidad. Para colectar muestras representativas, se necesita usar redes finas o redes de plancton. Los Rizópodos del grupo de los Foraminíferos y Radiolarios abundan en casi todos los mares y sus

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caparazones llegan a acumularse por millones en el fondo de algunas áreas marinas. Se puede obtener Foraminíferos vivos en las coralinas y otras algas marinas, tanto extrayéndolos con ayuda de una lente como utilizando un filtro grueso unido a una malla de seda. El filtro debe sumergirse en agua de mar y sobre él se colocan algunos puñados de algas, etc. La malla de seda atrapará los organismos que atraviesen el filtro. Se puede poner también fango o arena fina del fondo del mar en recipientes con agua de mar y agitar. Los Foraminíferos se hundirán hacia el fondo, y las partículas más ligeras se arrastran con el agua. Los caparazones de Foraminíferos se pueden colectar fácilmente con la arena fina depositada por la espuma de las olas que desaparecen suavemente sobre las playas extensas. Esta arenilla, después de secada, se observa en el laboratorio bajo un microscopio de disección. Los pequeños caparazones se aíslan con el pincel fino o con agujas de disección, y se pegan sobre preparaciones o sobre cartones negros diseñados especialmente para eso. Grandes áreas de fondo oceánico son ricas en conchas calcáreas de Foraminíferos muertos. El "barro" de Globigerina, que cubre aproximadamente ciento treinta millones de kilómetros cuadrados del suelo del océano, está formado casi por completo de estas conchas. Se pueden secar y filtrar dragados procedentes de estas áreas, colocando los filtrados más finos en recipientes con agua que se procede a agitar. Las conchas más delicadas flotarán, pudiendo ser recogidas, mientras que las más pesadas se

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hunden y pueden secarse tras extraer el agua. Muchas especies de Radiolarios viven en, o cerca de, la superficie del mar, donde a veces son muy numerosas. Pueden recogerse mediante una red de arrastre o en un simple frasco de agua marina. Las conchas silíceas de los Radiolarios muertos caen al fondo y forman el "barro de los Radiolarios", que cubre un área de más de cinco millones de kilómetros cuadrados. Este depósito se encuentra típicamente en aguas muy profundas de las regiones tropicales de los Océanos Indico y Pacífico. Se pueden recoger de igual forma que los Foraminíferos, por dragado, y secarse de forma similar. Las muestras de protozoarios marinos se pueden fijar mezclándolas con alcohol isopropílico de 95%. Este alcohol se puede agregar al agua que contengan los protozoarios, siempre que su volumen sea reducido o los protozoarios se hayan concentrado dentro de una área pequeña. Al fijar muestras con Foraminíferos o Radiolarios, se puede agregar un poco de rosa de bengala (un gramo de colorante seco por un litro de agua destilada), para colorear los protoplasmas de los protozoarios vivos. Entre los talos de las aguas marinas se encuentran algunos protozoarios que habitan estos sitios. Colecte las algas y lávelas en un frasco con agua del medio. Las redes y los tamices de mallas finas pueden utilizarse para concentrar los protozoarios en limitados volúmenes de agua. También se pueden matar y concentrar, agregando gota a gota a las muestras de protozoarios una cantidad pequeña de formol neutro al

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3%, hasta que mueran los protozoarios y se depositen en el fondo. En seguida, el agua se decanta dejando sólo una pequeña cantidad del fondo junto con el material sedimentado. Este puede fijarse y dejarse en alcohol de 70%. Algunas especies de protozoarios parásitos se pueden colectar con facilidad en los órganos internos de sus huéspedes. La cavidad oral y braquial de los vertebrados puede albergar Amibas. El tubo digestivo de casi todos los vertebrados y de muchos invertebrados es rico en protozoarios. En la cloaca de las ranas es frecuente encontrar varias especies. La sangre de los vertebrados terrestres también puede presentar protozoarios del grupo de los Esporozoarios (Gregarínidos, Coccidios y Hemosporidios ). En las "termitas" hay Fitomastiginos simbiontes que les ayudan a transformar la celulosa de la que se alimentan. Más de un 50% de algunas "cucarachas" como, por ejemplo, Blatta orientalis, Blatella germanica y Periplaneta americana, tienen en su intestino protozoarios del género Gregarina. Muchas especies de Amibas ocupan sitios semejantes. Las vesículas seminales de la "lombriz de tierra" presentan, casi invariablemente, protozoarios del género Monocystis. En cualquiera de los casos citados, los protozoarios se pueden observar vivos, poniéndolos en soluciones isotónicas, o bien, pueden hacerse frotis, teñidos con colorantes vitales como rojo neutro o azul de metileno en soluciones diluidas ( por ejemplo al 1/1000 ). Los frotis de

