01 - Citologija i Histologija

BIOLOGIJA ĆELIJE Termin citologija je relativno zastareo, danas je uobičajnije da se kaže BIOLOGIJA ĆELIJE. Ova grana, disciplina biologije polazi od premise da se u nešto/neku organizaciju može verovati nakon viđenja (”Seeing is Believing”); odnosno, struktura se mora videti da bi se objasnila njena funkcija. Kratak pregled istorije mikroskopije Ljudi su jako rano shvatili da u prirodi postoje neke stvari koje mogu da pomognu poboljšanju viđenja, odnosno da se slabost našeg oka, koja se sastoji u ograničenju da vidite u neku dubinu, dužinu, daljinu ili kada približite predmet, može savladati nekakvim pomoćnim sredstvom. Naime, ljudi su jako rano shvatili da gledajući kroz nekakav providan sud, stakleni, napunjen vodom, dolaze do uveličanja objekta koji žele da posmatraju. To ih je podstaklo da razmisle šta je to što uveličava, pa su uvideli da je to uveličavajuće svojstvo zapravo kompozicija tog suda i vode koja se u njemu nalazi. Iz prirode su znali da postoje nekakvi prirodni, gorski kristali (providni), koji kada se približe oku pojačavaju/povećavaju sliku, naročito relativno sitnih objekata iz prirode. Smatra se da su Kinezi bili prvi koji su koristili gorske kristale da bi svojim carevima pravili naočari, jer je poznato da su njihove dinastije patile od miopije. Dalje u istoriji ljudske civilizacije, zabeleženo je da je, npr. u Rimu, Neron voleo da koristi smaragdne kristale da bi posmatrao uvećane prizore borbi gladijatora u areni. Ali, suštinski za razvoj citologije, ma koliko to banalno danas izgledalo, zapravo je zaslužna astronomija ili astrologija u vreme kada se sve na kugli zemaljskoj objašnjavalo više voljom bogova, voljom nebesa, konstelacijom zvezda, ljudi su želeli da više prouče to nešto što je bilo van njih; dakle, njihove oči su bile uperene ka nebu/vasioni, tako da su, zapravo, prva uveličavajuća stakla, odnosno prve aparature koje su izrađene da bi se dobio uveličani lik objekta, zapravo bili teleskopi! prva imena-braća Jansen, Hans i Zakarias (slika ). Oni su iskoristili jednu cev u koju su umetnuli brušeno staklo, jer se tada staklo već bilo sve više u upotrebi, i primetili su da takva jedina sprava dovodi do formiranja uveličanog lika.,tj. do boljeg posmatranja objekta. Nakon toga, počela se slika revertirati, odnosno ljudi su sve više počeli da se zanimaju za svet oko sebe, da vide strukturu onoga što se nalazi oko njih pa i u njima/nama samima. Tada, može se reći, nastala je citologija i tadašnji citolozi mogli su se s pravom nazvati anatomima, odnosno, morfolozima citolozima. U istoriji citologije postoje tri imena, tri objavljena rada, koja su, zapravo, kamen temeljac za ovakvu biologiju ćelije kakvu je mi danas poznajemo. Prvo imena tom spisku jeste Marčelo Malpigi. On je 1660. godine koristeći mikroskop (v.sl. )(u to doba se reč ”mikroskop” pojavila) da bi istraživao cirkulatorni sistem, odnosno krvni sistem životinja i čoveka. M.Malpigi je bio zasužan što je pronašao kariku koja je nedostajala cirkulatornoj teoriji krvnog sistema koju je postulirao Vilijem Harvi, englesko kraljevski lekar; koja je u to doba bila neka vrsta jeresi, jer se radeći dobre anatomske i morfološke studije V.Harvi vrlo pravilno zaključio da u krvnom sistemu životinja, pa i čoveka, postoji jedno centralno anatomsko mesto. To je srce, pumpa koja pumpa krv kroz zatvoreni sistem krvnih sdova, što je značilo da ta krv kruži našim telom, odnosno telom životinja. S obzirom da je u to doba vladalo Galenovo mišljenje o otvorenom krvnom sistemu, što je značilo da se krv stvara u crevima iz hrane, zatim se krvnim sudovima koji su bili uočljivi šalje do jetre, zatim iz jetre u srce, a srce je tu bilo samo pumpa koja je slala tu hranu koja se u krvi nalazila do svih ostalih tkiva i ćelija da bi ih tkiva trošila. Znači, V.Harvi se potpuno usprotivio takvoj vrsti hipoteze

1

ili teorije i za to doba to je zaista bilo strašno. Spasila ga je reputacija kraljevskog lekara. Šta je to što se nedostajalo da se Harvijeva teorija prihvati kao ispravna? Harvi je kao dobar anatom video srce, aortu, plućne arterije, sve veće krvne sudove-arterije, vene,arteriole, venule ali ono što je njegovom oku nedostajalo bili su najsitniji, najmanji delovi krvnog sistema – kapilari. Dijametar kapilara je mikrometarski: 7-10 mm. Bez upotrebe mikroskopa V.Harvi nije mogao da dokaže da je njegova teorija tačna. Nažalost-tri godine nakon njegove smrti, M.Malpigi je, gledajući pod mikroskopom, našao tu kariku koja nedostaje, dokazao je da kapilari postoje, odnosno da je Harvijeva teorija o zatvorenom krvnom sistemu potpuno ispravna. Sledeće bitno ime jeste Robert Huk, ima jako malo njegovih fotografija na slici br. je zapravo vitraž iz crkve u kojoj je sahranjen. R.Huk je bio sjajan mehaničar, Oksfordski đak; na Oksfordu je R.Bojlu pomagao u njegovim eksperimentima sa gasom. Ono što je R.Huka nateralo da iskoristi mikroskop kao spravu za uveličavanje predmeta nije bilo to što je želeo da otkrije i vidi ćelije. On je dobio zadatak da otkrije zašto je pluta svetla, lagana, elastična i pliva po vodi, dakle, njegov zadatak je bio da otkrije kakva su to strukturna svojstva plute koja joj omogućavau tako divne fizičke osobine. Robert Huk je isekao plutu žiletom ili skalpelom na vrlo tanke preseke (v.sl. ), stavio je pod mikroskop i dobio sliku strukture po tipu saća. Video je veliki broj peto- i šestougaonih komora. One su bile prazne, zato izgledaju ovako crno, ali je vrlo jasno video njihovu strukturu zbog prisustva zidova. S obzirom da su ga te strukture podsetile na manastirske kelije/ćelije, on je nazvao najmanju jedinicu ove organizacije ćelijom. I, vidite paradoksa, posmatrajući mrtvo tkivo biljke, Robert Huk je i ne znajući, jednoj mrtvoj strukturi dao naziv danas jedne izuzetno žive i dinamične jedinice u organizaciji živog sistema. Fasciniran onim što je video, R.Huk objavljuje mikrografiju, publikuje jedno od svojih čuvenih dela (Sl. ) – to je ”Mikrografija malenih/delikatnih telašaca napravljenih uveličavajućim staklima”. Sledeće ime koje je možda najzaslužnije za povećanje rezolucije mikroskopa, odnosno poboljšanja vidne moći putem mikroskopa, jeste čovek koji nikakve veze nije imao s naukom, on je bio trgovac tkaninama. To je Antoni Van Levenhuk. On se iz čistog amaterizma, zainteresovan malo pre pomenutim Hukovim delom, krenuo da interesuje za te ”igračke” – mikroskope i zaživi svet oko sebe. Putujući po Italiji i posmatrajući kako rade stakloduvači, došao je na ideju, zaista genijalnu da iskoristi osobinu da kada dolazi do pravljenja staklene posude, stakloduvač na kraju one cevi dobije jedan vrlo tanak stakleni mehur i on je shvatio da taj stakleni mehur ima izuzetno tanke, savijene zidove koji bi mogli da mu omoguće da napravi mikroskop i poboljša njegovu rezoluciju. Zašto da poboljša rezoluciju mikroskopa? Zato što, kako je naše oko nesavršeno, s obzirom da je naše uveličavajuće staklo u oku zapravo sočivo, pa isti način i sočiva u mikroskopu pokazuju limit uveličanja. Možete povećati broj sočiva u mikroskopu, da ih brusite tako da su lučno savijena, ali ćete jednog trenutka dosegnuti moć razdvajanja dve tačke u prostoru koje posmatrate tim sočivom. Mikroskop Roberta Huka mogao je jasno da razdvoji dve tačke na rastojanju od 2 mikrometra. A van Levenhuk uspeo je da staklenim balončićima dosegne rezoluciju od 0,2 mm. To je, praktično, rezulucija kojom mi danas baratamo i svi mikroskopi, svetlosni, vama dostupni sada, tokom studiranja, zapravo imaju tu rezoluciju. Sva naknadna poboljšanja ticala su se sfernih, hromatskih aberacija, kako se ne bi dobijala obojena slikaspektar ili zamućeni krajevi onoga što se posmatra, tako da su se sve snage koncentrisale na korekciju takvog tipa aberacija. A. van Levenhuk ne samo što je napravio ovakvu vrstu mikroskopa (V.Sl. )(*Posmatrati takvu vrstu mikroskopa bilo je veoma naporno, jer se morao jako biti primaknut oku), već se posmatrajući svet oko sebe, uzimajući suze, pljuvačku, spermu, baricu i stavljajući ih pod ovakav mikroskop, ovaj trgovac, ponavljam, uspeo da napravi crteže toga što je video koji su do te mere savršeni da ni mi danas, posmatrajući te iste strukture i ćelije ne bi smo mogli da napravimo detaljniju strukturnu

2

analizu. A.Vanh. dopisivao se sa Engleskim Kraljevskim Društvom, objavio je više radova, publikacija kojima je prikazao divnim crtežima sve one strukture/ćelije koje je video: protozoe, ćelije krvi, spermatozoide, bakterije. Sve nakon toga, vodi nas tehnološkom napretku, stvaranju kompanija (fabrika, zanatskih radnji, u ono vreme), npr. fabrika Karla Cajsa u Nemačkoj. Cajs je bio čuveni proizvođač uveličavajućih stakala: teleskopa, lupa, mikroskopa. On je angažovao najčuvenija imena fizike, mehanike toga doba, npr. Ernest Abe, ne bi li poradili na tim aberacijama sfere i boje i da bi se dobila što kvalitetnija slika. Poboljšavši na taj način mogućnost da posmatrate mikroskopske/mikronske strukture sada dobijate u naučnoj javnosti čitavu plejadu ljudi koji se samo time bave. Znači, od citologa koje je bio anatom i morfolog prešli smo put citologa koji je mikroskopičar i sada imamo citologa koji je preparator i mikroskoptičar, jer da bi ste mogli da posmatrate pod mikroskopom tkiva, organe, ćelije, morate ih preparirati, obojiti i tek tada doći do nekih slika. U to vreme počinju da se izoluju tzv. ”kovarske knjige citologije” ili recepture kako fiksirati tkiva, kako sprečiti njihovo raspadanje kada ih već uzmete iz životinje, kako naseći što tanji preparat, čime da ih obojite, pa su, naravno, u prvo vreme korišćene prirodne boje kao što su: indigo, karmin, teraktora, tako da na sl. imate navedene godine i imena ljudi koji su prvi put publikovali da postoji nekakva organizacija, struktura žive materije, živih organizama, njihovih organa i tkiva, možete videti da je prva organela uočena i opisana bio zapravo nukleus, kao najkrupnija organela u ćeliji; zatim, u okviru nukleusa, poboljšanjem bojenih metoda vrlo jasno je bio uočljiv nukleolus. Nakon toga Tiodor Švan opisuje veći broj ćelija, pokazuje da ustrojstvo ćelija, odnosno, organizacija tkiva ili organa kod biljaka i životinja uopšte nisu iste. Zatim, 1849. se opisuje mitoza kao vid nastanka ćelija, mitohondrije u mišićnim ćelijama i sve to, sva ta narastajuća otkrića i opisi dovode do formiranja 2 jako važna mišljenja za bilogiju ćelije: Čuveni Nemački histolog i histopatolog-Rudolf Virhov ”omnis cellula a cellula”- svaka ćelija nastaje iz prethodno postojeće, novo stvaranje ćelije, već samo iz postojećih,deobom, nastaju nove. Mi smo, dakle, došli do definicije ćelije da je to protoplazma sa nukleusom – dobili smo definiciju 2 najbitnija kompartmenta u organizaciji ćelije: Citoplazmu i nukleus. Sve to ”nateralo” je, da ako kažemo, Šlajdena i Švana da postuliraju svoju funkciju jedinica svih bića, i to važi do dana današnjeg. XIX vek bio je posvećen glavnim otkrićima unutrašnje organizacije tkvia, otkrića ćelije kao osnovne jedinice, pa čak i nekih ogranela unutar ćelije. XX vek doneo nam je tzv. ”zlatno doba” citologije jer je tada načinjen tehnološki i tehnički skok, radom hiljada naučnika, došlo se do tačno određenih i propisanih procedura koje ste mogli pratiti, na taj način preparirati tkivo, posmatrati ga pod mikroskopom i otkrivati strukturu različitih celija. Pomislite samo na ono mnoštvo živog sveta, živih organizama koji nas okružuju i svako se polako i mukotrpno bavio istraživawem strukture i funkcionisanja tih organizama putem studiranja mikroskopom. Dakle, citolog je krenuo intenzivno da mikroskopira. Sva ova saznanja iz XIX i s početka XX veka rezultirala su u prvoj shematskoj predstavi ćelije koju e 1925.g. dao čuveni ćelijski biolog Vilson (v.Sl.) Na šemi je ćelija ustrojena kao entitet postojanjem membrane koja je okružuje. Membrana okružuje jednu tečnu unutrašnjost koja se naziva protoplazma i u kojoj, kako je Vilson tada pisao, ”plivaju organele”; nukleus-na shemi detaljno nacrtana struktura: vidimo hromatin i nukleolus, doduše, nepravilno nacrtan, kao da ima membranu. Osim nukleusa, uočljive su vezikule i interesantno, uočljive su 2 tamne tačke blizu nukleusa, nekada ovijene tankim omotačem koje su nazvate centrom ćelije ili centrozom. Danas znamo da je to par centriola. To je bilo vreme, kada se polovinom ili prvoj trećini XX veka ponovo dostigao plato, zasićenje u istraživanju ćelije putem mikroskopa, koji se koristio prirodno ili veštačko svetlo,

3

svetlo lampe. Morao je ponovo da se desi tehnološki i tehnički pomak ne bi li se saznanja o ćeliji proširila. Taj pomak počeo je da se dešava nešto pre i tokom II svetskog rata kada se u Nemačkoj, koja se prvo intenzivno pripremala za rat, a zatim i ušla u rat, mnogo radilo na stvaranju atomske bombe i stvaranju tipa mikroskopa koji je nazvan elektronski. Pred kraj II Svetskog rata, sva ta saznanja i prototipovi el.mikr.proširene su do Amerikanaca. Nakon toga rata, Amerikanci su celokupne prototipove i sve naučne ekipe koje su na tome radile preselili u Njujork, pa sadašnji Roufever Institut a tadašnji Univerzitet. Te ekipe su imale zadatak da konstruišu operabilan EM. Uporedo sa konstruisanjem EM-opa koji je trebalo da umesto dnevne i veštačke svetlosti koje definitivno pokazuju nedostatak zbog nemogućnosti potpunog fokusa na preparat, niti imaju moć probojnosti kroz preparat dovoljno da razluče nešto više od 02 mikrometra. Bilo je potrebno, dakle, razviti mikroskop koji će da koristi snop elektrona ubrzan magnetnim poljem i taj snop elektrona mogao je jako brzo da prolazi kroz preparat i da daje rezoluciju od 20 nm odnosno od 2 nm. Vidite do koje se mere rezolucija poboljšala kroz vreme. Dakle, sada smo mogli da vidimo dve tačke na udaljenosti od 20 pa onda od 2 nm. Uporedo se konstrukcijom takvog tipa mikroskopa, moralo se razmisliti kako sada preparirati tkiva da bi ste mogli da posmatrate pod takvim tipom mikroskopa, jer koliko god da su snopovi e-čisti po svojoj materijalnoj prirodi, koliko god da su ubrzani ipak nemaju toliko ubrzanja/prodornost da mogu da prođu kroz preparat debeo 5 mikrometra. A svi preparati koji se danas seku za SMiju su debljine 5 mikrometra; Morao se naći način da se posmatra nešto tanje od toga inače bi ste ponovo dobijali mutnu sliku. To se nije baš najbolje odvijalo, pa su ekipe koje su radile na preparatima za EM-iju odustale od preparacije tkiva i krenule sa razvijanjem jedne tada potpuno nove oblasti biologije, a to je gajenje ćelija u kulturi. Oni su probali da odvoje ćelije u kulturi, a to su bili fleroblasti jer s se oni polazali kao najotpornije, najbolje gajene ćelije i da probaju da ih tako razvuku da dobiju jako tanke delove ćelije koje mogu da stave EM-op i da posmatraju kako ta ćelija izgleda pod mikroskopom. Ti mukotrpni radovi rezultirali su u objavljivanju jedne elektron-mikrografije ćelije ”Žrnalu eksperimentalne medicine” 1345. godine, dakle, Amerikanci su požurili da prisvoje slavu ovih rezultata, i ova su 3 čoveka zaslužna podjednako za dobijanje slike: Portret, Lord i Fulam i one će kasnije, 1974. Ako se ne vara, dobiti Nobelovu nagradu. Model koji ovde vidimo na slici , prva E-M-ija, načinjena je na fibroblastu vidi se: unutrašnje strukture ćelije, jasno se vidi nukleus, mitoh.. i delimično se, čak, nazire citoskelet. Ovo je, kako je Porter rekao na dodeli Nobelove nagrade potpuno nov svet, otkrovenje za njih, oni su se osećali kao da su ušli u kuću svog postanja i krenuli da popisuju inventar. Možete pretpostaviti da su se od 50-ih godina do kraja XX veka ponovo čitave plejade naučnika preusmeravaju – svi koji su radili SM-iju sada sve od početka kreću; pravljenje preparata, fiksiranje, kalupljenje, sečenje, stavljanje u EM-op, ne bi li se što pre/bolje istražile sve strukture unutar ćelije. Tu se dolazi do zapanjujućih otkrića da ćelijska membrana ima svoj kontrapunkt u celiji u vidu jako dobro razvijenog endomembranskog sistema, odnosno, sve one organele ispostavljene membranama, sve one organele koje su supramolekulski kompleksi u citoplazmi, nukleusu, rezultirano u stvaranju ponovo, prve sheme ćelije, ali gledano pod EM-om. I sada, odjednom, vidite sve ono što se zvalo protoplazmom, jer ćelija se do tada smatrala vrećicom enzima, a zapravo predstavlja jako dobru struktuiranost i membransku organizaciju unutar citoplazme, u vidu membranskih organela. To je otvorilo jedan potpuno nov put u biologiji ćelije i možemo reći da do devedesetih godina prošlog veka, praktično svi živi organizmi, tkiva, organi bili proučeni na nivou EM-opa i saznali smo njihovu ultrastrukturu. Dakle, čitav listing ćelijskih organela, kako izgledaju, gde se nalaze, kako nastaju i šta se u njima dešava tokom F-onih promena u ćeliji. Možemo reći da je kraj XX veka, samo vidite koliko je brzo dosegnut plato u zasićenju rezolucije i o tome šta sada da radi ćelijski biolog – IMA:SM, fluorescentnim, konfokalne,invertne, visokovoltažne. EM-

4

ope,atomske mikroskope (kada su citolozi mislili da je tu njihov kraj, da mogu da se prebace na, tada, ekskluzivnu oblast molekularnu biologiju) dolazimo do novog milenijuma, odnosno do povratka svih tipova mikroskopa u biologiju ćelije na potpuno nov nacin i zato veliki proizvođač ”Leika” može da reklamira svoje mikroskope kao nešto što se fokusira u novi milenijum (Sl. ). Šta u novom milenijumu znače mikroskopi? Sada možemo koristiti brojne metode citologije da bi smo se spustili na nivo molekula u ćeliji i da bi smo mogli da ih zaista pratimo. Sada sve više i više, razvojem nanotehnologije, ulaganjem ogromnih svota novca u razvoj nanomikroskopa kojima ćemo moći da vidimo nukleotide u DNK molekulu. Znači, može se postići mnogo toga. Možemo studirati citoskelet – citoskelet se može najbolje studirati fluorescentnom mikroskopijom – fluoroforama obeležavamo elemente citoskeleta. Možemo birati boju kojom želimo da obojimo, npr.aktinske filamente-žuta,pin,,ljubičasta,crvena. Mogu se obeležiti pojedinačne organele u ćeliji-nukleus,Goldži, lizozome, citoskelet i da ih pratimo kroz vreme i prostor; Kako se ponašaju kada se ćelija deli, umire, kada se ćelija da natera da produkuje proteine kada se ta njena funkcija ugasi itd. Šta dalje možete? Pošli smo od slike četkastih hromozoma oocite žabe koja daje utisak 2 niti paralelno postavljene sa dugačkim petljama, po čemu se i dobio naziv, fluorescentnim mikroskopom kada obeležite, možete videti strukutru, veličinu petlji i konačno, možete kada specifično obojite/odvojite/molekul DNK od RNK da na ovakvom tipu hromozoma studirate proces transkripcije (plavo-mol.DNK, crveno-mol iRNK) zatim, možete studirati kretanje ćelija, onkogene promene ćelija, da utvrdite pojedinačne bolesti koje targetuju organele i šta je to što možete da učinite da te promene ili poništite ili da ih sprečite, što je, najčešće, pokretačka snaga u svim istraživanjima-klinička aplikacija.Danas imate mogućnost da posmatrate npr. Ca2+ jone nakon aktivacije određenih ćelija. (Slika ) ćelije koje pod diferencijalnim mikroskopom ovako izgledaju – jedro, naziru se 2 nukleolusa, te iste ćelije se mogu kroz specifične filtre posmatrati kroz koncentraciju određenih jona (npr. Ca2+joni-crveno). Posledica influksa Ca 2+ je aktivacija ćelije. Može se pratiti preraspodela tog jona između organela, citoplazme, EPR ili mitohondrija. Postoji softver kojim se 2 slike mogu spojiti u prostoru, u 2D ili 3D prikazu. Moderniji mikroskopi koji će koristiti nanotehnologiju (slike prototipa ovog mikroskopa – sl. ) moći će da poboljšaju rezoluciju tzv. atomskih mikroskopa, pa ćete moći na parčencetu ćelijske membrane ili bilo koje membrane da studirate organizaciju jonskih kanala ili receptora ili da obeležite inserira deo u molekul DNK tokom genetičkog inženjeringa kada želite da postignete transformaciju i da u prostoru i vremenu pratite šta se sa tim dešava. Takođe, možete posmatrati ćelije u deobi specifično i jednovremeno bojeći hromozome, deobno vreteno, centrozome i aktinski citoskelet oko deobnog vretena. Može se koristiti veoma veliki spektar i mikroskopskih tipova i načina prepariranja ćelija. U toj sumi podataka tehnički dostupnih aparata i procedura jako je bitno znati šta želite da studirate. To su izuzetno skupi, sofisticiratni metodi i zato je jako bitno da znate, da imate plan, šta želite da posmatrate. (slika ) – ovo je jedan fibroblast, gajen u kulturi, posmatran običnim mikroskopom. Osim oblika, dužine ćelije i nukleusa, praktično nemate više ni jedan podatak o ćeliji. Dakle SM-op tu ne može pomoći. Ako je tako, postavlja se pitanje kako sve možete da studirate taj fibroblast? Možete ga posmatrati na preseku tkiva, in situ, izolovati iz tkiva, staviti ga u ćelijsku kulturu i posmatrati ga, npr. pod laserskim skenirajućim mikroskopom. Zatim, možete ga preparitati za EM-ju ili iz tkiva ili iz ćel.kulture i posmatrati ga na TEM-u i videti da poseduje nkleus, nukleolus, mth,EPR, kolagena vlakna koja su produkt ove ćelije. Ili, ako baš želite da pratite malignu ili bilo koju transformaciju ćelijskog oblika, možete koristiti skenirajući 3D EM-op koji vam daje izgled površine, tj. dubinu ćelije, tako da možete videti kako ona izgleda u prostoru i kakvu komunikaciju ostvaruje sa susednim ćelijama ili sa matriksom koji samo sintetiše.

