Guía - PD4 Diseño de Plásmido I PDF

 

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Práctica Dirigida Nro. 04 – Diseño de plásmido I Descripción de vectores que se usan en clonación  En la siguiente sección se busca que describa y explique la función de los componentes de los plásmidos. Para ello deberá usar el software SnapGene Viewer.  1. Buscar en la página de Addgene (ingresar al link): pUC18 (www.addgene.org/50004/ www.addgene.org/50004/  )  

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sequences”.  2. Al ingresar a la página ingresar al link “View “ View all sequences”.  

3. Seleccionar la secuencia, copiarla y guardarla en un bloc de notas con la extensión “.fasta”. Por ejemplo: plásmido_pUC18.fasta . Incluir la línea de cabecera que comienza con “ >”.   

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  4. Ejecutar el programa SnapGene Viewer y seleccionar abrir un documento (“ pen” seguido de “ pen files”) files”).. Seleccionar el archivo plásmido_pUC18 que almacenaron en el punto anterior.  

5. Seleccionar la opción “Circular “Circular”” para visualizar al plásmido. Desmarcar “Automatically “Automatically annotate common features”. features”. Presionar OK.  

6. Visualizar el plásmido ¿Qué característica puedes notar?  

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    7. En la barra de opciones seleccionar “Features “Detect common features”. features”. Los “Features”” y “Detect “features” sirven para identificar y marcar secuencias en el plásmido plásmido que son de interés. Marcar las secuencias de interés y discutir para que sirve cada una de ellas.  

8. Visualizar y discutir sobre la función que cumple cada una de las partes de los plásmidos.  

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  9. Explorar la barra inferior. Seleccionar “Sequences Sequences”” y “Restriction “Restriction enzymes”. enzymes”. ¿Qué puede observar? Presionar Control+F o presionar la lupa ¿Qué sucedió?  

10. Si se escoge la opción “Sequences” va a poder visualizar la secuencia de nucleótidos del plásmido y se van a poder visualizar también los “Features “ Features”” plásmido. Explorar en la barra de opciones, la opción “Features Features”. ”.   

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    11. Si se escoge la opción “Enzyme” en la barra inferior. En “Chosen enzymes” se puede  

explorar los distintos sitios de restricción en base a la cantidad de veces que se repiten en el plásmido y/o en base a la longitud del sitio de reconocimiento.  

12. En la barra de opciones seleccionar “Enzymes” y “  hoose enzyme”. ¿Es posible visualizar en el mapa del plásmido solo dos sitios de restricción a la vez?  

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  Elementos de un plásmido para la expresión recombinante de proteínas En esta parte de la práctica se explorarán los elementos de secuencia que participan en la transcripción y transcripción. 1. Buscar en la página de Addgene el siguiente plásmido para expresión bacteriana: www.addgene.org/149531/ ) - pGBW-m4136458 (www.addgene.org/149531/  2. Visualizar la descripción del plásmido y notar que a diferencia del plásmido visto anteriormente, este tiene un inserto el cual se describe a detalle.  

 

 

sequences”.  3. Ingresar al link “View “View all sequences”. 4. En este caso, descargar la secuencia en el formato Snapgene, donde dond e ya están anotadas las características del plásmido.  

 

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5. Ubicar los elementos básicos de un plásmido y determinar dónde debería estar insertado el gen. Este debe estar en el mismo marco de lectura que los elementos que le permiten ser purificado, como las colas de histidina (His-tag). Snapgene reconoce las secuencias en frame con esa clase de elementos. Para visualizarlas, expandir la opción “View” de la barra de herramientas superior y dar click a “Sequence”.    

6. Luego, volver al mapa del plásmido en el mismo menú usado en el paso anterior. Usar la herramienta “Zoom” en la barra inferior o presionando la tecla Ctrl y moviendo la rueda de su ratón. Acercarse a la región upstream de la región codante y luego a la región downstream. ¿Cuáles son los elementos que controlan la transcripción del gen Spike? ¿Le parecen conocidos tales elementos?  

7. Finalmente, reconocer aproximadamente la región que representaría el RNA mensajero y qué elementos participan en la traducción deseada de d e la región codante.  

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  Clonamiento de secuencias dependiente de digestión por enzimas de restricción En esta sección se explorarán las nociones necesarias para clonar secuencias que puedan pued an ser traducidas con éxito. 1. Descargar la secuencia del plásmido pJK635 (www.addgene.org/72473/ www.addgene.org/72473/))   

2. Identificar el sitio de clonamiento múltiple (MCS) y las enzimas de restricción candidatas.  

3. Obtener la secuencia del gen de interés CRYGD humano. hu mano. Debe ser la secuencia de mRNA o CDS del gen ya que a partir de d e ella hará la am amplificación. plificación. Si el RNA no es procesado, puede usar el genoma como template. En este caso, usar la secuencia de mRNA (NM_006891.4) .  