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sangre pueden teñirse con Giemsa para poder observar los parásitos. En general para su conservación, los especímenes vivos deben colocarse primero en alcohol al 70 - 90 %. También pueden ponerse

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directamente en una solución de formol neutro al 3 - 5 %. Si se está recolectando especímenes para un posterior exámen citológico, debe consultarse literatura especializada en técnicas de fijación.

FIJACION Entre los fijadores más recomendables están los de Schaudin, Goldschmidt, Boui y Guilson. El material fijado en estos líquidos se puede usar para elaborar preparaciones fijas. Los flagelados, como Euglena, se pueden fijar con el líquido de Noland, que produce la muerte instantánea del protozoario y permite la observación clara del flagelo. Para fijar y montar temporalmente algunos protozoarios, agregue una gota de una solución de verde de metilo en ácido acético al 1% a una gota de cultivo de protozoarios. Este colorante fija y tiñe de verde los núcleos. Los cultivados

ciliados o flagelados también se pueden

observar en montajes temporales siguiendo el método de Noland: Solución de Noland: - Solución saturada de fenol en agua destilada............................... 80 cc. - Formol al 40% (comercial)............ 20 cc. - Glicerol.......................................... 4 cc. - Violeta de genciana....................... 20 mg.

Se debe mezclar al colorante con un poco de agua, antes de agregar los otros ingredientes. No debe quedar fenol en suspención. Agregue a una gota del cultivo de protozoarios, una gota de la mezcla. Los cilios y flagelos se tiñen claramente. Este es un método útil para el estudio de ciliados que poseen cirros.

DIVISION SISTEMATICA Clasificación elemental de los Protozoarios: Los Protozoarios se dividen en varias Clases en atención a la naturaleza de los órganos locomotores que poseen, los cuales faltan en el caso de aquellos que están habituados a la vida parasitaria. Las cuatro Clases generalmente admitidas son: Phylum Protozoa Clase I.

Rhizopoda. Protozoarios provistos de seudópodos.

A. Morales H.; E. Bocardo D. 7 Ejemplos: Amoeba, Endamoeba, Actinophrys, Globigerina, Thalassicola.

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Clase II.

Mastigophora. Protozoarios dotados de flagelos. Ejemplos: Trypanosoma, Giardia, Codosiga, Euglena.

Clase III.

Sporozoaria. Protozoarios parásitos, que durante sus fases evolutivas pueden tener seudópodos o flagelos que desaparecen en su fase definitiva, se reproducen por esporulación. Ejemplos: Monocystis, Isospora, Plasmodium, Nosema.

Clase IV. Infusoria. Protozoarios revestidos de cilios o pestañas vibrátiles, cuando menos en sus fases juveniles. Ejemplos: Paramecium, Colpoda, Vorticella,Stentor, Acineta, Podophrya.

Despues de la presentación de la clasificación elemental de los Protozoarios se hace referencia a una clasificación más actualizada: Phylum Protozoa I. Subphylum Plasmodroma o Cytomorpha 1. Clase Mastigophora o Flagellata Subclase Phytomastigia Orden Chrysomonadida Orden Cryptomonadida Orden Dinoflagellida Orden Euglenoidida Orden Chloromonadida Orden Phytomonadida Subclase Zoomastigia Orden Protomonadida Orden Polymastigida Orden Trichomonadida Orden Hypermastigida Orden Rhyzomastigida 2. Clase Sarcodina o Rhizopoda Subclase Actinopoda Orden Heliozoida Orden Radiolarida Subclase Rhyzopoda Orden Proteomyxida OrdenMycetozoida