5

UVOD U METODE Mi ovde, na fakultetu, posedujemo rutinske SM-ope, konfokalni laserski skenirajući M-op i EM koji bi trebalo da radi i kao skenirajući i kao transmisioni. Šta bi bili metodi u biologiji ćelije? (Slika ) Ovo su ćelije bukalne sluzokože (usna duplja), ćelije se naziru-zato se žive, ne preparirane ćelije jako retko koriste u citologiji, za sada. Sledeći tehnološki napredak će verovatno biti pravljenje mikroskopa koji ćete moći da stavite da živi organizam i da im in vivo posmatrate ćelije, tkivo, odnosno, organ. Za sada se žive ćelije jako retko koriste u istraživanju. Paradoks je da u nauci o ćeliji, o životu, osnovnu organizaciju života (ćeliju) morate što brže, što efikasnije da ubijete ne bi li ste je onda preparirali i posmatrali pod mikroskopom. Iako imamo nameru da na Institutu za fiziologiju, pod vodstvom prof.Pavla Andusa, napravimo laboratoriju za ćelijsku kulturu, moja grupa radi i na pacovima (W.soj). Nas u tim pacovima zanima masno tkivo i ovde (Sl. ) su vam šematski prikazani nivoi rezolucije odnosno šta smo sposobni da vidimo golim okom; sposobni smo da vidimo organ, da izolujemo npr.Mrko ili BMT, SM-om smo u mogućnosti da vidimo adipocite (osnovne ćelije ovog tkiva)-kako izgledaju, gde ih je nukleus, koliko lipidnih kapi ima (plavo obojene tačke), koliko adipocita okružuje jedan kapilar, krvni sud i uopšte, kako je ovo tkivo organizovano. Finije detalje organizacije pojedinačnih adipocita možemo posmatrati pod EM-om i, vidite, granica vidljivosti je 0.2 nm, a to će se još pomerati na dole-jedan naš čovek sa Mašinskog fakulteta na Berkliju radi na konstruisanju nanomikroskopa. Oni dobijaju mnogo sredstava za njegovu konstrukciju, iako je u osnovi svega interes zbog ?? nanomaterijala, kolateralnu korist iz toga dobija i razvijanje metodologija za ćelije. Npr. moći će da se fokusira mitohondrija i da se, bukvalno, zaviri u e- transportni lanac ili u ATP sintezu i da vidimo kako se sintetiše ATP. U konkretnom slučaju, u MMT nema sinteze ATPa već se oslobađa toplota. Kada uporedimo MMT i BMT vidimo da se razlikuju morfološki, anatomski jasno. MMT deponije masne kapi (neutralne trigliceride) ali služi za produkciju toplote, dok je BMT žućkasto i služi kao depo energije. Oba tkiva imaju izraženu i endokrinu F-ju. Znači, održanje telesne mase i telesne temperature. Šta radimo sa tkivima kada ih jednom izvadimo iz pacova? Možemo ih pripremiti za SM-ju, videćete kako se kalupe u parafinske kalupe, kako se preparati seku i lepe na pločice i na slici se vidi kako se iste pločice na različitim mikroskopima izgleda rutinsko bojenje jednog drugog tkiva. Možete videti običnu, fluorescentnu mikroskopiju, konfokalno lasersku mikroskopiju, zatim, prepariranje za EM-ju. Pogledajte razliku u komadima, veličini tkiva koja se uzima za SM i EM-ju. Za EM se uzimaju kubni mm. Svaki presek koji se dobije prepariran za EM ne stavlja se na staklene pločice, nego na bakarne mrežice. Tu se nanose vrlo tanki preseci tkiva. Osim za mrezice, kao rezultat sečenja ovih kalupa mogu se dobiti i preseci koji se stavljaju na pločice. Oni se označavaju kao polutanki, za razliku od tankih, i debljine su 1 mikrometra. Vidite koliko je slika nuklesa jasija na preparatu sečenom sa kalupa za EM-ju. Debljine je 1 mikrometra i tu je struktura ćelije mnogo jasnija. Naravno, to još uvek nije dovoljno za informaciju i mi tkivo ovako pripremljeno vidimo pod EM-om (Sl beli adipocit; Slika: crni adipocit). Svetlosni mikroskopi: izvor: dnevna svetlost ili lampa-sociva-preparat-sociva-slika [Fluorescentni mikroskop: izvor: fl.lampa (na fakultetu emituje plavo svetlo)-preparat (svetlost pobudjuje fluorofor-fluorescinizocijanat-FITC, pobudjuje se plavom svetloscu, a emituje zelenu] Metod zamrzavanja i lomljenja

6

Metod za EM-iju koji nam pokazuje kako su, najčešće, proteini raspoređeni u membrani. Odnosno, konkretno ovde se vidi jedno polje koje se jasno razlikuje od membrane i ovakvih loptastih struktura. To je zato što ovaj metod koristi zamrzavanje tkiva. Kada zamrznete kockicu tkiva vi ga ubacite u aparat koji ga bukvalno polomi i s obzirom da se radi o sleđenom tkivu, taj lom kroz tkivo neće ići pravo nego cik-cak (kao što puca led). To znači da će se na različitim nivoima ćelije – u nivou membrane, nukleusa, citoplazme imati tu površinu-tu se nanosi grafitni, zlatni, platinasti sloj (u zav.od mogućnosti materijalnih) i dobije se nešto što je kalup/odlivak te površine. Taj odlivak je na slici i on se postavlja na mrežicu i posmatra kroz EM-op. Ovo je oblast međućelijske veze, pa imate koncentraciju proteina-vidite kako vezikule izgledaju kao da vire iz citoplazme. Osim korišćenja pacova, izolovanja organa i posmatranja tkiva bićete u prilici, možda, da vidite i ćelije gajene u kulturi. Ćelije se gaje u flaskovima (Sl. ). Morate ih staviti u medijum koji kupujete ili ga možete praviti iz tkiva ali je to vrlo mukotrpan posao i ta ćel.kultura se može posmatrati brojnim tipovima mikroskopa od kojih mi posedjemo ova 3: Fazno-kontrastni Darkfield Fluorescentno-konfokalni (Slike)

METODI U CITOLOGIJI Slika ?????? Tpovi i porlekolo ćelije Danas ćemo videti postojeće tipove ćelija i na osnovu toga, tih saznanja, pokušati da odgovorimo da li su te ćelije evoluirale, šta pretpostavljamo i kako i konačno da li se ta evolucija zaustavila ili se i dalje odvija. Krenimo od onog što smo juče čuli – Šlajden i Švan su postulirali tzv.ćelijsku teoriju koja nam kaže da su sva živa bića sačinjena od ćelija, znači, ćelija je osnovna strukturna i funkciona jedinica živih bića. Svaka ćelija u našem organizmu potekla je od prethodno postojeće ćelije, znači nije nastala kreacijom de novo, što znači da se kao jedna od osnovnih karakteristika života može smatrati reprodukcija, odnosno, reproducibilnost strukture i funkcije kroz vreme i prostor. I konačno, ako ćelije shvatimo kao najmanju osnovnu strukturnu i funkcionu organizaciju živih bića, možemo reći da je jednovremeno ćelija, znači, jedinica života. To je bitno zato što ćemo videti kroz dalju priču da se o današnjem živom svetu zemlje može nekada povući jednakost između jedne ćelije i jednog organizma, ali isto tako i od milijardi ćelija ukomponovanih u jedan jedini organizam. Pre nego pređemo na konkretno studiranje ćelija, hajde da vidimo, kakve su relativne veličine, odnosno, da imamo prosto u glavi nekakvu mernu skalu u koju ćemo smestiti ćelije, pojedinačne organizme ili grupacije ćelija. Vidimo da, golim okom, možemo najčešće videti žive jedinke, organe u okviru tih živih jedini, tkiva, a može se, čak, desiti da vidimo i pojedinačne ćelije. Svetlosnim mikroskopom veoma dobro znači da svetlosnim mikroskopom možemo videti gotovo sve ćelije postojećih živih bića. Em-om, pak, možemo razlučiti ultrastrukturu ćelija, znači, možemo studirati i analizirati unutarćelijske kompartmente bilo da su oni membranski, kada ih zovemo ćelijskim organelama, bilo da su oni supramolekularni kompleksi, kada govorimo o npr. ribozomima, polizomima, proteazomima itd. Dakle, kada kažemo ”ćelija” mi zapravo mislimo na jako veliki broj različitih oblika (slike) i ovde su vam dati neki primeri, prosto, da bismo shvatili koliko je veličina ćelije i oblik ćelije,varijabilna

7

kategorija,naročito u višećelijskim organizmima, zapravo, ako pogledamo veličinu pojedinačnih organizama, kakva se npr.bakterija, možemo zaključiti da je veličina bakterije 1-2 mikrometra; kada pogledamo dijametre ili veličine ćelija u eukariotskim organizmima, odnosno, višećelijskim organizmima mi vidimo tu, sada, povećanje ćelije, jer su sve ćelije daleko iznad dimenzija bakterije; čak možemo reći da su dimenzije bakterije poput pojedinačne organele (poput mitohondrija), a sve ostale imaju dijametre od 5,7,10,50,100 mikrometra. Znači, dijapazon veličina ćelija je od nekoliko mikrometra do 100-inak mikrometara. Tako možemo videti da su eritrociti, odnosno crvena krvna zrnca, dijametra 5-7 mikrom (kod ljudi), nervne ćelije (neuroni su ćelije koje su u svom centralnom ćelijskom telu veličine 10-15 mikrom, ali stvarna dužina ćelije je daleko iznad tih veličina zato što neuroni poseduju jako dugačke ćelijske nastavke bilo da su to dendriti ili aksoni. Takođe, mišićne ćelije, naročito poprečno-prugaste mišićne ćelije, u organizmima životinja mogu da budu jako dugačke, pa neki kažu da čak na leđima u okviru leđnih mišića naše poprečne prugaste ćelije mogu da dosegnu veličinu od 1 m. Pri čemu imajte na umu da su popr-prug.ćelije kod nas, kod adulta, nastale fuzionisanjem velikog broja mioblasta tako da, ipak, ne možemo govoriti da je to jedna jedina ćelija te dužine, znači, radi se o funkcionom klasterisanju/fuzionisanju ćelija. Primer jako krupne ćelije u našim orgaizmima je primer jajne ćelije koja se nalazi kod ženki životinja, odnosno kod žena u našoj vrsti. To su ćelije koje se mogu nazreti golim okom, znači naše jajne ćelije su približno 1mm, tako da kada se otvori trbušna duplja i pogleda se -u ovarijum, otvori se Grafov folikul, može se golim okom nazreti ovocita. Ne zaboravite da je u živom svetu to još varijabilnije setiti se samo kokošijeg jajeta, to je jedna jajna ćelija i svi dobro znate koliko centimetara je ona kuprna/duga. Što se tiče ćeije biljaka, može se reći da su ćelije u biljnim organizmima prilično krupne, znatno krupnije nego ćelije životinja. Obično se kaže da su dimenzije (dijametar) od oko stotinak mikrometara. Sada kada znamo da postoji vrlo šakolika slika u okviru veličine ćelija, naše je da se zapitamo zašto je to tako, odnosno, kako je evolutivno izabrana strategija povećanja ćelija, ipak kada pogledate bakterije i današnje ćelije eukariot, (Sl. ) ovde vam je dat primer teorijskog objašnjenja rasta čelija, odnosno evolutinog pritiska višećeličnosti, , udruživanja većeg broja ćelija. Pogledajte kakav je odnos površine i zapremine jedne kocke/ćelije. Znači, kada imamo kocku čije su strane dužine 4 mm, vidite kakva je površina i zapremina, tj. kakav e wihov relativni odnos. (Sl. ). Kada se uradi deljenje i dobije se 8 kocika ivice od po 2 mm, pogledajte kako površina drastično raste u odnosu na velumen, odnosno pogledajte kakav je njihov odnos. Konačno kada podelite još više ovu početnu ćeliju-na 64 kockice čija je stzrana 1 mm, pogledajte odnos P/V. Znači relativan odnos površine i zapremine je jako bitan za celiju zato što površinamembrane mora da opslužuje unutrašnjost ćelije i obrnuto. Mora postojati zapremina ćelije koja će davati komponente površine, odnosno ćelijske membrane, što će reći da nokleus mora biti u određenoj zapreminskoj korelaciji sa citoplazmom i sa površinom ćelijske membrane svo primanje i odavanje u ćeliji kojeide putem ćelijske membrane mora biti striktno korelisano sa zapreminom/količinom citoplazme i zapreminom jedra/nukleusa. Ako ćelija želi da uveća svoje procese, i kvalitativno (kvantitativno, a to ne može da radi povećanjem ćelijske membrane, ona će se smanjiti (površina), podeliće funkciju sa većim brojem istorodnih ćelija i treća važna stvar koja se u evoluciji ćelije desila, a to je: stvore je endomembranski sistem. Ako nemate veliku površinu membrane ćelije, povećavaće se, evolutivno, unutar ćelije memb.sistema koji će preuzimati određene funcije. Ako to znamo, hajde da vidimo kako se ćelije organizuju, odnosno, koji su danas postojeći tipovi ćelija koje možemo da izdvojim, klasifikujemo, analiziramo i zaključimo kakva je njihova organizacija. Imajte na umu da se u biologiji ćelije lako preferira terminska organizacija” organizacija znači: jedinstvo strukture i funkcije ćelije, odnosno ćelijskog tipa jer mi u biologiji ćelije volimo da posmatramo te dve

8

stvari neodvojivo. Znači, iako analizirate praktično strukturu, jako je tanka linija i praktično je ne možete povući između str. i F-je ni danase ne može jasno reći da li je struktura ta koja određuje F-ju ćelije ili ćelijskih ko ili je F-ja ta koja određuje kako će neka ćelija/njena organela izgledati. Da bi prevazišli tu ”naizgled, suprotnosti mi govorimo o organizaciji najčešće, dakle, vršimo nekakvu umnu kompilaciju strukture i funkcije. S obzirom da nemat mogućnosti da za ćelije analiziramo fosilne ostatke, mi danas možemo analizi postanka ćelije pristupiti regresivnim metodama, znači – analizirati postojeće, nama dostupne tipove ćelia i na osnovu te strukture razmisliti na koji način su mogle nastati i kako će se dalje, tj. u perspektivi razdvajati. Danas postojeće tipove ćelija još uvek klasifikujemo kao ćelije Procanota, ili kako je to kod nas odomaćeno, kao frokariotske ćelije i kao fukariotske ćelije pri čemu uzimamo prototipove, tj.ćelije koje su najzastupljenije u okviru ove podele, pa tako ćelije bakterija uzmamo kao model-sistem za studiranje prokariotskih ćelija, a u okviru eukariotskih ćelija uzimamo ćelije životinja i ćelije biljaka, pri čemu je na za model ćelije životinja. Uzet kao model izabran hepatocita za ćelije biljaka-meristemska ćelija (slika). (Sh. ), odavno je vama poznata ova definicija prokariotske i eukariotske ćelije, odnosno većina vas kada dođe iz srednje škole ovde kaže da se: ”sve eukariotske ćelije fundamentalno razlikuju od prokariotskih zato što imaju membranom zaokružen nukleus (genom je membranski izdvojen od citoplazme), zatim imaju kompleksni endomembranski sistem (znači, imaju organele) i imaju citoskelet”. Naravno, osim ovih razlika, verujem da ste govorili da se razlikuju i po načinu života, dužini ćelijskog ciklusa, deobama (da se prokarioti razmnožavaju binarnom fisijom, da su to proste ćelije dok su eukariotske ćelie vrlo složene, da se dele mitozom ili mesožom i.t.d.). Danas, međutim, u biologiji ćelije se sve više misli kako se ta razlika između prokariotskih i eukariotskih ćelija nije tako drastična, da se prosto radi o nekakvnim F-onim tipovima, da se ne može reći da su prokariotske ćelije proste, već da su jednostavne organizacije, za razliku od eukariotskih koje su složeno ogranizovane. U međuvremenu otkriveno e da postoje prokarioti koji imaju fukleus, doduše jedan jedini slučaj za sada, otkriveni su svi elementi citoskeleta koji su analozi citoskeletnim elementima eukariotskih ćelija i danas se zna da se prokariosti dele jednostavnom mitotičkom deobom koja čak u citokinezi jako podseća na deobu eukariotskih ćelija, ali ćemo mi to sve postupno studirati u toku ovog kursa. No, kada nemate baš previše podataka, vi se držite ustaljene sheme objašnjenja postojećih tipova ćelije, te ćemo se mi, uz ogradu, da su prokariotske ćelije ”jednostavno” organizovane, nači, imaju vrlo redukovanu strukturu u odnosu na ipak krenuti sa tim da vidimo kako izgleda ćelija prokarista na model sistemu bakterije i to Ecoli, koja je model sistem i molekularnoj biologiji, ?? i tipične biljne ćelije. (Slika) – ovde možete videti uzdužni i poprečni presek E cole posmatran pod elektronskim mikroskopom. Vidite da zaista osim ćelijske membrane, citoplazme, ćelijskog zida i nukleoida nema nikakvih endomembrana niti možete da uočite strukturu unutar same ćelije. Kada shematski predstavimo sve ono što vidimo studirajući različite bakterijske organizme različite tipove prokariotskih ćelija možemo reći da dolazimo do nekakvog prototipa ili prokariotskog tipa organizacije na kome su sumirane najčešće strukture koje se javljaju. Sve one koje s izuzetak studiraćemo pojedinačno kada na njih .Tako možemo videti da je tipicna bakterijska ćelija organizovana tako što je uspostavljena ćelijskom membranom, da ćelijska membrana nije jedina barijera spram spoljašnje ili okolne sredine da većina bakterija poseduje oko ćelijske membrane. Ćelijski zid a jedan veći broj bakterija i kapsulo, koja je dodatni zaštitni omotač na nivou ćelijske membrane, ćelijskog zida i kapsule, mogu se uočiti strukturne diferencijacije po tipu pila koji su u vidu kratkih izraštaja , ili bakterijskog flageluma koji je jedan dugačak izraštaj nejčešće prisutan u svrhu pokretanja bakterijske ćelije sama unutrašnjost prokariotskog tipa ćelije sastoji se iz citoplazme koja je veoma retka da tako kažem ali u smislu-solubilna, u sol stanju, kada govorimo o centru prokariotske ćelije, a veoma gusta

9

kada govorimo o periferiji i iako ne postoji nukleosi ovog, dakle, membrana koja fizički odvaja genom prokariotske ćelije od citoplazme po gustini citoplazme možemo reći da postoji kompartment citoplazmatični i genomski koji je verovatno uspostavljen supramolekularnim strukturama tipa irnk, ribozona, euzima, multiproteinskih komplexa, jer nikada ne dolazi do mešanja centralnog retkog citoplazmatičnog dometa koji sadrži uvijenu, cirkularnu DNK, dakle, genom bakterijske ćelije i ”spoljašnje” ili perifernog (možda je pravilnije reći) – gustog dela citoplazme koji sadrži brojen enzime, poliribozome i multimerne proteinske komplexe. Za razliku od prokariotskog tipa kada pogledamo EM-ju hepatocita mi prvo vidimo da to nije samostalna, solitarna ćelija već da je udružena sa drugim istim takvim ćelijama u tkivu jetre za razliku od E.coli pretpostavljam da svi vrlo jasno vidite pod EM-om da, dakle, ova ćelija poseduje nukleus, vrlo izrazit, poseduje citoplazmu ispunjenu brojnim membranskim organelama i poseduje veliki broj ribozoma kao i glikogenih partikula. U našim organizmima postoje na stotine ćelijskih tipova koji se jako razlikuju po svojoj unutrašnjoj organizaciji i zato je jako teško reći da je hepatocit idealan model sistem za studiranje eukariotskog tipa životinjske ćelije, te je shema koju vam ja ovde prikazujem zapravo himera svih postojećih citoloških oblika hepatocita, ??neorgana??, spermatozoida, ovocita, dakle, svih ćelija koje sadrži jedan višećelijski organizam. Zato ćete videti da je eukariotski tip ćelije kod životinja je uspostavljen ćelijskom membranom, da ta ćelijska membrana najčešće nema ćelijski zid kao zaštitni omotač, da poseduje diferencijacije po tipu mikroresica ili eukariotskog flageluma, da zatvara unutrašnjost ispunjenu citoplazmom koja je visoko diferenciran sistem, uređen u tom smislu da možete da uočite kompartentne ćelije, ti kompartenti su membranom uspostavljeni (recimo nukleus, nukleusnim ovojem), bogata je endomembanska mreža u vidu EPR-a, bilo da je on granuliran ili glatki, tu je, zatim, komplex Goloži, mith-e, različite vezikule, lizozomi, peroksizomi i brojne druge membranske organele, zatim supramolekulski kompleksi, kao što su:centrozomi ili par centriola, polizomi (poliribozomi) sama tečnost, sama plazma organizovana je putem visoko diferencijalne proteinske mreže koja se naziva ??? i koja je izgrađena iz 3 osnovna elementa: AF-a MT-a i IF-a Biljna tkiva, takođe imaju različite tipove ćelija po tkivima. Visoko su diferencirani tipovi ćelija, čak je diferencijacija u biljnim organizmima daleko nepovratnija, daleko različitija od diferencijacije u ćelijama životinja, kada posmatramo posebna tkiva, ali se na jednom shematskom prikazu ipak može videti nešto što je zajedničko za sve te raznorodne tipove ćelija u biljnim organizmima/tkivima, pa tako govorimo o citološkoj organizaciji eukariotskog tipa ćelije karakterističnog za biljke. Možemo videti da je, kao i u slučaju E.coli, kao i u slučaju hepatocita, ćelija biljaka uspostavljena ćelijskom membranom, ali da, za razliku od ćelija životinja, oko ćelijske membrane poseduje dobro struktuiran, dobro diferenciran, čvrst ćelijski zid, da se u unutrašnjosti mogu videti gotovo sve organele koje poseduju i ćelije životinja, a osim njih i neke koje karakterišu samo ćelije biljaka Govorim o plastidima, ovde su vam konkretno, predstavljeni hloroplasti, koji su najpoznatiji zbog svoje fotosintetske sposobnosti, od plastida, ali ćete tokom ovog kursa videti da postoje, verujem i da znate, mnogi drugi tipovi plastida. Nekada se vakuola smatrala posebnošću biljne ćelije danas znamo da je vakuola ništa drugo do jedan ogroman lizozom, odnosno endolizozom kojeg susrećemo i u ćelijama. Kada znamo, sada, ova 3 tipa postojeća ćelija, možemo da vidimo kako su ti tipovi uopšte mogli nastati, odnosno diferencirati se u tako različite organizme kakve danas nemamo na kugli zemaljskoj. Postoji nekoliko škola koje se bave poreklom i evolucijom ćelija. Svaka ta škola drži do svog mišljenja i vrlo je isključiva, znači, ne priznaje ni jedno drugo mišljenje.

10

Meni se čini da je istina uvek negde na sredini, znači da ne možete i ne smete biti isključivi spram svojih rezultata, pogotovo ne kada nemate neke konkretne ostatke nekakvih pra pra pra ćelija, pa možete na osnovu njih pouzdano reći, a nauka je ipak egzaktna: ”E, imamo sada ovaj niz i možemo reći da je to transformacija od ove organizacije do ovog tipa organizacije”, znači takve linije danas ipak nema. Ovo što sam ja odabrala da vam predstavim je nekakav kompromis onoga što se u tim različitim školama predstavlja kao jedini scenario nastanka ćelija, i recimo da to teče ovako kroz vreme (slika) Svi znate ovu priču da je nekada Zemlja bila takva i takva, da je došlo do hlađenja, formiranja zemljine kore, da su se tada u tim nekakvim vodenim basenima stvarali molekuli, da su kao najbolji, u smilsu preživljavanja u tim datim uslovima se pokazali organski molekuli tipa kiselina (DNK, RNK), zatim su nastali proteini,pa lipidi, šećeri i da su, otprilike, ta jedinjenja na bazi ugljenika, azota ?? bila tokom te, molekulske evolucije koja se neosporno morala desiti pre evolucije ćelije prosto iskristalisani oni organski elementi koji bi mogli potencijalno da daju nekakve strukture koje će funkcionisati kroz vreme. Tako možemo lako da zamislimo da se u toj nekakvoj organskoj ”supi” dešavalo da se formiraju nekakvi lipozomi, odnosno da su se određene količine molekula pakovale s vremena na vreme u nekakve membranom zaokružene strukture. S obzirom da se radilo o vodenim basenima jasno je da su takve membranske vezikule, mogle biti stvarane, i može se reći da su na taj način mogle nastati nekakve predačke ćelije, ali reći ”ćelija” znači izgovoriti da je to nešto što je živo, što se reprodukuje, što može stvoriti u vremenu istu strukturu kao što je ona i proslediti tu informaciju dalje kroz generacije za te lipozome za te pra pra praćelije ne može se ipak reći da su imale tu ”sposobnost” ili taj atribut života. Pre se može reći da su to, zaista bile nekakve lipozomalne ili memb.vezikule koje su u sebe onda zatvarale proteine DNK i RNK molekule. Verujem da ćete na mol.biologiji malo više slušati ili ste već slušali nekad o tome da li se prvo nastalo – da li DNK ili RNK ili proteini ili šta je starije ”kokoška ili jaje”naravno, te priče uvek postoje. Ako ste molekularni biolozi, morate da priznate da proteini dominiraju, DNK molekul je samo jedan parazit u ćeliji koga proteini iskorišćavaju da održavaju strukture i funkcije. Elem, kada se u vremenu jednom napravila nakakva populacija različitih ćelija, dakle onih koje su sada, naglašavam, stekle ”živo”, mogle da se reprodukuju i strukturno i funkciono u prostoru i vremenu, možemo reći da je ta ćelija, po strukturi, najverovatnije, ličila na onu ćeliju koju sada znamo kao bakterijsku ćeliju, odnosno kao prokariotski tip organizacije. Svi dosadašnji podaci nas upućuju na to da je taj predački tip ćelije morao ličiti na prokariote, što naravno ne znači da je to mišljenje ispravno, ali recimo da je bilo tako. Zamislite da imate veliku populaciju različitih predačkih prokariotskih ćelija i sve su one, recimo, u jednom istom vodenom basenu, kakav scenario dalje možete da zemislite? Da se svaki od tih pojedinačnih u okviru sto tipova razvija u nekom svom pravcu ili možete da zamislite da dolazi do aktivne interakcije tih ćelija, jer znamo da ćelijska membrana inherentno i dakle, sadrži svojstvo fuzionisanja, pa se može zamisliti da se te pojedinačne ”ćelije” možda fuzionišu ili – razdvajaju putem fisije (deobe) na 2 različite, pritom kombinujući osobine koje svaka donosi kada dolazi do fuzije. Kako god zamišljali scenario nastanka i evoluiranja različitih tipova ćelija moramo imati uvek na umu danas postojeće ćelijske tipove, što znači da se jedna populacije tih pra pra ćelija sigurno moralo odvojiti u smislu da se za date uslove sredine u kojoj je živela ta vrsta ćelija najviše isplatilo da ostaju tako organizovane, da ostaju po tom tipu jednostavne strukture, da zadrže molekule, energije, dakle, ATP, nukleotide, dakle, da idu u energente, a ne da idu u pakovanje što dužeg i formiranje što dužeg molekula DNK ili RNK. Znači to je strategija koja je odlučila da ćelije prokariota budu sitne, da nemaju uobličen nukleus, znači da nemaju povećanje genoma kroz vreme, da taj genom bude cirkularan i da se transkripcija odigrava policistronski, da nema gubitka nukleotida, da to bude više na račun stvaranja ATP-

