CRISTIANA FILIP
ENZTME$r COENZIME
't
Editurapf,ll
rAsr.2007
REFEnnrytt gTm,rT, rFrc r: '
PROF.DR.COJOCARUDUMITRU - Uniuersitatea,Al.I.Cuza" Iasi PROF.DR. NASTASIA EORGHIIA_ U.M. F. " Gr. T.pop a" ragi -GH PORF.DR.MAGDA BADESCU - IJ.M.F."Gr.T.popa" Iagi
EDtruRAtrn SoseauaStefancelMarenr. 11 lasi-7OO49g f el. lfax:0232-212740 e-mail :
[email protected] www.pimcopy.ro EDITURA ACREDITATA CNCSISBUCURESTI 66/01.05.2006 DescriereaCIP a Bibliotecii Na{ionalea RomAniei FILIP, CRISTIANA .I Enzime9i coenzime/ Filip Cristiana.- Iagi : pIM, 2007 Bibliogr. ISBN 978-973-7 16-798-9 577.15
Tehnoredactare computerizatd: Doina R6.$canu
Prefati Enzimele sunt componente esenliale ale vietii. Fdr5. ele reacliile chimice s-ar desfasura cu o viteza atAt de mici probabil, viala nu ar fi sesizabi15.. incAt, Mai mult, f5re capacitatea 1or de a discerne atat intre structuri diferite, cdt qi intre structuri asemdndtoare, in mod sigur hoasul ar fi regula. Surprinzdtor enzimele mai dau dovadd qi de capacitate de adaptare la modificirile ce intervin in mediul 1or, celular. De aceea putem, fard refinere, sI numim aceste molecule, primele molecule inteligente. Manualul de fali se doreqte a fi un material util in primul rdnd studentilor facultalii de medicinS. cAt qi celor ce studiazd biologia qi biochimia. Materialul pune accentul pe elementele de cinetic6 ertzirrraticS', a cSlor utilitate practici in proiectarea medicamentelor, este de necontestat. in p1us, cinetica enzimaticd sti la baza in{elegerii regiirii metabolismelor gi a coreldrii intermetabolice care fac posibild suslinerea vielii. Manualul face qi o prezentare a vitamineior care sunt componente coenzimatice esenlia1e. Rolul lor in activitatea enzimelor este evidenliat prin prezentared mecanismelor reacliilor la care acestea participd. Importanla cunoqterii metabolismului vitaminelor este justificatd de faptul cd deficitul lor duce la insta-larea unor afectiuni severe, caracteristice. Materialul se adreseaze deopotrivd specialigtilor ce lucreazd in laboratorul clinic, unde aproape toli parametrii biochimici sunt determinali prin metode enzimatice. Fere a avea pretenlia de a fi epuizat toate aspectele legate de tema abordati, autorul iqi exprimd speranla cd cei interesali vor gasi suficiente informalii gi rdspunsuri referitoare la acest capitol al biochimiei. in vederea exprimdrii pdrerilor critice qi a eventualeior completdri qi sugestii cu privire 1a conlinutul gi conceplia acestui la adresa de email: disponibil autorul este material,
[email protected]. Autor Cristiana Filip
CI'PRINS I. DNZIME INTRODUCERE I.1. DEFINITIE I.2. NOMENCI"{TURA
9
I.2. 1. Oxidoreductaze
11
I.2.2. Transleraze
13
I.2.3. Hidrolaze I.2.4. Liaze
74
l.2.5.Immeraze
t4
1.2.6. Ligaze sau sintetaze
74
I.3. STRUCTURA ENZIMELOR 1.3.1.lzoenzime
15 18
I.4. SPECIFICITATE
79
I,5. MECANISME DE CATALIZA
2T
I.6. CINETICA ENZIMATICA
26
I.6. 1. Noliuni de cinetic+ generale
26
I.6.2. Cineticd enzimaticd
29
I.6.2.1. Cinetica de tip Michaelis-Menten I. 6.2.2. Ecualia Uneweaver-Burk
40
I.6.2.3. Inhibilia activit6lii enzimelor
42
1.6.2.3.1. Inhibitia reversibild
42
1.6.2.3.7.7.Inhibitia competitivd I.6.2.3.1.2. Inhibifia necompetitivd
44
1.6.2 .3 .2 . Inhibitia ireversibil6 I.6.3. Medicamente - inhibitori competitivi
46
L6.4. Cinetica de tip sinusoidal
48
I.7. REGLAREA ACTIVITATN ENZIMELOR
52
I.7. 1. Reglarea alostericd L7. 1. 1. Structura enzimelor alosterice
53
I.7. 1.2. Funcfionarea enzimelor alosterice
J+
I.7. 1.3. Factorii care regleazS.activitatea enzimelor alosterice
58
I
I.7.2. Reglarea cova.lenta
60
I.7.3. Transformarea pro-enzimelor in enzime active I.7.4. Reglarea sintezei de enzime r.8. IMPORTANTA BTOMEDTCALAA ENZTMELOR I .8 . 1. Utilizarea enzimelor in stabilirea unui diagnostic I.8.2. Utilizarea enzimelor in scop terapeutic
II.1.4. Biotina (vitamina H) qi rolul ei coenzimatic II.1.5. Vitamina pp (niacina) gi coenzimele nicotinamidice IL 1.6. Acidul pantotenic (vitamina Bx) gi coenzima A derivate
pteroifgtutamic) I
II.2.1. Vitamina A II.2.2. Vitamina D IL2.3. Vitaminele E IL2.4. Vitaminele K qi rolul lor coenzimatic Bibliogralie
77 72 75 77 79 81
qi coenzimele
II.1.8 Vitamina Brz (cobalamina) qi rolul ei coenzimatic II. 1.9. Vitamina C (acidul ascorbic, factor antiscorbutic) II. 2. VITAMINE LIPOSOLUBILE
63
70
[.1.1. Vitaminei Br $i coenzima tiaminpirofosfat II. 1.2. Vitamina Bz (riboflavina) 9i coenzimele flavinice II.1.3. Vitamina Ba (piridoxina) qi coenzimele derivate
(acidul
OJ
69
II. 1. VITAMINELE HIDROSOLUBILE
folic
oz
68
II. COENZIME VITAMINICE
IL 1.7. Acidul
60
83 85 89 90 97 96 101 105 108
I. ENZIME
INTRODUCERE Existi
fundamentai.e pentru
doud condilii
via!d.: prima
ca
entitdlile vii s5. se poate multiplica qi cea de a doua ca acestea si se poatd hrdni. Nici unul din cele dou5. fenomene nu este posibil fdr5. enzime deoarece miile de procese care suslin viala ar avea loc cu viteze imperceptibile in absenla enzimelor. Enzimele au o extraordinard putere cataliticd qi o mare specificitate, mai mult capacitatea 1or catalitici poate fl reglati cu multi precizie.
I.1. DEFIMTIE Enzimele sunt
t biocatalizatori
care maresc viteza reactiilor
chimice care au 1oc in organism, fdrd a suferi modilicdri structurale, regS.sindu-seneschimbate 1a sfArqitul reacliei. Ele catafizeazS. doar reacliile posibile din punct
de vedere
termodinamic, prin micgorarea energiei de activare. Prin energie de activare se inlelege energia necesarS. unei molecule de substrat, pentru a ajunge intr-o stare inalt energeticd numitS. stare de ftanzilie, stare favorabild formdrii produsului. Energia de activare este egal5 cu diferenla dintre energia libera a reactanli1or qi energia unui
compus instabil, inalt energetic ce apare in cursul
formdrii produsului. Prin substrat se inlelege o moleculd sau un grup de molecule asupra cdruia actioneazd errzirna.
in reacliile chimice, pentru ca dou6 molecule sa interactioneze ele trebuie sd vind in contact (Iig. l). Nu toate ciocnirile sunt inse eficiente in sensul cd, Iie coliziunea nu are loc dupi un unghi favorabil (figl.a), fre nu este suficient de puternicd. pentru a genera produgi de reactie (fig 1.b), Este nevoie ca moleculele si aibd o anumite incircdturd energeticd incdt ciocnirea sd. fie suficient de putemice ca sa genereze produqi (fig 1,c.), cu arte cuvinte, existd o bariere energetica ce trebuie depiqitd pentru ca reactanlii se se transforme in produqi de reacfie. Aceasti barierd. energetice poarte numeie de energie de activare Si este notatd G (fig. 2).
GP@- - - - - - - ) TA ( .@ i l )( ( y (, G\
u .8
l.
>b)
+@ \-./
\--l
\
\ ",
a r--..,
! ^6
[email protected]
,.( A) . \ \ \_/
s# aetranzltie Fig.1 - In situati e a qi b ciocnir e sunt ineficiente deoarece nu duc ra produqi de reactie;'in situalia c ciocnirea a"Jr," ln"r"rrta I:t::: t la rormarea acestora "onducend
In absenla enzimelor puline molecule (uneori nici una) au suficientd energie pentru a depdgi aceasta barierd energetice qi a se tra'sforma in produgi. Deoarece viteza de reaclie este datd de numdrul de molecule de produs format in unitatea de timp, inseamna cE viteza de reac{ie in absenla enzimelor este micd. In faz1, gazoasd sau lichid5 moleculeie pot primi suficientd energie pentru a depdqi aceaste barierd energetici prin cre$terea
1
presiunii sau temperaturii
astfel ca ciocnirile dintre e1e sd devinS.
productive gi sd ducd 1aformarea de compugi. in organismele vii, moleculele nu pot primi energie in acest mod, in schimb bariera energetice poate fi micqorati astfel lncAt un numdr mai mare de molecule sd o poatd depdgi qi sd se transforme in produqi de reactie. Acest lucru este realizat prin prezenla unor "catalizatori" speciali qi anume enzimele. in consecinli,
cu cat aceastd barierd
energeticl va fi mai micd cu atat un numdr mai mare de molecule vor atinge starea de tranzilie, vor forma produqi de reaclie, deci viteza de reaclie va creqte (fig. 2).