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8 Orden Amoebida Orden Testacida Orden Foraminiferida

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3. Clase Sporozoa Orden Gregarinidae Orden Coccidida Orden Haplosporida Orden Haemosporida 4. Clase Cnidosporida Orden Myxosporida Orden Actinomyxida Orden Microsporida Orden Helicosporida

II. Subphylum Ciliophora 1. Clase Ciliata o Infusoria Subclase Holotricha Orden Gymnostomatida Orden Trichostomatida Orden Chonotrichida Orden Apostomatida Orden Astomatida Orden Hymenostomatida OrdenThygmotrichida Subclase Spirotricha Orden Heterotrichida Orden Oligotrichida Orden Tintinnida Orden Entodiniomorpha Orden Odontostomatida Orden Hypotrichida Subclase Peritricha Orden Peritrichida 2. Clase Suctoria o Acineta Orden Suctorida En la actualidad se presenta la siguiente clasificación, la cual debe conocerse y utilizarse para un mejor entendimiento del grupo de los Protozoarios: Subreino Protozoa I. Phylum Sarcomastigophora

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1. Subphylum Mastigophora Clase Phytomastigophora Orden Chrysomonadida Orden Silicoflagellida Orden Coccolithophorida Orden Heterochlorida Orden Cryptomonadida Orden Dinoflagellida Orden Ebriida Orden Euglenida Orden Chloromonadida Orden Volvocida Clase Zoomastigophora Orden Choanoflagellida Orden Rhizomastigida Orden Kinetoplastida Orden Retortamonadida Orden Diplomonadida Orden Oxymonadida Orden Trichomonadida Orden Hypermastigida Superclase Opalinata 2. Subphylum Sarcodina Superclase Rhizopoda Clase Lobosa Subclase Gymnamoeba Orden Amoebida Orden Schizopyrenida Orden Pelobiontida Subclase Testacealobosa Orden Arcellinida o Testacida Clase Filosa Orden Aconchulinida Orden Testaceafilosida Clase Granulorreticulosa Orden Foraminiferida Superclase Actinopoda Clase Acantharia Clase Polycystina Clase Phaeodaria Clase Heliozoa II. Phylum Apicomplexa Clase Sporozoa Subclase Gregarinia Subclase Coccidia Clase Piroplasmea

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III. Phylum Microspora IV. Phylum Ciliophora Clase Kinetofragminophora Subclase Gymnostomata Subclase Vestibulifera Subclase Hypostomata Subclase Suctoria Clase Oligohymenophora Subclase Hymenostomata Subclase Peritricha Clase Polyhymenophora Subclase Spirotricha Orden Heterotrichida Orden Odontostomatida Orden Oligotrichida Orden Hiopotrichida

OBJETIVOS  1. Reconocer e identificar los protozoarios de vida libre más comunes de nuestra región.  2. Identificar las principales estructuras y características de los diversos grupos taxonómicos de protozoarios de vida libre observados.  3. Reconocer y diferenciar los protozoarios parásitos.  4. Reconocer y determinar la función de las principales estructuras externas e internas de los protozoarios parásitos.  5. Conocer el ciclo biológico o vital de los principales protozoarios parásitos.

MATERIAL MATERIAL DE LABORATORIO: - Microscopio - Lámina porta-objetos - Laminillas cubre-objetos - Láminas escabadas - Vaselina

COLORANTES VITALES: - Pardo de Bismark - Rojo Congo - Verde Jano - Verde de metilo - Azul de metileno

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- Algodón - Glicerina - Palillos de madera

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- Lugol - Rojo neutro

MATERIAL BIOLOGICO: - Muestras diversas de aguas con protozoarios. - Cultivos de protozoarios. - Láminas con preparaciones permanentes coloreadas y sin colorear de protozoarios de vida libre y parásitos.