11

a i preživljavanje, znači, korišćenja energije. Kako su onda nastali ovako složeno, komplikovano organizovani eukarioti? Jedna škola kaže da su eukarioti nastali tako što su: (1) koristili onu strategiju koju sam vam pokazala, znači, imate uvećanje ćelije i imate sve veće zahteve sredine da povećavate broj f-ja i ćelija raste. Alu, ta ćelija raste tako što imate jednu ćelijsku membranu, jednu jedino membranu toj ćeliji koja sada u sebi inserira molekularne komplekse ili pojedinačne molekule zadužene za sve kompleksnije i kompleksnije funkcije. Ta membrana međutim, ne može da raste beskonačno – ona se opredeljuje za uvrtanje, da dolazi do invaginacije membrane i ti uvrati membrane polako, polako počinju da zatvaraju endomembranske sisteme. Dakle, imate sada unutar membranski, uvučene u ćeliju, bivše ćelijske membrane koje imaju posebne f-je, i samim tim, imaju i posebne strukture i to su danas, nama dobro poznate membranske organele. Na taj način nastao je prvo EPR, a zatim i nukleusni ovoj – da se razdvoji replikacija i transkripcija od procesa translacije i aktivnog metabolizma ćelije u citoplazmi. Kako su onda nastale druge organele? Šta su kompleksom Goldži, peroksizomima, lizozomima, vakuolama, mth, plastidi-kad su one nastale? Tu se ove 2 škole definitivno razilaze: Jedna se mnogo bavi procesom endosimbioze. I kaže da su mth, odnosno plastidi, endosimbiotskog porekla što znači da se jednog trenutka tokom evolucije došlo do prvo fonog a zatim i strukturnog udruživanja jednog predačkog eukariota sa jednim prokariotskim organizmom, odnosno, ćelijom. U slučaju mitononorija, to su bile purpurne bakterije, a slučaju hloroplasta to su bile one zelene, već kako se zovu, koje su mogle da vrše fotosintezu. Na taj način, dakle, može se objasniti zašto s ove 2 organele veoma različite od ostalih membranskih organela u ćeliji eukariota što znači da poseduju dve membrane koje se lako razlikuju, da sadrže sopstvenu DNK, što znači da poseduju i sopstvene RNK koje se prepisuju sa te DNK i da sadrže njima specifične ribozome koji vrše translaciju tih iRNK, znači pokazuju relativnu nezavisnost u sintezi određenih proteina. Kada uradite mapu cirkularnog hromozoma,mth odnosno hloroplasta vidite da postoji visoka sličnost sa hromozomima kod tih tipova bakterija i odatle se kaže da su hloroplasti i mitonondrije nastali putem endosimbioze, znači udruživanja predačkog eukariota sa postojećim, već formiranim prokariotskim ćelijama. Za druge organele, kao što je peroksizom ili lizozom može se pretpostaviti da su nastali tako što se multiplim fuzijama različitih predačkih eukariota jednostavno iskristalisao ćelijski tip koji sadrži i takve membranske organele pri čemu je meni lično verovatnije to za peroksizome, a za lizozome bih pre rekla da s obzirom da nastaju u samoj celiji i da su u prvo vreme imale te organele odnosno ti enzimi su prvo nastali u ćelijama da bi bili izbačeni van, da bi varile te ćelije okolocelijsku sredinu, te je verovatno da je to neka dodatna f-ona specijalizacija već formiranog eukariota pre nego da se lizozom nekakva posebna bivsa ćelija koja je ušla fuzijom u ovaj predački eukariot.Znači, može se reći da jedan tip organela je, najverovatnije, nastao endosimbiozom a da su druge organele u eukariotskim ćelijama nastale ili specijalizacijom ćelijske membrane koja se uvrtela, ulazila u citoplazmu i uzimala određene delove, dakle formirala se kao struktura, a samim tim i zadržavala svoju posebnu funkciju i tako postala definitivno jedna organela ćelije. Dok su druge organele, najverovatnije posledica multiplih fuzija, stvaranja, dakle, različitih hibrida eukariotskih, predačkih ćelija. To se, otprilike, ono što se sadašnjoj literaturi može naći o poreklu ćelije. Što se dalje tiče evolucije šta mislite da li je s obzirom da znamo sada koliko postoji tipova je li ona zaustavljena ili mislite da ona, evolucije ćelije teče? Naravno da teče – u živom svetu teško da se šta može zaustaviti u jednom trenutku na jednom nivou, ta evolucija ćelije teče, to možemo, nažalost videti na kancerogeno izmenjenim/malignotransformisanim ćelijama. To

12

su ćelije koje se strukturno, da ne govorim, f-ono potpuno razlikuju od normalnih, ćelija integrisanih u strukturu i f-ju organizma. Na neki način zadivljujuće je kako menjaju svoju strukturu svoje kompartmente i kako ti kompartmenti funkcionišu, koliko god da su čudovišne u kliničkom smislu, s druge strane vidite da može dolaziti i do ugradnje delova, znači oligo-fragmenata DNK koji se unose bilo hranom, gde dolazi do neke vrste tranmisije DNK/genoma-ivećavanje stalno, i na taj način se verovatno, nama za sada nama neprimetno menja prvo u smislu funkcije a onda u smislu strukture, a možda i obrnuto – to je ono što kažem da je jako teško razlučiti.

BIOMEMBRANE-STRUKTURA I ORGANIZACIJA Danas koristimo pojam biomembrane (struktura i f-ja biomembrana, organizacija biomembrana) jer ih najčešće studiramo na eukariotskim ćelijama, te nemamo samo ćelijsku membranu, već govorimo o strukturi membrana: gER-a sER-a, nukleusnog ovoja, plastida, mitohondrija i svih membranskih vezikula (lizozoma, peroksizoma) itd. Kako god danas govorili o membranama, građa membrane ???? je na nivou ćelijske membrane, pa ćemo preći na istorijat, kako se to membrana studirala s obzirom da se i pod najjednostavnijim SMom, vidi da je ćelija entitet uspostavljen tankom linijom koja predstavlja barijeru u odnosu na spoljašnju sredinu, kako se to ranije pisalo. Dakle, c.m.bila je barijera putem koje je ćelija dozvoljavala prolaz određenim molekulama i Hegeli i Kremer su 1855. ćelijsku membranu označili kao barijeru, prvo joj je data f-ja, da bi objasnili proces osmoze. 1871. Hugo de Vris opisuje propustljivost c.m. za dve konkretne materije: amonijak i glicerol čime proširuje f-ju ”barijere” na relativno propustljivu barijeru. Overton je 1895. razvio sledeće teze (a) lipoidne membrane zaokružuju ćelije i kod biljaka i kod životinja (b) podeljenost dve faze: lipida i vode, može se iskoristiti da se objasni delovanje anestetika. Znači propustljivost + barijera. (c) dolazi do razmene natrijuma i kalijuma ??? Model organizacije ćelijske membrane gde su iskoristili model Gortera i Grendla iz 1927 lipidni dvosloj), ali su proteine pridružili u vidu 2 sloja: iz unutrašnjosti ćelije i iz okoloćelijske sredine po tipu sendviča. Ako su pripadnici druge škole, protivnici ovakvog modela sendviča sa c.m-om, govorili da je nemoguće napraviti ovakav model, jer su matematički, iz analiza videli odnos količine proteina i lipida u ćelijskoj mebrani objašnjavali da je nemoguće da tako mala količina proteina bude u 2 sloja, da ih nema dovoljno za takav model, jer se površina ćelijske membrane jednostavno izračunati – kada se hloroformom ili alkoholima ekstrahuju lipidi iz c.m., možemo kao cisto frakciju razvući po vodenoj površini i dobije se površina ta i ta. Kada se dođe od dijametra ćelije, (količina), vidi se da lipidi moraju biti u dvosloju -dobijena površina lipida površina membrane. Količina proteina koja je izolovana nikada nije mogla biti po modelu sendviča uvek su falili proteini. 1952, jer se od 45. krenulo sa EM-om, tada ustoličeni bog strukture na EM-ji, Džordž Palade je dao prvu elektron mikrografiju ćelijske membrane koja je bila visoke rezolucije, što znači da se pouzdano na osnovu te slike može reći ”Vidim”, dakle ”Verujem”. Membrana je izgledala troslojna što se savršeno uklapa u troslojni model membrane, može se reći da se hidrofilni delovi-proteini + polarni domeni lipida sa citoplazmatične i ekstraćelijske specifikovao da se razmenjuje ?????????? Rekao je da to jeste aktivni transport, odnosno, da ovaj proces zahteva potrošnju energije. S obzirom na to da je u to doba hemija bila prilično razvijena, prvo što je i najlogičnije da se uradi jeste da se analizira sastav, hemijski sastav ćelijske membrane. Koliko god da su bili grubi ekstrakti ćelijskih membrana ipak je bilo jasno da su to lipoidme membrane, da

13

membranu ćelijsku strukturno uspostavljaju lipidi i to polarni lipidi koji poseduju 2 regiona: hidrofilan i hidrofoban, i da se vodenom sredinom specifično organizuju tako što će se hidrofilni domeni okrenuti ka vodenoj sredni, a hidrofobni udaljiti od nje. S obzirom na to da su ćelije strukture koje imaju ć.m. kao barijeru između 2 vodene sredine, citosola i okoloćelijske tečnosti, logično je da će se ti polarni lipidi tako strukturirati da nagrade lipidni dvosloj – o tome su 1925. govorili Gorter i Grenol kada su dali model ćelijske membrane. Kako su hemijske analize napredovale, shvatilo se da, osim lipida, kao strukturna komponenta ćelijske membrane figuriraju i proteini. Kako ih uklopiti u lipidni dvosloj? Dugo se razmišljalo kako ti proteini mogu da interaguju sa lipoidnom membranom. Postojala su 2 mišljenja i nadvladalo strane divno boje crno, odnosno kontrastiraju, a da se ovi hidrofobni regioni, odnosno jedan (pošto ne može da bude kontrastriran jer odbija vodu kojom dovodimo boju) daje belu traku.I eto savršenog primera kako oko može da vas prevari, jer kada se preračuna količina lipida i proteina, shvati se da je jedini yaista mogući model organizacije ćelijske membrane upravo fluidnomozaični asimetrični koji su postavili Singer, Lenard i Niklson 1972god. a njima je mnogo pomogao rad koji se pojavio 1970god. u kome se eksperimentalno dokazali da se proteini mogu kretati u ć.m. što je ljude navelo da pomisle da su proteini integrisani u lipidni dvosloj odnosno da su mozaično raspoređeni u ć.m. Ovaj model, malo modifikovan, važi i danas. S obzirom na to da morate da vidite da biste verovali, bilo je potrebno da na el. mikr. pokazati da su proteini u lipidni dvosloj (odnosno da ja prisutna mozaičnost). Metod odmrzavanja i lomljenja između 2 monosloja membrane omogućava da se vide i unutar monoslojeva granule*to su proteini~direktan dokaz prolaza proteina kroz lipidni sloj (mozaican raspored u celijskoj ili bilo kojoj drugoj membrani. Ovaj model je....... i savremenim metodama. Kao savremeni model za cel. mem. uzima se eritrocit sisara (eritrocit sisara-zato sto on ne sadrzi jedro, osim kod lame kamile, niti bilo koju drugu membransku organelu), tako da kada se u epruveti uradi hemoliza i izvrsi blago centrifugiranje, na dnu epruvete se dobija savrseno cist model za studiranje celijske membrane. A to je jedna jedina membrana koju eritrocit poseduje. Prvo sto se uradi, to je hemijski sastav. Kada se to uradi, prethodna tvrdjenja ce biti potvrdjena, znaci-lipidi + proteini ali i ugljene hidrate. Dakle, model cel. memb. mora ukljucivati u ebe i ugljenohidratne latice, oligofragmente. Struktura lipida biomembrana - radi se o polarnim lipidima (za razliku od neutralnih koji su trigliceridi i sluze za deponovanje, recimo, u adipocitama). Sto se tice lipida membrane polarni sadrze: 1. Hidrofilne glave (polarne grupe) 2. Hidrofobne repove (masne kiseline) Parovi masnih kiselina bice u sendvicu izmedju polarnih grupa, a polarne grupe zavise, kada se posmatraju razliciti lipidi koji ucestvuju u gradjenju. Znaci lipidi mogu biti fosfolipidi ili sfingolipidi. Mi govorimo o glicerofosfolipidima zato sto je prisutna esterifikacija glicerola i zakacena fosforna grupa. Sfingolipide pominjemo jer je prisutan sfingozin sa masnom kiselinom pri cemu on moze biti takodje sa fosfatnom grupom ili sfingozin moze nositi secer kada govorimo o glukolipidima. Fosfolipidi i glukolipidi se tako okrecu u vodenoj sredini (citosol i okolocelijska tecnost) da formiraju lipidni dvosloj; taj lipidni dvosloj se karakterise izrazitom asimetrijom zato sto pojedini lipidi jesu zastupljeni u spoljasnjem monosloju, a drugi u unutrasnjem monosloju. Neki od lipida koji izgradjuju celijsku membranu su: fosfatidil holin, fosfatidil serin, fosfatidil inozitiol, biofosfati, sfingolipidi i glukolipidi. Glukolipidi se uglavnom rasporedjuju u spoljasnjem monosloju, ka ekstracelijskom matrixu i oni najcesce grade jednu vrlo delikatnu mrezu od cel. memb. ka okolocelijskoj sredini koja se naziva slatki cel. omotac/glycocalix. U citosolnom monosloju lipida izrazito je zastupljen

14

fosfatidil serin i fosfatidil inozitol bifosfat. Sfingolipidi su radije rasporedjeni u spoljasnjem monosloju, a isto to vazi za fosfatidil holin. Fosfolipidi i glukolipidi nisu jedini lipidni domeni cel. memb., njima se pridruzuje holesterol, steroidni molekul, koji je rigidan, planaran zbog svojih prstenova. On se umece u monoslojeve cel. memb. i on tu vrsi neku vrstu kompenzacije prometa unutar lipidnih monoslojeva koji se desavaju tokom izlaganja membrana niskim i visokim temperaturama. Kazali smo da je na snazi model membrane taj da je cel. memb.: a) lipidna b) tecna c) asimetricna d) mozaicna. Videli smo zasto je lipidna. Tečna je zato sto lipidi u monoslojevima jesu pokretnjivi i ta njihova pokretljivost se oznacava kao tecljivost c.m. Na telesnoj temperaturi, lipidni molekuli su rasporedjeni tako sto imaju odredjene fosfolipide koji imaju ravno rasporedjene repove masnih kiseline, a neki drugi imaju, onako, kolenasto rasporedjene u zavisnosti od ovih veza, vrsta masnih kiselina koje su esterifikovale glicerol, tako da se moze reci da se mestimicno, unutar slojeva, pojavljuju male supljine. Te supljine ispunjava horesterol i to je jako znacajno pri temperaturnim promenama koja vodi (kada je rec o visokoj temperaturi) ka strahovitoj tecljivosti i neuredjenosti lipida u membrani, tako da su procepi sve veci i veci unutar pojedinacnih lipida ili, (u slucaju niske temperature)-lipidni molekuli se uredjuju po principu parakristala, grupisu se, skupljaju se tako da nam se cini da je u pitanju solidifikacija, a u stvari, dolazi do otvaranja velikih rupa na plazminoj membrani i to je ono sto ne dozvoljava holesterol, ne dozvoljava preterano razilazenje fosfo- i sfingolipidnih molekula, niti njihovo preterano uredjivanje. Na taj nacin on kompenzuje promene tokom niskih i visokih temperatura. S obzirom na tecljivost membrane, lipidi se mogu kretati na nekoliko nacina, pri cemu ti pokreti nisu u istom smeru, niti su favorizovani u zivim celijama na isti nacin. Lipidi se unutar jednog monosloja mogu lako i dobro pokretati, tada govorimo o lateralnom kretanju (levo-desno ili napred-nazad). Pojedinacni molekuli unutar jednog monosloja mogu se jos rotirati, ali to je relativno redje; mogu poskakivati unutar monosloja, najcesce ka spolja. Rotacija i poskakivanje su daleko manje zastupljeni u odnosu na leteralnu difuziju. Lipidni molekuli se mogu kretati izmedju monoslojeva izmenom (spolja-unutra i obrnuto). To pokretanje je jako retko zastupljeno pri 'normalnom' (fizioloski homeostatski status celije) i zove se flip-flop. Ovaj pokret je jako favorizovan u slucaju celijske smrti. Kada celija ukljucuje program celijskog umiranja, dolazi do masovne ekstahalizacije fosfatidil serina, sto znaci da ce se sav fosfatidil serin iz unutrasnjeg monosloja, gde dominira, preseljavati u spoljasnji monosloj, i to za okolne celije znaci da ta celija ulazi u program celijskog umiranja, a za celije koje odstranjuju takve celije, to ce biti signal da dodju i da kasnije fagocitiraju tu celiju. Flipaze su enzimi koji favorizuju taj proces, oni vrse eksterhalizaciju fosfatidil serina. Flipaze su prisutne i u endoplazminom retikulumu, tj. membrani. Kolicina lipida jako se razlikuje, ne samo od tipa do tipa celije, vec i po monoslojevima fosfatidil holin, sfingolipidi su dominantniji u spoljasnjem sloju, dok su fasfatidil srin i fosfonozutol 4 biofosfat dominantni u unutrasnjem monosloju. To vazi za membranu eritrocita Asimetrija membrane je i tkivno specificna, ako je ovo bioeritrocit coveka, pogledajte eritrocit pacova ili svinje kakvu imaju raspodelu lipida u monoslojevima. Sastav membrane celije je tkivno specifican i kada se posmatra jedna celija unutar tkiva, unutar monoslojeva se moze uociti razlicit hemijski sastav lipida. To, medjutim nije jedina asimetrija. Sve o cemu smo do sada govorili je vcestacka situacija (na osnovu eksperimenata i hemijski modeli na osnovu hemijskih analiza). Kako je to u zivoj celiji? Posmatramo celokupnu povrsinu celijske

15

membrane. Zakljucujemo ono sto smo rekli--Æ Monoslojevi su hemijski razliciti. Ali, zakljucujemo da raspored lipida nije identican po celoj povrsini celijske membrane, kada integralno posmatramo oba monosloja. Naprotiv, videcemo da je celijska membrana 'zaposednuta' lokalnim hemijskim sastavom membrane/lipida u vidu tzv. lipidnih ostrvaca (lipidrats). kako su zastupljena ta lipidna ostrvca? Mahom su sastavljena od sfingolipida i holesterola (model-lizozom/imitacija celije). Sfingolipidi su veci, duzi molekuli od klasicnih fosfolipida., zakljucuje se da lipidna ostrvca deblja. Debljina c.m. izmerena je el. mikro. je 7.5ηm, debljina c.m. u nivou lipidnog ostrvca je 10-Æ to su zadebljanja c.m. koja se karakterisu visokom tecljivoscu i to su domeni gde c.m. trpi velike promene u smislu invaginacija, dakle to su domeni gde se vrsi endocitoza. Proteini cel. membrane su najcesce polimeri, mnogo cesce nego pojedinacni proteinski molekuli. Proteine cel. membrane ( s obzirom na to da smo rekli da je mozaicna) mozemo podeliti na integrisane proteine (one koji potpuno prolaze lipidni dvosloj), oni imaju nacesce 3 domena: citoplazmatski (citosolino, submembranski), membranski i ekstracelijski. Proteini po svojoj strukturi mogu biti zavojnice, globularni, jako su raznoliki po svojoj konformaciji, ali je za sve njih karakteristicno da potpuno prolaze lipidni dvosloj i da imaju tri funkcionalna domena. S druge strane, proteini mogu biti pridruzeni i to tako da delimicno mogu biti integrisani u membrani, bilo sa unutrasnje ili spoljasnje strane u monosloju (iako nije prikazano na shemi), a mogu biti samo kovalentnim ili nekim drugim vezama prikaceni za, najcesce, glave fosfolipida i oni takodje spadaju u grupu pridruzenih proteina. I oni mogu biti i sa unutrasnje i sa spoljasnje membrane. Seceri, oligosaharidi su prikaceni i za lipide i za proteineÆ glukolipidi, glukoproteini (glikokalis/slatki cel. omotac) Kvalitet i kvantitet proteina jako varira od membrane do membrane, nije uopste isto sta ce se nalaziti od proteina u cel. memb. eritrocita ili neurona. Neke pumpe su ipak zajednicke anuaporini i neki drugi proteini, ali se najcesce jako razlikuju. I proteini poseduju sposobnost lateralne difuzije. *Cel. coveka i cel. misa- slicnog su sastava c.m. specificni proteini za coveka i za misa pa su razlicito obelezeni. Kada dodje do fuzije dve celije (svaka membrana ima inherentno svojstvo da moze da se fuzionise sa drugom kada se dovoljno priblize) u prvom trenutku vide se dve celije (pod fluoresc. mikroskopom.) pola membrane fluorescirace jednom, a pola drugom bojom, ali posle nekoliko minuta ce krenuti do potpunog mesanja fluorescentnih polja, sto je direktno dokaz za lateralnu difuziju proteina. Oni ce se tecljivoscu membrane preraspodeliti po citavoj povrsini membrane fuzionisane celije. Ugljeni hidrati se kace ili za lipide ili za proteine i oni grade glikokalis. Cel. memb. je troslojna, a iznad nje se vidi pramenkasti materijal-to je glikokalis (obojeni secerni domeni). Secerni domeni su tu da mehanicki stitepovrsinu cel. memb. i, cak se, kod cel. zivotinja posmatraju kao analog celijskog zida (kada se pogleda sastav cel. zida kod bakterija i biljaka vidi se da su ugljenohidratne prirode). Ti seceri, ztim, privlace ogromne kolicine vode, obolake vode, koji stvaraju termalnu i mehanicku barijeru (izolaciju) i donose nutrijente, molekule, komunikacije ili odnose nepotrebne produkte metabolizma. Postoje primeri da se upravo secerni domeni receptori na cel. memb. (npr. glukolipidi na eritrocitima su odgovorni za formiranje krvnih grupa). Seceri mogu biti razliciti:galaktoze, glukoze...itd. Funkcije celijske membrane ...su razlicite. Ona strukturno uspostavlja celiju, ali nije semi....(nesto). Ona je aktivna struktura celije. To je mesto koje stalno trpi strukturne promene, koje dozvoljava prolaz odredjenim tipovima materije, odlucuje sta moze doci u celiju, ali to nije njena odluka-celija odlucuje sta ce membrana propustiti (ako celija iz unutrasnjosti posalje membranske vezikule akvaporinima, membrana ce propustati ogromne kolicinevode, u suprotnom slucaju propustace malo vode). Funkcija membrane je duboko

16

odredjena zahtevima unutrasnjosti celije i trenutnom fizioloskom statusu celije, sto znaci da mozemo funkcije celijske membrane razdvojiti u dva vida: mehanicka svojstva provodljivosti, sto znaci da cel. memb. (s obzirom na to da celija stalno komunicira sa svojom okolinom) propusta (provodi, pumpa) unutar sebe ili ispumpava van sebe odredjene jone. Zatim, materije koje zele da izbaci, bilo da ih ona sintetise ili je to podsticaj, putem odredjenih transportera unosi ili izbacuje. Moze da vezivanjem odredjene komponente iz spoljasnje sredine dovede do influxa jona(sekundarni odgovor celije), pri cemu govorimo o provodljivosti integralnih (integrisanih) membranskih proteina. Oni su najodgovorniji za ovaj tip transporta kroz membranu. Integrisani membranski proteini imaju i neka druga svojstva/funkcije: 1. ostvarivanje medjucelijskih veza adhezivnog tipa 2. receptori (ugljenohidratna komponenta glikolipida) 3. povezivanje unutrasnjosti celije sa okolocelijskom sredinom i to rade tako sto: a) unutrasnji domen - povezivanje sa citoskeletom b) spoljanji domen - fizicko povezivanje za komponente okolocelijskog matrixa Podatak o latelarnom kretanju proteina nije sasvim tacan. Dolazi do latelarnog kretanja proteina, ali mi ovde govorimo o 2 ...... celije. Kada ih fuzionisemo pod obicnim fluoresc. mikros. vidimo pomeranje tackica. Ako, medjutim, parce membrane dovedemo do izbeljivanja (foto bleaching) unisticemo fluorofore u tom regionu i dobicemo belu prazninu. Kada sukcesivno u toku desetak minuta posmatramo, sta mozemo pretpostaviti da ce se desiti? Znajuci da lateralna difuzija postoji, proteini ce se vratiti ponovo u to belo parce. Neki ce reci da ce belo ostati belo, jer je region unisten. Tacno je sledece: doci ce do delimicnog popunjavanja tog belog prostora, sto nam govori o jednoj vaznoj osobini membrane, a to je da membrana (odnosno celija) ne dozvoljava potpunu pokretljivost, nema nasumicnog, nekontrolisanog kretanja. Odnosno, postoji restrikcija kretanja i proteina i lipida. *npr: u domenu medjucelijskih veza integrisani proteini (njih ima na stotine) kao kopce drze membrane. Nema kretanja lipida koji mogu preskociti tu vezu. Zato hismo sincicijom sa milijardu jedara (sve membrane bi fusionisale) restrikcija kretanja i dodirivanja dve cel. memb. mora da postoji. Zivi svet, zive celije to kontrolisu sintezom ECM koji ne dozvoljava da se fizicki priblize/pridruze membrane ili bas ako moraju da se priblize, on samo na odredjenim delovima dozvoljava to povezivanje. Proteini imaju restrikciju kretanja tako sto se povezuju sa elementima citoskeleta. Aktinski filamenti, jako zastupljeni u submembranskom domenu, se najcesce ili direktno ili preko pridruzenih proteina prikace za integralni protein i drze ga na tom mestu. Dakle, ako endocitozom zelite da unesete neke molekule u celiju, receptori za te molekule bice na jednom parcetu membrane, tim receptorima nece biti dozvoljeno da sami setaju po celoj povrsini membrane. Isto tako i vezivanje komponente okolocelijskog matrixa prakticni efekat restrikcije kretanja-ako se protein veze za okolocelijski fibril (kolagen, elastin) automatski ce se fiksirati (+veza sa citoskeletom) i domen membrane ce biti od tog proteina do sledecag i zato su prisutna i lipidna ostrvca, zato postoji mogucnost da se sfingolipidi i holesteroli zadrze u domenu lipidnih ostrvaca. Nije sasvim tacno da je potpuno dozvoljeno kretanje lipida i proteina u membrani, naprotiv, postoji restrikcija njihovog pokretanja. {e sad ide gomiletina slajdova}