Dire ctia dE darfesnrare
a reactiei
:] Fig. 2 - Varialia energiei libere funclie de direclia de desfe$urare a reacliei S)P. Graficul prezinte pe ordonate modilicdrile suferite de energia de activare in timpul reactiei iar pe abscisd schimbdrile chimice progresive suferite de substrat (rupere, formare de legaturi) in cursul transformSrii in produs. G".."r este diferenta de energie in cazul reacliei necatalizate, AG."t este diferenla de energie in cazul reacliei catalizate elfzi'lj,atic l2l.
Graficul din figura 2 prezintl, varialia energiei libere {cantitatea de energie din totalul energiei interne ce poate fl utilizat de o mo1ecul5. pentru:
a forma noi legdturi
substratului
in
produs
chimice etc.) in timpul
de reaclie,
in
care
conversiei
pe ordonatd
este
reprezentate energia liber5 (G), iar pe abscisd direclia de desfS.qurarea reacliei. Energia liberd a produsului de reaclie P (G P/ este mult mai mic5. decAt cea a substratului S (G I
, ca atare diferenla de energie dintre
cele doud stdri este negativd, G P - G S < 0,
ceea ce din punct de
8
vedere termodinamic
indicd. faptul cd reaclia se poate desfdgura in direcfia formirii produsului S) p. Altfel spus, reaclia este posibili din punct de vedere termodinamic, independent de pre?.enla oricirui catalizator. Cu toate acestea, deqi reaclia este posibild., pentru a se putea transforma in produs, substratul S trebuie mai int6i sd. atingd. starea de tranzlfie. ln aceastd stare atet reaclia directd. S)p cat gi cea inverse P)S
sunt Ia fel de posibile. Diferenla de energie AG (intre energia liberi a substratului qi cea a stdrii de tranzilie), cunoscutd. ca energie de activare, reprezintd energia necesari tuturor aranjArilor gi rearanjdriior structurale pe care Ie suferd substratul pentru a se putea transforma
in produs. Ea are o valoare mare in cazul reacliei necata-lizate (AG necat). Valoarea mult mai mic5 a lui AG in cazul reactiei cataJizate de enzima (AG cat), indicd faptul ce aceasta ofera o alternativS. prin care toate aceste transformdri se fac mult mai sau uqor. Astfel prin aceasta ,,alternativd." ieaclia decurge mai rapid, fdri ca enzima s5. modifice energiile libere ale substratului sau produsuiui adicd fdr5. s5.intervind in echilibrul reactiei. Nu este obligator ca o reaclie chimicd sd decurgi" intr_o singurd etapd S)P, ci poate avea loc printr-o succesiune de reaclii secventiale (etape de reaclie) in care pot 1ua nagtere intermediari ca de ex. ES, Ep (fig. 2). Un intermediar este orice specie chimicd ce apare intr_o cale d.e reaclie cu o viald foarte scurte mai mare decat vibratia moleculard -1013 sec. Viteza unei astfel de reaclii este data de viteza etapei care necesitd cea mai mare energie de activare, cu alte cuvinte, de etapa ce decurge ce1 mai incet. Aceasti limitanti in
reacfie poarta numele d.e reactie
de vitezd. concluzie
viteza de reaclie este invers proporlionale
cu
energia de activare. Enzimele nu fac al.tceva decAt sd micqoreze aceastd energie prin mecalisme speciale care insd nu influenleazd echilibrul chimic a1 reactiei.
I.2. NOMEI{CI"ATUR.A Fiecare enzimS.are dou5. denumiri: - o denumire uzualS. prin care sufixul "a25.' este ataqat denumirii substratului
pe care aclioneazd, enzima (ureazd, glucozidazi)
sau
acliunii exercitate de aceasta (\ipazd,,peptidazdl. - o denumire sistematicd care face referire la tipui de reaclie pe cate enzrrna o cataJizeazd, qi pe baza ceruia aceasta poate fi exact Cr.' i.t-t-t':i:at.t.l)tt* u& ivQ,'ttlu-{t identificati. S"*l A elov ""i Uni.r.rli Internallonale de rjloc.rumle
'f " J .: .l stabilit un sistem de clasificare zecirnal.d.care line seama de reaclia ] catlJizate gi d.enatura substratului. in acest sistem fiecare enzimi este I ia pentru-Enzi-"
I
notate cu un numer de cod format din patru cifre, numdr care permite I identificarea
enzimei, a substratului
asupra cdruia
reactiei catalizate: - prima cifr6 a numirului
ac\ioneazd qi a 1'-/',/ ;"1'
de cod indicd clasa qi se referd la tipul
reacliei catalizate. - a doua cifrd a nurpdrului de cod definegte subclasa gi se referS. la tipul grupdrii din molecula substratului
asupra cdreia ac\ioneazd.
enzirrra. -
a treia
cifr5. defineqte subsubclasa
qi indicl
gruparea
tralsferatd sau natura acceotorului. - a patra cifri
reprezinti
numdrul
de ordine a enzimei in
subsubclasa resoectivd.
E ab cd \ ttt\ / / // s1asz subclasa
\
numdr de ordine \ subsubclasa
i
I 10
De exemplu enzima cu numdrul de cod E 1.1.1.1. este Alcool:NAD-oxidoreductaza, care catalizeazii dehidrogenarea a_lcoolului etiiic la aceta.ldehidd. Uzual se acceptd acele denumiri ce sunt in acord cu denumirea gtiinlificd ,,Alcool dehidrogenaza,, (ADH). Funclie de reacfia cata)izate, enzimele se clasiltcd in qase clase majore fiecare cu numeroase subgrupe:
/,."t.-0,-"1'- --\ (Td:1.-d":tT:,,,
cataJizeazd. reacliite de oxido_ reducere; in func{ie de acceptorul de electroni se pot distinge: ). dehldrogenaze/ tedtctaze _ transfer5 electronii de la un substrat la alt substrat (altul decdt oxigenul); .2. ortgenaze - incorporeazd.direct oigenul in substrat; 3. oxtdaze - traasferd electronii de la un substrat direct la
oxlgen;
,,.4.
peroxidaze
- transferA
acceptor.
electronii de la substrat la HzOz ca t.
catalizeazd tralsferul 2 ,-q l. Transferaze de grupdri func!ionale substrat (donor) pe alt substrat (acceptor).
,E CrtransJerqze - transferd unitali d.e un atom de carbon intre substrate (exemplu: metil_transferaze) ; _ ,Kamino-transferaze transferd gruparea amlno de pe un aminoacid pe un cetoacid: .7 . kinqze - tratsfer5 un radical fosfat din ATp pe un substrat; p/.fosforilaze - transferd radicalul fosfat din fosfat anorganic (Pa) pe un substrat.--*--_
3
4
iiaroU..
cu ajutorul apdi: -
) catahzeaz|,scindarea legdturilor chimice
"g. fosJataze - indepdrteazd radicalul pOsHz_de pe un substrat; trU. fosfodiesterq.ze - cliveazd, legdturile fosfatdiesrence, cum ar fi cele din acizii nucleici; J"'r. proted.ze _ scindeazd legdturile peptidice din proteine.
/'
/ D
rl
1\
ll
\ I
t aze F catalizeaze, scindarea ":tt nehidrolituce a unei grupari de'!e-6n substrat cu formarea unei duble legAturi sau fixeazd. o grupare la o dubld tegdturd.: d.ecarboxilaze _ indepltteazd, ,LX' COzde pe substrat; fo.rmeazdaldehide in reaclii de eliminare; {>":o:*.y;htaze 4e;cd\A molecule fird implicarea ATp_utui. lzom.etue _Jcatalizeazd, .pl' reacliile de interconverstune t a zomenlor oplldilleometrici qi de catend: -'-.
racemaze gi epimeraze .,L{ stereoizomerilor L D; 9i 4 xt. geometrici:
_ cataJizeazd. interconversiunea
transferd grupdri intre atomii aceteiaqi molecute; ::::.cts_trans-izorneraze _ interconversiunea izomerilor
y6.
izomerq.ze care catalizeazd reacfia de interconversie aldozd ,\ ::et9ze:
b .q' ll,igaze cataJizeazaunirea a doi Tl_."1151*ge,t compugiutiri;;a- ene;gi; eriberatdprin hidrolizaunei molecure (-'_-- de ATP. r . 5,!;.4| 6, l /i )7.i. , , t {;, ,.* /.(_ I.2.l. Oxldoreductaze
O
Reacliile de oxido_reducere sunt reaclii in care are loc un transfer de H2 sau electroni. Acest transfer este asrgurat de partea coenzimaticd. a enzimei (" structura enz. p.r7). principa.lele coenzime cu rol in oddo.,
NADp*vezi p.7e), ,ffiT"::il':T:r,T";i: "..",:;ffi;":acidul lipoic, citocromii, coenzima
e. in multe reaclii transferul electronilor se face concomitent cu transferul protonilor (cu alte cuvlnte are loc transferul de atomi de H), astfel ce acceptarea de H/e(hidrogenarea) este echiva
(dehidrogenarea)este
de H/e-
(tabel nr' "":;t;#*I*::o::"o*.oerea 1)' oxidoreductaze re catalizeaz-a oxidoreducerea gruprrilor: "";"-"r*^:oarea -cHz-oH; cHz-cHz_; _cH_NH2;_"n=;:
I 12
Tabei 1: Clasificarea generald a fenomenelor de oxido_reducere funclie de elementul transferat. Element transferat
Hz
Acceptare de c5.treun
Cedarede cetre un-
substrat
substrat
reducere
e-
reducere
Oz
oxidare
oxidare
----oxiaare
-.
reducere
Enzime care ,rlucreaza" cu Hz (e-): Dehidrogenaze N-)/ Dehidrogenazele sunt enzime ce ,,scot,, hidrogenul d.e la un substrat transferdndu-l unor ,,transportori" care sunt cunoscuti sub denumirea de NAD (nicotin adenin dinucleotid) si FAD (flavin adenin dinucleotid).