4. Identificar la secuencia codante usando la herramienta “Translate” de Expasy  

https://web.expasy.org/translate/)). Verificar que coincida con la secuencia establecida de (https://web.expasy.org/translate/ la proteína.

5. Diseñar primers que amplifiquen la secuencia codante. Usar la herramienta pick primers de NCBI. Es importante señalar el rango de la secuencia codante que desea amplificar.  

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  6. Para la práctica, se usarán los siguientes primers:  

Forward Primer: GGAAGATCACCCTCTACGAG GGAAGATCACCCTCTACGAG Reverse Primer: AGGAGAAATCTATGACTCT AGGAGAAATCTATGACTCT

7. Ubicar los primers en el template y determinar que los elementos si la secuencia codante  

está incompleta. De no estarlo, podría añadir nucleótidos en el extremo 5’ de sus primers.  

GCTCAGCGCCGCCGCCCCACCAGCTCAGCACCGCCGTGCGCCCAGCCAGCC ATGGGGAAGATCACCCT CTACGAGGACCGGGGCTTCCAGGGCCGCC CTACGAGGACCGGGGCT TCCAGGGCCGCCACTATGAATGCAGCAGC ACTATGAATGCAGCAGCGACCACCCC GACCACCCCAACCTGCAGCCC AACCTGCAGCCCT T ACTTGAGCCGCTGCAACTCGGCGCGCGTGGACAGCGGCTGCTGGATGCTCTATGAGCAGCCCAACTAC TCGGGCCTCCAGTACTTCCTGC TCGGGCCTCC AGTACTTCCTGCGCCGCGGCGACTATGC GCCGCGGCGACTATGCCGACCACC CGACCACCAGCAGTGGATGGGCCTC AGCAGTGGATGGGCCTCAGCGA AGCGA CTCGGTCCGCTCCTGCCGCCTCATCCCCCACTCTGGCTCTCACAGGATCAGACTCTATGAGAGAGAGGA CTACAGAGGCCAGATGATAGAGTTCACTGAG CTACAGAGGCCAGAT GATAGAGTTCACTGAGGACTGCTCC GACTGCTCCTGTCTTCAGGAC TGTCTTCAGGACCGCTTCCGC CGCTTCCGCTTCAATGA TTCAATGA AATCCACTCCCTCAACGTGCTGGAGGGCTCCTGGGTCCTCTACGAGCTGTCCAACTACCGAGGACGGCA GTACCTGCTGATGCCAGGGGACTAT GTACCTGCTGA TGCCAGGGGACTATAGGCGCTAC AGGCGCTACCAGGACTGGGGGGCCAC CAGGACTGGGGGGCCACGAATGCCAGAGTGG GAATGCCAGAGTGGGC GC TCTCTGAGGAGAGTCATAGATTTCTCCTGA TCTCTGAGGAGAGTCATAGATTTCTCC TGAAATATGTCCTCTTTTGTTGTTTCTTAATTTGGAAACTAATA AATATGTCCTCTTTTGTTGTTTCTTAATTTGGAAACTAATA AAATATTTTCTGTGTGTTCCTGGCA F primer modificado: ATGGGGAAGATCACCCTCTACGAG ATGGGGAAGATCACCCTCTACGAG R primer modificado: TCAGGAGAAATCTATGACTCT TCAGGAGAAATCTATGACTCT

8. Identificar si el sitio de restricción que se quiere usar se encuentra en la secuencia. De encontrarse ahí, descartar la enzima de restricción ya que, al hacer hac er la digestión enzimática, la enzima cortará el inserto. Esto se puede hacer manualmente enzima por enzima, pero se debe tomar en cuenta que Addgene puede pued e reconocer todos los sitios de restricción. Por ello, se abre el inserto en Addgene y se comprueba que NdeI (CATATG) y HindIII (AAGCTT) pueden ser usados. Se añaden estos sitios al primer. Es mandatorio añadir bases al extremo 5’ del primer que faciliten el corte de las enzimas de restricción.    

F primer: TCCCATATGGGGAAGATCACCCTC TCCCATATGGGGAAGATCACCCTCTACGAG TACGAG R primer: p rimer: GCAAGCTTTCAGGAGAAATCTATGACTC GCAAGCTTTCAGGAGAAATCTATGACTCT T 9. Finalmente, se pega la secuencia del inserto en el plásmido (ver detalles resaltado)  

tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacac tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgc gcagcgtgaccgctacacttgccagcgccc ttgccagcgccc tagcgcccgctcctttcgctttcttccc tagcgcccgctcc tttcgctttcttcccttcctttctcgcc ttcctttctcgccacgttcgccggctttccc acgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccc cgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggtt tttagggtt ccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcac ccgatttagtgctttac ggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgcc gtagtgggccatcgccctgatagacggtttttc ctgatagacggtttttc gccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactc gccctttgacgtt ggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccc ttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattct tatctcggtctattcttttgattt tttgattt ataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgctta caatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatt caatttaggtggcacttttc ggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatcc tttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaatta gctcatgaatta attcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaatac attcttagaaaaactcatcgagcat caaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgt catatttttgaaaaagccgtttctgt aatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaataca acctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcacc acctattaatttccc ctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagttt atgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagttt

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11. Verificar si se necesitan añadir bases que permitan que el marco de lectura se mantenga con respecto a algún elemento que quiera mantener en la proteína, como el His-tag.  