17

OKOLINA ĆELIJE - VEZE ĆELIJE I NJENE OKOLINE Okolocelijske sredine Kako se formiraju okolocelijske sredine od strane celija, iz cega su izgradjene, kako celije uspostavljaju vezu sa okolocelijskim sredinama? Prokarioti Kada se radi o prokariotima, najcesce govorimo o jednoj celiji, jednom celijskom tipu=jedan organizam/jedinka. U okviru pojedinacinih prokariotskih celija, mozemo opisivati razne tipove bakterijskih celija koje postoje. Mi cemo se drzati samo onih domena koji se ticu struktuiranja prokariotske celije- drzacemo se tipicnih okolocelijskih sredina, ili celijskih zidova. Prokariotski tip celije formira sopstvenu okolocelijsku sredinu u vidu celijskog zida. Uobicajeno je da sve prokariotske celije grade celijski zid, sa izuzetkom nekih intracelijskih parazita. Moze se uociti nekoliko tipova strukture celijskog zida prokariotskih organizama. Jedna od najstarijih podela je na tipove celijskih zidova kod bakterija, odnosno prokariotskih celija i to je podela na Gram + i Gram – celijske zidove u zavisnosti od toga kakvo je bojenje po gramu. Osim G+ i G- celijskih zidova, posmatracemo gradju cel. zida kod tzv. acid fast bakterija. (slika ) Kada se posmatra pod EM G+ bakterija vidi se da se oko cel. membrane nalazi jedan relativno debeo, homogen sivi sloj koji se naziva celijski zid. Struktura cel. zida G+ bakterija: latelarno se slazu ugljeno-hidratni molekuli koji su povezani molekulima teihojne kiseline (mureini). tehojna kiselina ne samo sto prozima citavom duzinom slojeve mureina, vec se moze vezivati za fosfolipidne molekule celijske membrane. U tom slucaju govorimo o lipotehojnoj kiselini. Lipotehojna kiselina je ujedno fizicko povezivanje celijskog zida (spec. okolocel. sredine) za celiju (cel. membranu). U slucaju G- bakterija cel. zid se tesko razlikuje od cel. membrane, jer je cel. zid izuzetno tanak, pogotovo ako se poredi sa G+ bakterijma, ali je slozenije strukture. I ovako tanak zid pokazuje dva distinktivna sloja. Prvi sloj je takodje od peptidoglukana (mureina), on je neposredno iznad cel. membrane i izuzetno je tanak. Iznad njega nalazi se membrana cel. zida (spoljasnja membrana). Iako je na prvi pogled membrana cel. zida identicna cel. membrani (zapaza se dvoslojnost u organizaciji lipida i mozaicni raspored proteina) ipak postoji znacajna razlika u hem. sastavu spoljasnjeg sloja. Spoljasnji sloj je izgradjen od liposaharida. Na strukturnom modelu pokazano je da se spoljasnji monosloj membrane cel. zida razlikuje znacajno od unutrasnjeg monosloja koji jeko, po fosfolipidnidnom sloju lici na cel. membranu. Proteini koji su pridruzeni membrani cel. zida vezuju se za murine (peptidoglukane) i ostvarujuci cvrstu fizicku vezu ova dva sloja zapravo cine ih jednom celovitom strukturom koju nazivamo Gram- cel. zid. Uobicajeno je da se prostor izmedju cel. zida i cel. membrane naziva periplazmaticni prostor (periplazma). Iako ovde nije predstavljen, postoji jedan proteinski konektor (protein koji povezue cel. zid sa cel. memb.), prosto da naglazi da sama g- bakterija aktivno regulise prikopcavanje cel. zida . Znaci, postoje i integralni proteini cel. memb, a ne njoj pridruzeni, koji ce se vezivati ili uranjati u ovaj sloj peptidoglukana i ostvariti fizicku vezu cel. meb sa cel. zidom. U slucaju g- bakterija, [poveziaci cel. memb i cel. zida su proteini za razliku od g+ , gde je to liptehojna kiselina. Iznad cel. memb. kod g- bakterija postoji jos jedna, malo izmenjena membrana. Evolutivno, g- bakterije su zadrzale integralne proteine u membrani cel. zida do te mere da se kaze da je membrana cel. zida potpuno porozna. Proteini koji dopustaju tu poroznost nazivaju se porini. Dakle, memb. cel. zida sadrzi veliki broj integrisanih porina koji omogucavaju visoku propustljivost. Moreini i kod g- i kod g+ , stvaraju neku vrstu 3 D mreze sa okcima u kojima

18

se zadrzava voda sa hranljivim sastojcima ili ekskretovanim matabolitima. Na taj nacin bakterijske cel. okruzene specificnom okolocelijskom sredinom (cel. zid) cine jednu vrstu mehanicke, metabolicke i termicke izolacije u odnosu na ekolosku nisu u kojoj te bakterije zive, bila to voda, vazduh, zemljiste... Kod acid-fast bakterija vidimo da postoji kombinacija g+ i g- u struturnom smislu, postoji dvoslojnost u gradji cel. zida, postoje ugljenohidratni domeni. Postoji nesto sto lici na spoljasnju membranu, ali vidimo da cel. zid ovakvog tipa bakterija je izgradjen od mikolicne kiseline, lipoarabihemana i arabinoglaktana koji se samo prividno kombinuju u dvoslojni cel. zid. Moze se zapaziti da zbog prisustva kiseline i ovih secera dolazi do odbijanja negativnog naelektrisanja i vode a samim tim i dotoka do cel. membrane, pa se na struturnom modelu moze videti da su i ovde, iako nije prava membrana, integrisani proteini tipa porina. Receno je da kod prokariota moze doci do sintetisanja, izbacivanja i do formiranja jos jednog dodatno0g omotaca oko bakterijske celije, a to je bakterijska kapsula. Ona je najcesce ugljeno-hidratna, ali moze biti i proteinska resetka. Iako na SM kapsula deluje belo, kao da nema nicega u njoj, pod EM se vidi da je ona od molina, debele struture koja dodatno stiti prokariotki organizam. Ni cel. zid ni cel. kapsula nisu okolocel. sredina, u smislu da te cel. zive u ekoloskoj nisi, za njih je ekoloske nisa H2O ili vazduh, i cel. zid i kapsula su u direktnom kontaktu sa ekoloskom nisom u kojoj zive. Primeceno je da neke prokariotske celije mogu imitirati evoluciju visecelijskih eukariotkih organizama, odnosno, sintetisu kapsule koje se fuzionisu u vrstu bakterijskog filma. Kapsule se mogu fuzionisati i stvarati vrstu okolocel. sredine u koju uranjaju specificnim dodacima bakterijske celije. Ovo je vrsta primitivnog tkiva jer ce kasnije videti da se cel. eukariota udruzuju u tkivima, upravo putem lucenja odredjenih komponenti specificne okolocel.... {ne vidi se na fotokopije sta pise dalje} Ti specificni dodaci kojima prokariotske celije uranjaju u biofilm nazivaju se pili. (slika) To su relativno kratki brojni i dlakoviti nastavci, koji vire sa povrsine bakterijske celije. Oni predstavljaju proteinske fibrile izgradjene od pilina koji polaze iz citoplazme, neposredno ispod membrane celije, prolaze kroz cel. membranu, cel. zid i mi ih vidimo kao dlakolike ekstenzije u okolocel. matrixu. Iako konjugacini pili nemaju nikakve veze sa adhezivnim, pomenucemo ih jer prokariotske celije koje se mogu konjugovati formiraju jedan dugacki kojiugacioni pilus, suplju cev kroz koju mogu razmenjivati plazmide (delove DNK). Eukarioti Kod eukariota (cel. zivotinja) mozemo reci po tipovima tkiva koji grade organe kakve celije postoje. Postoji do 200 razlicitih tipova celija, sto znaci da pod Em ili SM mozemo jasno uociti razliku u obliku duzini izgledu neurona, jajne celije, hepaticita, (slika ) hondrocita, kostane celije, adipocita. itd. Svaka ta celija poseduje veoma slicnu celijsku memb. i vemo slicnu internu strukturu. Ono sto ih drasticno razlikuje i sto im daje tkivnu specificnost jeste okolocel matrix, koji, najcesce, sintetisu, izbacuju van celije i tu oko nje, te komponente okolocel. matrixa (slika ) sklapaju se u vrlo specificnu trodimenzionu strukturu. To su, zapravo, vrlo specificni ogrtaci celija u pojedinim tkivima i mi tacno razlikujemo komponente okolocel. Matrixa ili okolicel. matrixa (mnozina) s obzirom na tako veliki broj razlicitih tipova celija. Komponente okolocel.Matrixa mozemo grupisati na: klikozaminoglikane, proteoglikane i vlakna (fibrili (slika ) Glikozaminoglikani su: 1. heparan-sulfat 2. hondritin-sulfat 3. dermatan-sulfat

19

4. keratan-sulfat 5. heparin 6. hijaluronan (hijaluronska kis)

(slika )

Pocetni deo naziva (heparan, hondritin,...) je vezan za (oznacava) tkivnu specificnost (da li je izolovan iz dermisa, hrskavice itd.) a –sulfat nam govori da se radi o velikom prisustvu sulfatnih grupa koje glukozaminoglikanima daju negativno nelektrisanje sto znaci da ce se te komponente okolocel. matrixa ponasati tako da ce privlaciti velike kolicine vode i stvarati oko cel. membrane oblak vodene sredine. (slika ) Drugi tip molekula u ECM (ekstra celularnom matrixu) nosi naziv peptidoglukan i odmah nam sugerise da su se glikozaminoglikani povezali sa nekim proteinima i sagradili komleksniju, proteoglikansku strukturu koju oznacavamo kao proteoglikani. Najpoznatiji proteoglikani: 1. agrekan 2. sindekan 3. perlekan. Konacno, vlakna koja mozemo naci u ECM kod zivotinja sintetišu bas svi tipovi ćelija. (slika) Najcesce sintezu kolagenih i elasticnih vlakana konkretno u kozi, u potkoznom tkivu vrse fibroblast. Vlakna ECM se ne sintetisu u celijama kao tkiva (kao gotove vlaknaste strukture), najcesce je njihova sinteza u proformi(monomernoj), koja se sekretuje van celijea onda se u EC prostoru vrsi polimerizacija, agregacija, finalna dorada i sklapanje u okolocel. fibrile ili vlakna okolocel. matrixa. Struktura oko same eukariotske celije zivotinja, zaista izgleda kao suma. Izgleda 3D, i prilicno neuredno na prvi pogled. Tek kada postavimo svaku komponentu na meto koje joj pripada, vidimo da je ta uredjenost visoka i da je uredjenost ECM-a u funkciji mehanicke zastite celija, da je celija entitet, dakle da je odvojena od susednih celija (da ne dodje da sincicijumaÆfuzije membrana) i da se cak sintezom specificnog ECM-a omoguci pojedinim domenima cel membrane da to samo bude prilaz. Kada se prilazi jednoj prilazi se samo onom domenu okolocelijske sredine gde je to dozvoljeno. Ta slozena, kompleksna strutura oko celije je fizicki povezana integralnim proteinima cel. membrane, i to s specificnim tipom integralnih proteina. (slika elastini) Da bi se naglasilo da je to povezivanje komponenati ECM sa cel. memb. u svrhu integracije, te dve strukture proteina zaduzenih za tu fizicku vezu, zovu se integrini. (ne brkati sa integralnim membranskim proteinima!!!) Na ovoj semi se moze videti da postoji i specificna organizacija citoplazme neposredno ispod cel. membrane (submembranskog regiona); da su tu nagomilani elementi citoskeleta, ne bi li se preko integrina ostvarila sada posredna fizicka veza komponenti okolocel. sredine i same cel. unutrasnjosti (slika integrini) sto je izuzetno bitno jer nase celije reaguju i na mehanicku (dodir), na promenu pH, promenu metabolita, dolazak odredjenih hormona itd. Svi oni se primaju kroz ili putem okolocel. sredine. Proteoglikani mogu biti integralni proteini celijske membrane koji su boato secerno dekorisani (glikokalix). Kada posmatramo model cel. memb., ugljeno-hidratna komponenta se moze nalaziti na fosfolipidima, kada govorimo o glikolipidima, a moze biti i u matrixu okolocel sredine, jer ti proteini duboko zalaze u okolinu celije svojim ekstracel. domenom, prakticno cine njen neodvojivi deo. Mozemo reci da su ti glikoproteini zapravo proteoglikani sa stanovista okolocel. sredine. Jedan od najpoznatijih proteoglikana jeste agreakan (ili: agreakanski komplex), on je karakteristican za okolocelijski matrix hijalniske hrskavice koja oblaze zglobove. Ukratko, agreganski komplex je izgradjen tako sto se na jednu dugacku niz hijaluronske kiseline zakacuju u ogromnom broju, glikozaminoglikani, ali tako da se oni

20

(dlakolike strukture) vezuju za centralni protein (centralno proteinsko jezgro) cineci proteoglikan, koji se dodatno putem vezujucih proteina (linkera) prikacinje za hijaluronsku kiselinu. Kada gledamo agreganski komlex, vidimo nesto sto podseca na jelkice-to su proteoglikani. U matrixu hrskavice osim agrekana postoje i brojni fibrili. Kolageni fibrili su najzastupljniji po tipu vlakana u ECM. Oni su ogromna proteinska familija. Postoji mnogo formi kolagena. neki su solubilni (ili golubilni, ne mogu da procitam) pa ih ne vidimo kao vlakna, neki nisu (primarno se udruzuju, pa su zapravo vlakna). Ovde je data jedna od najopstijih podela kolagena na one koji 1. stvaraju vlakna 2. stvaraju mreze 3. kolageni povezivaci (koji sluze da integrisu/povezu komponente ECM, najcesce solobilni, da povezu glikozaminoglikane i proteoglikane i da sagrade specificnu trodimenzionalnu struturu). Vlaknasti kolageni, povezuju se u monomerne jedinice-dobija se jedno relativno debelo, dugacko vlakno karakteristicno po prugavosti. Ta prugavost oznacava poziciju N-ICterminusa monomera. Kolageni su za ECM najcvrsce struture. Oni su tu da daju ECM-u cvrstinu, mehanicki otpor pritiscima. Kolageni koji daju mreze, lice na pauke, poseduju domene koji mogu da se povezuju sa drugim kolagenima i formiraju mreze malo manjeuredjene ili visoko uredjene u tom prostoru oko celije. Elasticna vlakna, elastini, za razliku od kolagena koji daju cvrstinu (rigidnost), vise su specijalizovani za elasticitet ECM-a. Radi se o proteinima koji mogu da zauzimaju ovakve konformacione forme, reagovati na istezanja i sabijanja ECM-a. Sve komponente ECM-a (vlakna, jelkaste strukture, pojedincne proteinske trukture, velike kolicine vode) funkcionisu tako plasticna boca. **ako uzmata plasticnu bocu praznu i zgazite je, spljeskacete je. Ako je napunite vodom, njeni zidovi ce se opirati mehanickom pritisku i nece moci da se spljeska. Voda i komponente okolocel. sredine, koji dovode i vezuju tu vodu upravo to isto rade celijama, znaci pomaze da imaju jedan mehanicki cvrst omotc oko sebe. Elasticna vlakna su nesto tanja od kolagenih i vrlo su nepravilno rasporedjena u prostoru. Retikularna vlakna su zaduzena za formiranje (organizovanje) delikatne sredine unutar tkiva, recimo kostana srz, limfni cvorovi, slezina. Svi ti mekani organi su puni vode, krvi i limfe i zapravo u ECM-u sdrze mnogo cesce retikularna vlakna. Kolageni i elastini su vise karakteristicnoi za kozu, sluzokozu, podepitelske lamine... Specificne veze koje celija ostvaruje sa ECM-om: 1. strukturno neuoblicene 2. strukturno uoblicene Strukturno uoblicene veze se mogu videti nekim tipom mikroskopa (najcesce EM-om) i one su znacajno redje od strukturno neuoblicenih, (slika veya ćelije) odnosno pojedinacnihstrukturno neoblicene Strukturno neuoblicene, one se zasnivaju na pojedinacnom povezivanju integralnog molekula membrane sa komponentom ECM-a.Uglanom se zasnivaju na vec pomenutim: a) glikokalix (integralni membranski proteini dekorisani secerima i predstavlja integralni deo okolocelijskog prostora npr. glikozaami-noglukan), ili b) integrini (integralni membranski proteini specificno zaduzeni za povezivanje sa Ecm-om) Strukturno uoblicene su zapravo samo jedan tip hemidezmozomi. (slika) Integrini su zapravo dimer α i β lanca. Oni poseduju ona tipicna 3 domena karakteristicna za integralne proteine mebrane. Znaci: spoljasnji, membranski i citoplazmatski deo. Pri cemu na ovoj shemi nije prikzano, na njima dominira ekstracel. domen koji visestruko puta premasuje visinu ili duzinu membranskog odnosno citoplazmatskog domena. Taj spoljasnji domen integrina je globularan, oznacava se kao glava integrinskih molekula, moze za sebe vezivati i

21

glikozaminoglikane i proteoglikane i fibrile ECM-a. Globularni domeni integrina mogu vezivati sve tri komponente OCM-a (okolocel. matriksa). Osim njih, globularni domeni integrina mogu vezivati i jone i najceshce su to joni Ca 2+. Joni kalcijuma najcesce su faktori koji regulishu kolichinu povezivanja integrina sa komponentama OCM-a i kvalitet tog povezivanja. Znaci, nije svejedno da li ce se za integrine vezati samo kolageni fibrili, ili za jedan kolageni fibril, pa za sledeci glikozaminoglikan.... Integrini su takodje, signalni molekuli. To znaci da celija iz okolocel. sredine prima signal direktno putem integrina i taj signal prenosi na unutrashnjost celije dvojako- ili na citoskelet na AF-e ili putem slozenih sekundarnih ili tercijalnih mesendzera. Znachi taj signal se upucuje ka nukleusu i promeni genske {ne vidi se dalje na fotokopiji}... .... nukleusu bude indukovano otvaranje gena, prepisivanje i promena odredjenog tipa proteina u citoplazmi kao odgovor na taj pritisak. Znahi, integrini su ma koliko to jednostavno izgledalo, veoma znachajni signalni molekuli celije, pogotovo shto je signal na nivou cel. membrane vishestruko prenet na unutrashnje celijske komponente (citoskelet, citoplazma, organele, pa i sam nukleus). No, integrini nisu jedini integralni proteini celijijske membrane zadzeni za vezu sa ECM-om. To si josh i integralni membranski proteini, zaduzeni za povezivanje sa nechim izvan celije: mucin, selektin, kaderin, itd. Poludezmozom (strukturno uoblichene/vidljive veze celije sa okolocel. matrixom) prisutne su samo onda kada je tako dobro uredjen ECM, da se takodje i on moze viet na nivo svetlose ili EM. Ako posmatramo hepatocit/hondrocit i njegovu vezu sa ECM-om, necemo videti ECM kao poseban oko svake celije, vec ce se on videti kao homogena, bledoroze struktura u kojoj se nalaze pojedinachne celije u lakunama (belichastim prostorima). Postoji veza tih celija sa ECM-om, ali se ona takodje nece videti, jer su one na nivou pojedinachnih molekula. Ali, ako se gledaju epitelna tkiva,(konkretno, jednoslojni cilindrichni epitel tankog creva) videce se jedan niz celija cilindricnih celija, ali ce se posmatranjem njihovog ECM-a zakljuchiti da jedan deo njihove okoline predstavlja lumen creva, odnosno, videce se da se na njihovoj povrshini nalazi jako debeo glikoklaix, a iznad njega lumen creva {ne vidi se....}... ... suprotne, videcese da te cilindrichne celije leze na jednoj relativno debeloj jako roze liniji. Ta linija posmatrana EM-om je jeko debela struktuirana okolocel. sredina koja se naziva bazalna lamina ili podepitelska lamina (nekada se nepravilno nazivala bazalna membrana, a danas se zna da je to okolocel. sredina diferencirana u plochu na kojoj svojom bazom leze sve celije jednoslojnog epitela). Bazalna lamina je izgradjena od brojnih matrixnih molekula, matrixnih fibrila koji cine visoko diferenciranu 3D mrezu.Kako stupaju u vezu sa tako visoko uredjenom sredinom?Ako se prati bazalna/podepitelska lamina,vide se brojne stuktuirane veze same epitelne celije (slika 'okolocel.sredina') sa svojom okolocel. sredinom. Polidezmozomi se tako nazivaju zato shto postoje dezmozomi (celovite veze koje celije mogu uspostavljati). Cel. membrana je u nivou poludezmozoma (hemidezmozoma) zadebljala, ali zadrzava prividnu troslojnost. Osim zadebljale cel. memb.primecuje se i intracelijsko zadebljanje u vidu diska/plocice u niivou hemidezmo-zoma i , konachno, vide se fibrili koji kao da uranjaju u te elektron-guste plochice. (slika 'poludezmozom') Okolocelijski matrix kod biljaka Kod biljaka, specifichna okolocel. sredina je celijski zid drugachije organizovan nego kod prokariota, mada se moze reci da su ugljeni-hidrati tokom evolucije, kao organski molekuli, uzeli na sebe tu sposobnost stvaranja okolocel. sredina mnogo vise nego druge komponente celije. Cel. zid kod biljaka je iznad cel.membrane. Najceshce govorimo o (slika) primarnom cel. zidu kod meristemskih, nediferenciranih celij biljaka ili o sekundarnom cel. zidu ili tercijarnom cel. zidu kada govorimo o diferenciranim celijama biljnih tkiva i organa. Cel. zid biljaka, konkretno primarni, izgradjen je od slojeva/lamela

22

koje se nizu iznad celijske membrane. Njih grade (organizuju) celulozni fibrili(jako roze). Oni su paralenlno pozicionirani u okviru jedne lamele ali kada posmatramo susedne lamele, vidimo da je pravac pruzanja celuloznih fibrila ....(nesto sto se ne vidi) zbog toga da bi celijski zid biljaka buo rigidni (slika 'cel. zid') i otporniji na mehanichke uticaje. Celulozni fibrili susednih lamela povezani su molekulima hemiceluloze (plave trake), a celokupnu lamelarnu strukturu celijskog zida ispunjava zelatinozna materija-pektin. On privlachi H2O i ispunjava prostor cel. zida. komponente koje sintetishu prekursore hemiceluloze, celuloze i pektina u celijama biljaka se locirane u dva kompartmnta. Prekursore celuloznih fibrila (mikrocelulozne fibrile) sintetishu komlexi celulozo-sintaze (sintetaze) koje se nalaze u cel. membrani i kada se posmatra cel. membrana biljne cel. vide se mikrocelulozni fibrili koji kao da izviru iz unutrashnjosti same celije. Zpravo, to je jedan od nachina da se ostvari fizichka veza celijske membrane i cel. zida kod biljaka- putem stalnog izviranja cel. membrane i njihovog dubokog komponovanja u celulozne fibrile lamela, odnosno, sam cel. zid. Hemiceluloza i pektin se sintetishu ispod nivo cel. membrane u regionima EndoPlazminog Retikuluma i kompexa Goldzi i bivaju procesom egzocitoze izbacheni u okolocel. matrix. Ovako ptravilna orjentacija celuloznih fibrila u okviru jedne lamele, odnosno, promena orjentacije medju susednim lamelama postize se tako sto ispod cel. membra-ne u biljnoj celiji leze mikrotubule koje se postavljaju paralelno, povezuju sa celijskom membranom, i na taj nachin formiraju nekakve membranse rovove. (slika) Kako su usmerene mikrotubule ispod celijske membrane, na taj isti nachin ce se usmeravati celulozni fibril. Dakle, kada celija zeli da promeni pravac pruzanja ili orjentaciju celuloznih fibrila, ona ce to uraditi tako shto ce komlexe celulozo-sintetaze u membrani da pomeri putem mikrotubula. U celiji ipak nekako kao da dolazi do potpunog odvajanja celijske membrane od cel. zida (vidi se kao loptica u centru koja se nalazi u shupljini koju stvara cel. zid), ali se veruje da postoje odredjeni povezivachi koji se narushavaju tim osmotskim disbalansom i dolazi do odvajanja cel. membrane od cel. zida. Drugim rechima, nije turgor iz vakuole jedini koji vrshi pritisak citoplazme i cel. membrane na cel. zid, vec se i cel.membrana delimichno prikopchava za ovako rigidan cel. zid. Celijski zid kod biljak, inache moze biti vrlo komplexan, na samo zbog lamelarnosti, nego i zbog formiranja visheslojnih sekundarnih cel. zidova, iako se smatra da su komponente sekundarnog cel. zida zapravo indentichne komponentama primarnog cel. zida, samo shto u njima dominiraju celulozni fibrili, pa su jako chvrsti, rigidni i najcheshce nepropustljivi za vodu za rzliku od prim. cel. zida koji je mekan, elastichan i dozvoljava da celija raste. Cel. zidovi se mogu impregnirati i nekim drugim materijama bilo organskim, bilo neorganskim i na taj nachin se povecava njihova otpornost. *** Potsetnik za okoloceljsku sredinu *** Za prokariote smo videli da mogu da prave neku vrstu primitivnih tkiva, da se u okviru njih udruzuju i da formiraju nekakve okolocel. veze za koje ne znamo sa sigurnoshcu da li su proteinskog tipa, da li su sluchajne, da li su po tipu dodirivalja adhevzivnog tipa ili neshto trece. To ostaje da se ispita. Ali, prokarioti pokazuju tip organi-zacije kao shto je biofilm. Biofilm je karakteristichan za dentalne plake ili plake na sochivima za vid. (slika) Sto se tiche eukariota rekli smo da su komonente okolocel. sredine sulfovni glukozaminoglukani + hijarulonska kiselina, proteoglikani= glukozaminoglukani + proteini. Ti proteini mogu biti integralni proteini cel. membrane ili agrekanski komlexi. Postoje i fibrili: kolageni, elastichni i u manjoj meri, retikularni. Takodje smo naglasili da postoji vrlo izrazena veza komponenti okolocelijske sredine sa celijskom memranom i citoskeletom ispod