I FAD
FADH2
-CH:-CH:-
- CH-a r{
-CH:CH,'1,. \/
NADH+H+
-fiH-cHr-
t-
OH
o
Observafie: FAD preia cei doi atomi de hidrogen de 1a acelagi tip de atomi in timp de NAD preia cei doi atomi de hidrogen de Ia atomi diq'rili. /f
/{
Reductaze
Reductazele sunt enzime ce ,introduc,, hidrogenul ia un substrat acesta fiind preluat de la un ,,transportor" care este cunoscut sub denumirea de NADpH (nicotin adenin dinucleotid fosfatl NAD|H+H+ -CH:CH-
NADP+ - CH2-CH2-
;
t3
Enzlme ce ,rlucreazdt' cu Oz: O, ,/ Oxldaan Oxidazele catalizeazS. reaclii in care oxigenul devine acceptor pentru hidrogenul transferat de 1a un substrat: SubstraFH + o, -!!@--$,,s
sub$rat+ H2O2
O*igetaze Oxigenazele cataTizeazd reaclii in care oxigenul este introdus la
un substrat: Subsfat-H+ c)2 Monooxkenaza > substrat-oH+ Hro hdF*
subsb:at-H* o,
t o = subsb:at-oH
1,2.2. Ttarr,sfetaze CalaJizeazereaclii1e de transfer a unor grup5ri ,,G" (altele decAt H) de la un substrat Sr la qlt substrat 52, conform reactiei: Sr-G* + Sz -----+ Sr + Sz-G Grupirile
transferate por fi grupdri ce contin un singur atorn de
carbon (meti1, metilen etc), resturi de aldehide, cetone, aci1, alchil, glicozil, amino, fosfat, sulfat. ducort,+ o*
hexokinadt
ADp + GKp Glncoz6-fosfat
I.2.3, Hidrolaze Hidrolazele cataTizeazd ruperea
unor
legdturi
organice, cu
participarea apei, dup5. reaclia: A-B + HzO -----+ AH + BOH Legaturile care pot fi desfdcute prin hidrolizd. sunt legdturile esterice, eterice, peptidice, anhidrice, legdtura peptidicd), C-X, P-N.
C-N (altele decdt C-N din
t4
pentru
Caracteristic
aceastS. clasd
de enzime este lipsa
coenzimelor. Ele necesitd prezeritraunor ioni meta1ici pentru activare. Din aceastd clasd. fac parte, in general, enzimele digestive: amilaza, Iipaza, tripsina, chimotripsina. n T'fl ll' _HN -cH-c -e -In{-CH-e
o jl
Pepridaza
t"
() o
Tn Q I u -HN-CH-C-OH
ll + H2N-CH-C-NH
lHzol
Rn+1
Rn+1 Rn+1
1.2.4. Llaze Liazele sunt enzime care cataJizeazd indepdrtarea unor grupdri din molecula substratului fdrd" participarea apei, ducAnd 1a formarea unei duble legS.turi:
-c-c-
------------> x-Y
ll
+
)":"(
XY
Aceastd
clasd
include
enzimele legdturilor C-C, C-O, C-N, C-S, C-X. '
care
ac,tioneazd asupra
I
1.2,5. lzom,eraze Izomerazele sunt enzimele care caLafizeazd. interconversiunea izomerilor optici, geometrici qi de caten6. CHO |
'ffpz-iznrrcraza
-(J|-l
I.lL
I
cHroH I-
c:o I
cH2-o-P
cH2-o-P
Dftilroxiaceton-fosfrt
Gliceraldehil- 3-fosfi t
1.2.6. Ligaze sau sintetaze Ligazele sunt
enzime cate cataTizeazS- formarea
de legd.turi
chimice cu consum de energie (utiIizeaz6, energia eliberate din ATP pentru realizarea noii legdturi). In acest mod se real.izeazdlegituri C-O; C-S; C-N; C-C. Ex: glutaminsintetaza catalizeazd sintetiza glutaminei: Glutanin-
Lchrtarnat + NI{4+ j\_+ ATP
chramhE ADP + Pa
15
I.3. STRUCTURA ENZIMELOR Din punct de vedere structural enzimele sunt (cu cAteva excepfii) proteine
cu
polipeptidic)
structura sau
terliare
(formate
cuaternarS. (formate
din
dintr-un mai
singur multe
lant
lanluri
polipeptidice sau subunitefl). Activitatea cataiiticd a enzimei depinde de integritatea sa structurali;
astfel dac5. enzima este denaturat5. sau
subunitalile ce o formeazd disociazi, aceasta iqi pierde capacitatea cata-1itici. Structura
terfiard/ cuaternare determind o anumita aranjare
gnqi. ,,buzunar", unde se desfdsoard spaliald care duce.la., apantia ..,,, t:z/,J, a4 t.'1,. ...t^ /u(t /.,nji,Ji,,.:!tr ,".,,. reaclia caLalizatd.Acest 1oc (situs) poarte denumirea de centni activ al enzimei. Dupd unii autori centrul activ prezinte doud zone distincte $i ' , anume un situs de legare al substratului qi un situs cata-litic unde are loc cataliza propriu-zisd.. Pentru a inle1ege structura spaliald pe care o adopte centrul activ, se poate imagina mperea unei bare rigide de metal (fig. 3). O barA metalici
.r se poate rupe tregand de capete in direclii
opuse, acliune in urma cdreia rezultd doud fragmente. Pentru aceasta este necesar un efort apreciabil, adicd o cantitate mare de energie. Dacd insd bara rigida este indoitd mperea acesteia se reaJizeazd cu un consum mult mai mic de energie. Prin indoire bara metalicd este adus5. intr-o stare intermediard ,,de tranzitje" din care trecerea ln cele doud fragmente separate, adicd ruperea ei se face mult mai ugor. Aceasta stare de tranzi\ie este reaLizatd de interacliile magnetice intre bard qi enzimd, interaclii care sunt de aqa naturd incAt,aduc" bara in starea de tranzilje foarte favorabild formdLriiprodusului/produqilor. Se poate deduce prin analogie ca structura centrului activ al enzimei este complementare nu neaperat cu structura substratului ci mai cur6nd cu structura stdrii de tranzi,tie prin care acesta va trece in transformarea lui in produs/produqi.
(a) Enrima nu €ste plpzenti
'- -*'
^
{r/tt,t
-r ->
SubsAat @ara ds metat)
- ,
------*,*i*t*
Star€ de tanzltis Oa$ inddla)
{},}Enziha romplemsntarl
Prodnst (bale rupd)
cu substntul
Magneti
€
tc) Enzima complementar.e cu starea de tranzitib
m.-ffi-*_ffi .g
"rttv
,
Dir.cria & d.sE eit.n&lilt
tbn
j,-, tl""gir ea o enzima imaginari care catalizeazd ruperea unei _^-^ , ^T:metal (a), ^prezinte oare qe aclionafld asupra ei prin forle magnetice. O structuri a enzimei complementara cu substratul il itabilizeaza p. ingreunand indoirea (b); O enzimei complementare cu starea de""."i" tranzitiJdestabilizeaza substratul ;strucjYe.a ravorzand ruperea acestuia. Interacliile magnetice sunt cele care furnizeazd aportJ de energie necesar pentru indoire. In diafarnele alaturate-este ilustratd varialia energiei de activare in cazul unei structuri complementare cu substratul gi in cazui unei structuri complementare cu starea de t. rrri1i", i., ca.ul complementaritdlii cu s hstratul complexul ES fiind mai stabil are o energie liberd mar mica decat a -mare substratului, in consecinle necesite o energie de acdvaie mJ dec6.t acesta.[21
Acliunea enzimei asupra unui substrat presupune ma1 tntai fixarea acestuia la centrui activ, adicd formarea comptexului ES. De-a lungul timpului formarea complexului enzim6, substrat ES a fost explicatd.de doud modele: - modelul clasic (Fischer) sau modelul cheie_broascd in care centrul activ al enzimei are o structurd rigida complementari cu cea a substratului, cuplarea acestuia fdcAndu_se dupd. modelul cheie-broascd.
Acest model este pulin cAteva cazuri complementare
eficient (deqi a fost evidenliat
de catalizl. enzimaticd) cu
substratul
il
va
in
deoarece o enzime total fixa
ferm
pe
acesta
ingreunAndu-i transformarea ulterioari.. - modelul "centrului activ indus,, (Koshland) care postuleazd ca centrul activ al enzimei are o conformalie relativ diferiti de a substratului.
