-EXTRACTO Matarraton Ucla

EFECTO DE EXTRACTOS ETANOLICOS Y ACEITES ESENCIALES DEL OREGANO SILVESTRE ( Lippia  Lippia origanoides H.B.K.) Y MATARRATON (Gliricidia sepium (Jacq.) Walpers) EN EL CONTROL CONTROL DE LA GARRAPATA COMÚN DEL BOVINO Rhipicephalus microplus (ACARI: IXODIDAE) METODOLOGÍA

Elaboración de extracto de orégano silvestre ( Lippia  Lippia

origanoides origanoides

H.B.K.) Y

matarratón (Gliricidia sepium (Jacq.) Walpers)

La obtención de los EE se realizará utilizando la metodología recomendada por Marcano y Hasegawa (2002). El material vegetal para la obtención del EE consistirá en 4 Kg de hojas frescas, aparentemente sanas y plenamente desarrolladas de orégano silvestre y matarratón, las cuales se colectaran, en el primer caso de plantas silvestres localizadas en el Parque Nacional Terepaima, específicamente en terrenos aledaños al Decanato de Ciencias Veterinaria de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA) y en el segundo, de plantas ubicadas en la Estación Experimental Dr. Manuel Salvador Yépez “El Torrellero, finca perteneciente a la UCLA. Una vez en el Laboratorio de Microtecnia e Histopatología Vegetal del Posgrado de Agronomía, las hojas se colocaran, por separado, en sacos de malla, para favorecer la ventilación y facilitar el secado y se cuelgan en cobertizo, para evitar la luz. Transcurridas 2 semanas, serán molidas en molino industrial y el polvo resultante se pesa, obteniéndose un valor inicial en Kg. Para macerar el polvo obtenido de las hojas, el mismo se coloca en tobos de plástico con etanol al 96%, en una proporción de 1Kg de material vegetal molido/10 L de etanol, ésta mezcla se deja reposar por 2 semanas. El líquido será filtrado utilizando una gasa de cuatro capas y concentrado en un sistema de secado rotatorio al vacío (roto-vapor Brinkmam MR, Mod. RE111) a 100°C. El extracto crudo concentrado obtenido, luego de la evaporación del agua y etanol, será recuperado utilizando el sistema de secado rotatorio y almacenado a 8 ° C hasta la evaluación de las propiedades acaricidas, se guarda en un envase protegido de la luz, bajo refrigeración, hasta el momento de la aplicación de los tratamientos.

Extracción del aceite de orégano

Para la obtención del AE del orégano se usan hojas molidas y secas, se colocan en un equipo de destilación. Inicialmente se obtiene el aceite + agua, concentrándose el primero en la parte superior de la mezcla, posteriormente, una vez terminado el proceso de destilación, se separan ambos líquidos con la ayuda de un embudo de separación. El aceite resultante se guarda en viales, protegido de la luz directa y bajo refrigeración. En el caso del matarratón no se obtiene aceite esencial, según ensayos previos con esta planta.

Determinación y cuantificación de metabolitos secundarios (MS) en extractos etanólicos de orégano silvestre ( Lippia origanoides H.B.K) y matarratón (Gliricidia  sepium (Jacq.) Walpers) por

cromatografía en sílica gel.

a. Determinación cualitativa. Utilizando cromatofolios de silica gel (TLC 60 F254) cortados a 6,5 x 2,5 cm; con la ayuda de una micropipeta se adicionan 10 µL de los EE de ambas plantas distribuidos en 2 gotas a 1 cm de uno de los extremos del cromatofolio (Marcano y Hasegawa, 2002).

i. Alcaloides. Se prepara la mezcla de solvente utilizando n-butanol+ ácido acético + agua a una proporción de 9:2:1. Se agrega el solvente en la cámara para cromatografía, dejando correr el solvente hasta que ascienda 0.5 cm antes del extremo final del cromatofolio. Se revela la presencia del MS bajo lámpara de luz UV, la presencia de coloración fluorescente-naranja es indicio positivo para este grupo de metabolitos.

ii. Flavonoides. Dentro de la cámara para cromatografía se adiciona el solvente, el cual contiene una mezcla de benceno + ácido acético + agua en una proporción 12:7:2. Se colocan los cromatofolios dejándolo correr hasta 0.5 cm antes del extremo. Revelado bajo lámpara UV, el indicativo de la presencia estos MS sería la aparición de una coloración blancaverdosa.

iii. Fenoles.