23

membrane. Kada posmetramo vezu celije sa OCM-om postoje: neuoblichene i uoblichene veze. Pomenuli smo da samo u jednom sluchaju mozemo govoriti o uoblichenim, stukturnim vezma i tio u sluchaju celija epitela tankog creva koje su visoke, cilindrichne, imaju visoku polarizovanost, i svojim bazalnim delom membrane leze na visokodiferenciranoj okolocel. sredini koja se naziva bazalna/podepitelska lamina. U tom nivoucel. membrane gde je okolocelijska sredina bazalna lamina, celija se povezuje sa njom putem poludezmozoma. Poludezmozom je, zapravo, jedna stuktura koja sadrzi visoko koncentrovane integralne proteine (na hiljade). Za njih se unutar celije vezuju brojni submembranski proteini, pridruzeni (plakini), i na taj nachin, u stavri povezuju unutrashnjost celije sa podepitelskom laminom i ta veza je izuzetno chvrsta. Takodje, okolocelijska sredina na vrhu eritrocita je specifichna i postoje celije diferencirane u vidu prstolikih izrashtaja (mikroresica) koje nose jako debeo i mocan glikokalix. Shta je okolina za laterale ove celije? Susedne celije. Znachi, u okolocelijsku sredinu s pravom mozemo ubrojiti i susedne celije, kada govorimo o celijama koje su komponovane u tkivo. Dve celije mogu biti priblizene na dovoljno mali razmak da mogu da ostvare medjucel. veze ili da se chak priblizene ne dodiruju i da ne bude dozvoljen multikontakt celijskih membrana koji bi doveo do fuzije celija.Kako komponente glikoalixa (ne okolocel. matrixa koji fizichki udaljava dve celije po desetine µm, nego kada se dve celije toliko priblizene da su skoro u kontaktu). Dakle glikozolirani proteini i lipidi, se vizichki odbiaju, chak iako se dodiruju, to je nekakva distanca koja ne dozvoljava da se dve celijske membrane ne priblize suvishe. Ovakvo priblizavanje i povezivanje dve celije je gotovo do savrshenstva dovedeno u sluchaju medjucel. veza. Medjucelijske veze rekli smo da se celija vezuje sa ECM integralnim membranskim proteinima, integrinom nema nikakvog razloga da celija menja strategiju ako je ta okolocel. sredina sada druga celija. Ponovo ce se isti mehanizam primeniti. Imacemo integralne membranske proteine potpuno slichne integrinima, koji ce imati visoko razvijene, dugachke ekstracelijske domene, ali ce u ovom sluchaju najcheshce, njihov ekstracelijski domen biti zaduzen za homotipnu interakciju. Znachi, nece biti integrin (slika) sa kolagenim vlaknm, nego ce biti kadherin sa kadherinom. To znachi da ce dve celije, susedne, koje eksprimiraju kadherine, selektine i Ig superfamiliju moci da se povezuju u prostoru tako shto ce dozvoliti ekstracelijskim domenima da se fizichki vezuju jedan za drugi. Ovo je molekulski mehanizam koji pochiva u osnovi medjucel. veza. Medjucelijske veze moze deliti na razlichite nachine: Po strukturi: a) uoblichene 9vidimo ih pod mikroskopom) b) strukturno neuoblichene (mali broj molekula pa ih ne vidimo) Po funkciji: a) ADHERENS (athezivne) b) COMUNICANS (komunikacijske) Kako citoloshki mozemo najlakshe da pratimo i da studiramo te veze, koji su molekuli (slika) Komponente medjucelijskih veza su prvo dve celije. One imaju celijske membrane koje pod eM-om izgledaju prividno troslojne (vide se 3+3 sloja) i izmedju njih se uochava relativno uzan medjucelijski prostor i on nije prazan ali je sveden na neki minimum koji dozvoljava formiranje medjucelijskih veza. U citologiji je dosta staro ali josh uvek (slika) uobichajeno kazemo da je ovo sedmoslojni izgled (3 sloja jedne membrane, 3 sloja druge i medjucelijski prostor). Da bi se pravilno posmatrale medjucelijske veze moramo posmatrati transmembranske vezujuce proteine. prvo nas interesuje membrana, koji su to

24

integralni proteini koji ostvaruju vezu dve celije (na shemi se vidi da su transmembranski proteini razlichiti). Zatim nas zanima shta je u7 submembranskom domenu pridruzeno integralnim povezivajucim proteinima, odnosno, koji su plakini(plavi i zeleni na shemi), jer ti dodatni stvaraju nekakva zadebljanja (zakrchenja) uz celijsku membranu i oznachavaju se kao plake,adhezivne plake. Te adhezivne plake (plakini) ne samo shto se vezuju za transmembranske integralne proteine, (slika) koji ostvaruju vezu, vec se vezuju i za elemente citoskeleta koji su treca, jako vazna komponenta svake medjucel. veze. Mi cemo ici stereotipno kroz razlichite tipove veza: koji su transmembranski proteini, kako se povezuju, koji su plakini i koji su elementi citoskeleta. Celija ima tri osnovna dela citoskeleta: AF-Aktinski Filamenti(ispunjavaju chitavu celiju i narochito su submembranski locirani, MT-MikroTubule ( Koje kao da izviru iz jednog centra-centrozom i trakasto se pruzaju ka periferiji), IF-Intermedijarni Filamenti (po debljini su izmedju AF i MT, stvaraju kavez oko nukleusa, tako da daju mehanichku chvrstinu celiji). Jedan od nachina za citoloshko tipiziranje celije jeste pracenje morfologije veze. Gde se ta veza nalazi na celiji i kako se 3D prostire ta veza, da li je traka, tachka ili neshto drugo. Zatim kakav je citoloshki izgled veze, da li se membrane menjaju po izgledu na mestima gde stupaju u vezu. kakav je medjucelijski prostor u nivou veze i konachno, kakav je izgled submembranske citoplazme, da li ona menja izgled u odnosu na ostatak koji se vidi oko nivoa veze. Na kraju molekularno model veze, molekulski osnov gradjenja veze i to je onaj transmembranski vezujuci protein. VEZE ADHERENS TIPA Model-sistem na kome se studiraju medjucelijske veze je jednoslojni cilindrichni epitel tankog creva, odnosno, enterocit. On je jako zgoden jer je to jedna visokodiferencirana, polarizovana celija, gde se vrlo jasno uochava stalnost i pozicija medjucel. veza. (slika) Kada posmatramo sa apexa ka bazi celije, bochne strane enterocita, videcmo pravilnost u poziciji adherens veza i to ovim redom: Æ najvishe pozicionirana (neposredno uz mikroresice) nalazi se prva veza koja se naziva zonula occludens (veza po tipu okluzije) Æ ispod zonule occludens jeste zonula adherens, malo ispod nje se nalazi tachkasta veza Æ macula adherens (dezmozom). Ispod nivoa dezmozoma mogu se uochiti eze koje pripadaju vezama komunikans tipa, a oznachavaju se kao Æ pukotinaste veze. Zonula occludens posmatrana u 3d, vidimo je u obliku shpanske kragne oko celije. prostire se u vidu jednog chvrstog pojasa oko vrha enterocite. kada posmatramo citoloshki izgled..... (ne vidi se dalje) (slika) Zona okluzije dve membrane nacin ostvarivanja ove medjucelijske veze, odnosno mestimicno mozemo da konstatujemo petoslojnost ove veze sto znaci da se u medjuvremenu izgubio medjucelijski prostor (7- 5) a dva spoljasnja monosloja susednih celijskih membrana su se „pomesali“, vizuelno izgleda tako (od 3+3, dobili smo fuziju membrana, odnosno prividnu petoslojnost). Kao sto je troslojnost membrane prividna/artefakt, na isti nacin je i petoslojnost prividna. Kada pogledamo citavom duzinom te veze, z.o., kako se fuzija membrana ostvaruje mi vidimo da do fuzije membrana ni ne dolazi, vec dolazi do ostvarivanja tackaste veze, tackaste fuzije, odnosno povezivanja transmembranskih vezujucih proteina koji se zovu klaudini i okludini. To su jako veliki proteini u smislu da mnogo puta prolaze kroz celijsku membranu, pa formiraju jednu vrstu plocice, njihova ekstracelijska

25

povrsina je velika ali taj domen nije visok. Znaci oni nisu ekstracelijski visoki vec su naprotiv vrlo niski, ali su zato po povrsini veliki i tu vezu najlakse mozete zamisliti ako zamislite povezivanje 2 drihera na tkanini. Kao sto se prikopcavanjem drihera spajaju 2 parceta tkanine, na isti nacin dolazi do driherskog prikopcavanja klaudina ili okludina u prostoru. Znaci, medjucelijski prostor je sveden na minimum, prakticno, medjucelijski prostor je visina 2 klaudinska molekula. S obzirom da je to toliko malo,hiljaditi delovi nm-a, ??? cini da su tu membrane jednim svojim slojem fuzionisane.(slika) Klaudini ili okludini formiraju rovove, granate rovove, koji se prostiru citavom duzinom veze stvarajuci na taj nacin jednu vrlo cvrstu, neprobojnu vezu koja ne dozvoljava nikakvo mesanje ekstacelijske sredine tj. svega onog sto je u lumenu creva, sa medjucelijskim prostorom izmedju celija i, eventualno, ulaz svih tih antigena i nezeljenih patogena dalje u organizam kroz tu vezu jer se radi o jednom sloju celija; one moraju da budu dobro obezbedjene jer trpe stalan pritisak hrane iz lumena creva i razlicite antigene i patogene koji zele da naruse strukturu tog jednoslojnog epitala i izvrse invaziju organizma. Klaudinima i okludinima pridruzeni su i plakini sa unutrasnje strane membrane i ti plakini su oznaceni kao zonulini (to je familija zonulina: zonulin 1, 2 i 3 – loptasti, zeleni proteini) kao i singulin (plavi trakasti protein sa globularnim domenima preko kojih se vezuje za zonuline npr.,a svojim repnim regionom se vezuje za elemente citoskeleta). Citoskeletni elementi u slucaju z.occludens su vrlo tanki, fini aktinski filamenti i oni se ne mogu videti pod elektricnim mikroskopom, tj. citoplazma u nivou z.o. pod elektronsim mikroskopom izgleda gotovo identicna ostatku citoplazme celije. Tu se nalaze i nekakve kinaze jer i ako je u pitanju izuzetno cvrsta veza, zato se i zove okluzija, ipak postoji nacin da ih celija blago remodelira fosforilisanjem ovih proteina i zato su A kinaze?? najcesce prisutne u ovim regionima. (Zasto se kaze klaudini ili okludini, od cega zavisi da li ce biti jedan ili drugi tip proteina u vezi? To zavisi od tkiva koje posmatramo, a posto oni mogu homotipno i heterotipno da se povezuju izgleda da od toga zavisi i jacina veze. Nije do sada precizno receno zbog cega su ili klaudini i okludini) (slika) ???...odmah ispod nivoa z.o. takodje u 3D tip spanske kragne, kao traka obavija celiju. Prividna sedmoslojnost je ocuvana iako su celije prilicno priblizene u odnosnu na „regularni“ medjucelijski prostor. Membrane nisu zadebljale ali se ipak sumembranski uocava nekakva mreza, malo zgusnuce koje zse dublje ka citoplazmi pretvara u aktinske filamente. Uocavamo intenzivno aktinske filamente. Transmembranski vezujuci proteni su ovde kadherini. Oni su homotipni u povezivanju i najcesce za to potrazuju jone Ca2+. Plakini su mnogobrojni a neki od njih su npr. katenin i vinkulin?? (oni su ujedno u vezi sa citoskeletnim elementima i to aktinskim filamentima (AF). AF iz nivoa za.?? Povezivace se sa AF-a koji dolaze iz mikroresica, preplitace se i formirati strukturu koja se zove terminalno tkanje, mreza koja trpi pritisak ogromno povecane povrsine celijske membrane. Macula adherens (dezmozom) Zove se macula jer je tackasta – ona je pojedinacna veza, nije u vidu pojasa vec u vidu tacaka ili kako mi to kazemo biskvita. Dve celije ce se udruzivati tako sto ce se u medjucelijskom prostoru povezivati transmembranski vezujuci proteini. S obzirom da je ovo adherens veza, ponovo ce to biti kadherini i oni su do te mere skoncentrisani u tacki da ih mi sada vidimo. Znaci kvantitet nam sada daje kvalitet, daje nam sliku. (slika) U medjucelijskom prostoru, izmedju zadebljalih celijskih membrana, postoji jedna rajsfeslus struktura zato sto se susedni kadherinski molekuli visestruko povezuju i preklapaju u prostoru. Kadherina ima puno – na shemi je dat primer dezmogleina i dezmokolina, prosto, ovo je tip dezmozoma koji se susrece izmedju nasih keratinocita u kozi. Tu su dezmozomi najzastupljeniji kao veza. U slucaju enterocita to su, ipak, homotipske interakcije kadherita. Na osnovu velikog gomilanja molekula u celijskoj membrani pa je ona zadebljala iako se

26

njena prividna troslojnost ocuvava u ovoj vezi i postoji vizuelno pojavljivanje strukture povezivanja u medjucelijskom prostoru. Normalno je predpostaviti i ocekivati da ce se molekuli gomilati i sa submembranske strane, znaci da ce i plakini biti zastupljeni u ogromnoj koncentraciji da bi drzali sve te membranske proteine na jednom mestu. To ocekivanje je opravdano. Ovde su od plakina navedeni plakofilin, plakoglobin i dezmoplakin. Veliki i brojni plakini stvaraju te „biskvite“. Ne samo da je na molekulskom nivou preuvelicana citava veza, nego su i citoskeletni elementi koji se pridruzuju sada drugaciji. To su intermedijarni filamenti (IF); oni su deblji, mehanicki su cvrsti i pridruzuju se dezmozomima. Nekada se oznacavaju kao tonofilamenti, ali to su zapravo IF. Oni u velikom broju inseriraju u oblast plakina. Kada bi se pogledalo gde se IF zavrsavaj, videlo bi se da dolaze od nukleusa gde grade kaveze oko njega (petougaoni, sestougaoni). Zapravo IF koji polaze iz brojnih makula, posto njih ima na stotine, svi se susticu oki nukleusa i ti intrmedijarni filamenti se pridruzuju kaveznim IF-a, drze nukleus lociran u toj regiji celije. *** PODSECANJE*** Keratinociti su celije koje formiraju najveci broj dezmozoma (zeleno); to je zbog toga sto keratinociti moraju ocuvati integritet koze koja je „najugrozenija“ od strane mehanickih povreda, invazije patogena itd. Cak postoji diferencijacioni program – ukljuceno kroz slojeve koze eksprimiranje razlicitih tipova i povezivanje transmembranskih proteina i plakina. VEZE KOMUNIKANS TIPA Nazivaju se tako jer se dve celije udruzuju ovim vezama da bi ostvarile komunikaciju. Ta komunikacija moze biti razlicita. Naime, komunikacija moze biti: 1) metabolicka, odnosno prvi tip veza komunikans tipa jesu PUKOTINASTE (GAP) VEZE. Takav naziv su dobile iz razloga sto kada se dve celije udruzuju pukotinastim vezama, one svoj medjucelijski prostor svode na pukotinu koja je promera 2 – 4 nm. (slika) Iako su prividno troslojne membrane, sve je ovde ocuvano, da se u tom medjucelijskom prostoru nalaze kao nekakve precage. Upravo su te precage veze koje te dve celije uspostavljaju i one se ostvaruju takozvanim konexonima. Svaka od celija u spoju formira od 6 subjedinica integralnih membranskih proteina koji se zovu koneksini jedan polukanal (6 koneksina = ½ konexona). Druga celija isto daje polukanal i ceokanal se naziva konexon. Kod ovakvog tipa pukotinaste veze formira se jedan hidrofilan kanal koji omogucava prolazak ATP-a, brojnih jona, sitnih metabolita i on se formira kako u embrionskim tkivima tako i kod adulta (izmedju adipocita, hepatocita, enterocita...)??? To su, dakle, metabolicke veze i kod enterocita smo ih naveli kao adhezivni sloj jer de facto da bi ove celije ostvarile komunikaciju, moraju se adhezivno udruziti. Dakle, ovo je adhezivna veza sa....??? … (slika) Ovakav tip veze dozvoljava ne samo prolaz metabolita, ne samo da su metabolicka udruzivanja, vec dozvoljava i tzv. 2) elektricno kuplovanje, a to znaci da sada, za razliku od hepatocita i adipocita, sve nase kardijacne, radne misicne celije (u srcu) ostvaruju pukotinaste veze, potpuno morfoloski identicne konexonima ali su one povezane ne zarad komuniciranja metabolitima, vec zarad propustanja jona Na+ da bi se pripremile za nadolazecu depolarizaciju membrane, odnosno, kontrakciju srca. Zato se morfoloski identicne veze pukotinastim vezama nazivaju ELEKTRICNIM SINAPSAMA. Iako su dva termina u pitanju, struktura veze je potpuno ista. Ovakav tip pukotinastih sinapsi nalazi se u starim delovima mozga (hypothalamus) i tu se nervne celije udruzuju u elektricna kola koja stalno rade; to su one celije koje spontano imaju ostvarivanje depolarizacionog talasa, imaju stalni aktivni ciklus za razliku od ostalog dela koji se naziva hemijska sinapsa. Kao citoskeletni element pridruzen konexonima javljaju se mikrotubule (MT) sto je jako interesantno jer je prvi put pokazano da se za jedan tip, za jednu izoformu koneksina vezuje direktno tubulin iz

27

mikrotubula. To je vrlo vazno zato sto konexoni rade po tipu blende; mogu da menjaju konformaciju vrceljem isto kao blenda. Smatra se da mikrotubule ne samo sto dovode odredjene vezikule/metabolite formiraju specifican celijski kompartment u tom domenu veze, vecda prakticno pridrzavaju ove subjedinice u membrani, da ucestvuju u restrikciji lateralne difuzije koneksina u membrani. Mikrotubule drze to parce membrane tako da je fluidnost fosfolipida moguca izmedju koneksona ali sami koneksoni ostaju u tom domenu. Celija po potrebi moze ukljucivati (ugradjivati) koneksone ili ih vaditi iz svoje membrane i na taj nacin regulisati kolicinu/jacinu prometa i komunikacije sa drugom celijom. Suprotno od elektricnih sinapsi koje su izuzetno brze zato sto koriste taj hirdofilni kanal i joni/informacije trenutno prelaze iz jedne celije u drugu celiju, postoje u nervnom sistemu, kako u CNS-u tako i u PNS-u HEMIJSKE SINAPSE. Znaci postoje veze komunikans tipa koje se oznacavaju kao hemijske sinapse (zeleno). Fizioloski se hemijska sinapsa jos naziva i sinapsa sa kasnjenjem zato sto se vrlo jasno uocava da postoji jedan medjumembranski prostor koji je sada 10x siri od GAP-a (od pukotine), sirine od 20 - 40 nm. (slike) Hemijska transmisija ili hemijska komunikacija se ostvaruje neurotransmiterima koji se nalaze u transmiterskim vezikulama koje moraju da dodju do membrane da se sa njom fuzionisu, izbace hemikalije u medjucelijski prostor i da se tek onda, nakon izvesnog vremena/vremenskog kasnjenja, primi na nivou druge celije taj signal koji moze biti jako razlicit: otvaranje jonskih kanala, vezivanje proteina za proteine, pomeranje citoskeleta, indukcija sinteze nekog drugog proteina, formiranje cAMP-a, repertoar sinapticke transmisije je veliki.(slika) Sa citoloske strane bitno je razlikovati presinapticku od postsinapticke oblasti. Presinapticka oblast izgleda citoloski prilicno bogato u odnosu na postsinapticku oblast. Prisutne su mitohondrije i u jednoj i u drugoj oblasti. Postoje razlicite neurotransmiterske vezikule; cak po obliku i izgledu neurotransmiterske vezikule citolog moze da zna sta se unutra nalazi, npr. ??? noradrenalin, okrugle, prazne – acetilholin, elipsoidne – glutamati... Ono sto je karakteristicno za samu vezu jesu zadebljanja pre- i postsinapticke membrane i u medjucelijskom prostoru postoji nesto sto, ipak, i u slucaju ove veze ostvaruje nekakvu adheziju. Naime, kada se uradi strukturni model pre- i postsinapticke oblasti i sinaptickog jaza, jasno se vidi da su takodje prisutni transmembranski proteini; oni su vrlo slicni kadherinima, samo imaju znatno duze domene i formiraji de facto ??? membrane, vidi se da nisu sve vezikule uz celijsku membranu u nivou spoja, to je tzv. kvantni pristup membrani, odnosno plakini koji su prisutni u presinaptickoj oblasti formiraju jednu vrstu resetke koja je kao sace i u okviru te resetke postoje prazni prostori u koje ulaze vezikule i koliko takvih prostora ima toliko vezikula moze da pristupi egzocitozi. Na postsinaptickoj membrani takodje vidimo zadebljanje celijske membrane ali ne u vidu trouglastih, resetkastih zgusnuca vec u vidu jedne celovite trake, a to je zato sto te trake drze receptore u samoj membrani. Poenta je da su ovo hemijske komunikans veze; hemijske zato sto je komunikacija posredovana neurotransmiterima, molekulima koji se sintetisu u telu neurona, zatim se aksonima dopremaju do presinapticke oblasti i procesom regulisane egzocitoze bivaju izbaceni u sinapticki jaz koji je sirok 20 – 40 nm. U sinaptickom jazu molekuli neurotransmitera moraju biti transportovani do receptora. Zato i postoji jedna vrsta trodimenzionih hodnika u sinaptickom jazu, znaci transmembranski adhezivni proteini (vezujuci proteini) koji prvenstveno ostvaruju adhezivnu vezu u nivou hemijske sinapse. U tri dimenzije imaju odredjene hodnike tako da neurotransmiteri egzocitozirani na parcetu presinapticke membrane bivaju direktno upuceni ka receptorima na postsinaptickoj membrani. Transmembranski vezujuci proteini slicni su kadherinima, ali iako imaju ekstracelijski domen perlast?? (kao kod kadherina), homotipske interakcije nisu citavom duzinom tog ekstracelijskog domena. U presinaptickoj oblasti postoje brojni plakini. Oni