Centrul activ se comportd ca o matrild flexibild care poate lega substratui intr-o formi ce reduce la maxim gradele de libertate ale acestuia, in ceea ce prive$te rotalia, translafia, fapt care favorizeazd atingerea rapidd a stdrii de tranzi\ie, Aceasta reprezinta
interpretarea
datd.
scdderii
energiei
de
activare, observate in cazul reacliilor catalizate de enzime. Pe lAngi structura centrului activ al enzimelor, un alt aspect structural se referi la alcdtuirea 1or. Enzimele in majoritatea 1or sunt heteroproteiene, formate dintr-o parte proteicd. (alcituitd doar din lanluri polipeptidice) numite apoproteind qi o parte neproteica ce este cunoscute sub mai multe denumiri: a. b.
cofactor - dacd partea neproteicd este un ion metalic; coenziml. - dacd partea neproteicd este o moteculd
organicd sau o structura ce conline o vitamind, asociate sau nu cu un ion metalic Ai care este slab legati de partea proteica. Precursorii coenzimelor impiicate in cataliza enzimaticd sunt vitamine hidrosolubile, prezentate pe larg in capitolul ,,Coenzime vitaminice". parte prosteticd _ dacd partea neproteicd este o structurd organicd legatd ferm de partea proteice. c.
indepirtarea cofactorului sau a coenzimei duce la pierderea activitS.lii enzimatice. Apoproteina este responsabilE de specificitatea enzimaticd (de acliune, dar mai ales de substrat), in timp ce partea neprotelca este implicatd direct in catalizd.
I IE
I.3.1. Izoenzime Anterior
s_a afirmat
cd
unele
enzimeie sunt proteine cuaternare. Aceasta semnificd. faptul ce ele sunt aic5tuite din mai multe lanfuri potipeptidice (numite subunitdfi) asociate intre ele prin legaturi chimice slabe. posibiiitatea asocierii diferite a subunitdlilor duce hfiaritia unor enzime cu forme moleculare multiple numite izoenzime, IzoenzimeLe cata)izeaz,aaceeaqi reaclie chimicd. dar cu randament diferit qi au localizare tisulard. diferitdIzolarea $i evidentierea acestor izoforme se face pe baza proprietd.filor fizico_chimice diferite. Doud dintre cele mai intAlnite izoenzime in practica medicald, sunt LDH - lactat dehidrogenaza qi CK (CpK) _ creatrn kinaza (creatin fosfokinaza). LDH este un tetramer alcdtuit polipeptidice: unul de
(mu scre). subunitatea l;*,l inimii
gi
in
general
din doud tipuri
de lanturi
"
"::.::,:l j',r",I ;" "ti "l ":::"L::
lesuturilor cu metabolism aerob, iar subunitatea M (muscle) este caracteristicd muqchiului scheletic Ai_ in general organelor gi fesuturilor cu metaboiism anaerob (excepfie fac ficatul gi eritrocitul). Cele doud tipuri de subunitdli se asociazd cate patru pentru a forma un tetramer ducAnd la aparitia a 5 izoenzime: LDHI LDHZ
- HHH H ) cre$te in infarctul de miocard .HHHM
LDHS
-HHMM
LDH+
-HMMM
LDHs
-MMMM
) creqte in afectarehepaticA CK este un dimer alcdtuit din doud tipuri de lanluri : unul de tip B (brain) cel de ai doilea de tip M (muscle). Subunitatea de tip B este specificd creierului, cea d.e tip M, muqchiului. Cele doui subunitdli se asociazd. diferit pentru a forma un dimer d6nd naqtere Ia 3 izoenzime.
CKr - BB CKz
- MB ) creqte in infarct in primele 6-24 ore.
CKs
- MM
Se evidentiazd astfel importanfa cunoagterii particularitililor gi funclionale
structurale
aJe izoenzimelor in stabilirea cu acuratete a
unui diagnostic. Uneori
enzimele
sunt
asociate
in
aqa-numite
compiexe
multienzimatice in care enzimele individuale sunt fixate prin Iegdturi slabe pe o proteind. central5, intr-o ordine ce corespunde intrdrii 1or in actiune. Aceaste organizare are ca scop transferul eficient al produqilor de reaclie ai unei enzime la enzima urmetoare, evit6ldu-se pierderile qi imprimAnd procesului o anumiti itezl. IJn exemplu de complex multienzimatic
il
constituie
piruvat
dehidrogenaza
(pDH), care
cataJizeazd,decarboxilarea oxidativd a acidului piruvic, compus ,cheie" in metabolismul glucidic.
I.4. SPECIFICITATE
slfff citateaenzi\:*ic5'^W# dea W#g ?9&7tr\vtft.erzirr5:1or deosebi
intre
structuri'
diferite.
De
aceasta
,,capacitate" este
responsabild partea proteica a enzimei $i anume apoenzima. Specificitatea enzimelor se poate manipsta_..in trei variante principale: specificitate de reaclie, de substrat (i opti"a) t '-.-.' /lSfspecificitertea de reactie - denotd fapliiT-cd o enzima este ,,corJceputd" sE catalizeze un singur tip de reaclie. pornind de la aceasta treseturd s-a fhcut clasificarea enzimelor in cele qase grupe enzimatice.
fuffipecificitatea prezinta:
specificitateabsolute;
J t( "/
de substrat - care funclie de aria de actriune
4
specificitate absoluti de grup; specificitate relativd de grup;
I 20
a) Speclficiteteq
absolutd.
Unele enzime actioneaze numai asupra unui singur substrat, catalizdrrd o singurd. reactie, de exemplu uteaza: HrNJ-NH,
+ H2o-l&33L*
2NH3 + Co2
Aceasta enzimd este total inactivi fa{d. de compuQi foarte asemdndtori structural _ tiourea HzN_CS_NHz. De asemenea, arglnaza - enzima care cateJizea2d hidroliza L_argininei la uree gi ornitind nu poate cataliza hidroliza esterului metilic al argininei sau scindarea agmatinei, amina rezultati prin decarboxilarea argininei. HN-CH2 I
-CH2-CH2-CH-COO"
**0,,-
NH:
I
f H: c:o I NHz
NHz Arginind
H2N-CH-CH2-{H2-cH rl + COOH rus^
Uree
b)
specilrcitatea
Din
aceaste
atsotuti.
d.e grup - prezt.te enzimere ce catalizeaz1. acelasi tip de reaclie asupra unui numdr restrens de substrate apropiate ca structura chimicd. categorie
fac pa_rte gJicozid,azele qi succin_ dehidrogenaza (sDH). sDH catarizeazd. reaclia de trecere a acidurui succinic 1a fumarat, dar cu aproximativ aceeagi vfteze qi dehidrogenarea acizilor L-metil_succinic, L-etil_succinic qi L_clor_ succinic. Hooc -cH2 -cHz-cooH
srcch-d"hid.ogenara'' Hooc _cH:cH_cooH
Acil succinb
cl
specificitatea
Acid fumarb
rerqtrod
de grap - prezlnte enzimele ce catalizeazd. acelaqi tip de reacfie asupra unui numAr relativ mare d.e substrate apropiate ca structura chimicd. Din acest grup fac parte ligazele sau esterazele care fac posibild scindarea mono-, di- trigriceridelor gi chiar arli esten cu structure chimicd mult mai compricata. Enzimeie proteoritice care hidrorizeazi
Iegdturile peptidice din proteine qi din alti compuqi neproteici, fac parte tot din acest grup. 3) Specificitate opticd sau stereochimicd. Este foarte rdspdnditd dat frind fapful c5. majoritatea substratelor au carboni asimetrici deci se gdsesc sub forma de stereoizomeri. Enzimele catalizeazd transformarea numai a unui stereoizomer (specificitatea opticS. este de obicei absoluti) neputAnd fi prelucrat
celAlalt antipod optic
de enzima. De exemplu, L-serin-hidroliaza
catalizeazd,numai dezaminarea L-serinei la piruvat, nu gi a D-serinei: CH,
i l_*r, fH'?-oH _I* fH-NH, f cooH H2O COOH
_i:\H
pHs
Hzo
9H,
\
t\l cooH
- l:o NH2cooH
Lserina
Acil piruvi:
Enzimele care recunosc
substrate
cu
izomerie geometrici
prezirrtd.specificitate geometricd. Ftmaraza,
de exemplu, permite hidratarea acidului fumaric
(izomer trans) gi nu a aciduhli maleic {izomer cis) cu formarea acidului malic ca orodus final: H
HOOc--c:g-cooH I H
Funwaza -
cH-cH2-cooH
-H p :H o o c-
Acid turnrt
I.s. MEcANIsMEDE cATALIZA
OH Acil malic
dl u
AtAt specificitatea cAt gi cataliza p.esupun
'' "' ')'
' "' t '
I 6
(, stabilirea unor
leg5.turi intre enzimd gi substrat ce duc la formarea temporare a complexului enzima-substrat ES. Formarea acestor legaturi tg1rrp_o,lqlg-(mai mult sau mai pulin
slabe) are ca scop
lgqq"g"" miqc5rii libere a sub_stratului,extragerea 1ui din mediul apos etc. Cumulate toate aceste interacfii imprimd substratului o forma corespunzitoare stdrii de tranzitie si oferd
-
energia necesare catafizei p.oprilr-ri"".