Para la determinación de fenoles se prepara el solvente, mezclando agua + ácido acético

a una proporción de 9:1. Colocando los cromatofolios en la cámara de

cromatografía, se dejan igualmente correr hasta 0.5 cm antes del final de la placa. Se realiza el revelado con una solución de cloruro férrico al 1%, la aparición de una coloración parda oscura es el indicativo de la presencia de estos MS en el cromatofolio. Todo el procedimiento se hace dentro de la campana de flujo laminar.

iv. Saponinas. Se diluyen 5 ml del EE en 5 ml de agua destilada, manteniendo una relación 1:1, se agita vigorosamente durante 1 min. Posteriormente, ocurre la formación de espuma y si ésta es persistente durante 15 minutos, se considera positiva la prueba para este grupo de MS.

v. Aceites esenciales. Se determina por los aromas característicos que le proporcionan este grupo de MS al extracto etanólico.

b. Determinación cuantitativa. Para la cuantificación se utiliza la metodología planteada por Vásquez

et al.

 (2008) se

utilizan los mismos cromatofolios usados en las corridas cromatográficas, a las cuales se les determinó los grupos de MS presentes en los EE de orégano silvestre y matarratón almacenados a 8 y 26°C. Siendo positiva la presencia del MS en el cromatofolio, se procede a marcar el área ocupada por el metabolito. Con un sacabocado afilado se extraen tres secciones, las cuales se raspan y luego se pesan en una balanza analítica Ohaus Adventure N° AR2140, se utiliza para calcular el peso (g) de cada MS. Este primer material pesado es la silica gel, correspondiente a lo que se llama área conocida (AC); esta contiene MS + sílica + solvente. Lo restante de la marca igualmente se raspa y se anota como área desconocida (AD), contiene de igual modo MS+silica+solvente. Posteriormente se procede a sacar tres discos con el sacabocado en el cromatofolio correspondiente al control, los cuales se raspan y pesan denominándose como el área control (ACt), la cual contenía sílica + solvente. Para

conocer la concentración de metabolitos secundario en mg · mL-1 se emplea la siguiente fórmula.

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Donde los 10 µL representan la cantidad de extracto que se agrega a cada cromatofolio.

Evaluación de extractos etanólicos y aceite esencial de orégano silvestre  (Lippia  origanoides H.B.K) y matarratón (Gliricidia sepium (Jacq.) Walpers) sobre la garrapata Rhipicephalus microplus. Para la evaluación de los EE y AE de orégano silvestre y matarratón se usarán teleoginas (hembras adultas ingurgitadas) de R. microplus de 6 a 9 mm de largo, obtenidas directamente de la piel de la región inguinal de bovinos de una finca. Se transportan en envases de plástico con tapa agujereada; identificados y colocados en cavas con hielo para su procesamiento en las siguientes 24 h. Las teleoginas colectadas se identifican y se seleccionan aquellas que estén vivas y sin daños, luego se lavan con agua corriente en un colador de acero inoxidable, se secan con papel absorbente y se pesan individualmente en una balanza electrónica. Se distribuyen en placas de Petri grupos de diez garrapatas/placa con un peso homogéneo por grupo. Se utilizarán los EE de L. origanoides y G. sepium a las concentraciones: 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5% y 1,25%, disueltos en agua destilada. Asimismo, el aceite esencial de L. origanoides obtenido se emulsiona por agitación en agua destilada y se preparan las concentraciones al 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,06%. Se aplica el test de inmersión de adultos de Drummond et al. (1973), en el cual se usan dos grupos de 10 garrapatas por cada concentración más un grupo control, que consistirá en seis grupos de 10 garrapatas no tratadas. Los especímenes se incuban a 26º C ± 85% HR en cabinas de vidrio por 18 d, colocados en bandejas de vidrio y pegadas con cinta adhesiva de manera que el producto ovipositado pueda ser colectado, pesado, transferido a tubos de ensayo e incubado nuevamente por 25d hasta obtener las larvas. Una vez eclosionados los huevos se diferencian las larvas y los huevos no eclosionados, para obtener el porcentaje de eclosión por el método visual.

