Punto Isoelectrico de Aminoácidos y Proteínas

PUNTO ISOELECTRICO DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS  Alvaro Rueda 4-772-1613 Bolívar Chen 4-773-587 Krisly Sánchez 4-771-654 Facultad de Medicina, Escuela de Medicina BIOQUÍMICA OBJETIVOS: Determinar los pKa de un aminoácido y utilizarlo utilizarlo como punto de referencia para determinar su punto isoeléctrico. Establecer la importancia del punto isoeléctrico de las proteínas en el desarrollo de procesos fisiológicos en nuestro cuerpo. Determinar el punto isoeléctrico de una proteína mediante la técnica de precipitación. Determinar la importancia de algunos aminoácidos y proteínas como sustancias amortiguadoras. 

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MARCO TEÓRICO:  Aunque la mayoría de los grupos carboxilo y grupos amínicos de los aminoácidos se bloquean cuando estos se unen para formar las uniones peptídicas, siempre quedan libres algunos de estos grupos, ya sea en los extremos de las cadenas polipeptídicas, o en las cadenas laterales de los aminoácidos ácidos y básicos. La disociación de los grupos ionizables que están presentes en las proteínas, ocurre como en el caso de los grupos ionizables de los aminoácidos individuales, y es gobernada por el pH del medio en el que se encuentra la proteína. A pH 7,0 o en valores cercanos a esta condición, que son los habituales en la mayoría de la la células, los grupos carboxilo de los ácidos aspártico y glutámico se encuentran en sus formas básicas cargadas negativamente, mientras que los aminoácidos lisina y arginina están presentes en sus formas acídicas, cargadas positivamente. La contribución de los grupos sulfhídrico de la cisteína y fenólico de la tirosina, es mínimo; por ejemplo el grupo fenólico de la tirosina se encuentra ionizado en un 0,1 %. La carga total de la molécula proteica depende pues, del pH de la solución y del número relativo de cada aminoácido en la molécula. Así cuando el pH de la solución es tal que la carga neta de la molécula proteica es cero, es decir, cuando el número total de cargas positivas presentes en la molécula iguala al número de cargas negativas, se llama a este valor de pH, punto isoeléctrico o pH isoeléctrico de la proteína. (Bioquimica, Antonio Peña, Limusa 2004) MATERIALES Descripción Bureta

Capacidad 25 mL

Cantidad 1

Soporte

-

1

Pinzas de bureta

-

1

Vasos químicos

250y 500 mL

2

Pipeta

25 mL

1

Potenciómetro de pH

1

REACTIVOS Descripción Fórmula

Concen Cantidad Toxicidad tración 0.5% 25 mL No tóxica

 Ácido Glutámico

C5H504

Lisina

C6H14N2O2 0.5%

25 mL

 Ácido clorhídrico

HCl

2%

7 mL

Hidróxido de NaOH sodio

0.2 M

44 mL

Leche

-

50 mL

95%

50 mL

Etanol

C2H5OH

Propiedades fisicoquímicas

Pertenece al grupo de los llamados aminoácidos ácidos, o con carga negativa a pH fisiológico, debido a su segundo grupo carboxílico en su cadena secundaria No tóxica Actúa como neurotransmisor inhibidor en el central. Utilizada -in vitro- como medio gástrico, en solución 0.4M, amortiguada al pH estomacal para determinar bioaccesibilidad Irritante, Disolución acuosa del gas cloruro de provoca hidrógeno (HCl). Es muy corrosivo y quemaduras ácido. Punto de ebullición de 48°C; líquido incoloro o amarillento. Irritante Sólido blanco cristalino sin olor que absorbe humedad del aire. Corrosivo, se usa para fabricar  jabones, rayón, papel, explosivos, pinturas y productos de petróleo No tóxica Está compuesta principalmente por agua, materia grasa, proteínas, hidratos de carbono (lactosa), calcio, minerales y sal Tóxico Líquido incoloro, con punto de ebullición a 100°C y punto de congelación de 0°C.

PROCEDIMIENTO 1. TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS

Colocar 25 mL de solución de Lisina en vaso quimico de 250 mL

Titular con NaOH al 2 M 1 mL cada vez.

Repetir el procedimiento con una solución de ácido glutámico.

Graficar los resultados.

Medir el pH con un potenciometro hasta alcanzar 10

2. DETERMINACIÓN DEL PH DE LA CESEÍNA DE LA LECHE

Diluir 50 mL de leche en 150 mL de agua en un vaso químico de 500 mL

Titular con HCl al 2% hasta obtener un pH de 4.8

RESULTADOS 1. Titulación de aminoácidos 1.1 Lisina Volumen Norma mEq= NaOH -lidad (v (mL))(N) (mL) 0 0.2 0.00 1 0.2 0.20 2 0.2 0.40 3 0.2 0.60 4 0.2 0.80 5 0.2 1.00 6 0.2 1.20 7 0.2 1.40 8 0.2 1.60 9 0.2 1.80 10 0.2 2.00

pH 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2 2.3 2.4 2.4 2.5 3.1 9.7

Graficar los resultados.