28

formiraju jednu strukturu u vidu saca koja se, kada se presece sinapsa (frontalno) vide ...???... na membrani, a kada se presece uzduzno taj region gde se nalaze trouglasta zacrnjenja mi, zapravo, vidimo resetkastu strukturu po tipu saca (petougaone i sestougaone komorice) i te komorice sluze da bi membranske vezikule mogle u odredjenoj kolicini da pridju membrani i da se tu izvrsi egzocitoza. Na taj nacin svaki neuron, svaka hemijska sinapsa, ima regulisanu kolicinu izlucenih neurotransmitera. Sama neurotransmisija odigrava se tako sto dolazi do depolarizacije membrane, ona pristize sa celijskog dela aksonom i u prosirenom delu aksona, zavrsetku aksona, gde je presinapticka oblas dolazi do otvaranja kalcijumovih kanala koji ulaze u velikoj kolicini u presinapticki ??? aksona. Kalcijumovi joni imaju dvostruku funkciju: 1. Stimulisu aktinski citoskelet, koji je bogato prisutan u presinaptickoj oblasti, da „pogura“ vezikule sa neurotransmiterima 2. Ca2+ joni ce se vezati za plakine, koji ce doziveti konformacionu promenu i umesto da drze vezikulu na nekom malom odstojanju od membrane oni ce dozvoliti da membrana vezikule pridje presinaptickoj membrani i da dodje do egzocitoze neurotransmitera. Fuzionisanje membrane neurotransmiterske vezikule i membrane presinapticke oblasti je po tipu pore. Znaci nece doci do potpunog slivanja membrane vezikule u memranu presinapticke oblasti, vec ce se samo otvoriti jedna mala pora i kroz nju ce neurotransmiterski molekuli da pokuljaju hodnicima u sinaptickom jazu i da dodju do postsinapticke oblasti. Sa citoloske strane interesantno je da u postsinaptickoj oblasti postoji e- - oblast, ali ona za razliku od presinapticke gde su trouglasta zadebljanja plakina, u postsinaptickoj oblasti plakini prave jednu ??? trakastu oblast. ...???... Zajedno sa aktinskim filamentima drzi receptore postsinapticke oblasti ukotvljene u membrani, u tom parcetu membrane, i tu je umesana i restrikcija lateralnog kretanja. Dakle, imate jednu vrlo definisanu , citolosku oblast sa puno razlicitih integralnih membranskih proteina, pridruzenih proteina i citoskeletnih elemenata koji odrzavaju tu strukturu kroz vreme;stalnost strukture se postize na taj nacin. Sve ovo o cemu smo pricali odnosilo se na strukturno uoblicene medjucelijke veze, bilo one adherens ili komunikans tipa. No, znamo da postoje i strukturno neuoblicene veze, a strukturno se ne uoblicavaju jer se zasnivaju na pojedinacnim i sporadicnim kontaktima molekula dve celijske membrane. Radi se o privremenim vezama i komunikans i adherens tipa. Na slici dole je dato koji od integralnih membranskih proteina ucestvuju u privremenim vezama. Privremenu komunikaciju ostvaruju selektini (pomenuli smo ih kada smo komparirali integrine, kadherine, Ig suprfamiliju ??? i selektine); a privremenu adherens vezu ostvaruju integrini. Kao primer uspostavljanja privremenih strukturno neuoblicenih medjucelijskih komunikacija i adhezija uzima se izlazak leukocita iz krvnog toka. (slika) Leukocit dobija podsticaj od strane nekog organa ili tkiva da napusti krvni tok i da dodje u to tkivo, najcesce je inflamacija povod, znaci luce se inflamatorni citokini, komunikacijski molekuli kojima leukocit dobija obavestenje da mora da izadje iz krvnog toka, da napusti krvni sud i da dodje u to tkivo. ...???... god pozeli, anatomski mu je dozvoljeno da krvni tok napusti u jednoj regiji krvnog sistema a to je postkapilarna venula. Znaci postkapilarna venula ima specificno dizajnirane medjucelijske veze endotelskih celija koje omogucavaju da se leukocit moze provuci kroz taj deo krvnog sistema i napustiti krvni tok. Sa druge strane, i endotelske celije moraju da dobiju signal da ce u jednom trenutku prici leukocit i da su one duzne da ga obaveste da je to mesto postkapilarna venula i da je to meato gde se on treba prikaciti i napustiti krvni tok. (slika

29

Informatorni?? citokini istovremeno deluju i na leukocite i na endotelske celije postkapilarne venule, sto znaci da se prvo mora ostvariti komunikacija ovih celija. I leukociti i endotelske celije eksprimirace u svojoj membrani selektine, integralne membranske proteine, tako da ce leukociti moci svojim selektinima da iskomunicira sa selektinima na membrani endotelskih celija. S obzirom da je leukocit solitarna, samostalna celija pretpostavljate da ce se ti selektini „nasumicno“ rasporedjivati po membrani, duz citavog obima leukocita. Selektini, medjutim, na endotelskim celijama nece biti nasumicno rasporedjeni vec ce se striktno koncentrisati na desetak endotelskih celija u nivou postkapilarne venule. Sta se sada desava? Leukociti, noseni krvnim tokom, dolaze do post kapilarne venule i tu je, naravno, anatomska prilagodjenost – blago suzavanje krvnog suda tako da leukocit ...???... prione na endotelske celije. Jedni selektini reaguju sa drugima, medjutim, kako je krvni tok nekakvom brzinom ustaljen u krvnim sudovima taj leukocit, s obzirom na privremenost veze, ce se u sledecem momentu otkaciti sa tih selektina, znaci iako ce selektini leukocita i selektini endotelske celije interagovati ipak su to slabe molekulske komunikacije i doci ce do njihovog razlaganja, odnosno, leukocit ce se jednostavno odvojiti. Sta se dalje desava? Leukocit, zbog toga sto je desetak vezanih selektinskih molekula nece se svi odjednom odvojiti sa selektina endotelske celije, vec ce to vise da se desava po principu rajsfeslusa, pojedinacno ce se odvajati (prvi, drugi, treci...) i leukocit ce se polako odvezati sa endotelske celije. U tom trenutku, medjutim, drugi deo leukocita ce da nalegne dalje uz povrsinu endotelske celije, pa ce se ponovo uspostaviti komunikacija izmedju komplementarnih selektina i to ce posmatrac dozivljavati kao kolanje i kotrljanje leukocita po tom delu od npr. desetak endotelskih celija kapilarne venule. Zasto je bitno to rolanje? Zato sto su to signali koji obavestavaju leukocit da je to upravo mesto gde ce se on zakaciti i napustiti krvni tok a endotelska celija se priprema da razmakne svoje medjucelijske veze adhezivnog tipa i da dopusti leukocitu da se provuce kroz zid krvnog suda. U trenutku kada se tako rolajuci leukocit primakne domenu gde su dve endotelske celije povezane medjucelijskim vezama adhezivnog tipa, on ce da naidje na visoku koncentraciju integrina kao integralnih membranskih proteina zaduzenih za adhezihu. Kada naidje na tu visoko koncentrisanu zonu, leukocit ce ostvariti privremenu adhezivnu vezu koja je znatno cvrsca po molekulskim inerakcijama od ...???... bukvalno prikaci za endotelsku celiju. Kada ostvari tu relativno cvrscu komunikaciju, odnosno adheziju, doci ce do formiranja lokomotornih organa, odnosno pseudopodija, kojima ce se leukocit provlaciti izmedju adhezivnih veza, odnosno kroz medjucelijski prostor i, jednostavno, napustiti krvni tok. Kada dodje do izlaska veceg dela celije razorice se i ove privremene adhezivne veze i leukocit ce se naci izvan krvnog suda. Medju nasim celijama postoje i brojne druge neobicne komunikacije i veze.

BILJNE ĆELIJE Sto se tice biljnih celija, s obzirom na to da se radi o celijama koje oko svoje membrane stvaraju jedan prilicno debeo, struktuirani, mocan celijski zid jasno je da su biljne celije morale evolutivno na poseban nacin da se snadju da ostvare veze adherens i komunikans tipa. Sto se tice veza adherens tipa tu je situacija jednostavna zato sto dve susedne ili tri susedne biljne celije lako mogu ostvarivati adheziju putem sredisnje lamele, odnosno, jedne strukture koja popunjava supljine izmedju celijskih zidova susednih celija. Znaci, sredisnja lamela sluzi kao adhezivna komponenta izmedju susednih biljnih celija. Sto se tice komunikacijskih veza tu je situacija malo slozenija zato sto se komunikans veze mogu jedino sagraditi tokom nastanka biljnih celija, odnosno, tokom mitotickih deoba stem celija u biljnim tkivima; kada deleci se majka celija formira u svom ekvatorijalnom delu celijsku plocu i istovremeno formira membrane buducih cerki celija i izmedju njih njihove celijske zidove. Dok formira celijsku plocu ...???... fragmoplast. Iako zeli da sagradi komunikans

30

veze, majka celija ce u celijskoj ploci ostavljti mestimicno supljine/pore putim kojih ce kasnije celije cerke komunicirati. Te pore nazivaju se plazmodezme. (slika) Ako su ovo dve susedne biljne celije (uzduzni presek) moze se videti da se kroz plazmodezme koje predstavljaju kanalice u kontinuitetu prostiru membrane susednih celija, citoplazme susednih celija i, cak, EPR susednih celija, jer se vrlo cesto unutar plazmodezme moze primetiti dezmotubul koji nije mikrotubula vec je membranski tubul poreklom od gEPR- a. Dezmotubul povezuje dva gEPR- a (jedan je iz jedne a drugi iz druge celije). Za plazmodezme je karakteristicno da kada se posmatra poprecni presek vidimo celijski zid, celijsku membranu, tzv. citoplazmatski anulus i dezmotubule. Vidi se da ovaj membranski tubul nije go, odnosno da oko sebe nosi nekakve proteinske molekule, na elektronskoj mikroskopiji to se ocitava kao nekakva fina mreza oko membrane i kada se napravi strukturni model, vidi se da dezmotubul sadrzi brojne pratece proteine koji ga povezuju sa membranom plazmodezme koja nije nista drugo nago nastavak celijskih membrana susednih biljnih celija. Dezmotubul moze aktivno da bude regulisan u dijametru sto znaci da susedne celije mogu aktivno da regulisu transport metabolita tj. jona, cak kazu, i nekakvih hormona tako sto ce sirenjem dezmotubula u potpunosti zatvarati komunikaciju, odnosno suzavanjem ...???... & ...???... ...komunikacije u biljnim tkivima. Iako je formiranje plazmodezmi vezano za nastanak celije (tesko se moze zamisliti novo formiranje plazmodezmi), prisutan je obrnut proces- primeceno je da kada jedna celija ukljuci program umiranja da onda druga celija, susedna, koja nije ukljucena u taj program, aktivno zatvara domene plazmodezmi tj. dolazi do prilaska vezikula iz gER- a i Goldzi kompleksa, zatvara se membrana i dolazi do gubitka komunikacije se celijom koja ce umreti. TRANSPORT KROZ MEMBRANU CELIJE (slika) Vreme je da se vidi da li je membrana (koja je fluidna, asimetricna i mozaicna) selektivna barijera, da li je uopste barijera ili je transport kroz membranu aktivno regulisan i od strane okolocelijske sredine i od strane celijske unutrasnjosti. Posto se zna da su monoslojevi izgradjeni od fosfolipida, glikolipida, sfingolipida, holesterola, proteina i da ima ugljenih hidrata sta se ocekuje da ce slobodno moci da prolazi kroz tako hemijski komponovanu celijsku membranu. Znajuci da su oko membrane vodene sredine: citoplazmaticna (citosol) i celijska tecnost u okolocelijskom matriksu?? celija se bori, membrana celije se bori da opstane izmedju dve vodene sredine i pritom mora da uspostavi gradijent molekula jer nije svejedno kada posmatrate citoplazmu ili okolocelijsku tecnost u kojoj ...???... molekule. (slika) Molekuli koji slobodno prolaze kroz celijsku membranu su oni koji slobodno difunduju kao gasovi (CO2 i O2 ce po principu difundovanja slobodno prolaziti kroz celijsku membranu). Prolazice i organski rastvaraci zato sto ce rastvarati lipide i na taj nacin ulaziti u celiju, delimicno i anestetici tako prolaze. Sasvim lepo i lagano prolaze molekuli vode, iako se to nikako ne bi ocekivalo na psnovu polarnosti membrane, odnosno po postojanju jednog relativno debelog hidrofobnog dela unutar celijske membrane.Molekul H2O koji pritiska, naleze na celijsku membranu ceka trnutak rotiranja/poskakivanja pojedinacnih lipidnih molekula dvosloja membrane, jer ce se u tom trenutku formirati mala supljina i molekul H2O ce se „zavuci“ u supljinu u prvom monosloju a zatim ce se to isto desiti u drugom monosloju i molekul vode ce jednostavno ulaziti u celiju. Sve ostale materije, celiji neophodne za zivot, ne prolaze slobodno kroz celijsku membranu: glukoza, aminokiseline, lipidi i brojni joni. (slika)

31

Celija celijskom membranom odrzava homeostazu u svojoj citoplazmi. Kada posmatramo molekulske mehanizme transporta kroz celijsku membranu iliprolaska kroz celijsku membranu vidimo da je jedino proces difuzije neposredovan a da su svi ostali nacini transporta posredovani proteinima ...???... jonske ili transportere. DIFUZIJA?? Medju transportnim sistemima u celijskoj membrani konstatujemo proces: - olaksane difuzije (OD) Integralni membranski protein sacinjen je od jednog, najcesce hidrofilnog hodnika koji je stalno otvoren tako da kroz njega slobodno prolaze materije iz spoljasnje sredine u celiju. Smer je povratan, ali mi najcesce usvajamo kako celija usvaja materije iz spoljasnje sredine. Kako celija regulise olaksanu difuziju? Kolicinom proteina; celija ce aktivno ugradjivati te proteine u membranu ako zeli da ima olaksanu difuziju. - aktivan transport (AT) On se odigrava nasuprot jonskom gradijentu, najcesce jonskom, mada se i druge materije mogu transportovati. AT zahteva trosenje ATP- a i proteini koji vrseAT su najcesce ATPaze.prenos transporterima Ono sto je zajednickou transportu kroz celijsku membranu jeste to da su posrednici tog procesa integralni proteini. Jedna od podela proteina koji ucestvuju u transportu kroz celijsku membranu jeste da postoje: (1) jonske pumpe (2) jonski kanali (3) proteinski nosaci (slika) S obzirom da se kroz te proteine/transportere mogu prenositi istovrsni ili raznovrsni molekuli mozemo razlikovati transport: - samo jednog tipa molekula u jednom smeru – UNIPORT - dva raznovrsna molekula u istom smeru – SIMPORT - dva raznovrsna molekula u suprotnim smerovima – ANTIPORT (slika) Eritrocit je celija model – sistem na kome smo proucavali i strukturu celijske membrane tako da cemo i na membrani eritrocita ispitivati/opisivati najznacajnije procese transporta kroz celijsku membranu, a to je transport: jona, vode i glukoze. Zasto se za eritrocit bitno da odrzava homeostazu jona, vode i glukoze? Nasi eritrociti nastaju u kostanoj srzi, zive oko 120 dana u krvi obavljajuci pritom osnovnu funkciju – razmenu gasova (O2 i CO2) i ziveci pritom od jednog metabolickog procesa koji se zove glikoliza i koji je strasno siromasan u prinosu ATP molekula. Eritrociti su celije lisene svih organela, imaju samo kompleksan citoskelet, proteinima bogatu membranu i imaju enzime koji im omogucavaju da prezive tih 120 dana, ne racunajuci hemoglobin koji je najzastupljeniji u eritrocitima. On treba da zivi 120 dana u jednoj sredini kakva je nasa krv. Ona odrzava, u odredjenim opsezima, jonsku, glukoznu vodena homeostazu ali su to ipak rastegljive granice, taj opseg je vrlo sirok. Za jednu celiju koja zivi i putuje krvnim tokom od esencijalnog je znacaja da u celijskoj membrani obavlja transport jina,, vode i glukoze da bi mogla da ...???... zivi i funkcionise tih 120 dana. Kako eritrocit to postize? Eritrocit moze vrsiti olaksanu difuziju ili imati u svojoj membrani proteinske nosace, odnosno, jonske pumpe.(slika) U slucaju Na+ - K+ pumpe, koja je izuzetno znacajna za odrzavanje jonske homeostaze/balansa, radi se o proteinima koji daju izgled stipaljke, proteinske stipaljke u celiji eritrocita i ta stipaljka ima sposobnost konformacione promene u membrani, ATPaznu aktivnost i vezna mesta za Na+ i K+ (tri vezna mesta za Na i dva vezna mesta za K) (slika) Kako funkcionise Na+ - K+ ATPaza/Na+ - K+ pumpa? U koraku broj 1 ta stipaljka (pumpa) je okranuta ka citoplazmi, sto znaci da su slobodna vezna mesta za Na+ i 3Na+ ce se prikaciti za svoja vezna mesta. Vezivanje Na+ stimulise fosforilaciju proteina, znaci, ATPaznu aktivnost, a fosforilacija nekog proteina najcesce znaci da ce taj protein da dozivi

32

konformacionu promenu. U slucaju Na+ - K+ - ove pumpe ta konformaciona promena dovodi do skretanja stipaljke tako da se sada Na+ (joni) mogu izbaciti u okolocelijsku sredinu. Istovremeno, otvorice se dva vezna mesta za K+, kalijum ce se ...???... fosforilaciju Na+ - K+ pumpe, sto ce znaciti revertovanje konformacione promene i dobicemo situaciju identicnu koraku broj 1. Kalijum ce biti otpusten i pumpe i ceo ciklus zapocinje ponovo. (slika) Osim Na+ - K+ pumpe, za eritrocit je jako bitno da ima i protonske pumpe koje su, takodje, ATPaze i koje ispumpavaju aktivno, najcesce, protone u okolocelijsku sredinu.(slika) Voda se smatra esencijalnim molekulom, ne samo sto je dobar rastvarac, ne samo sto je najveca komponenta kako citosola tako i okolocelijske sredine, veoma je bitno za eritrocit da odrzava vodni, odnosno osmotski balans. U suprotnom dolazice ili do bubrenja celije i lize kada voda u ogromnoj kolicini ulazi u celiju ili ce dolaziti do skupljanja celije kada voda napusta celiju i gubitka osnovne funkcije eritrocita. Da bi, dakle, regulisala svoj osmotski/vodni balans, membrana eritrocita mora da vrsi transport vode. On se odigrava najvise putem proteinskih kanala koji su izgradjeni od specificnih inegralnih proteina celijske membrane koji su oznaceni kao akvaporini. Akvaporini su veliki proteini, mnogo puta spanuju celijsku membranu (6x) i 4 akvaporina se udruzuju u takozvani akvaporinski komplex. Voda se akvaporinima transportuje na dva pretpostavljena nacina: model tusa i model slavine (cesme) (slika) Model tusa predpostavlja da se molekuli vode transportuju unutar pojedinacnih akvaporinskih molekula (porama unutar akvaporina). Model slavine kaze da se voda prvo transportuje sirokim kanalom izmedju 4 akvaporina (pora izmedju 4 akvaporina je veca pa je i mlaz vode veci, a u modelu tusa pore su sitne). *Prica uz animaciju: celijska membrana je pod konstantnim pritiskom ogromnih kolicina vode. Iz prvog u drugi monosloj ali uglavnom kroz akvaporinske komlekse odvija se transport vode. Akvaporinski komleksi vrlo specificno transportuju molekule vode. S obzirom na to da je H2O vrlo dobar solvent, postavlja se pitanje kako je moguce da se samo H2O transportuje kroz tu poru. Tu postoje nekakvi rezidui aminokiselina, specificni za prihvatanje molekula vode, i tako se zaista samo voda transportuje kroz akvakomlekse. Akvaporini su jedna jako velika porodica, postoje akvaporini 1,2,3... Kao i glukozni transporteri i akvaporini su jako prisutni u membrani eritrocita, u membrani celija u sprovodnim kanalicima bubrega (tu se H2O resorbuje), u suznim zlezdama. Znajuci ovo, da li celija dozvoljava da membrana trpi onako stravican pritisak vode? Ne. A cime to sprecava? Okolocelijskom sredinom – u njoj su prisutni brojni matriksni molekuli koji za sebe vezuju vodu, a sa druge strane tu je i citoskelet. (slika) U slucaju glukoze kod eritrocita ona se mora transportovati kroz celijsku membranu iz vrlo jednostavnog razloga sto se glukoza non stop trosi u eritrocitu u citoplazmi u glikolizi, tako da dolazi do jako visokog koncentracionog gradijenta, pa prisutni glukozni transporteri nemaju problema sa transportom glukoze jer je ona konstantno u visku u krvi, vezuje se za vezno mesto unutar glukoznog transportera, nema ...???... transporter promenom njegove konformacije i glukoza konformacionom promenom glukoznog transportera biva oslobodjena u citoplazmi eritrocita gde ce brzo biti potrosena i citav ciklus se ponavlja ( isto mehanizam stipaljke). Ako ovo vazi za eritrocite, kako je sa ostalim celijama? I da li to vazi i za sve biomembrane? Naravno da vazi. Varijacije na tu temu postoje u zavisnosti od tkiva i organeke koja je u pitanju. S obzirom da su te razlike mnogobrojne prezentovacemo samo neke. Sto se tice Na+ - K+ - pumpe ona je jako bitna kod nervnog tkiva, kod provodjenja nervnog impulsa. Sto se tice protonske pumpe, transporta vodonikovih jona, mozemo videti da je protonska pumpa na nivou celijske membrane prisutna ne bi li dolazilo do zakiseljavanja okolocelijske sredine; recimo tkivo to zahteva, ili pak protoni, tj. H+ joni se

33

koriste da bi iz spoljasnje sredine simportom bili transportovani molekuli saharoze. Dakle, postoji: 1. izbacivanje 2. zakiseljavanje spoljasnje sredine 3. izbacivanje protona a zatim se ti isti 4. protoni iskoriscavaju za simport sa molekulima saharoze. Protoni, odnosno jonske protonske pumpe se mogu iskoriscavati i za ATP sintezu ( kod ATP sinteze; ona se nalazi u unutrasnjoj mitohondrijalnoj membrani kod nas, multiproteinski je kompleks. Ima odredjene domene/segmente. Membranski deo je protonska pumpa. Izmedju matriksa mitohondrije i intermembranskog prostora uspostavlja se protonski gradijent koji se iskoriscava za sintezu ATP- a. Prolaskom protona kroz membranski segment ATP sintaze dolazi do sinteze ATP- a. Dugo se nije znalo da li je ova struktura pokretna ili staticna, tek u skorije vreme pokazano je tako sto je za ovaj segment zakacen fluorescentno obojen aktinski filament i onda se videlo da se tokom sinteze ATP- a AF vrti u krug; pokazano je da je ATP sintaza u unutrasnjoj mitohondrijalnoj membrani rotor, sto je onda objasnilo da se ista takva ATP sintaza nalazi kod prokariota u membrani celije. Narocito je koncentrisana u domenima bazalnih tela kod flageluma prokariota i zato dolazi do rotiranja prokariotskog bica i pokretanja celije, ali o tome kasnije. Bitno je zapamtiti da je familija protonskih pumpi vezana za ATP sintezu ili za pokret struktura u okviru kojih se protonske pumpe stacioniraju. Sto se tice transporta vode, on je na isti nacin regulisan posebnim?? tipovima celija po tkivima; postoje razliciti tipovi porodica akvaporina. Glukoza – kod eritrocita su glukozni transporteri uvek prisutni u membrani. Za razliku od njih ostale celije ne mogu sebi da dozvole taj luksuz stalnog eksprimiranja glukoznih transportera jer se u tim celijama ATP dobavlja iz mitohondrija, radom ATP sintaze a ne glikolizom, pa se glukoza ne trosi u toj kolicini kao kod eritrocita. Kada bi glukoza bila stalno prisutna, u membrani ostalih celija dolazilo bi do intenzivnog ulaska glukoze u citoplazmu tih celija, dolazilo bi do glikozilacije proteina i gubljenja njihove funkcije ili, jos gore – s obzirom da glukoza stravicno remeti osmotski balans, dolazilo bi do ulaska vode i lize celije. Zato u procesu homeostaze glukoze ucestvuju glukozni transporteri. Oni se najcesce eksprimiraju na celijama koje pripadaju tkivima/organima koja ucestvuju u homeostazi glukoze: jetra, misici i masno tkivo; znaci na: hepatocitima, poprecnoprugastim misicnim celijama i adipocitima se najcesce nalaze glukozni transporteri ali se u tim tkivima glukoza, koja se unosi u citoplazmu, deponuje u formi osmotski neaktivne strukture, a to je glikogen. Cak i ta tri tkiva ne eksprimiraju glukozne transportere stalno nego na podsticaj, na poziv i proces kojim povlace receptore sa celijske membrane zove se regulisana endocitoza. Sta to znaci? Glukozni transporteri se nece konstantno nalaziti na celijskoj membrani vec ce se povlaciti u submembranski pul vezikula, regulisanom endocitozom, a onda ponovo na hormonski podsticaj vracati u celijsku membranu. Dva hormona koja podsticu ovaj proces su insulin i glukagon. Hormonski je regulisano prisustvo glukoznih transportera.

ENDOCITOZA Poseban tip transporta kroz celijsku membranu koji ne ukljucuje integralne membranske proteine vec ukljucuje aktivno formiranje membranskih vezikula i internalizaciju molekula iz spoljasnje sredine. Ovaj proces se naziva endocitoza zato sto se materije unose u celiju putem membranskih vezikula. Ovaj proces karakterise skoro sve celije. Odigrava se na i putem celijske membrane, koja ce davati vezikule. Proces je najcesce lokalizovan na celijskoj membrani, vrlo specifican i karakteristican za odredjene tipove molekula. Razmatrali smo unos vode, jona, glukoze. Ali, sta ako celija celi da unese lipide?