Odate substatul fixat, asupra lui ,,incep" sd acfioneze gruperi funclionale pozitionate adecvat, care permit ruperea sau formarea unor legdturi, printr_o varietate d.e mecanisme: mecanisme acido-bazice gi/sau covalente, mecanisme de tensionare a substratului, mecanisme bazate pe efecte entropice etc. S-a observat ci in cursul catalizei o enzimE. utllizeazd, de reguid mai multe mecaaisme simultarr. Grupdrile funclionale ce participd. la aceste mecanisme sunt: - aminoacizi din lanful polipeptidic; - compu$i organici (coenzime)/ qi ioni metalici: - ioni metalici. Dintre toate aceste mecanisme va fi prezentate cataliza ce se desfdqoard prin mecanism acido-bazic qi catalizd covalentd. cataliza acido-bazicd 4, rn acest tip de catalizd sun{ implicate gruped functionale cu caracter de acid sau bazd slaba, care 1a pH fiziologic pot ceda/primi un H+. in acest tip de reaclie iau naqtere intermediari instabili cu sarcina electricd. Cel mai intA_lnit aminoacid, care ia pH frziologic poate funcliona sub forma perechii acid.-bazdconjugatd. este histidina, care are pKn = 6 $i a carei comportare este prezentata mai jos: -NH-CH-COCH, tHN
-NH-fH-co+H+_H+
/.N:
Ptn=o tslo a
nt_ '44
__J", nrSr-H zl
Cataliza covalentd
ln acest tip de catalizd grup5rile funclionale ale centrului activ aI enzimei atacd nucleofil (in majoritatea cazurilor) sau electrofil (mai ra-r) substratul, ducAnd Ia formarea, intr_o secvenld. de reaclii, unui
intermediar legat covalent de enzimS. Acest intermediar covalent este mult mai labil dec6.tsubstratul inilial. Un mecanism de catalizl
enzima.ucd, in care sunt utilizate atAt
mecanisme acido-bazice cat $i covalente, il reprezinti nrperea legdturii peptidice sub acliunea chimotripsinei in urma cdreia rezultd. aminoacizii formatori.
p
ho r
tl
-HN-CH-C-!I\-CH-C
H2o
-
S.P r
a
HN-CH-C-oH
I
Rn+1
+ Ii2N-CH-C-NH I Rn+1
Procesul are loc prin combinarea a doud tipuri de catalizd, in cursul reactiei luAnd naqtere at6.t intermediari instabili cu sarcind electricd cAt qi intermediari fixati covalent de enzimd. Centrul activ al enzimei prezintA o triade cataliticd a_lcdtuitd din trei aminoacizi qi anume Asptoz, Hyssz, gsltes. 't
Ser 10i
*o)
Fig.4 - Centrul catalitic al chimotripsinei evidenfiazd pozitionarea aminoacizilor Asp, Hys si ser astfel incat sd lie posibil transferul de protoni fiinia punctate) [6].
CAnd un substrat, care conline legetura peptidicd, se leag[ la centrul activ al chimotripsinei, are loc o uqoard modificare conformalionald care comprimd legatura de hidrogen dintre Hyssz qi Argtoz ducdnd Ia aparilia unei legdturi mai puternice. Aceasta interaclie cre$te pK.-ul Hyssz de 1a valoarea 7 (la histidina liberd) la valoarea 12, permi!6:nd histidinei sd.-gi accentue ze caracterul bazic incat ea devine capabil5 sE atragd protonul aparlinAnd gupdrii hidroxil de Ia Sertes. Deprotonarea imprimd Serles un caracter nucleofil puternic; are loc atacul grupdrii carbonil a substratului, atac in urma cS.ruia se formeazd un intermediar scurte, cu sarcinS.negative. Instabilitatea
compusului
incarcat
cu viatd foarte
negativ
duce
ia
rearanjarea qi formarea unei duble legdturi intre carbon qi oxigen, care dezlocuieqte legd.tura dintre* carbon gi gruparea amino a legiturii peptidice, ducAnd la ruferea acesteia. Gruparea amino este protonate de Hyssz,uqurAndu-i_se astfel indepdrtarea. in aceastd etapa ia naqterea un intermediar legat prin legaturi estericd de enzima, denumit intermediar acil-enzimd. in etapa urmitoare
o moleculi
de apd este deprotonatd prin
mecanism acido-bazic ducAnd la generarea unei grupdri hidroxil cu carater puternic nucleofil. Aceasta atac6 legitura estericd a acil_ enzimei generd.nd un nou intermediar cu sarcind negativi, cu viatd foarte scurt6. Instabilitatea acestuia produce rearanjari care duc la indepirtarea
produsului
de reacfie, ce contine gruparea carboxil si la protonarea g91r9sgu regenerarea enzimei.
25
Rr.6 Ltirtrtr | rotLld I
-'
t
\/
'*i o.
r*-r'ui^i:
YE] )
t"
t- s.,'
Fig.s . - Mecairismul detaliat aI reacti, ei catalizate de chimotripsin6. Chimotripsina peptidice la gruparea COOH a cale.Jj?.earA hidroliza legiturii aminoaciZilor. cu radicali aromatici (a). Pe parcursd catalizei se fornieazd in urma transferului unui proton (c), compugi instabili cu sarcina electricd. (d), iar in ufma ruperii legiturii peptidice Si eliberErii po4iunii ce confine gruparea amino, compuQi intermediari legafi covalent (e). Atacul nucleofil af apei (f) genefeaza um nou compus cu sarcine electrice foarte instabil (g), a cErui rupere va elibera o po4iune de la:rt polipeptidic ce contine gruparea carboxil (h) Qi va regenera enzima (i). [6]
26
I.6. CINETICA ENZIMATICA I.6.1. Notiuni de cinetlci
generali
Cinetica studiazd viteza cu care se desfdqoari diferite fenomene, inclusiv reacliile chimice. Cinetica enzimaticd studiaza viteza reacliilor desfdqoard in organism gi factorii care o influenfeazd. Principiile
generale ale cineticii
enunld
chimice ce se
1egile care permit
calculul vitezei de reaclie in diferite reaclii chimice: 1. presupunAnd o reaclie chimicd ce are loc intr_o singure etape in care este implicat un singur substrat qi care este ireversibild (vezi exemplul barei rigide pC. 16),
S-P viteza de reaclie este datd de cantitatea de reactant [A] consumate in unitatea de timp (semnul indicd consumul "_,, reactivului) sau cantitatea de produs [p] formatd in unitatea de timp. dtAl
v=. dar
dt
dtAt -
= dlPl dt
V-tAl-V-klAl
unde: K= constanta de vitezi. dependentd de natura reactaltului condiliile de reactie. [A] = concentralia reactantului [P] = concentralia produsului Unitatea de mdsurd Jrenrnr.
M
semnificalia acestei loislan,l-t;*-"9
si de
I
"t""r'rr"i
rrit"r" unitare
indicAnd ,,caltitatea" de timp necesard. transformarii unei ,.unitdti",.
Aceastdconstantdestestrict specilicdfiec5reimotecut.,ffol"kllA
de natura
gi tiria
legdturilor
ce urmeaz6- a suferi tralsformiri
qi
dependentd de condiliile de reaclie (T, pH, tdrie ionicd., presiune). Pentru a intelege semnificalia constantei de vitezi. K, linAnd cont de expresia ei matematicd (sec-l), vom compara rlrperea unei bare de metal cu ruperea unei bare de material plastic. Ruperea unei bare de meta-l necesitd un timp (exprimat in secunde) mai mare decAt necesitd mperea unei bare de material plastic. Constanta de vitezd, fiind datd. de raportul l/sec, va avea valoare mai micd. in cazul barei de metal decdt in cazul barei de material plastic. Cu a_ltecuvinte viteza unitari pentru ruperea unei bare metalice este mai micd decAt viteza unitard pentru ruperea barei de material plastic. Se evidentiazd faptul cE structura dicteazi, merimea specificd a acestei constante, ce reprezintd viteza unitare, pentru fiecare compus in parte. 2.
s5. presupunem
o reaclie bimoleculard
{vezi exemolul
ciocnirii a doud molecule, p. 6) A+B---+P + Q in mod analog viteza de reaclie este datd de cantitatea de reactivi consumatd in unitatea de timp sau de cantitatea de produsi de reactie formatd in unitatea de timp: IdP l =--rdnl v_ _ [d Al _ _ ldB l _ dt dt - dr -v-tAl.tBl-+V=ktAl.fBl in care : K = constanta de vitez6, dependentd de natura reactantilor si de conditiile de reactie [n] qi [e] = concentraliile reactangilor tpl Si tQl = concentraliile produqilor Unitatea de mdsurS.pentru
Reacliicu
-,.- _
-",.",,-;;;;";il';r:
M .I
_.".,
ll";J0,i",o""
ciocnirea
simultand a trei molecule fenomen relativ rar intalnit qi mult mai greu de definit din punct de vedere matematic.
\J !,tuuJ A t u.A {tr'61 . L + t t s W c & C c _ .
Dacd se reprezintd. grafrc veiiiafia cantitd.tii de produs format in funcfie de timp se obline o curbd ce prezirrtd o porliune rectilinie (cu panta constante) care apoi se inclind qi in frnal se aplatizeazd (frg.6).
Qa-ff
Fig. 6 - Variatia cantiteui de produs format funcfie de timp. Viteza de reaclie, date de dP/dt (care este tangenta la curbd, tgo,), nu este constante pe tot parcursuJ procesului, fapt evidenliat de modificarea targentei la curba (oo*or).
Din punct de vedere matematic tangenta in orice punct aI curbei data de relatia tg c = dP/dt va reprezenta irteza de reacfie, conform relaliei V = dP/dt. Portiunea liniarS. a curbei permite calcularea vitezei reale a procesului (numitd dupd unii autori viteza actuala, dupi ailii viteza inilial5
Vo) atunci cAnd orice cantitate de reactant se transformi integral in produs, cAnd nu existd. reaclii reversibile, cAnd nu existd impiedicdri sterice generatg {e 4cumularea de prod.gs etc. pe mesure
cecantitatea a" ,"""t""t*To*
il,iA^i Hffi*.k"'o.oo,r"
rormatd se
micqoreazS.qi viteza procesului scade. Datoritd faptului
c6. viteza nu este aceeaqi pe tot parcursul
procesului, este indicatd determinarea ei in primele secunde/minute ale procesului gi anume mdsurarea aqa-numitei viteze iniliale ve . in reacliile enzimatice activitatea unei enzime este apreciata funclie de cantitatea de produs formatd in unitatea de timp, prin urmare activitatea enzimatici este similard vitezei de reactie.