1.2 Acido Glutámico Volumen NormaNaOH lidad (mL) 0 0.2 1 0.2 2 0.2 3 0.2 4 0.2 5 0.2 6 0.2 7 0.2 8 0.2 9 0.2 10 0.2

mEq= (v (mL))(N)

pH

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00

3 3.4 3.5 3.9 4.2 4.4 4.7 5.1 8.1 9.3 9.9

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20

11.7 12.3 12.5 12.7 12.9 12.9 13.0 13.1 13.1 13.1 13.1

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0,2 0,2

pH vs mEq

2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60

10.4 10.8 11.5 12.2 12.5 12.8 12.9 12.9 13.0 13.0 13.0 13.1 13.1

pH vs mEq

14 14 12

12

10

10

8        H       p

       H       p

6

8 6

4

4

2

2

0

0 0

1

2

3

mEq de NaOH

ACIDO GLUTÁMICO

4

5

0

1

2

3

mEq de NaOH

4

5

LISINA

 ACIDO GLUTAMICO

LISINA  =

 +   ,+,

  =



 =

= ,  

  = ,  =

 +  

  =

+

   =

  =

 .+,

   = .

 = =

 +  = . 

 + 

  =

 +

   =

=

Determinación de pI de la caseína de la leche HCl al 2% / Ml pH 0 6.5 1

6.6

2

6.3

3

6.1

4

5.5

5

5.3

6

5.2

7

4.8

DISCUSION  Al graficar el pH obtenido al agregar cierto mEq de NaOH a un volumen de aminoácido en este caso lisina y acido glutámico, se puedo observar que ambas curvas iniciaban con un lento ascenso, seguido por un rápido y un lento y estacionario ascenso finalmente.  A pH bajos, todos los grupos del

aminoácido están en su forma protonada, de forma que la carga neta del aminoácido es de signo  positivo. A pH altos estos mismos grupos se encuentran en forma de base conjugada, por lo que la carga neta en este caso será de signo negativo. Entre esta zona y la otra habrá un pH en el que la cantidad de carga negativa será igual a la positiva; llamado punto isoeléctrico o pH isoeléctrico de la  proteína, que es una contaste característica de la misma.   (Biomóleculas, Enrique Battaner Arias,2009). En base a esto podemos decir que la curva de lento crecimiento se debe a la capacidad amortiguadora de ambos aminoácidos. Al encontrarse en un pH acido los aminoácidos tendrán una carga positiva porque el grupo carboxilo es capaz de aceptar iones H, y el grupo amino queda cargado positivamente. Al agregarse pequeñas cantidades de base el grupo amino comienza a despotronarse para unirse a los iones hidroxilo de la base agregada y el aminoácido queda cargado negativamente. El punto medio entre los dos puntos de rápido ascenso en la gráfica representa el punto isoeléctrico. En este punto las cargas positivas y negativas del aminoácido son iguales. Los aminoácidos que poseen grupos aminos o grupos carboxilos adicionales en sus moléculas presentan puntos isoeléctricos que reflejan su tendencia a ser protonados o a perder un protón adicional, respectivamente. La lisina tiene tres valores de pKa, pKa: 2,18 para el grupo carboxilo, 8,95 para el grupo alfa amino y 10,53 para el grupo amino del carbono 6, el grupo €-amino. El punto isoeléctrico de la lisina es 9,74, el grupo € -amino de la lisina es más básico que el grupo amino en posición alfa y que, por lo tanto, el zwterion de la lisina tiene protonado el gr upo amino del carbono6, la representación de la variación de concentración de distintas formas de la lisina frente al pH muestra de cruce ya que la forma completamente protonado de la lisina posee tres puntos que pueden perder un protón y por lo tanto, tres valores de pKa. El punto isoeléctrico de la lisina sugiere que este aminoácido debe poseer una carga neta positiva a pH 7, un pH similar al de las células. Únicamente cuando el pH de la solución aumenta por encima de 9,74 la mayoría de las moléculas de lisina se convertirán en la forma zwitteriónica y no tendrán carga neta. El ácido glutámico posee un punto isoeléctrico de 3,2. El grupo carboxílico en el carbono 4 es similar a un grupo carboxílico alifático y tiene un pKa de 4,25. El otro grupo carboxílico alifático tiene un pKa de 2,19 y el grupo amino protonado un pKa de 9,67  (Química Orgánica: Estructura y Reactividad, Volumen 2, Seyhan Ege, pág. 1201-1202) En el cuadro de la determinación del pI de la caseína se aprecia las variaciones de pH de la caseína a medida que se le adicionaban 1,0 mL de HCl 2%. Partimos de un pH de 6.5; adicionamos 7 mL de, HCl 2% para que se diera la formación de la caseína llegando a un pH de 4.80. El pH en el que precipitan las proteínas de la leche (caseína) es el punto isoeléctrico (pI), en este caso nuestro valor de pI (experimental) es de 4.80, consultando encontramos el valor de pI (teórico) corresponde a 4.60 para la leche, nuestro valor es muy cercano al teórico, de diferencia solo tenemos 0.20. Este resultado cercano se puede deber a posibles errores en la titulación, o bien diferentes propiedades en la leche, como la marca la cual pudo haber influido debido a que a veces no se conservan las mismas concentraciones proteicas en las diferentes marcas de la leche, y tienden a variar un poco en la