34

Ili proteine? Morace da se iskoristi potpuno drugaciji nacin transporta kroz celijsku membranu, a to je proces endocitoze. (slika) U zavisnosti od toga oju celiju posmatramo u toku endocitoze, kakvi citoloski izrastaji ili uvrati se koriste tokom procesa, da li se unose tecnosti ili cvrste materije ili citave celije i kako se formiraju ...???... : -

FAGOCITOZA PINOCITOZA RECEPTORNA ENDOCITOZA TRANSCITOZA REGULATORNA ENDOCITOZA AUTOFAGOCITOZA

Ovo su sve termini koji se koriste da bi opisali specifican nacin endocitoze i iz respekta prema istorijskom aspektu/naucnicima biologije celije mi ih i danas koristimo. Neki od njih su ispravni, drugi su delimicno ispravni a treci su potpuno neispravni, sto je slucaj sa receptornom endocitozom jer je svako tip endocitoze posredovan receptorima celija. Celija nista ne unosi nespecificno/neregulisano, sve je regulisano na neki nacin. Fagocitoza (slike) Prvi tip endocitoze koji je otkriven ticao se imunog sistema, odnosno imunokompetentnih celija koje mogu da prozdiru bakterije i da na taj nacin ucestvuju u imunom odgovoru, odnosno bio je proces fagocitroze. Dvadeset godina se na svim mogucim mikroskopima studirao proces fagocitoze od strane celija, kako se formiraju celijski izvrati (pseudopodije) kojima se bakterija zahvata i internalizuje. Danas znamo da proces fagocitoze obuhvata ne samo unosenje bakterija nego i apoptotskih tela, ostataka neke celije u susedstvu koja je umrla programiranom celijskom smrcu. Kada dolazi do internalizacije/unosenja materijala koji je prilicno krupan i cvrst govorimo o procesu fagocitoze i jedinao tada zapazamo da se celijska membrana izvrce ka spoljasnjosti (formira membranske evaginacije) i zahvata to sto zeli da unese u sebe. U svim ostalim slucajevima endocitoze dolazi do formiranja membranskih uvrata, dakle, invaginacija ka citoplazmi cime se unosi/internalizuje zeljena materija. Za razliku od fagocitoze, celijskog jedenja/prozdiranja, postoji i celijska pinocitoza, celija pije; opisujemo je kada se iz okolocelijske sredine unosi prilicno tecnosti prilikom endocitoze. Primer pinocitoze jesu kaveoli, brojni flasoliki uvrati celijske membrane karakteristicni za glatke misicne celije ili za endotelske celije, nasuprot fagocitozi koja je karakteristicna, recimo, za makrofage ili heterofilne granulocite. Treci najcesce opisivani tip endocitoze jeste receptorna endocitoza zato sto je to endocitoza posredovana receptorima. Smatralo se da su i fagocitoza i pinocitoza specificno zahvatanje materijala a da u receptornoj endocitozi postoje receptori za jedan tip molekula i samo se oni unose u celiju. Ovaj tip endocitoze je najvise bio favorizovan u citologiji i zbog jedne druge odlike a to je formiranje maljavog ogrtaca oko vezikule u endocitozi. Mislilo se da je to neka specificnost receptorne endocitoze. Klatrinski omotaci/maljavi ogrtaci celije su se opisivali, izolovali su se proteini koji ga cine, tako da je dobrih 30 godina endocitoza bila svedena na nivo receptorne endocitoze. Danas znamo da receptornom endocitozom skoro sve ili velika vecina nasih celija unose gvozdje u formi apoferitina, lipide u formi LDL partikula, hormone, odredjene proteine itd.

35

Fagocitoza citoloski specificnija od ostalih tipova endocitoze tj. nesto drugacija. Fagocitoza kod nas je rezervisana za fagocitno sposobne celije, u velikoj meri makrofagi i heterofilni granulociti, a ostale celije mogu da fagocitiraju apoptotska tela (znaci, za fagocitovanje apoptoznih tela nisu potrebne specijalne celije). (slika) Fagocitoza se studirala fluorescentnim mikroskopom (crveno se unosi u zelenu celiju), skenirajucim mikroskopom gde se vrlo jasno vidi kako celija membranom zahvata celije faznokontrasnim mikroskopom koji nam omogucava da vidimo internalizaciju organizma koji se fagocitira i koji cesto moze da prevazilazi velicinu celije koja je fagocitarno sposobna, odnosno citolozi su posvecivali paznju promeni oblika celije koja se iz neaktivnog okruzenog oblika pretvara u celiju grabljivicu koja se ustremljuje ka bakterijama, podize sa podloge i vrsi aktivno fagocitozu. Svi ti opisi mogu da posluze kao istorija jer se u medjuvremenu radilo mnogobrojnim molekularno bioloskim i citoloskim metodama, dakle, razlicitim tipovima mikroskopa otkrilo da je i fagocitoza receptorima posredovana endocitoza, da je formiranje pseudopodija/evaginacija celijske membrane samo zato sto se radi o visestruko krupnijoj materiji ili celiji koja se unosi ali da ta partikula ili celija mora biti obelezena, ovo je proces koji je receptorno posredovan, fagocitarna celija prepoznaje te obelezivace, prikopcava se za njih (dolazi do inerakcije antigen – antitelo) i trigerise?? se proces obuhvatanja partikule koja se unosi. Dalja sudbina, znaci internalizacija i dalji put u degradativne celijske kompartmente je potpuno identican svim ostalim endocitozama. Danas je uobicajeno da se proces endocitoze prikazuje ovako, znaci na jednoj shematski prikazanoj celiji i da se posmatra u razlicitim delovima celije kako napreduje kroz vreme, sta se desava sa tim unetim materijalom, znaci, prvo kako se unosi, sta se sa njim kasnije desava, kakva je njegova dalja sudbina i da se opisuju molekulski mehanizmi koji su za to zaduzeni. Mi cemo sada prvo posmatrati nivo celijske membrane i videti na koji nacin dolazi do formiranja endocitotskih vezikula. Kako je naziv receptorna endocitoza definitivno, u molekulskom smislu, pogresan jer su sve endocitoze receptorne. Mi naglasavajuci da je proces endocitoze receptoran po svojoj molekulskoj prirodi, studiramo ga kroz ove stupnjeve: Receptorna Endocitoza 1. receptorno, specificno prepoznavanje onoga sto se unosi u celiju 2. grupisanje zaposednutih receptora i formiranje endocitotskih organela 3. postepena internalizacija vezikule 4. „otkidanje“ vezikule od celijske membrane 5. kretanje vezikule ka unutrasnjosti i transformisanje kroz rane i kasne endozomske forme 6. Dalja sudbina vezikule – prikljucivanje membranskom degradativnom kompartmentu (lizozomski sistem) ili povratak ka membrani i egzocitoziranje unetog materijala (slika Stupanj broj 1. Kakav je nacin unosenja? Receptoran, visokospecifican, celija receptorima bira sta unosi u sebe. Stupanj broj 2. Kako se grupisu receptori zaposednuti ligandom? Kako dolazi do formiranja endocitotskih vezikula? Stupanj broj 3. Kako se formira vezikula? Stupanj broj 4. Kako se unose u celiju? Stupanj broj 5. Kako se dalje krece kroz celiju, kroz rane i kasne endozomske forme? Stupanj broj 6. Kako se prikljucuje degradativnom celijskom kompartmentu tj. organelama koje sadrze enzime za razaranje toga sto je celija unela?

36

Kako se formira endocitotska vezikula? Sto se tice receptorne endocitoze opisujemo formiranje tzv. klatrinskih vezikula (onih koje su prve vidjene pod elektronskim mikroskopom). Ako pod elektronskim mikroskopom posmatramo proces endocitoze, od momenta dolaska zeljenog materijala do momenta kada je zeljeni materijal internalizovan formira se jedna membranska vezikula u cijoj se unutrasnjosti nalazi taj materijal, vidimo sledece stupnjeve: (slika) Ovde je inace prikazana LDL partikula – lipidno telo koje sluzi da se putem krvi do svake nase celije distribuira holesterol i trigliceridi, znaci – masne kiseline, kao gorivo. Mehanizam unosenja endocitozom, odnosno, transporta kroz membranu, koliko god da je poseban u odnosu na jonske kanale ili pumpe ili transportere ipak koristi transmembranske proteine. Ako zelite da unesete u celiju LDL partikulu ona mora da se veze za neki protein koji je integralni membranski protein. To je receptor za LDL partikulu. S obzirom da LDL partikula nosi lipide, protein ne moze biti receptor za lipidnu komponentu, zato je LDL partikula lipoproteinska cestica i najcesce sadrzi jedan protein koji se naziva APO – B i upravo tu proteinsku komponentu ce prepoznavati receptori na membrani. (slika) Dakle, LDL partikula je stigla i vidi se da se veliki broj LDL partikula prikaci za receptore. S obzirom da je veliki broj, velika kolicina, tih partikula dolazi do ugibanja celijske membrane, odnosno sukcesivnog produbljivanja tog ulegnuca (invaginacije celijske membrane) cime se postepeno zaokruzuje/formira membranska vezikula koja je pre otkidanja, odnosno potpune internalizacije, jednim malim vratom prikacena jos uvek; postoji kontinuitet izmedju celijske membrane i membrane endocitotske vezikule. Znaci, mozemo da pratimo sukcesivno udubljivanje celijske membrane, otkidanje membranske vezikule i internalizaciju. Sto se tice molekulskog modela/mahanizma (citoloski je vrlo jasan, lepo se prati) prvo pitanje koje se postavlja jeste kako i gde se u celijskoj membrani nalaze receptori; kako celija zna da membrana zna da su stotine receptora prikacili ligande; kako ih grupise, kako formira vezikule u unutrasnjosti celije; kako otkida vezikulu i sta sa njom dalje biva? (slika) Sto se tice molekulskih mehanizama mozemo reci sledece: Govoreci o strukturi membrane napomenuli smo da hemijski sastav membrane, kada gledamo citavu celiju, nije identican, da postoje tzv. lipidna ostrvca koja su jako bogata holesterolom i sfingolipidima, odnosno glikolipidima. Upravo u tim regijama koje su deblje i koje vire van gro dela celijske membrane su koncentrisani receptori za endocitozu. S obzirom da postoji relativna lateralna difuzija, relativno pokretanje tih receptora, oni mogu u okviru lipidnih ostrvaca da se krecu, cak, primeceno je i izvan lipidnih ostrvaca. Grupisanje zaposednutih receptora medjutim (onih koji su vezali LDL partikule), vrsi se ekskluzivno u lipidnim ostrvcima, sto znaci da neki citoplazmaticni elementi (najcesce citoskelet) zapravo potpomazu guranje svih receptora koji su vezali LDL partikule u domen lipidnog ostrvca zato sto je to mesto koje ce moci da se ugiba ka unutrasnjosti celije jer je prilicno tecljivo. Koji je to molekulski faktor koji prepoznaje receptor koji je vezao za sebe ligand? Kada se LDL partikula veze za receptor taj receptor blago potone u celijsku membranu, odnosno, otkrije jedan submembranski region koji prepoznaje prvi pomazuci protein endocitoze, a to je ADAPTIN. Postoji citava porodica adaptornih proteina koji prepoznaju receptore koji su vezali za sebe ligande. Vezujuci se za njih pomazu njihovo grupisanje u oblasti lipidnog ostrvca. Ne samo da potpomazu grupisanje zaposednutih receptora nego adaptorni proteini poseduju na svom drugom kraju mesto za vezivanje tzv. koatomernih proteina koji su drugi proteini suigraci u procesu endocitoze. Proteini ogrtaci ili koatomeri (klatrin, u ovom slucaju) su tu da vezujuci se za adaptine/adaprorne proteine formiraju jednu vrstu ogrtaca/resetke/kaveza oko membrane koja se ugiba i na taj nacin oni stvaranjem ogrtaca fizicki podsticu uvlacenje celijske

37

membrane.Citoloski je onda lako objasniti zasto se membrana tada sve vise i vise udubljuje, odnosno formira vezikulu – zato sto je potpomazu proteini ogrtaci. Tako ce biti sve dok se ne dodje do otkidanja vezikule od celijske membrane. Za celijsku membranu otkinuti parce je prilicno bolno; to je jedan proces koji mora da bude strogo kontrolisan da ne bi doslo do narusavanja integriteta ni celijske membrane (a samim tim i celije), ni integriteta onog sto je celija unela kao endocitotsku vezikulu. Molekulski osnov tog procesa otkidanja vezikule je protein DINAMIN. To je protein, treci protein koji potpomaze proces endocitoze, koji ima konformaciju stapica i spirale, odnosno dinamin se pozicionira u regionima vrata buduce endocitotske vezikule. Razlazuci GTP, troseci energiju, dinamin se pretvara u jednu vrstu spirale (zamislite feder; on ima svoj pocetak pa svoje navojke i svoj zavrsetak – tako izgleda dinamin). Troseci GTP, zamislite da ta dva kraja ili sabijete ili razvucete, u tom trenutku vi cete dovesti do otkidanja ove vezikule i tim federirejucim sposobnostima vratiti ostatak membrane da zadrzi svoj normalan status. Dinamin olaksava otkidanje (omogucava otkidanje) endocitotske vezikule sa celijske membane.Kada je vezikula potpuno inernalizovana, odnosno nalazi se u citoplazmi, neposredno ispod celijske membrane (vezikula sadrzi membranu; unutar nje je ono sto je zelela/trebalo da unese; ima adaptine i ima klatrinski omotac). Sta sa njom dalje? Ona sada (klatrinska vezikula) mora da se prikljuci endozomskom kompartmentu celije; to je membranski kompartment i najcesce opisujemo rane i kasne endozome. Na celijskoj membrani se ne formiraju samo klatrinske vezikule; formiraju se i kaveoli i glatke vezikule, odnosno molekul klatrina je jako velik, jako tezak, velike molekulske mase i zato sto pravi parakristalne resetke moguce ga je lepo videti pod elektronskim mikroskopom. Svi ostali koatomeri, a ima ih mnogo, nisu tako krupni molekuli i ne formiraju tako pravilne resetke pa se nama pod EM- om cini da su ostale vezikule bez ogrtaca/gole. To, medjutim, nije tacno – sva endocitotska vezikula poseduje koatomer. On moze biti pridruzen kao klatrin, a moze biti i deo plazmine membrane odnosno deo membrane te vezikule kao sto je slucaj sa KAVEOLIMA. Kod njih umesto klatrina jeste prisutan protein kaveolin koji je inegralni membranski protein. Kako god da celija unese/na koji god nacin ona formira endocitotske vezikule, sve one se moraju naci u ranom endozomskom kompartmentu. To znaci da mozemo citoloski da vidimo da se endocitotske vezikule polako spustaju elementima citoskeleta i to prvo aktinskim filamentima, a zatim i miofibrilama ka unutrasnjosticitoplazme i najcesce se spustaju ka nukleusu/nukleusnoj regiji. ADAPTIN – prepoznaje i vezuje za sebe receptore koji su vezali za sebe ligande; potpomazu grupisanje receptora u regionu lipidnih ostrvaca. Na svom drugom kraju ima mesta za vezivanje KOATOMERNIH PROTEINA (proteini ogrtaci), klatrin u ovom slucaju. KLATRIN – vezuju se za adaptine i formiraju ogrtac/resetka/kavez oko membrane koja se ugiba (fizicko podsticanje uvlacenja celijske membrane). DINAMIN – molekulski osnov otkidanja; konformacija stapica/spirale; razlaze GTP.] Rani i kasni endozom S obzirom da celija trosi stravicno puno ATP- a i GTP- a za proces endocitoze, dakle to je energetski veoma skup proces, celija ce se truditi da bude efikasna po broju unetih partikula i trudice se da unese veliku kolicinu vezikula koje ce sve da posalje u rani endozomski kompartment. Dakle, na hiljade endocitotskih vezikula ce se fuzionisati sa preegzistirajucim ranim endozomskim kompartmrntom. U celiji postoji jedna laka forma koja se zove tubulo – vezikularna, zato sto ima tubularni profil i profil vezikule i koja sluzi da primi u sebe sve ono sto celija endocitozom unese. Ali, da bi ste fuzionisali endocitotsku vezikulu sa drugom membranom, celija mora da vrati, odnosno da skine glomazni ogrtac oko vezikule. Dakle, klatrinski molekuli se skidaju sa vezikule i vracaju/recikliraju da ponovo dezuraju u submembranskom regionu i cekaju formiranje novih endocitotskih vezikula. Sve tako nastale,

38

glatke, vezikule sada ulaze u rani endozomski kompartment. Za rani endozomski kompartment je karakteristicno da poseduju u membrani protonske pumpe, odnosno da blago zakiseli sredinu unutar sebe, zato sto je pH vrednost/sredina unutar endocitotske vezikule jednaka onoj izvan celije. Endocitotska vezikula se ponasa kao da je unela deo spoljasnje sredine (pH = 7). U ranom endozomu pH = 5.9 do 6. Cak i tako mala promena pH vrednosti na nivou proteina odrazice se tako da ce se zeljeni ligand otkaciti sa receptora i naci slobodan u ranom endozomskom kompartmentu. Zasto je to bitno? Zbog dve stvari: jedna je da zelite da razorite ili da iskoristite ?? LDL partikulu a ne da razorite receptore i deo celijske membrane, odnosno rani endozomski kompartment ce se transformacijom, kroz reciklirajuci endozom vratiti celijskoj membrani ono sto je njeno (parce membrane koje je uneto i receptore koji su na tom parcetu membrane). Najcesce se ta reciklirajuca forma susrece lateralno kada posmatrate celiju, na apikalnom delu ce se vrsiti endocitoza, a ?? ce se vracati i fluidno ce membrana sa bocne strane nadoknadjivati na apksu ono sto njoj pripada. Da ovog nema, celija bi brzo samu sebe pojela. Ostale su LDL partikule nakon reciklaze parceta membrane i receptora. LDL partikule nisu jedino sto se upucuje ka odredjenim degradativnim kompartmentima. U endozomskim sistemima (ranim i kasnim) prakticno se sumiraju/susticu svi putevi endocitoze ali i autofagocitoze i zato je neophodno da se koncentrisu materijali pre nego se fuzionisu sa primarnim lizozomima i odu u degradaciju. Znaci, mora doci do jos jedne trijaze/sortiranja molekula da celija prosto bude sigurna da je u degradativni kompartment/u lizozome uputila samo ono sto zeli da degradira i da jos malo zakiseli tu sredinu, jer ce se zakiseljavanjem sredine, prakticno, pre ulaska u degradativni kompartment protein pripremiti za degradaciju. Dakle, formira se kasni endozom u kome je pH = 5 do 6, gravitira petici sto je priprema za nisku pH koja je u lizozomima ili u organelama za degradaciju. (slika) Vracamo se na kaveole, da bi smo pokazali kako izgleda kaveolin. Pomocu ovih shema pokazacemo zasto u odredjenim slucajevima endocitoze dolazi do prerade u ranom i kasnom endozomu, odnosno zasto unete materije nikada ne budu degradovane. Prvi slucaj je unosenje virusa. Virusi se unose kaveolima, zaobilaze put degradacije jer nateraju kaveole da se fuzionisu u tzv. kaveozome i odu direktno u endoplazmaticni retikulum. Virus izaziva redirekciju endocitotskih vezikula ili kaveola u gER i jer ce se u gER- u odigravati sinteza proteina virusnog omotaca. Naravno njegova DNK/RNK ce napustiti kaveozome, ali poenta je da neminovan put endocitotske vezikule ima izuzetke – jedan je virus, a drugi izuzetak je tzv. transcitoza, odnosno, postoji nekoliko primera gde se transcitoza odigrava, a transcitoza znaci da celija receptorno unese u sebe neku materije ali je istovremeno izbaci na drugom kraju, dakle samo je provede kroz svoju citoplazmu ne narusavajuci njen integritet. Slucaj broj jedan za transcitozu jesu kapilari, odnosno endotelske celije. Oni moraju da propuste odredjene materije i oni ih provode kao LDL partikule. LDL partikula mora iz krvi da dodje do celija i mora da prodje endotelsku celiju, tako procesom transcitoze endotelska celija unese u sebe LDL partikulu ali je na drugoj strani, prema celijama, jednostavno ekskretuje procesom egzocitoze. Drugi primer transcitoze jeste dojenje bebe u nasoj vrsti/mladunci moraju da se doje, odnosno ne moraju ali pozeljno je zato sto nekih cetrdesetak dana bebe nemaju imunitet, nemaju uspostavljen imunski sistem. U tom prvom periodu jako je bitno dojiti dete zato sto se u majcinom mleku nalaze imunokompetentni molekuli, dakle proteini i imunoglobulini koji ce bebi znaciti imunski sistem. Beba mleko usvaja digestivnim sistemom, mleko dolazi do enterocita. Enterocit endocitozom usvaja antitela ali ne sme da ih digestira/razlozi nego ih mora transportovati/ekskretovati tj. transcitozirati u ekstracelijski fluid gde ce se oni ponasati kao imunski sistem bebe. Enterociti bebe vrse intenzivnu transcitozu Ig- a (imunoglobulina??), kod beba dok ne uspostave sopstveni imuni sistem i ne krenu same da se brane od patogena. Treci slucaj jeste regulisana endocitoza koja nema za

39

podlogu samo ...???... dalje, vec zadrzava u membranskom pulu i regulisano vrsi fuziju sa celijskom membranom. (slika) Primer regulisane endocitoze su glukozni transporteri. Oni se nalaze u submembranskom vezikularnom pulu i cekaju aktiviranje insulinskog receptora. Insulin dolazi, vezuje se za INS?? receptor koji poseduje aminokiseline koje se fosforilisu tako da onda pokrece put integrisanja vezikule (glut??) u celijsku membranu. Glut vezikula ce se aktinskim filamentima pribliziti celijskoj membrani, fuzionisati sa njom i glukozni transporteri koji su ugradjeni u membranu transportuju glukozu u celiju. Nakon tog procesa ili ce glukoza u spoljasnjoj sredini opasti u koncentraciji, ili ce se insulinski receptori internalizovati i insulin degradirati pa vise nece biti signala. U tom trenutku celija ce primiti signal (za sada se ne zna koji je to na molekulskom nivou) da izvrsi endocitozu upravo tog parceta membrane i ponovo dobiti isti submemranski vezikularni put. Ovo je, dakle, primer kada celija endocitozom unese deo svoje membrane ali je ne salje u degradativni kompartment.

Degradativni kompartmenti Kako se ono sto je celiji potrebno,a ne dobija ga u iskoristivom obliku,degradira li ne bi li postalo iskoristljivo za celiju?Kako celija uklanja ono sto je nepotrebno? Kada govorimo o celijama Procariota,ono sto je nepotrebno,uglavnom su proteini,a kada govorimo o Eucariotima to su i pojedinacni proteini,citave organele ili delovi citoplazme,tako da se kod Eucariota u celijama sustizu degradativni putevi u okviru odredjenih citoplazmatskih kompartmenata i oni mogu biti membranski i nemembranski ali o tome malo vise kasnije. Procariota Kod prokariota se radi o pojedinacnim proteinima. S obzirom na to da kod njih ne postoje membranske organele,njihov degradativni kompartment zasniva se na prisustvu proteazoma u citoplazmi. Proteazomi su supramolekulski kompleksi,to su proteinske masine za degradaciju. Kod procariota na nivou EM su negativno kontrastirani(leva slika). Znaci,radi se o cilindricnim strukturama, izgradjenim od proteina,tacnije od proteinskih prstenova koji sacinjavaju strukturu debelu 15nm(desna slika). To je supalj cilindar ali u tom cilindru supljina nije celovita,odnosno postoje komorice,tri komore koje suceksivno prihvataju proteine I vrse njihovo seckanje ,degradaciju do AK-a. Proteazomi kod procariota oznacavaju se kao 20s I to su proteinski cilindri sa 3 komorice koje vrse degradaciju proteina do aminokiselina. Eucariota Kod eukariota, kod zivotinja govorili smo da degradativni kompartment u celiji “sacekuje” sve one vezikule koje su poreklom iz endozomskog sistema,odnosno govorili smo o:1.Govorili smo na koji nacin se vrsi transport kroz celijsku membranu formiranjem endocitotskih vezikula,bilo da su one klatrinske, kaveole ili glatke vezikule. Pomenuli smo da moze biti i fagocitoza formiranjem evaginacija membrane za razliku od klasicnih invaginacija kod formiranja endocitotskih vezikula,ali da je njihov put usmeren ka jednom zajednickom kompartmentu koji se naziva endozomski. Znaci dolazi do internalizacije materijala spolja unutar celije i te vezikule se sukcesivno fuzionisu sa preegzistirajucim kompartmentima ranog i kasnog endozoma (slika br.2). Videli smo koje su to strukture, zasto se formiraju i kako izgledaju i sada nam ostaje (3)deo tog puta, odnosno da vidimo kako se vezikule poreklom od endozomskog kompartmenta (ili ako vise volite iz spoljasnjosti)

40

degradiraju u kompartmentima celija eukariota. Zapamtite da bilo kako unet materijal spolja (faogocitozom,pinocitozom ili receptornom endocitozom) sve sto se nadje u endocitotskoj vezikuli najcesce zavrsava u degradativnom kompartmentu. Takodje smo pomenuli da postoje i izyzeci. To je transcitoza. Kada endocitotske vezikule ne zavrsavaju u degradativnom kopartmentu. Danas cemo posmatrati samo one vezikule koje ulaze u degradativni kompartment i posmatracemo nacin degradacije tog materijala. Osim unetog materijala spolja,celija eukariota ima potrebu da se nekada oslobodi viska organela ili dela citoplazme, te organele mogu biti proliferisane (uvecane brojno,zato sto su celije fizioloski bile potrebne) ili su to organele koje su ostarele pa vise nisu funkcionalne, zato moraju na specifican nacin da budu odstranjene iz celije. Za njih je karakteristicno da se celija prema njima ponasa na isti nacin kao da zahvata deo spoljasnje sredine. Radi se o jednoj vrsti endocitoze, jer ce se deo celije naci unutar membranske vezikule ali s obzirom da je to deo postojece celije,ne govorimo o endocitozi,vec o autofagocitozi ili procesu autofagije. S obzirom da znamo da je,kada nastaje endocitotska vezikula, membrana te endocitotske vezikule,prvo membrana celije, zatim ulazi u rani i kasni endozomski kompartment i prakticno biva zamenjena endomembranama, membranama iz ranog i kasnog endozomskihkompartmenta, postavlja se pitanje kog je porekla membrana vezikule koja daje autofagozom? To su takodje endomembrane ali ne poreklom iz ranih i kasnih endozomskih kompartmenata,vec su to membrane poreklom od glatkog ER-a (vidi semu na prethodnoj strani). Membrane SERa moraju prepoznati deo citoplazme i organele koje celija zeli da zahvati,zaokruzi membranama i od njih sacini autofagnu vezikulu. To je proces koji je takodje receptorima posredovan. Do sada su na molekularnom nivou definisani i geni za autofagocitozu. Danas znamo da se moraju sintetisati odredjeni proteini obelezivai ostarelih ili nepotrebnih membrana,a samim tim,celijskih organela i da je taj receptorni mehanizam prepoznavanja izmedju onoga sto se zeli odstraniti i membrana unutar celije,dakle,glatkih endomembrana uzajaman. Znaci, ponovo se radi o receptorima, o proteinima, sa jedne strane obelezivacima, a sa druge strane receptornim proteinima na memranama SER-a.Koja je druga razlika u ondosu na klasicnu endocitozu? Pogledajte kako je izgradjen Ser. To su dve membrane slicne po debljini celijskoj membrani koje zatvaraju prostor nazvan cisterna. Kada memrane SER-a zahvataju deo celije, dolazi do toga da se citava cisterna, odnosno dve membrane, oviju oko tog dela koji se odstranjuje. Vidimo sa se u slucaju autofagite vezikule mogu primetiti dve membrane. Na taj nacin najradije odstrane ER-e (GER I SER), mitohondrije i peroksizome. Sada kada znamo sta cemo pratiti vreme je da vidimo kako citoloski izgledaju kombnente degradativnog kompartmenta. Degradativni kompartmenti u eliji eukariota,u zivotinjskim organizmima,dele se na membranske, i tu spadaju lizozomi,tako da cesto govorimo o lizozomskom sistemu. Osim membranskog postoji,kod celija zivotinja, i membranski degradativni kompartment koji je olicen istim onim strukturama koje postoje i kod prokariota samo su sada evoluirale, dakle, radi se o proteazomima. Kada govorimo o membranskom degradativnom kompartmentu,dakle,lizozomskom sistemu zelim da se dotaknem istorije proucavanja lizozomskog sistema I otkrivanja organela koje ga sacinjavaju. Prvo ime koje zelim da vam prezentiram jeste ime jednog belgijskog naucnika Kristijana de Duva,koji je radio u Americi na Roknfeler univerzitetu. On je bio biohemicar koji je proucavao kisele fosfataze, enzime, radio je sa njihovom aktivnoscu i to aktivnoscu acidnih fosfataza u celijskim homogenatima, sto znaci da je Kristijan uzimao celije, vrsio njihovu homogenizaciju i taj homogenat biohemijski ispitivao na aktivnost pomenutog enzima. S obzirom da je koristio razlicita tkiva, i kako to u labarotorijskom radu esto biva, stalno je bio u trci sa vremenom. On je neke homogenate drzao u frizideru i koristio ih nakon 3, 5, 7 dana i na svoje veliko zaprepascenje shvatio je da aktivnost kisele fosfataze raste s vremenom. To je njemu u prvom trenutku izgledalo potpuno nelogicno (jer je isao logikom “sto sveziji preparat, to najveca aktivnost”).