Activitatea enzimatica se exprime in: >::>2)/1J.I
(unitdli
internalionale)
-
1 Unitate
Internafionali.
reprezintl, cantitatea de enzimd. ce catalizeazl. tra-nsformarea unui pM de substrat/min
in condilii standardizate pentru
fiecare enzimd (temperaturd, pH optim etc.). - 7kat. reprezintd cantitatea de enzimi -=- )-Katal transformarea unui mo1 de substrat/sec.
ce catafizeazd.
2=. 3) Turnover - IG"t reprezintd o mesurd a activitdlii maxime.
Kcat este numdrul
de
molecule
cata_litice
de
substrat transformat pe moleculd de enzimd qi in unitatea de timp cAnd enzima este saturate cu substrat. T\rrnoverul reprezintd. deci activitatea moleculard a enzimei. L6.2. Cinetica etrzimatici Conceptul de bazE al cineticii enzimatice consideri c6 formarea produsului de reac{ie este condilionatd. de formarea in prealabil a complexului enzima substrat ES, concept redat de relatia: l
g .1,_5
___j_
gS _
E + p
Factorii care influenfeaz1. iteza de reaclie sunt, dupd cum se observS.din relalia de mai sus, concentralia substratului, concentralia enzimei la care se adaugd parametri ca temperatura qi pH_u1, la care se desfEgoardreaclia. a)
Influenta pH-ului asupra actlvitegl
enzimatice
Varialiile de pH pot avea efecte atdt la nivelul enzimei, cat qi la nivelul substratului. Astfel, se poate modifica gradul de ionizare a unor grupdri funclionale
de pe enzimi,
a cdror sarcind (pozitivd sau
negativS.)este necesard fie formdrii complexului enzimi._substrat, fie menlinerii conformaliei tridimensionate native a protein_enzimei, fie activitefli catalitjce propriu-zise (fig. 7). De asemenea, pH_ul mediului poate modifica gradul de iorizare al substratului,
impiedicAnd sau
30
favorizAnd formarea complexului enzimd-substrat. Valoarea pH_ului 1a care reaclia enzimaticd se desfdqoara.cu vitezd maximd se numeste pH optim.
Influenla pH-ului asupra activitdlii enzimei. Structurile 1in care - .Itgbazice gruparile qi cele acide sunt fie ambele protonate, fie ambete neprotonate n,-i corespund ioniziri.i necesare activitSlii enzimatice. Intervalul de actlvitate al enzimei este cel in care formele bazice stgttt Ptotott"te iar cele acide neprotonate' adica pHul optim este cuprins intre 6 gi
Figura 7 prezinti varialia activitdlii enzimatice a unei enzime lpotetice, funcfie de pH, pentru care ionizarea reziduurilor din centru activ este esenliale pentru catalizd. Cu alte cuvinte pentru ca enzima sd fie functionald centrul activ trebuie sd prezinte grLlparea bazici {B) in forma protonata (BH+), iar cea acidd (A) in formd neprotonate (A ); pK-ul formei bazice este 8; pK-ul formei acide este 6. La pH 7 in jur de 9Oo/odin ambele grupe (A si B) sunt prezente in formd activd., pe mdsurd ce pH-ul scade sau cregte, una sau a-1tadin cele doud. forme trece progresiv in forma inactivd. Cu alte cuvinte pentru enzima de fald pH-ul optim este situat in jurul valorii 7. pH_ul optlm pentru cele mai multe enzime are valori cuprinse intre 6_ g.
}cepfie
fac enzimele digestive, pepsina (pH = 1,5-2), arginaza (pH =
r . 5 - i 0) . b)
Influenta temperaturii
asupra activitifii
enzimatice
Influenla temperaturii asupra activitdfii enzimatice derivi. din ::rtul ce odate cu cregterea temperaturii cre$te agitalia termicd gi prin '::=rare gi viteza de reactie. Peste o anumite temperaturd. enzimele ::r-in instabile qi ca urmare a denatur5rii iqi pierd activitatea intr-un :::erva.1foarte ingust de temperaturS.. Temperatura optimd a enzimelor -: organismele superioare nu depS.qeqte4OoC; eistd insd bacterii ::-nofile a ciror enzime prenntE- activitate optimd 1a 10OoC.
0.8 E iJ- -
0.4
f,nzimi denaturata
0.0 0 Temperaturd("()
Fig.S - Influenla temperaturii asupra activitelii enzimei. Structura enzimei este menlinute intre anumite limite de temperature bana in jur de 4OoC) dupa care cre$terea agitaliei termice favoizeazd denaturarea. Aceasta cauzeazd distrueerea aranjarii spatiale esentiale pentru capacitatea catajitice a enzimei J3l.
cl
Influen{a
cantitilii
de
enzimi
asupra
acti\rititii
enzimatice influenla
concentraliei
enzimei asupra activitdlii
enzimatice
derivd din faptul cd odate cu mdrirea cantitelii de enzimd se md,reste
cantitatea de complex ES gi deci cantitatea de produs formatd, prin urrnare iteza de reactie cre$te. Spre exemplu, sub actiunea unei enzime, intr_un preparat biologic se formeazd X mg de produs p intr_un timp dat. Daca, repetandu-se experimentul, cu acelasi preparat, in acelaqi interval de timp, se formeazd.o cantitate de doud. ori mai mare de produs 2X mg p, inseamna cd in a doua situalie cantitatea de enzimd, care catafizeazdformarea de produs p, a fost de doud ori mai mare (fig.9). Proporlionalitatea dintre viteza de reaclie si cantitatea de enzimi are importanld practic5., deoarece permite determinarea concentraliei enzimelor din preparate biologice, determinare utili in diagnosticarea unor stari patologice.
Fig.g - Cinetica unei rea4ii enzimatice in prezen a unor concentratii crescetoare de enzimd. Addusarea, ra o cantitate n*a d" a unor cantita! crescdtoare de enzima Es r E2 , Er duce 1a f"r*;;" ",ruJi."t, il;iitaii crescetoare de produs P3> Pr > Pr, in acelaqiinterval de timp,
dl
Influenla
concentratiei
substratului
asupra activititii
enzimatice Dacd in organism cantitatea d.e enzimd (cu exceplia enzimelor inductibile) poate fi consideratd relativ constanta, concentralia substratelor variaze inse in fimite foarte largi. De aceea se poate afirma
-:-::
cu relative corectitudine ce viteza reactiei enzimatice depinde 1n principal de concentralia substratului. Dupd
felul
in
care
enzimele iqi
modifici
activitatea
Ia
cregterea/scdderea cantitelii de substrat, acestea pot fr impirfite
in
doud mari grupe: z.t/. - enzir.rrece respectd cinetica Michaeiis -Menten; 4. - enzirne ce prezinte o activitate sinusoidalS., a$a numitele -1 enzime alostericel,ff, 't-.2,/t
Comportarea diferitd a enzimelor qi diferenfele dintre cele doud categorii, vor fi prezentate pe laig in cele ce urmeazd. 1.6,2,1. Cinetlca de tip Michaelis-Menten Michaelis substratului
$i
asupra
Menten
au
activitefli
studiat
influenla
enzimatice
realizAld
concentratiei urmitorul
experiment: la o ca,ntitate constanta de enzimd au addugat cantitali crescatoare de substrat $i au inregistrat vitezele de reaclie mesurate. Cu datele oblinute au trasat un grafic in care pe abscisd sunt trecute concentraliile
de substrat
iar
pe ordonatd
vitezele de reaclie
corespunzatoare (figura 10).
':l i-
[5] {mN)
Fig.10 - Variatia vitezei de reaclie, functie de concentratia substratului
34
AnalizAnd acest grafic se desprind urmdtoarele concluzii: concenttalii mici de substrat viteza este direct proporfionald ,!l7a cu concentratia acestuia (porfiunea liniard a curbei); '2f
ra concentralii crescute de substrat viteza devine independenta de concentralia acestuia, adicd oricAt substrat am ad5uga viteza de reaclie nu mai cregte gi devine egald. cu viteza maximd (Vmax);
platoului indicd existenla fenomenului de saturatie adicd )faparilia indici o capacitate limitatd. a enzimei de a fixa substraful, irecAt oricdt substrat am adduga nu mai existd. centre active disponibile care sA-l accepte pentru prelucrare ulterioard. De aici concluzia cd formarea produsului
este precedata obtgator de formarea unui complex intre enzimi" Si substrat si anume ES. pe grafic se poate determina jumdtate din viteza maximd. adicd Ymax/2; acestei viteze ii corespunde o concentratie de substrat cunoscute drept constanta |-Iichaelis_Menten (Km). Altfel spus Km reprezintd o concentratie de substrat pentru care viteza ;reactiei este egald"cu Vmax/ 2. nn aa informafii asupra afinitdtii enzimei pentru substrat: 14 astfel valori mari ale Km-ului indicd o alinitate scdzuti pentru substrat in timp ce valori mici ale Km_ului indicd o a-finitate crescuta pentru substrat. Acest lucru este vizibil din grafic unde enzima 1 are un Krnl (valoare micd), ceea ce indicd. faptul cd are nevoie de o cantitate micd de subshat pentru a atinge Vmax/2, in timp ce enzima 2 are nevoie de o cantitate mai mare de substrat pentru a atinge acelagi randament adicd. Vmax/2. Km are valori cuprinse intre 10-6M - t0rM.
6fu'#j'u' 1l,U '-i.\'t n ltt lr2 k JJ Michaelis gi Menten au stabilit o .et"iie matematica care exprimS" varialia vitezei de reaclie funclie de concentratia de substrat. E+
+
Kr
S --
K2
K,
ES ----i-----+
F . D ;-'
(1)
Conceptul de bazd al cineticii enzimatice (1) postuleazS. cd :eac{ia de formarea a produsului
este una ireversibilS.. Viteza de
ibrmare a acestuia este data de dP/dt (cantitatea de produs formatS. in
I
'rritatea de timp) care este insi proporlionale cu cantitatea de complex 'ESl. Aitfel spus viteza inilialn Vo $ezi p. 28\ este egale cu produsul dintre K: 9i concentralia complexului ES, produsul formAndu-se atAt
a
iimp cat se formeazd complexul ES.