METODOLOGIA I. OBSERVACION DE PROTOZOARIOS DE VIDA LIBRE Con el material necesario y las muestras de agua con protozoos proceder según las técnicas de observación siguientes: 1. TECNICAS DE OBSERVACION: 1. 1.EXAMEN DIRECTO: Este examen permite la observación de los protozoos vivos, su morfología, locomoción, reacciones, etc., durante la observación se requiere de enfocar adecuadamente y diafragmar convenientemente. Con una lámina portaobjetos y una laminilla cubreobjetos proceda a preparar y montar una muestra de agua estancada o una gota de cultivo. Observar al microscopio con mayor y menor aumento. Si al observar la muestra se nota demasiada movilidad en los especímenes, agregue a la preparación unas fibras de algodón (puede también utilizarse gelatina, goma arábiga, glicerina, etc.) para que de esta manera se pueda realizar una mejor observación. Si la muestra es muy pobre, y contiene pocos individuos, se puede consentrar los protozoos, para el caso se utiliza la filtración rápida e incompleta a través de un paño (tela o papel filtro) el residuo de la filtración debe ser vaciado rápidamente en un recipiente adecuado, antes de que se complete la filtración; puede también utilizarse la centrifugación a bajas velocidades. 1.2. OBSERVACION EN CAMARA HUMEDA: A fin de que la pequeña gota de líquido que se examina no se concentre o deseque durante la observación, no se recurre al sencillo sistema de poner la gota entre porta y cubre-objeto, sino que se la encierra en un pequeño recinto situado entre ellos, que permite, además, entretener la vida de los protozoos durante algún tiempo. Esto se consigue de tres modos diferentes: 1.2.1. Cámara de Gota Pendiente:

A. Morales H.; E. Bocardo D. 12 Para esta técnica se requiere de un porta-objetos especial, en cuya parte central tiene una excavación o concavidad de poca profundidad (porta-objetos excavado o lámina excavada). En la laminilla cubre-objetos bien limpio proceda a colocar en cada ángulo un punto de vaselina, esta puede ser colocada con la ayuda de un palillo de madera (mondadientes o fósforo); en la parte central de la laminilla coloque una gota de las muestras de agua a observar, luego adhiera la lámina portaobjetos a la laminilla de manera tal que la excavación coincida con la gota del medio de cultivo; realizado esto invierta y observe al microscopio con menor y mayor aumento. De ser conveniente se puede sellar los bordes con vaselina.

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1.2.2. Cámara Húmeda de Ranvier: Con la técnica de la gota pendiente, el espesor de la capa líquida que se examina no es uniforme; esto hace que la observación a grandes aumentos venga perturbada por los fenómenos de reflexión y refracción de los rayos luminosos al atravesar la parte inferior de la gota. Para obviar este inconveniente y conseguir una capa líquida de igual espesor, con sus superficies límites paralelas, se recurre a otros métodos, entre los cuales el más utilizado es el de Ranvier. La cámara de Ranvier consiste en un porta-objetos, de bastante grosor, que tiene excavado en su parte central un canal circular, rodeando una plataforma de unos 15 o 20 mm. de diámetro y cuya superficie queda 0.1 mm. más baja que el resto del porta. Depositando la gota que se quiere examinar sobre esta plataforma y tapando con un cubre-objeto, éste la extiende en una capa uniforme entre dos caras paralelas cayendo al canal circundante el exceso de líquido que hubiese, y quedando así una capa líquida de igual espesor entre cubre y la plataforma, y una pequeña cantidad de aire encerrada en el canal, suficiente para mantener alg+un tiempo la vida de los protozoos, aunque no lo bastante para que la preparación se seque. 1.2.3. Cámara Húmeda de Tieghem: Para esta técnica se utiliza una lámina porta-objeto corriente en la que se forma una celda usando un anillo de vidrio que se adhiere mediante el uso de vaselina, lanolina, bálsamo, etc. Se coloca unas gotas de agua en el fondo para conservar la humedad, se unta el borde superior del anillo con vaselina sólida; se pone la gota de la muestra en el cubre-objeto, se coloca el porta sobre el cubre, se invierte rápidamente, debe hacerse ligera presión para que se obtenga una buena adherencia y la cámara quede completamente sellada. 1.3.OBSERVACION CON COLORANTES VITALES: Procedimiento intermedio entre el examen en fresco y las técnicas de coloración después de la fijación. El uso de colorantes vitales tiene por objeto teñir algunos elementos celulares de los protozoos, de manera que las hagan fácilmente visibles, sin causar modificaciones intensas que puedan alterarlos o matarlos.