Con las herramientas que has explorado hasta esta parte, estás listo para resolver el siguiente ejercicio:

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  Un estudiante clonó un fragmento de PCR del gen X en el plásmido puc18. El plásmido se man mandó dó a secuenciar y se obtuvo lo siguiente: > pUC18_GenX sequence tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagac aagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggctt aagcccgtcagggcgcgtc agcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcac aactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccata cata tgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattc tgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaatacc gcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcga gccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcga tcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgc tcggtgcgggcctct tcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttccc aaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcac agtcac gacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactc gacgttgtaaaacgacggccagtgccaagc ttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccgtgcgagacatcaaggagaagctctgc tagaggatccgtgcgagacatcaaggagaagctctgctac tac gtggcacttgacttcgagaacgaaatgagcaccgctgccaccagctcc 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Sábado26desetiembrede2020

 

DepartamentoAcadémicodeIngeniería.MolecularBiologyforEngineers2020-2

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Crear un archivo de SnapGene Viewer con el plásmido “pUC18_GenX sequence” y añadir “Features” correspondientes al GenX.

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¿Cuál sería el tamaño del producto de amplificación si se utilizaran los primers M13 Forward y M13 Reverse? ¿Qué sitio de restricción flanquea al fragmento de PCR del gen X?

Ejercicio en clase El dominio catalítico de una proteína es de interés Una proteína tiene dos d os dominios, uno dominio cuya función es reguladora y un dominio catalítico. Para poder determinar la actividad del dominio catalítico en ausencia del dominio regulador se debe clonar la secuencia correspondiente al dominio catalítico en un vector de expresión. Si se sabe que el dominio catalítico empieza en el aminoácido 211, entonces el fragmento que se quiere clonar debe comprender al menos desde el nucleótido 631

Se generaron primers para clonar la secuencia que codifica para el dominio catalítico Para ello se han diseñado primers que permitan p ermitan amplificar el fragmento de interés. Sin embargo, para poder insertar el fragmento en el vector de d e expresión es necesario seleccionar sitios de restricción adecuados para que la proteína se oriente y exprese de manera correcta. o

 

o

 

Primer Forward: (Sitio de restricción) TTCCAGTACGGTCTCCCAGA Primer Reverse: (Sitio de restricción) ATACGGTGAAATTGTGCA ATACGGTGAAATTGTGCAGC GC

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DepartamentoAcadémicodeIngeniería.MolecularBiologyforEngineers2020-2

  La secuencia de la enzima de interés es la siguiente:

>Enzyme X  ATGCGCTTCGCCTGGACCGTGCTCCTGCTCGGGCCTTTGCAGCTCTGCGCGCTAGTG ATGCGCTTCGCCTGGACCGTGCTCCTGCTCGGGCCTTTG CAGCTCTGCGCGCTAGTGCACTGCGCCCCTCCCGCC CACTGCGCCCCTCCCGCCGCCG GCCG GCCAACAGCAGCCCCCGCGCGAGCCGCCGGCGG GCCAACAGCAGCCC CCGCGCGAGCCGCCGGCGGCTCCGGGCGCCTGGCGCCAGCAGA CTCCGGGCGCCTGGCGCCAGCAGATCCAATGGGAGAACAACGGG TCCAATGGGAGAACAACGGG CAGGTGTTCAGCTTGCTGAGCCTGGGCTCACAGTACCAGCCTC CAGGTGTTCAGCTTGC TGAGCCTGGGCTCACAGTACCAGCCTCAGCGCCGCCGGGACCCGGGCGCC AGCGCCGCCGGGACCCGGGCGCCGCCGTCCCTGGT GCCGTCCCTGGT GCAGCCAACGCCTCCGCCCAGCAGCCCCGCACTC GCAGCCAACGCCTC CGCCCAGCAGCCCCGCACTCCGATCCTGCTGAT CGATCCTGCTGATCCGCGACAACCGCAC CCGCGACAACCGCACCGCCGCGGCGCGAACG CGCCGCGGCGCGAACG CGGACGGCCGGCTCATCTGGAGTCACCGCTGGCCGCCCCAGG CGGACGGCCGGCTCAT CTGGAGTCACCGCTGGCCGCCCCAGGCCCACCGCCCGTCACTG CCCACCGCCCGTCACTGGTTCCAAGCTGGC GTTCCAAGCTGGCTACTCGA TACTCGA CATCTAGAGCCCGCGAAGCTGGCGCCTCGCGCGCGGAGAACCAGACAGCGCCGGGAGAA CATCTAGAGCCCGCGAAGCTGGCGCCTCGCGCG CGGAGAACCAGACAGCGCCGGGAGAAGTTCCTGCGCTCAGTAACC GTTCCTGCGCTCAGTAACC TGCGGCCGCCCAGCCGCGTGGACGGCATGGTGGGCGACGACCCTTACAA TGCGGCCGCCCAGCCGC GTGGACGGCATGGTGGGCGACGACCCTTACAACCCCTACAAGTA CCCCTACAAGTACTCTGACGACAACCCTTA CTCTGACGACAACCCTTA TTACAACTACTACGATACTTATGAAA TTACAACTAC TACGATACTTATGAAAGGCCCAGACCTGGGGGCAGGTACCG GGCCCAGACCTGGGGGCAGGTACCGGCCCGGATACGGCACTGGCTACTTCCAG GCCCGGATACGGCACTGGCTACTTCCAG TACGGTCTCCCAGACCTGGTGGC TAC GGTCTCCCAGACCTGGTGGCCGACCCCTACTACATC CGACCCCTACTACATCCAGGCGTCCACGTAC CAGGCGTCCACGTACGTGCAGAAGATGTCCATGTACAA GTGCAGAAGATGTCCATGTACAACCT CCT GAGATGCGCGGCGGAGGAAAACTGTCTGGCCAGTACAGCATAC GAGATGCGCGGCGGAGGAAAAC TGTCTGGCCAGTACAGCATACAGGGCAGATGTCAGAGATTATGA AGGGCAGATGTCAGAGATTATGATCACAGGGTGCT TCACAGGGTGCT GCTCAGATTTCCCCAAAGAGTGAAAAAC GCTCAGATTTCC CCAAAGAGTGAAAAACCAAGGGACATCAGATTT CAAGGGACATCAGATTTCTTACCCAGCCGACCAA CTTACCCAGCCGACCAAGATATTCCTGGGAATGG GATATTCCTGGGAATGG CACAGTTGTCATCAACATTACCACAG CACAGTTGTCAT CAACATTACCACAGTATGGATGAGTTTAGCCACTA TATGGATGAGTTTAGCCACTATGACCTGCTTGATGCCAA TGACCTGCTTGATGCCAACACCCAGAGGAGAGT CACCCAGAGGAGAGT GGCTGAAGGCCACAAAGCAAGTTTCTGTCTTGAAG GGCTGAAGGCCACAAA GCAAGTTTCTGTCTTGAAGACACATCCTGTGACTA ACACATCCTGTGACTATGGCTACCACAGGCGATTT TGGCTACCACAGGCGATTTGCATGTACT GCATGTACT GCACACACACAGGGATTGAGTCCTGGCTGTTATGATACCT GCACACACACAGG GATTGAGTCCTGGCTGTTATGATACCTATGGTGCAGACATAGAC ATGGTGCAGACATAGACTGCCAGTGGATTGATATTA TGCCAGTGGATTGATATTACAG CAG ATGTAAAACCTGGAAACTATATCCTA ATGTAAAACCTGGA AACTATATCCTAAAGGTCAGTGTAAACCCCAGC AAGGTCAGTGTAAACCCCAGCTACCTGGTTCCTGAATCTG TACCTGGTTCCTGAATCTGACTATACCAACAA ACTATACCAACAAT T GTTGTGCGCTGTGACATTCGCTACACAGGACATC GTTGTGCGCTGTGACATTC GCTACACAGGACATCATGCGTATGCCTCAGGCTGCACAATT ATGCGTATGCCTCAGGCTGCACAATTTCACCGTATTAG TCACCGTATTAG 

Visualizando el vector se determinan los sitios de restricción adecuados  El vector en el que se plantea clonar el fragmento de interés se llama pEXpEX-N-His N-His y puede ser descargado desde el siguiente link:  link: https://www.snapgene.com/resources/plasmidfiles/?set=basic_cloning_vectors&plasmid=pEX-N-His  Tarea 1: Con la información del sitio de clonación múltiple escoger las enzimas de restricción que usaría para insertar el fragmento en la orientación correcta y completar el diseño de los primers. Tarea 2: Tener en cuenta que cuando se quiera insertar el fragmento la secuencia de nucleótidos debe estar en el marco de lectura correcto parar que el dominio catalitico sea expresado de forma adecuada.

Sábado26desetiembrede2020