It
V = dP/dt- [ES] adiaaV - [ES] deciVo = K3[ES1
Q)
e a
Complexul ES reprezintd o stare in care probabilitatea formdrii produsului este egali cu probabilitatea revenirii la compugii iniliali E respectiv S. De aceea concentralia reald a complexului
[ES] este care se stabileqte intre reaclia de formare a
5
dictate de raportul
rt
complexului gi reaclii1e in care acesta se consume, atAt prin reaclia
ls
reversibild cAt gi prin trecerea in produs de reaclie:
a
1)
reaclia de formare a complexului este dati de: Vlo.r*," = K1[E]. [S]
b1 at
(3)
I
2\
reaclia de disfaritie
te
a complexului [ES]
Vde disparitiecauza6de reacdareversibila= Kz[ES]
(4)
L1
Vde dispariliecauza6de trecereain p.o6u, = K3IESJ (5)
de
ce la ISe
Din punct de vedere strict matematic cantitatea de enzima E nu apare in ecuafie deoarece, prezentl, in ambii termeni ai ecualiei 1, ea se anuleazd; din punct de vedere biochimic este acelaqi lucru pentru cd- enzirr,a se regS.seqteneconsumatd la sfdrqitul procesului. Relalia
tre
matematicd in condiliile acestea arati ci compusul S trece integral in
t.
P, cu alte cuvinte viteza de formare a complexului ES este egald"cu cea de consum.
0)
KrfEl.tsl = KztFSl+ K3[BS] sau KrtEl tsl = [Es] (Kz + K:)
(6) (7)
de unde:
KJ t?;;tsl sau[ES]= tESl= r\.2+ ^3
tEt.ts1
rrsr=ftflrrr
K 2+ K 3
a\ \
Relafia obtinutS. nu
este intru
KM
totul
utild
deoarece atAt
concentratia enzirrrei [E] rdmash liberd. c6t $i concentralia substratului [S] la un moment dat, sunt dificil de determinat. Cantitatea d.e enzima rdmasa liberd poate fi insd calculatd ca diferenla intre cantitatea totald de enzimd. [Er] $i cea care este implicatS. in formarea complexului ES:
.tEl=tsrl_fEsl
(e)
t.
inlocuind [E] in relalia 8 aceasta devine:
= ( tstl - tEsl).tsl Km.[ES] Km. [ES] + tEsl.tsl= tE"Il.tsl [ES].(Km+tsl ) = tE'Il.tsl
(10) (1 1 )
(r2)
tEr'l . l'Sl Km+ [S] Relalia 13 permite ca1culu1cantitilii de determinat stabilite
experimental) din
experimental) adicd din
(1 3 )
de complex ES (foarte greu
elemente cunoscute
(care sunt
cantitatea totald. de enzimd si
carutatea totala. de substrat. Dacd inmullim ambii termeni cu IG (care reprezintd. contanta de vitezd pentru formarea produsului) se obfine: K,'tESl =
K3' [E'I] Km+ [S]
(14)
-:::de: & . [ES] este viteza initiald, Vo, a procesului conform ecua{iei 2. IQ . [Er] reprezintd viteza maxima Vmax.a proc€Sului, atunci c6nd toate cantitatea de enzima este ocupatd de substrat, conform aceleaqi ecuafii. in aceastS.situatie relatia 14 devine:
v o= Vnnx.S
(15)
Km+ [S]
Relalia 15 este cunoscuta sub numele de ecualia Michaelis_ \fenten qi stabile$te influenla concentraliei substratului asupra vitezei '-:nei reaclii cata-lizatede o enzimi. Ecualia
stabilitd
de Michaelis-Menten
confirmd
matematic
:bservaliile lEcute prin analiza curbei oblinute experimental gi anume: 1) Ia concentralii mici de substrat, [S] A*o
r----------1
r
/--\
crrrfrn{
|
fcoi{NH-cutn-
l\- \l L--------"\--
OH
\ PABA
Acd folib
2\
fe
anticanceroase
Chimioterapia
face
apel
la
numerogi
inhibilia sintezei de acizi antimetabolili, a caror administrare produce celulelor cu multiplicare rucleici, fapt ce determini blocarea diviziunii exemplu il constituie :apidd, cum sunt celulele tumorale' Un medicamentul cunoscut sub numele de metotrexat'
us H2N-2N
se nd
\CID FOLIC ' ior-a inactiva) ,
I ""'N\ ll | n\,\N/-cH'-T
// \ -\jFCo-(GIu) cH:
Nu,
I il^
'oto**'
f lo EIYH ,Vt-y,,ty*.
-
dhidroblat
n,r'r-ZN-.,,.N- Xantin-oxidaza
(x.o.)
Nz\_N lilt l soAN Ntrn H
XANTTNA
ACID T]RIC
HTNAwAN/ H Guanina
Adenina qi guanina,
aparfinAnd materialuiui genetic, "o-plrg sunt degradate printr-o serie de reaclii ce duc la un compus comun numrt xantinS. Acesta este oxidat in prezenla enzimei xantln oxidazd la acid uric, produs care este eliminat prin urina. Acidur uric este un compus cu solubiiitate relativ micd. Creqterea cantitdfii de acid uric in sAnge duce la acumularea iui in lesuturile moi sau in articulalii sub formd de tofi gutoqi, care declangeazd, reaclia inflamatorie, in boala numitd guti. Aiopurinol-ul, utilizat in tratamentul gutei, inhibS. acliunea xantin-oxidazei, prevenind incircarea organismului cu acid uric.
:r.)
/1SJ ; a,^ac,", ,lr,r*rl
I.6.4. Cinetica de tip sinusoidal Ecualia Michaelis-Menten
/
descrie funcfionarea unor enzlme, care poate fi exprimatd. de o funclie de tip hiperbolic. Acest tip de funcgionare este ca.racteristic enzirnelor care au o afinitate datd. constanti' pentru substrat. De reguld. centru activ al acestor enzime se ocupe u$or cu substrat, se satureazi rapid qi activitatea lor devine independentd de concentralia substratului, depinzend doar de
initatea
intrinsecd a enzirnei pentru substrat. Ne aJldm in cazul in
:ere Km, afinitatea enzimei pentru substrat este ,,constante". Exista insd enzime care igi moduleazd activitatea funclie de -:onjuncturE", adicd uneori ptezir:le aflnitate mare pentru substrat, iteori au afinitate micd pentru acesta. Aceste enzime poarti numele :e enzime alosterice, sunt enzime ,,reglabi1e"cu afinitate adaptabili :leconstante) qi prezintd o cineticd de tip sinusoidal. Pentru
a
inleiege
comportamentul
acestor enzime va
fi
prezentate functionarea hemoglobinei care nu este o enzim.i, dar care poate reprezenta un modei pentru funclionarea enzimelor alosterice. Hemoglobina este o proteind care are rol in transportul Oz de la pld.mani 1a lesuturi. Ea nu are afinitate ,,constanta" fald de oxigen ci aceasta variazd funclie de condilii1e fiziologice qi de lesut. Astfel ea are afinitate mare fald de oxigen la nivel pulmonar,
unde are loc
incercarea oxigenului qi alinitate micd la nivel tisular unde se face descdrcarea acestuia. Mentinerea constante a alinititii
pentru oxigen,
adic5.menlinerea aceleaqi afrnit5li (mari, de exemplu) 9i la nivel tisular ar face imposibild descdrqarea acestuia qi oxigenarea lesuturilor. Cu a-lte cuvinte hemoglobinzi nu poate avea o aflnitate constantd, ea trebuie s6-gi ,adapteze" afinitatea fa!5. de oxigen, pentru a-qi indeplini rolul frziologic. Deci in
studierea
hemoglobinei, afinitatea
enzimelor constante
ce se comportd definite
asemindtor
de Km nu
mai este
relevaltd. De aceea in cazul acestor enzime, nu mai este utilizatS. constanta Km ci un parametru S numit grad de saturare aJ enzimei, care se exprimd in procente [12]. Determinarea vitezei de reac{ie funclie
de concentrafia
de
substrat (gradul de saturaJe al enzimei) pentru aceste enzime a dus 1a oblinerea unor curbe de tip sinusoidd (ng 15).
50
Fig. t5 - Reprezentarea€rali:1l
_
;l|:f,SitJ:Li:T}ffY':-
g" reaciie
Vo funcfie de concentraua ":t9Ti ceprezinte't etici-J-i.,,-,Joiaaralcurba continua
*"n"* ."t"p.",",'tli jf, il'::':dffi1?iu "i""t"" r'al"r,*ri"-r'a" "o-i;il Analiza unui asemenea tip de curbd aratd ci: } la concentralii mici de substrat viteza d.e reaclie cre$te foarte putin (nu direct proporEonal pa in cazul cineticii Michaelis); p la concentralii ,,intermediare" addugarea unei mici cantitdli de substrat produce o creqtere bruscd, semnificativd, a vitezei de reacfie; !
viteza maximd este atinsd mai curdnd la concentralii foarte mari de substrat (fafd de cinetica Michaelis_Menten cdld viteza maximi se atinge relativ rapid la concentra{ii nu neaparat foarte mari de substrat); !
a"finitatea enzimei este dictatd direct de concentralia de substrat (in cazul cineticii Michaelis alinitatea rdm6le constante indiferent de concentralia substratului), acesta devenind un modulator al enzimei. Acest tip de activitate enzimaticd poate fi explicat prin fenomenul de cooperativitate (vezi modelul de funclionare a1 hemoglobinei, p.57) ce se manifesta atat la cre$terea cat $i la scd.derea cantitdlii de substrat; )
concentralia substratului pentru care viteza este Vmax/2 este notate ca S5osau So,s $i reprezinta gradul de saturare al enzimei ce determind atingerea unei viteze qald-vmax/2.