A. Morales H.; E. Bocardo D. 13 Los colorantes vitales son de naturaleza ácida o básica, en soluciones muy diluidas son poco tóxicos. Entre los colorantes vitales más usados tenemos a los siguientes: - Rojo neutro. - Azul pirrol. - Azul de metileno. - Verde Jano. - Tinta china. - Azul de tripan. - Rojo congo. - Amarillo anilina - Pardo de Bismark. - Verde de metilo. - Carmín latinado. - Cristal violeta. ZOOLOGIA DE INVERTEBRADOS - 2009

Se puede utilizar dos metodologías en la presente preparación: método de dilución o el método del secado. En el de dilución la preparación se realiza de la siguiente manera: en una lámina porta-objetos colocar una gota del medio a observar, luego directamente agregar una gota del colorante vital (el colorante debe estar en la dilución correcta para evitar matar a los protozoos), colocar una laminilla cubre-objetos y observar con menor y mayor aumento. En el método del secado la preparación se realiza de la siguiente manera: en una lámina porta-objetos colocar una gota del colorante vital, expandir la gota y dejar secar, luego de esto agregar sobre el secado una gota de la muestra a observar, colocar una laminilla cubre-objetos y observar al microscopio con menor y mayor aumento. En ambos casos el colorante debe estar en la dilución correcta para evitar matar a los protozoarios. Al agregar los colorantes vitales en solución, en primer lugar verifique la difusión del colorante para luego observar la reacción del protozoo frente al colorante y la acción del colorante sobre las diversas estructuras internas y externas del protozoo. Explique las reacciones, describa la coloración de las estructuras correspondientes y verifique la función de los colorantes. 1.4. OBSERVACION EN COLORACIONES SUPRAVITALES: Las coloraciones supravitales son aquellas que se realizan sobre el material simplemente desecado y no fijado, esta técnica es frecuente en el examen de protozoos y en los frotis de sangre. Los colorantes más usados para el caso son: el azul de metileno al 1/500 y el azul de toluidina fenicado. Azul de toluidina fenicado: - Azul de toluidina............................... 0.5 g - Acido fénico..................................... 3.0 g - Alcohol etílico de 95º........................10.0 cc - Agua destilada.................................90.0 cc Las preparaciones así obtenidas son muy interesantes, pues en ellas los protozoos simplemente secos no han sufrido alteración por los reactivos fijadores y los caracteres morfológicos se han conservado muy bien. 1.5. PREPARACIONES TEMPORALES: Para el caso se utiliza el líquido de Noland y el verde de metilo en solución al 1% en ácido acético (solución de verde de metilo en ácido acético al 1%).

A. Morales H.; E. Bocardo D. 14 La preparación se realiza de la siguiente manera: en una lámina pota-objetos coloque una gota de la muestra y agregue una gota del líquido de Noland o una gota de solución de verde de metilo; cubra con una laminilla cubre-objeto y realice la observación con menor y mayor aumento. ZOOLOGIA DE INVERTEBRADOS - 2009

Líquido de Noland: - Solución saturada de fenol en agua destilada................................... 80.0 cc - Formol al 40%.................................... 20.0 cc - Glicerol............................................... 4.0 cc - Violeta de Genciana............................ 20.0 mg 1.6. PREPARACIONES PERMANENTES: Para el caso se requiere que el material de la muestra sea previamente fijado, la fijación puede ser realizada sobre la muestra contenida en un porta-objeto, o en un pequeño volumen de la muestra. Luego de la fijación se procede a la coloración. 1.6.1. Fijadores: - Fijadores Físicos: calor, frio. - Fijadores Químicos: simples, compuestos. 1.6.2. Coloraciones: - Hematoxilina - Eritrocina - Orange G. - Hematoxilina Férrica de Heidenhain. - Impregnación Argéntica. - Shorr. - Giemsa. - Leisshmann - Hemalumbre de Mayer. - Hematoxilina - Método A. Para mayores detalles consultar la bibliografía especializada. 2. OBSERVACION DE FLAGELADOS: Realizando las preparaciones que considere necesarias, proceda a observar y reconocer los protozoarios flagelados más comunes, identificar los organelos constituyentes, rotular los gráficos y ubicarlos sistemáticamente.

