Tecnicas de Analisis en Genetica Forense

TÉCNICAS EN EL ANÁLISIS DE MICROSATÉLITES UTILIZADOS EN IDENTIFICACIÓN HUMANA

PASOS EN EL PROCESAMIENTO DE UNA MUESTRA DE ADN Muestra obtenida de la BIOLOGÍA

escena del crimen o de una prueba de paternidad

Cuantificacion Cuantificacion de deADN ADN

Extraccion Extraccion de deADN ADN

Amplificación AmplificaciónPCR PCRde de marcadores STRs marcadores STRs

TECNOLOGÍA Separación y Detección de productos PCR ( Alelos de STRs)

Comparación Comparación del del genotipo de la muestra genotipo de la muestra con con otros otros resultados resultados

Determinación genotipo muestra

GENÉTICA

Análisis Análisis de de los los resultados resultados (comparación con (comparación con datos datos poblacionales) poblacionales)

Entrega Entrega de de resultados resultados (cálculos estadísiticos) (cálculos estadísiticos)

•Describir tipo de

muestra, su color, su forma, su marca, etiqueta y talla si procede, tipo de envoltorio que lo contenía y estado de conservación.

•Muestras dubitadas

•Muestras indubitadas

Muestras utilizadas para extracción de ADN

EXTRACCION DE ADN  Extracción

orgánica

(fenol-

cloroformo)

 Extracción

no orgánica (agentes quelantes): agentes quelantes: resina Chelex, formada por copolímeros de estirenodivinilbenceno que contienen iones iminodiacetato que actúan como grupos quelantes.

CUANTIFICACION DEL ADN  Fluorometría 

Fundamento: capacidad de unión del ADN a ciertos tintes fluorescentes como H33258



Comparación de las muestras problema con muestras de cantidad de ADN conocida



Se utiliza lámpara de detector fluorescencia



ADN de doble cadena

un Fluorímetro: mercurio y un para medir relativa a 460nm

CUANTIFICACION DEL ADN  Espectrofotometría 

Medida de la cantidad de luz ultravioleta que absorben las bases nitrogenadas



Utiliza un espectrofotómetro, medidas de absorbancia a 260 y 280nm



OD260 /OD280 : nucleico



Poco sensible: no dectecta concentraciones de ADN inferiores a 250ng/ml

pureza

del

ácido

ESPECTRO DE ABSORBANCIA ADN

http://www.cardiff.ac.uk/biosi/staffinfo/kille/Methods/Gene/Spec_Anal ysis.html

CUANTIFICACION DEL ADN  Minigel de agarosa 

Midiendo la fluorescencia inducida por ultravioleta que se produce cuando se intercalan moléculas de bromuro de etidio entre el ADN



Comparar con patrones estandar de cantidad de ADN conocida



Poco sensible



Ventajas: se puede visualizar el grado de degradación del ADN

CUANTIFICACION DEL ADN  Hibridación con sondas (Dot Blot y

Slot Blot) 

Hibridación de las muestras a cuantificar con una sonda del locus humano alfa satélite D17Z11.



ADN problema se inmoviliza en una membrana de nylon (punto: dot-blot; guión:slot-blot), se pone en contacto con la sonda



Sondas marcadas



Comparación intensidad de señal de la muestra con estándares

CUANTIFICACION DEL ADN

•Solo cuantifica ADN humano •Altamente sensible, detecta cantidades del orden de 20pg •Cuantifica ADN de cadena sencilla y muestras de ADN no purificadas

 Hibridación con sondas (Dot Blot y Slot Blot)

CUANTIFICACION DEL ADN

QuantiBlot

CUANTIFICACION DEL ADN Cuantificación enzimática  Uso de una serie de enzimas para producir una cantidad de ATP que depende de la cantidad de AD N presente en la muestra seguida de la generación de una señal luminosa, dependiente de la concentración de ATP

AMPLIFICACION DEL ADN

TÉCNICA DE PCR 5’

3’

5’

3’

3’ 3’

5’ 5’

ADN MOLDE

Cadenas separadas (denaturación)

Forward primer

5’

3’

5’

3’ Copias (extensión Adición de ) de primers primers 5’ (alineamiento)

3’

3’

5’

Reverse primer

MULTIPLES COPIAS DE ADN POR PCR

Original DNA target region

Thermal cycle

En En32 32ciclos cicloscon conun un100% 100%de deeficiencia eficienciase sepueden puedenproducir producirhasta hasta 1.07 billones de copias de ADN molde 1.07 billones de copias de ADN molde

MULTIPLEX PCR  Se pueden analizar hasta

10 loci simultáneamente

 Alta sensibilidad menos de

1 ng de ADN

 Util

en análisis de muestras degradadas y de mezclas

 Ventajas:

disminuye costos, tiempo, contaminación del ADN

SEPARACION de PRODUCTOS PCR  PCR

Multiple: diferentes marcadores fluorocromos pueden ser usados para el análisis de loci donde se sobrelapan el tamaño de los alelos

 Separación de productos PCR:  

TIPIFICACION MANUAL: Tinción de nitrato de plata DETECCION FLUORESCENTE SEMIAUTOMATICA Electroforesis capilar  Electroforesis en geles de poliacrilamida 

EJEMPLO DE UN KIT DE MULTIPLEX AmpFlSTR® Profiler Plus™

Separación por color

300 pb

200 pb

100 pb

400 pb

Separación por tamaño

D3 A

D8 D5

vWA

FGA

5-FAM (blue)

D21

D18

D13

D7

Estandar interno GS500

JOE (green) NED (yellow) ROX (red)

9 STRs amplificados junto con Amelogenina en una sola reacción de PCR

ELECTROFORESIS Electroforesis convencional  Geles de agarosa  Geles de poliacrilamida Fundamento  El ADN está cargado negativamente y al someterlo a una diferencia de potencial se moverá hacia el ánodo a través del gel una distancia proporcional a su tamaño, alcanzando mayor distancia las moléculas de menor peso.

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

ESCALERAS ALELICAS

ELECTROFORESIS CAPILAR

Cuando los fragmentos de ADN alcanzan la ventana capilar, el láser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia emitida por los colorantes es colectada por el detector a longitudes de onda particulares y registrados como señales digitales en el computador.

TIPIFICACION DE STRs

TECNICAS DE HIBRIDACION

SECUENCIACION

http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Automat1.jpg

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/F/FluorDideoxySeq.gif

El instrumento de secuenciación automática genera un cromatograma mostrando la emisión de los fluorocromos cuando ellos pasan por el detector en el instrumento. El orden de estos colores corresponde a el orden de las bases en el ADN. Así una secuencia de ADN puede ser leída directamente desde el cromatograma.

BIOCHIPS