CONCLUSIONES El pKa es la fuerza que tienen las moléculas de disociarse, un ácido será más fuerte cuanto menor es su pKa y en una base ocurre al revés, siendo más fuerte cuanto mayor es su pKa.. Las curva de titulación nos permitió determinar el pKa, y por med io de este, el punto isoeléctrico del aminoácido lisina y acido glutámico. El conocer el comportamiento ácido-base de los aminoácidos es de vital importancia para realizar este procedimiento. El pH en el que precipitan las proteínas se denomina punto isoeléctrico (pI), ya que se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas presentando una carga neta de 0 y la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada ya que la partículas se agregan produciendo una menor solubilidad. Mediante la titulación con ácido clorhídrico logramos alcanzar el punto isoeléctrico de la caseína donde es menos solubles, en base a esa menor solubilidad, la caseína se precipita y se puede aislar, que en la experiencia el pl fue en un pH de 4.8, en este punto la caseína se separa del resto de los componentes de la muestra de leche formando un precipitado. Se utiliza alcohol 

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para el lavado posterior del precipitado de la proteína obtenida, debido a que la caseína es insoluble en él alcohol y además el alcohol remueve la grasa de la leche, eliminando las impurezas del que pueda contener la muestra de caseína. BIBLIOGRAFIA Antonio Peña, Bioquímica, editorial Limusa (2004), 157 pag. Química Orgánica: Estructura y Reactividad, Volumen 2, Seyhan Ege, pág. 1201-1202 Brown, T. LcMay, H. Bursten, B. Murphy, 2009; Química La Ciencia Central, decimotercera edición. Pearson Educación Punto isoeléctrico, publicado por Dapne (11,2011), recuperado el 15 de abril de 2014 en http://biokimik2011.blogspot.com/2011/09/separacion-y-cuantificacion-de.html   

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CUESTIONARIO 1. ¿Por qué no se alcanza el pH 1 con HCl 0.1M en las soluciones en las que se prepararon de aminoácidos? Las proteínas son buenos amortiguadores por que los aminoácidos que lo constituyen se comportan como ácidos débiles .El gasto realizado con HCl al titular se deduce que mientras más estabilizada y estructurada esta la proteína mayor cantidad de volumen se requiere para lograr varia el pH de la solución cumpliendo así la propiedad amortiguadora que poseen las proteínas. En cambio cuando se desnaturaliza la proteína el gasto de HCl es mucho menor debido a que no alcanza mantener el pH constante. Como la concentración de ácido clorhídrico es de 0.1M, no se logra alcanzar un pH 1 debido a la estabilidad de los aminoácidos y a la baja concentración del ácido clorhídrico. 2. Compare los puntos isoeléctricos de la glicina y los péptidos glicil-glicina y glicil-glicilglicina? Que concluye sobre estos resultados: Glicina

 =

.+. 

= . 

La glicina es un aminoácido no esencial, lo que significa que tiene igual cantidades de grupo amino como ácido, al formar enlaces glicina-glicina, se forma una macromolécula por perdida de agua y su valor de pI no se altera bruscamente debido a que es el aminoácido más pequeño y neutro

3. ¿Porque las moléculas con grupos ionizables se hacen menos solubles en el punto isoeléctrico? Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese pH. Las moléculas se hacen menos solubles en el punto isoeléctrico debido a que el punto isoeléctrico representa el equilibrio de las cargas positivas y negativas presentando una carga neta de cero y la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada ya que las partículas se agregan. 4. En la precipitación de la caseína, qué pasaría si se añade muy rápido el ácido y si se alcanza un pH más bajo de 4.8. ¿Qué se debe hacer en este caso?

Si se le añade ácido muy rápido y se alcanza un pH más bajo de 4.8, la caseína se vuelve nuevamente soluble en este medio y desaparecería el precipitado. En este caso se deben añadir una solución de pH básico para compensar la disminución de pH o también se le añade más leche para disminuir la solución ácida.

5. ¿Por qué es necesario lavar la caseína precipitada con alcohol (etanol 95%) y éter? La polaridad del disolvente disminuye cuando se le añaden sustancias menos polares que el agua como etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la molécula proteica, provocando la agregación y precipitación. Los disolvente orgánicos intercambian con el interior hidrofóbico de la proteína, y desorganizan la estructura terciaria provocando su desnaturalización y precipitación.