En todos los casos, cada concentración se probará por separado, en ningún momento se mezclarán ni se repetirán pruebas de inmersión con extractos distintos. A continuación se describen los grupos experimentales y el control.

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Determinación de parámetros reproductivos en R. microplus Con los datos del peso de las garrapatas, el peso de la masa total de huevos producidos por garrapata y el porcentaje de eclosión, se calcula la eficiencia reproductiva (ER), valor que expresa la capacidad de una teleogina para transformar su peso corporal en larvas viables, de acuerdo a la fórmula siguiente (Drummond et al., 1973):

Peso de los huevos ER = ________________________ x % Eclosión Peso de las garrapatas

La eficacia o porcentaje de control se calcula en los grupos sometidos al test de inmersión de adultos, según la fórmula de Abbott la cual expresa el porcentaje de control parasitario (Abbott, 1925):

ER control- ER tratado Eficacia = _____________________

x 100

ER control

Determinación de porcentaje de mortalidad de larvas de R. microplus. Se utilizarán 30 garrapatas R. microplus adultas ingurgitadas para obtener la masa de huevos tras su incubación por 18 días a 26º C ± 85% HR en cabinas de vidrio. Será recolectada en tubos de ensayo y llevadas a incubación nuevamente bajo las mismas condiciones de temperatura y humedad por 21 días. Luego de la eclosión de los huevos se dejan madurar las larvas por 14 días. Utilizando cápsulas de Petri con papel filtro adosado en el fondo, se realizarán 2 grupos experimentales, con seis concentraciones distintas, un grupo con extracto etanólico (EE) de L. origanoides y otro con EE de G. sepium en dos repeticiones de cada concentración, haciendo un total de diez (10) preparaciones por cada extracto, más cuatro cápsulas que contienen papel filtro para preparar el grupo control o sin tratamiento, el cual solo se le agregará agua destilada. Se prepararán 20 ml de cada uno de los extractos a una concentración del 20%, diluida en agua destilada. Se tomarán 10 ml de esta concentración, diluyéndola en forma sucesiva en partes iguales de agua destilada para obtener las siguientes concentraciones: 10%, 5%, 2,5%; 1,25%, 0,625%, 0,312% de cada extracto por separado. Asimismo, se prepararán 6 concentraciones del aceite esencial de L. origanoides y G. sepium emulsionado en agua destilada al 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,12% y 0,06%. Con una pipeta automática se impregnarán los papeles filtro, dentro de las cápsulas identificadas, con 1 ml de la concentración correspondiente de cada tratamiento.

Posteriormente se colocarán sobre el papel filtro de 100 - 120 larvas por cápsula y se sella con cinta adhesiva de manera hermética cada una, para evitar que escapen las larvas. El grupo control consiste en 4 cápsulas con agua destilada sin tratamiento en el papel filtro. Se introducen de nuevo en la cabina de incubación por 24 horas para determinar el número de larvas vivas y muertas obtenido después de los tratamientos de los EE y AE para obtener el porcentaje de mortalidad de las larvas en cada grupo al final de las 24 horas. Se considerarán larvas muertas aquellas que no caminan ni mueven sus patas. Se contará el número de larvas muertas por cápsula y el total de larvas por cápsula utilizando una lupa estereoscópica y pinzas entomológicas. ����� �. ��������������� � ������ ������ ���� �� ������ �� ��������� �� ������ �� ������������� ��������� ��� ��������� ���������� �� ������ ����������� � ���������� ������

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