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3. OBSERVACION DE CILIADOS: Proceda a preparar y observar muestras de ciliados, diferencie los diversos organelos, rotule los grafico y ubique sistemáticamente lo observado.

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4. OBSERVACION DE SARCODINOS (RIZOPODOS) Con las muestras y/o los medios de cultivo realice las preparaciones que correspondan y observe al microscopio con menor y mayor aumento. Rotule los gráficos y ubique sistemáticamente lo observado.

5. OBSERVACION DE LAMINAS CON PREPARACIONES PERMANENTES:

A. Morales H.; E. Bocardo D. 19 Se proporcionará el referido material para su conveniente observación con menor y mayor aumento. ZOOLOGIA DE INVERTEBRADOS - 2009

En cada una de las observaciones realice el estudio de: - Extremo anterior y posterior - Presencia de citostoma, citofaringe, citopigio. - Ectoplasma y endoplasma, características. - Núcleos: macronúcleo y micronúcleo - Vacuolas: alimenticias, contráctiles - Otras observaciones de importancia De acuerdo a sus observaciones realizadas con las diferentes técnicas, ubique en el grupo taxonómico correspondiente al protozoario observado en las diferentes muestras. Esquematice y rotule cada una de sus observaciones.

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2. OBSERVACION DE PROTOZOARIOS PARASITOS Utilizando los objetivos de mayor aumento e inmersión, observe al microscopio las láminas permanentes identificando y ubicándolos sistemáticamente cada uno de los especímenes. Reconozca sus diferentes estructuras, así como las características de su hábitat. Haga esquemas rotulando e identificando sus observaciones. Además de los gráficos adjuntos.

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CUESTIONARIO 1. ¿Cuales son los factores o condiciones ambientales que influyen en el desarrollo de los protozoarios dulceacuícolas? Los factores que influyen en el desarrollo de los protozoos dulceacuícolas son:  pH: En aguas altamente ácidas predominan los protozoos que presentan testas. En aguas altamente alcalinas predominan los géneros Acantochystis, Hyalobryon, etc. En agua estancada la zona profunda es ácida debido a la descomposición de materia; mientras que la zona superficial es alcalina debido a plantas que realizan el proceso de la fotosíntesis ya que consumen CO2.  Luz solar: Es muy importante para los protozoos que realizan fotosíntesis como es el caso de los fitomastigóforos y también para los protozoos que dependen de estos como principal fuente de alimento.  Temperatura: Los protozoos de vida libre soportan una temperatura máxima entre 30 y 40 ºC. La temperatura óptima se encuentra entre 16 y 25 ºC. No obstante, en estado de quiste soportan mayores cambios de temperatura.  Cantidad de alimento: Es un factor muy importante que define la proliferación de las especies que se van a encontrar en el hábitat.

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 Composición del agua. 2. ¿Por qué los protozoarios no pueden alcanzar grandes tamaños? Debido a que están constituidos por una sola célula. Además se divide antes de alcanzar grandes tamaños. 3. Caracterice los tipos de seudópodos.  Lobopodios: Son anchos y con los extremos redondeados formados por ectoplasma y endoplasma. Lo tienen las amebas típicas.

 Filopodios: Lo presentan las amebas pequeñas. Son finos cortos y ramificados. Constituidos de ectoplasma.

 Reticulopodios: Son filiformes que contienes microtúbulos axiales. Presente en foraminíferos.

A. Morales H.; E. Bocardo D. 23  Axopodios: Son aciculares que irradian de la superficie del cuerpo. Tiene una varilla axial central cubierta por un citoplasma móvil y adhesivo. Presente en heliozoos y radiolarios.

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4. Esquematice y caracterice la estructura de un flagelo. Presentan una vaina membranosa externa y una médula fibrosa interna denominada axonema. Este axonema está formado por microtúbulos: 2 sencillos centrales y rodeados en círculo por nueve microtúbulos dobles. Estos contienen la enzima dineína que permite que el axonema se doble. Los flagelos se originan en un cuerpo basal semejante al axonema pero sin los microtúbulos centrales y con tripletes de microtúbulos.