41

Konsultovaci se sa citolozima, sa osobama koje su radile M-ju, on je polako poceo da prihvata ideju da je ta kisela fosfataza ne u citoplazmi nego mozda u nekakvim membranskim zaokruzenim kompartmentima koji su zbog blagog homogenizovanja opstali kao membranske strukture, tako da je on prvog dana nakon homogenizacije imao npr.50-ak razrusenih struktura i dostupnu acidnu fosfatazu za istrazivanje ali je isto tako imao npr.150celovitih /intaktnih struktura/ organela i zato je aktivnost kisele fosfataze rasla, jer nakon 3, 5, 7 dana dolazilo je do prskanja membrana tih organela. Da bi to potvrdio on je zatrazio pomoc od Dzordza Pakladea koji je radio na EM-u (50-tih. 60-tih godina proslog veka) i koji je uspeo da na nivou EM-ne detektuje te organele, da dokaze da je zaista kisela fosfataza u tim organelama i organele nazvao lizozomima, u cast Ilje Mecitikova, koji se bavio imunologijom, konkretno radio je sa makrofagima. Makrofagi izolovani iz peritonealne tecnosti pokazuju izrazitu fagocitarnu sposobnost, dakle fagocitiraju bakterije i viruse. Mecnikov se bavio fagocitarnom sposobnosu makrofaga odstranjivanjem patogena i dosao je do saznanja da nakon fagocitoze, nastali fagozom, bakterija uneta u makrofag, se fuzionise sa organelama koje nose u sebi enzime sposobne da u najvecoj meri, ako ne u potpunosti, degradiraju te fatogene. To su bili lizozomi. Membranski kompartment koji se naziva na endomski se naziva lizozomski i njega sacinjavaju organele koje nazivamo primarnim lizozomima, sekundarnim lizozomima i rezudealnim telima (ako ih klasifikujemo na ovaj nacin, prezentiram vam ih kao da se radi o 3 razlicita tipa vezikula u okviru jednog lizozomskog sistema). Danas znamo da je ovo zapravo niz vezikula koje se transformisu u degradativnom kompartmentu, nadovezujuci se jedna na drugu,tako da slobodno mozemo reci da iz primarnog lizozoma nastaje sekundarni lizozom, a iz njega rezidualna tela. Ali, primarni lizozom (na slici) se zapravo fuzionise sa vezikulom koja dolazi ili iz kasnog endozoma ili iz autofagozomalnog dela celije. Znaci ili kasni endozomski kompartment ili autofagni kompartment je dao membransku vezikulu, sa materijalom koji je neophodno degradirati i ta vezikula se fuzionise sa prvom organelom lizozomskog sistema, a to su primarni lizozomi. Primarni lizozomi su organele membranske koje su jako heterogene po svojoj velicini i po svom izgledu pod EM-om,sto znaci da njihova velicina jako varira (0.10.5nm), ali su opisani i primerci mikrolizozoma velicine 0.01nm, sto nam sve govori o tkivnoj specificnosti primarnih lizozoma. Najjednostavnije to mogu da vam pojasnim ovako: kada pogledate repertoar svih celija u nasem telu (neurone, hepatocite, celije creva, zeluca, koze…) videcete da u nasem telu postoje dve kategorije celija: 1. Profesionalne fagocitarne celije: to su celije u cojoj cete citoplazmi, kada god ih pogledate, uociti populaciju primarnih lizozoma. Ti lizozomi se jako lepo uocavaju jer su potpuno crni. Radi se o vezikuli koja ima jednu membranu i kojom je zaokruzen matrix i taj matrix je najcesce kod fagocitarnih celija izuzetno gust i crn sto nam sugerise odmah sa EMje da se radi o velikoj kolicini proteina,enzima koji postoje u tim lizozomima. 2. Za razliku od tih celija sve ostale nase celije vrse endocitozu na zahtev, one fagocitiraju onda kada je to celiji potrebno, sto znai da one nece trositi svoju energiju na sintetisanje i stvaranje primarnih lizozoma u takvoj kolicini i stalno, vec ce kada vrsi endocitozu ili autofagocitozu istovremeno ukljucivati signale da stvara i primarne lizozome i na taj nacin da objedinjuje strukturu i funkciju. Kada kazem da stvara primarne lizozome, to znaci da ovaj membranski kompartment nastaje od membranskih organela celije koje se nazivaju gER i kompleks goldzi, o kojima cemo govoriti kasnije, te je za sada dovoljno da znate da kompleks Goldzi i gER daju primarne lizozome. Ako govorimo o ostatku celija videcemo da su njihovi primarni lizozomi uglavnom veci od lizozoma koji postoje kod fagocitarnih profesionalnih celija i da su znatno svetlijeg matrixa, ali se ponekad u celijama susrece kontra primer, mikrolizozomi, sto opet ima logiku, jer ako se vrsi endozitoza na zahtev onda ce mala kolicina enzima tipicnog za fagocitozu biti koriscena, pa ce primarni lizozom biti vrlo mali. U primarnom lizozomu kako god on izgledao, a vidimo da je

42

heterogen, i po velicini i po izgledu, obliku (ovalan, elipsast, tobularne forme), svetlo, tamno siv ili crn. Ta heterogenost nam govori da je kolicina i vrsta enzima koji se nalazi u tim lizozima tkivno specificna, odnosno, razlicita. Sta sve primarni lizozom moze da degradira? Koje enzime sadrzi? Enzimi primarnog lizozoma, kada to kazemo, mislimo na spektar svih enzima koji se u njima mogu pojaviti, podrazumeva da se mogu degradirati i ugljeni hidrati i proteini i lipidi. I to naravno, do svojih monomernih konstituenata. Posto sadrzi veliku kolicinu enzima koji su hidroliticki enzimi, postavlja se pitanje kako je membrana primarnog lizozoma rezistentna na degradaciju od strane tih enzima? Membrana primarnih lizozoma sadrzi jednu zastitu u vidu izvrnutog glikokaliksa, odnosno, iako s na slici to ne vidi jasno, izmedju membarne i matrixa postoji relativno tanak, prosvetljen, beli prostor. Taj beli prosvetljeni prostor, ta fizicka distanca izmedju membrane i matrixa, ka enzimima, bogato dekorisana ugljeno hidratnim grancicama, jedna vrsta izvrnutog glikokalixa. Taj debeli mocni ugljeno-hidratni deo membrane lizozoma fizicki stiti od dejstva enzima. Zatim, prisustvo protonskih pompi u membrani primarnog lizozoma prilicno snizava pH, koji je oko 4, tako da su na toj pH vrednosti hidroliticki enzimi inaktivisani. Dakle ceka se momenat da dodje do fuzije ili sjedinjavanja primarnog lizozoma sa endozomskom ili autofagnom vezikulom i u tom trenutku kada se te dve vezikule fuzionisu svojim membranama nastaje druga organela lizozomskog sistema-sekundarni lizozom. S obzirom da nastaje fuzijom dve vezikule,jasno je da ce sekundarni lizozom biti veci od primarnog lizozoma i da ce se mesanjem dve sredine, koje se po pH vrednosti razlikuju,doci do optimuma pH delovanje hidroliza. pH vrednost ce se siftovati na gore, ka 6, taman za toliko da dodje do aktivacije hidrolitickih enzima. U sekundarni lizozom ce biti ubacen supstrat za enzime tako da membrana lizozoma vise nema razloga da “istrakuje” od ostecenja jer e se svi enzimi sada usresrediti na delovanje tako sto ce razlagati supstrat. Na taj nacin, celija je potpuno zasticena od prskanja membrane lizozoma i izlivanja tog sadrzaja u citoplazmu. Napominjem da je velika zabluda da membrana lizozoma mora da ostane intaktna, narocito primarnog lizozoma, jer ako dodje do izlivanja enzima oni ce da razaraju citoplazmu. Da li je to tacno? Koja je pH vrednost citoplazme? pH je 7-nema sanse da na toj pH vrednosti rade enzimi. Tacno je da lizomalni enzimi mogu da narusavaju strukturu i funkciju celije-to je jedan tip celijskog umiranja,ali pre prskanja membrane lizozoma i izlivanja enzima u okolinu i citoplazma menja svoju pH tokom programa celijskog umiranja i time cini svoje proteine prijemcivim za hidrolizu od strane enzima koji su bili u okviru primarnog lizozoma, odnosno lizozomskog sistema. U “normalnim” situacija, dakle, celija ne mora da “brine” jer se hifroliticki enzimi ne mogu aktivirati pri pH vrednsoti koja vlada u citoplazmi. No, da se vratimo na sekundarne lizozome. Da li citoloski mozemo da znamo sta je sekundarni lizozom? Mozemo na dva nacina. Posto je to organela koja trpi promene u izgledu kroz vreme. Prvi znak je belo polje, koje je polje delovanja hidrolitickih enzima i kako vreme tece mi cemo videti da sekundarni lizozom prvo malo povecava volumen jer ulazi voda, koja je potrebna, tu su hidroliticki enzimi, to je onaj deo koji ce povuci posle degradiran materijal kroz brojne transportere i izvuci u citoplazmu. Dakle, prvo malo primecujemo blago povecanje volumena, a zatim sve veci broj belih i svetlo sivih polja, koja dominiraju, dok se vrlo jasno pocinju izdvajati potpuno crne oblasti i to su oblasti gomilanja materijala koji ne moze da bude razlozen. U trenutku kada je sekundarni lizozom svojim enzimima potpuno razlozio ono sto se moze, kada je to sto je nastalo kao produkt razlaganja, zajedno sa vodom napustilo matrix sekundarnog lizozoma, kroz membranu, ostaje u celiji poslednji produkt, tj. Reziduana tela.Razlikujemo tri najtipicnija rezidualna tela: 1.Homogeno-heteregeno - tako se oznacava jer su u njemu potpuno u distinkciji homogene oblasti, znaci imaju jednu potpuno crnu i jednu potpuno sivu oblast, a opet sama struktura je heterogena zato sto ima i tamnu i svetlu oblast(ovaj tip rezidualnih tela najradije

43

stvaraju nase celije, zato sto je to rezidualno telo koje nastaje tokom degradacije onoga sto pristize regularnom receptoritom endocitozom. 2. Mijelinu slicne figure - to su rezidualna tela koja u svom matrixu imaju koncentricno postavljene “membrane” i zato se tako nazivaju, da bi naglasile slicnost sa mijelinskim omotacem koji se formira oko axona nervnih elija. Znaci imaju visestruko koncentricne lamele membranskog tipa,zapravo i jesu, na neki nacin,ne razgradivi deo membrana onih organela koje je autofagozom zaokruzio I poslao u lizozomski sistem. 3. Lipofuscinska granula - vrlo nepravilnog oblika, sadrzi jako tamne ili svetle regione i sadrzi lipidna tela. Cesto se histohemijskim metodama moze dokazati prisustvo gvozdja u ovim rezidualnim telima. Prisustvo lipofuscinskih granula u celiji najcesce znaci da je celija pretrpela oksidativna ostecenja, odnosno da je doslo do lipidne perokxidacije njenih membrana. Tako da je lipidna peroksidacija bila pojacana jonima gvozdja, koji imaju izrazito prooksidativna svojstva i da su te ostecene membrane bile razlozene, a kao produkt smo dobili lipofuscinska tela. Celije koje sadrze lipofuscinske granule su mrke boje i na kozi zena nakon 40 godina mogu da se zapaze (staracke pege). Stalno se vracaju, ni jedna vrsta izbeljivanja ne moze ih ukloniti jer jr to proces konstantnog nagomilavanja i pravljenja lipofuscina i one su pod stalnim oksidativnim ostecenjem. Zato se ti delovi koze najcesce mazu preparatima sa E vitaminom, jer on kompenzira, sluzi kao antioksidativ i pomaze da elija ne vrzi lipidnu peroksidaciju. Sta biva sa rezidualnim telima ako ih celija vec sadrzi, da li ih zadrzava (sto je jasno za lipofuscinske granule) ili ih moze na neki nacin izbacivati iz celije? Kada govorimo o celijama koje prave epitele i to epitele kojima zatvaraju supljine/kanale u nasem telu, onda mozemo reci da te celije mogu rezidualna tela jednostavno da izbace u lumen i da se na taj nacin njih oslobode i to se desava sa homogeno-heterogenim rezidualnim telima. Za mijelinu slicne figure ne mogu sigurno da vam kazem jer u literaturi do sada nisam nasla precizan podatak o tome da li se izbacuju ili zadrzavaju u celiji. Za razliku od membranskog degradativnog kompartmenta/lizozomskog sistema,proteazomi postoje i kod eukariota u celijama zivotinja. Kada posmatrate negativno kontrastiranje proteazome (centrifugiranje, izdvojene, stavljene na mrezicu i negativno obojene) vi vidite da oni lice, da su to cilindri i cak kada se bolje zagledate, kada je uzduzni pogled na njih, vidi se da postoje nekakve komorice-proteinski prstenovi. Kada vidite izvorni cilindar vi vidite da je on ustvari potpuno identican onom (20s) proteazomu koji se javlja i kod prokariota. Za razliku od prokariotskih celija, eukarioti su se specijalizovali u degradaciji putem proteazoma i nadodali tokom evolucije dve kape i sa leve i sa desne strane cilindra i time je nastao 26s proteazom, eukariotski, koji je karakteristican i za arhee. Dakle, i u okviru celija koje su slicne po organizaciji prokariotskom prototipu, mogu se susresti proteazomi koji su, da tako kazem,tipicni za eukariote. Proteinski prstenovi formiraju,zatvaraju,tri komorice unutar cilindra. Kada se sukcesivno izoluju komponente preteazoma i posmatramo ih negativno kontrastirane (to znaci da “bojimo”,jer kod EM-a nema pravog bojenja, kontrastiramo okolinu a ne samu strukturu, zato se zove negativno kontrastiranje, jer sama struktura nakon “bojenja” okoline vidi se kao bela,na taj nacin se dobija negativ posmatrane strukture), mozete videti da je zaista jedan cilindar, da postoje proteinski prstenovi, da na poprecnom preseku izgleda kao cvetic sa 6 latica, a kada pogledate celovit proteazom vidite da je od jednog malesnog ilindra nastala jedna vrlo dugacka struktura sa dve kape, i to su kape koje su “nadodate” na krajeve cilindra i sada dobijamo 26s proteazom. Kada pogledamo strukturu proteazoma,mozemo razlicitim bojama da oznacimo kape na dva kraja i cetiri proteinska prstena koja prave tri komore. Proteazomi su specijalizovane strukture za degradaciju proteina. U literaturi se proteazom opisuje kao stari mlinovi za kafu, na taj nacin, dakle kao mlevenje kafe, se odigrava i degradacija proteina na AK-e u proteazomima. Jasno je zasto su

44

proteazomi potrebni osim membranskog degradativnog kompartmenta-u celiji je sve od proteina, celija mora da kontrolise kolicinu i kvalitet proteina koji u njoj postoje. Da li svaki protein moze da bude proteran kroz proteazom? Moze, ali mora pre toga da bude oznacen ubikvitinom. Protein koji je nepravilno savijen, koji nema dobru primarnu sekvenciju, koji se oznacava kao strah za celiju, ne prepoznaje se, on biva ubikvitiran i zapravo, ubikvitinacijom se prepoznaje protein koji je za degradaciju u proteazomu, tako da se nakon degradacije proteina ubikvitin reciklira i vraca za obelezavanje ostarelih ili novih, nefunkcionalnih proteinskih molekula. (kada se oznaci ubikvitinom, da li se menja sama struktura proteina ili ostaje isti? Kazu da ostaje isti, jer taj protein je, to nije potpuno u literaturi objasnjeno.Ovde je prikazan i uvek cete videti da se u knjigama prikazuje kao nekakav fibril, kao linija, u sustini ogroman broj proteina nema tu linearnu strukturu, on je u prostoru savijen nekako. Izgleda da se protein, samim tim sto je ostareo, nepravilno funkcionise, vec delimicno odvijen i da ubikvintinacija na jednom kraju sluzi samo da ga prepozna proteazom, samo toliko i nista drugo. Znaci on ne utice na dalje odvijanje proteina. Izgleda da kada vec se odigra prepoznavanje i kada protein krene da upada unutra, da ga sam proteazom odvija, i prolazeci kroz tri komore jednostavno se dolazi do toga da imate linerarni sloj AK-a i samo se seckaju. Izuzeci: Videli smo ono sto je glavno u celiji, skolski kako sve ide,kako se proces odigrava. Sada da vidimo sta su izuzeci, da to nije uvek bas tako. Prvi primer su antigen-prezentujuce celije, to su one celije koje prezentuju nasem imunskom sistemu.Ti antigeni celijama imunskog sistema govore ili na sta treba da sintetisu antitela ili da prepoznaju promenjene proteine i da prozdiru te celije koje nose takve antigene. U antogen-prezentujuce celije spadaju makrografi,ali u nasim tkivima postoje posebne celije zaduzene za prikupljanje antigena i prezentaciju imunokompetentnim celijama, mora doci do njegove delimicne degradacije. Ako ga potpuno degradirate u celiji nista niste uradili,vas organizam nece prepoznavati patogene i kraj. Sto znaci da postoji vrlo specifican put prolaska antigena kroz antigen-prezentujuce celije da bi pojedini delovi proteina koji je antigen, dospeo do povrsine membrane AE-prezentujuce celije ne bi li ga limfociti prepoznali i videli, dakle reagovali na taj antigen. Antigena proteinska struktura, kako god da je usla u celiju, biva degradirana, posto prvo ulazi u proteazome, ali ne u potpunosti. Zatim ulazi u ER gde se komplexuje sa proteinima glavnog histokompatibilnoh komplexa (ovo ne mora da se detaljno uci jer je to predmet visih kurseva). Ulazi znaci u Er I to gER u kome se sintetise protein glavnog histokompatibilnog komplexa i dalje ide do komplexa Goldzi (posto je on jedini put ka spoljasnosti) da bi dao vezikulu i ta vezikula se fuzionise sa celijskom membranom, cime se prezentujuci antigen nadje u membrani, odnosno, moguce je da ga imunokompetentne celije “vide” i prepoznaju kao nesto strano za nas organizam. Proteini koji se na ovaj nacin obradjuju i prezentuju imunskim celijama ne moraju da idu kroz proteazome, oni mogu da budu uvueni u endozomski sistem, da prodju rane i kasne endozome, da udju u membranu degradativni kompartment i sada u tim sekundarnim lizozomima ne dozive potpunu degradaciju, zato sto u zajednici sa njima idu shaperoni, proteini pratioci koji ne dozvoljavaju da taj protein, potencijalni antigen, bude u potpunosti degradiran u lizozomskom sistemu. No, kada posmatramo jednu celiju koja moze da vrsi endocitozu, autofagocitozu, ima proteazome. Postavlja se pitanje da li je ta podela posla u celiji bas stoprocentna, da li je zacrtano “da ovi proteini i ovi materijali idu u lizozom, ovi proteini idu u proteazomski sistem” ili ima nekog preklapanja u funkcijama ova dva degradativna kompartmenta? Naravno da ima preklapanja, odnosno, moze se desiti da odredjene vrste proteina ne idu u proteazomski sistem na degradaciju nego ulaze direktno u primarne lizozome, bivaju

45

inserirani,inicirani u lizozomski sistem i to se radi kroz specificne proteine u membrani lizozoma koji cak lice na proteazome. Sastoje se od subjedinica, ali zna se da ti proteini moraju da sadrze tacno odredjenu sekvencu AK-a, dakle, oni su preformatirani sa tom sekvencom. Vec postoje kao takvi, samo je ta sekvenca nedostupna “pogledu” lizozomskog sistema dok je protein stabilan u svojoj tercijalnoj ili kvaternernoj konformaciji. Kada se ta struktura, odnosno njegova funkcija narusi, sekvenca biva izlozena i ona onda odvodi protein u lizozomski sistem gde se on ubacuje i degradira. Ovo je takodje, jedan izuzetak, prosto da se vidi da nije sve tako kako nam se po knjigama prezentira.

Eucariote -biljke- Vakuola Kod biljaka postoji analog endozomsko-lizozomskom sistemu, olicen u jednoj membranskoj organeli koja se naziva-vakuola. Kada posmatramo biljna tkiva, a mi se necemo previse baviti citologijom svih biljnih tkiva, uzecemo sva tipicna primera: 1. Meristemske celije - obnavljajuce celije u biljnim tkivima, 2. Mezofilne celije - diferencirane celije. Mozemo videti da kod meristemske celije zapazamo veci broj sitnih vakuola, a kod diferenciranih celija najcesce zapazamo jednu krupnu vakuolu, centralno poziciranu u celiji, tako da su citoplazma i sve ostale organele potisnute ka periferiji. Vakuola u biljnim celijama je organela koja je uspostavljena membranama. Ta membrana se posebno oznacava kao tonoplast i sama unutrasnjost vakuole je jedna vodena sredina ispunjena materijom u zavisnosti od tipa celije kojoj ta vakuola pripada. Kada posmatramo meristemsku celiju, vidimo veci broj sitnih vakuola, te nam postaje jasno da je poreklo vakuolarnog sistema sER, glatko-granularni ER. Dakle sa njega se odvajaju vezikule koje se fuzionisu i sacinjavaju sitne vakuole, a diferencijacioni program onda ukljucuje fuzionisanje veceg broja vezikula. Cak se zna da ovako krupnu, diferenciranu vakuolu, cesto obnavljaju sitne vezikule koje pristizu iz oblasti granularnog-glatkog ER o Goldzi komplexa i stalno obnavljaju i sastav i membranu vakuole. Kao sto smo pokazali da kod primarnog lizozoma postoji izvrnuti glikokalix i vakuola,odnosno tonoplast ga sadrzi, na svojoj unutrasnjoj povrsini, dakle, ka centru vakuole, matrixu. Sta se nalazi u vakuoli? Velika kolicina vode, zato sto je vakuola, u biljnim celijama, uzela na sebe da kada celija, tokom diferencijacije, dobije jedan debeo, mocan rigidan celijski zid, kolicinom vode potiskivanjem citoplazme zapravo ne dozvoli kolapoiranje celije. Vakuola sa ogromnom kolicino vode osnovni je regulator osmotskog balansa u biljnoj celiji. To nije slucaj sa meristemskom celijom, jer ona ima tanke, elasticne primarne celijske zidove, pa nema taj problem kao diferencirana celija, koja je “zarobljena” u celijskom zidu. Osim vode u celijskom matrixu vakuole se nalaze i enzimi, jer ona je analog lizozomskog sistema. Nalaze se brojni produkti bilo degradativni, bilo sintetski, pa tako znamo da se biljni pigmenti mogu deponovati u vakuoli. To je karakteristicno kod cvetnih latica, zatim se moze deponovati nikotin i jos citav spektar drugih supstancija. S obzirom da je vakuola i degradativni i endozomski kompartment, u tonoplastu su prisutni brojni funkcioni i strukturni proteini, znaci brojne pumpe, akvaporini, transporteri, da bi vakuola mogla da ostvaruje svoju tkivno-specificnu funkciju. i u biljnim organizmima, kao i u celijama zivotinja, endozomsko-lizozomski sistem je tkivno specifican, zavisi od toga sta se unosi u vakuolu i koji su degradativni enzimi pristni.

46