5. Diferencie cilios y cirros.  Cilios: Son apéndices cortos, en forma de pelos, tubulares constituida por microtúbulos que permiten la locomoción libre de los ciliados.

A. Morales H.; E. Bocardo D. 24  Cirros: Son cilios fusionados. Se ubican en la superficie ventral del cuerpo. Se presentan en penachos.

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6. En que consiste el aparato neuromotor de los ciliados. Está formado por cuerpos basales ciliares o cinetosomas, situados por debajo del nivel de la superficie celular y asociado con fibrillas que corren en varias direcciones algunas de las cuales están unidas a un corpúsculo (motorium) próximo a la citofaringe. Los cinetosomas y las fibrillas constituyen un sistema fibrilar, probablemente destinado a coordinar la acción de los cilios. 7. Caracterice el hábitat de los protozoos cataróbicos, oligosapróbicos, mesosapróbicos, polisapróbicos y coprozoicos.  Catárobicos: Manantiales, arroyos o estanques cuya agua es rica en oxigeno, pero comparativamente libre de materia orgánica. 

Oligosapróbicos: Aguas ricas en materia mineral, pero en las cuales no se realizan procesos de purificación.



Mesosapróbicos: Aguas en las cuales se realiza una oxidación activa y una descomposición de la materia orgánica. La mayoría de los protozoos de agua dulce viven en este tipo de hábitats.



Polisapróbicos: Aguas que contienen una cantidad muy pequeña de oxigeno y son ricas en acido carbónico gaseoso y en productos de descomposición nitrogenada, debido a la preponderancia de los procesos de reducción y división de la materia orgánica.

 Coprozoicos: Aguas ricas de materia orgánica en descomposición. Estos protozoos se encuentran frecuentemente en una suspensión de materia fecal de varios animales. 8. Describa las técnicas de coloración más importantes y/o usadas para la preparación de las muestras permanentes.  Hematoxilina Férrica de Heidenhain: Esta tinción es útil para demostrar la cromatina nuclear y las inclusiones citoplasmáticas de quistes de protozoarios. 

Impregnación Argéntica: Este método se fundamenta en la formación de depósitos opacos intracelulares de cromato argéntico, producto de la reacción entre el bicromato de potasio y el nitrato de plata (reacción negra).



Giemsa: La técnica radica en la disociación controlada de las sales de eosinato que ocurre al insolubilizar la mezcla del giemsa por disolución en H2O destilada; la eosina así liberada colorea el componente extracelular y determinadas extructuras acidófilas; y los derivados de azur, las estructuras de carácter basófilo. La cromatina nuclear adopta una tinción azul violeta.

A. Morales H.; E. Bocardo D. 25  Tinción de Ticromo: Para teñir protozoarios, recomendable especialmente para identificar características de quistes y trofozoitos como las amebas.

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9. ¿En que se basa el uso de los colorantes vitales? Se basan en la naturaleza ácida o básica del colorante que pueden teñir el citoplasma o el núcleo respectivamente. Su objeto es teñir las estructuras celulares de los protozoos de manera que las haga fácilmente visibles sin causar modificaciones que puedan alterarlos o matarlos. 10. Refiera las relaciones filogenéticas de los protozoos. Existen grupos de protistas que son más cercanos a los hongos, como por ejemplo el filo Microsporidia. Por otro lado, existen phyla de protistas que según los botánicos deben ser considerados plantas, como las algas verdes (Clorophyta). Las algas verdes contienen los mismos tipos de pigmentos, secuencias de ADN ribosomal de la subunidad pequeña del ribosoma idénticas a las secuencias de musgos y otras plantas inferiores. Las amebas grandes y sin mitocondrias (como Amoeba, Chaos, Pelomyxa, etc) son mucho más antiguas y muy distintas de otros grupos de amebas y deben separarse de estas. Los protozoarios del grupo del Phylum Choanoflagellata son muy cercanos a los animales, y son un grupo hermano de las esponjas. Los flagelados están presentes en varios grupos muy distintos entre sí. Los ciliados y protozoarios del grupo Apicomplexa (parásitos muy importantes de animales y del ser humano) así como los Dinoflagelados forman otro grupo y están relacionados entre sí. Las euglenas (protozoos fotosintéticos) y los Trypanosomas (grupo de los Kinetoplástidos, parásitos importantes como por ejemplo el que produce el mal de chagas) están relacionados cercanamente. Basados en los últimos descubrimientos en protozoología se puede hablar de que existen al menos 5 grandes grupos o super grupos de protozoarios:  Los “Excavata” que incluyen a varios flagelados como las euglenas, tripanosomas, el género Giardia (un parásito intestinal anaeróbico flagelado), el género Trichomonas y otros relacionados.  Los “Rhizaria” que incluye a amebas comunes como los radiolarios, foraminíferos y relacionados menos conocidos.  Los “Unikontes” son amebas y algunos flagelados de un solo flagelo. En este grupo también están los más cercanos a los animales (Coanoflagelados), grupos cercanos a los hongos (Microsporidia), amebas antiguas sin mitocondrias como el género Amoeba, Chaos, Pelomyxa, otras amebas como la parasítica Entamoeba, amebas coloniales como el Dyctiostelium y otros relacionados. El grupo de los “Chromalveolados” que incluye a los “alveolados” (dinoflagelados, los Apicomplexa, los ciliados).  Finalmente el grupo de los protozoos que en realidad son plantas, es decir pertenecen al reino Plantae: algas verdes (Chlorophyta).

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11. Caracterice las estructuras adicionales que presentan los flagelos de los protozoos parásitos. Los cinetoplástidos tripanosómicos son parásitos del digestivo de insectos y parásitos sanguíneos de los vertebrados. Solamente presentan el flagelo anterior, mientras que el segundo falgelo está representado por el cuerpo basal. Por lo común, el flagelo es posterior y esta conecatdo a los lados del cuerpo por una membrana ondulante. 12. Refiera la acción parasitaria de los ciliados. El género Balantidium se encuentra en el intestino de crustáceos, insectos, peces, anfibios y mamíferos. La única especie que afecta al hombre es Balantidium coli. Es el parásito más grande que infecta humanos. Es común en zonas tropicales, pero también está presente en climas templados. Tiene efecto y epidemiología similar a Entamoeba histolytica. Aparentemente es un parásito primario de cerdos, que se ha adaptado a otros huéspedes. Tiene quiste y trofozoitos, que cuando están vivos se ven amarillos o verdosos: 

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Trofozoitos: Son oblongos o esféricos, miden entre 30-150 μm por 25-120 μm, son la etapa parasítica, están rodeado por cilios y muestran un movimiento constante, se mueven hacia el frente con una dirección fija.

Quiste: Son ovoides o esféricos, miden entre 40-60 μm, son la etapa de transmisión, están preparados para sobrevivir en el medio ambiente, carecen de cilios. Poseen un macronúcleo en forma de salchicha y un micronúcleo que es mucho más pequeño. Normalmente los trofozoitos viven en el intestino grueso alimentándose de bacterias y células. La condición puede variar desde asintomática o hasta producir

A. Morales H.; E. Bocardo D. 27 diarrea. Algunas veces los organismos producen enzimas proteolíticas que digieren la mucosa epitelial y la destruyen. Usualmente se producen úlceras en forma de frasco, igual que en las úlceras amébicas. A consecuencias de las úlceras se producen infiltrados linfocíticos, hemorragias e infecciones bacterianas secundarias. Puede ocurrir una disentería fulminante que resulta en necrosis y desprendimiento de la mucosa, perforación del intestino grueso o apéndice y finalmente muerte. Rara vez hay migración a lugares extraintestinales como hígado o pulmón. También se han reportado infecciones en órganos genitales, vagina, útero y vejiga. Los trofozoitos se multiplican por fisión transversa. El paso de las heces hacia la parte posterior del recto estimula el enquistamiento, pero también puede ocurrir luego de salir al medio ambiente. En el medio ambiente los trofozoitos pueden sobrevivir hasta 10 días, y es posible que inicien infección si son ingeridos, aunque esto es poco probable. Los quistes pueden sobrevivir varias semanas en heces. La infección se inicia cuando los quistes son ingeridos, usualmente en agua o alimentos contaminados. Los parásitos son destruidos por un pH