)t
Factori care modlfici
viteza de reactie
Pe hngn influenla directi a concentraliei substratului asupra vitezei de reactie activitatea enzimelor alosterice este influenlatd' 9i de aqa-numilii functiona
efectori sau liganzL Ca modulatori
modulatori, substratele,
metabolilii
sau
intermediarii
pot
metabolici'
Inlluenta modulatorilor asupra activitdlii unei enzime alosterice este prezentatS.in frgura 16. lia a). EN
Funclie de efectul pe care il exerciti, modulatorii sunt pozitivi (activatori) sau negativi (inhibitori) : 1)
te
iti de
modulatorii
pozitivi (activatori A) mdresc capacitatea de
legare a substratului, in consecin!5 centrul activ se ocupa mai rapid, viteza creqte semnificativ gi curba tinde spre o alurd hiperbolicd (vezi funclionarea enzimelor a-lostericep. 54). modulatorii negativi (inhibitori I) micqoreazd capacitatea de 2l iegare a substratului,
viteza scade semnificativ gi se accentueazd
caracterul sinusoidal al curbei' l
te n ri
te
t's {t.]t
DT
in al
1.0
tsl lc
Fig.16 - Prezenla modulatorului pozitiv A m6re$te afnitatea enzimei pentru substrat li implicit saiurarea rapidd a acesteia, viteza cre$te brusc, alura curbei devine hiperbolic A. Prezenta modr.rlatorului negativ I micsoreazd afnitatea enzimei pentru substrat, viteza cre$te 1ent, curba i$i accentueaza aspectul sinusoid [6]'
ia concluzie:
cinetica enzimaticd
evidenfiezd. doud tipuri
de
comportdri ale enzimelor: 1)
o comportare ce respecti. cinetica Michaelis_Menten, de tip hiperbolic, caracteristicd. enzimelor constitutive cu alinitate "constante" concentratia
(mai mare sau mai micd.) fali acestuia, ln cazul cineticii
este o constantS., nu un parametru
de substrat indiferent
de
Michaelis Menten afinitatea
variabil.
Enzimele d.in aceasta
categorie au (de reguld.) un K,o mic, centrul activ al enzimei se ocupd uqor gi enzima ajunge rapid la saturatie. 2l
o
caracteristice substrat.
comportare enzimelor
Aceste
enzime
ce
respecta
alosterice i;i
cu
cinetica
afrnitate
sinusoidald,
variabild.
adapteazd. activitatea
pentru
functie
de
concentratia substratuiui
gi lucreazd diferentiat la concentralii mici respectiv mari de substrat. in cazul enzimelor alosterice afinitatea nu mai este o ,,constante" ci este un parametru variabil, dependent la rAndul lui de concentralia substratului qi de prezenfa/absenta modulatorilor.
r.7. REGLT\REA ACTTVTTaTTI TNZIMELOR Majoritatea enzimelor ri"spund la o cre$tere (de exemplu) a concentraliei substratului printr-o cre$tere a vitezei de reacfie. Aceasta are ca efect scdderea rapidd a concentraliei substratului, fapt care face necesard o nou5. reajustare a itezei de reacfie. Astfel reglarea vitezei de reaclie a enzimelor este esenliald pentru coordonarea proceselor metabolice. Principa.lele
mecanisme
prin
care
este
reglati.
enzimelor dintr-o cale metabolicd, sunt reprezentate d.e: ,Xl Reglerc a alo stericd.; f)
Regla:ea covalente (prin fosforilare-defosforilare)
pro-enzimeior inactive in enzime active; fl /lansformarea l) Reglarea sintezei de enzime.
activitatea
I.7.1. Reglarea alosterica este mecanismul cel mai complex coordondrii metabolice. Enzimele supuse acestui tip de reglare s:.int enzime alosterice, limitante de vitezS' in cadrul unui proces si =atalizeazd,de regu15 reaclii ireversibile. Reglarea activitelii 1or este 1or particulare. in cele ce urmeazd. vor fi
posibild datoritd structurii
.:ezentate pe larg structura, funclionarea gi factorii ce influenleazd. activitatea acestor enzime speciale. 1.7.L.1. Structura enzlmelor alosterice alosterice
Enzimele :entrul
sunt
enzime care prezintd
activ un situs (uneori mai multe) suplimentar,
pe lAngd numit situs
sau centru alosteric (fig. 17). A1o provine din grecescul ,a1o" care :nseame altul. Compugii care se 1eag5.la acest situs poartd numele de modulatori alosteric
sau efectori sau liganzi. Legarea unui
produce
modifrcS.ri conformalionale
modulator
aie enzimei,
care
determini modifi carea afmitelii acesteia pentru substrat' Din punct de vedefe structural enzimele alosterice : * sunt proteine cu structure cuaternare alcdtuite din mai multe lanluri poiipeptidice, numite monomeri sau subunitdfi, care de reguld sunt in num5.r Par. * fiecare unitate prezintS- un centru activ gi unul sau mai multe centre alosterice. * fiecare subunitate (tight
sau
tense)
se prezintd sub doui cu
afinitate
forme: o forma T
scdzutS. pentru
substrat
negativi) 9i o formd. R (relaxed) cu afinitate crescutS. pentru substrat (stabilizatd de modulatorii (stabilizat5. de modulatorii
pozitivi).
-
Centri cat litici cu afinitate mici pentru substrat
*"-. ***-flilc*,ru
a,.s,€ c
SrrreaTT Modulatorulnesativs€tcssn *"0r,,*', fl o-,tiv (sausubstHrur prcrerenlial d€ formaT qi nenline proteina in cooperrrivitlkr homorrop{pozttiva) | | alostericlln conforha a TT I ls€ teagi preferenliattaformaR ii mentrne prorein' atosteric,in conrormaliaRir ||
I
C€ntri crtaliticl cu afinitste mare Pentru substrat
Starea RR
Fig.17 - Structura enzimelor alostedce, alc5tuite din monomen ce i$i pot modifica afinitatea pentru substrat funclie a" f.r"a p. , adopte h un moment dat: torma T cu afnitate sc5_zuta, forma R cu aliniiate ""* p"rrt.,] substrat. Modificarea de forme este dictate de prezen!"7.UJ. "ies"l,,ta *"JJ"iorilor I12l .
1.7.1.2. Funclionarea enzlmelor alosterice Au fost elaborate dou6 modele care incearca
sd explice funcfionarea acestor enzime, modelul simetric qi modelul secventiai. Modelul simetric Acest model trebuie sd respecte condilia de simetne in sensul ci monomerii pot exista fie in forma T, fie in forma R, star e hibride TR nefiind admise (fig. IT). Legarea modulatorului (de exemplu modulator pozitiv) la starea T determind tranzilia acestuia la forma R fdrd aparifia de specii intermediare. In virtutea simetriei toli monomerii vor suferi tral:zilia T-+R ceea ce va accelera semnificativ legarea substratului.
55
Iapt ce va determina o cre$tere bruscd a activit4ii enzimei, respectiv a ritezei de reaclie - efect cooperativ. Aceeaqi comportare se va manifesta 9i la fixarea unui modulator negativ, numai c5"efectul va fi contrar, de scS.dererapidd a fixirii substratului, respectiv a itezei de reactie. Modelul secvential Acest model abandoneazS. principiul
simetriei in sensul cE
monomerii pot exista in forma T sau in forma R dar sunt admise qi formele hibride TR (fig. 18). Legarea unui modulator pozitiv la forma T, induce tranzilia T)R, dar efectul se limiteazd doar la monomerul vecin. Numai
monomerul
vecin va fixa cu mai multd
ugurinld
substratui 9i modifrcdndu-gi conformalia, va induce tranzilia T)R monomerului
urmetor,
fenomenul propagAndu-se din aproape in
aproape la toli monomerii. Contdcdalitid ql Ninhlle mlci
Cs{rr alo$edc
Cooperdtvftrta deg{tba
Cooperthl{te pad$vl
Fig.18 - Model secvential, in care monomerii pot adopta configuralii in intregime T sau R sau conliguratii hibride TR. Modulatorii pozitivi induc ttalfzilia T)R doar monomerului vecin ducand la aparitia formei mixte TR. Aceasta leage la unitatea R (ce are afinitate crescut5) substratul, ceea ce induce tranzilia T) R urmdtorului monomer. Modificarea se transmite progresiv tuturor monomerilor [ 12].
I 56
Modelul
sewenlial
poate
fi ilustrat pnn comportarea hemoglobinei. Hemoglobina este un tetramer alcdtuit din patru lanluri polipeptidice, numite subunitdli sau monomeri, in care fiecare subunitate transporte o moleculd de odgen. Hemoglobina se prezintd. sub doud forme: 1.
o formd tensionatd., cu alinitate micd pentru oxigen, determinati de o structure densd, cauzate de legituri de hidrogen, ce impiedicd migcarea Iiberd a monomerilor (Iig.2O); 2. o formi relaxate, cu afinitate mare pentru oxigen, determinatd de o structurd. ,afAnatd.", canrzatd-de ruperea unor legdturilor de hidrogen fapt ce permite miqcarea iiberi a monomer or:
o., _\__*
(b)
j:,xT:T: ,,,,,,.:,:'?""*; ,ltiii*H"efiffl .|iRii:::i:iLT"ffix,"'H:
$T:#:HlTrl"&:*?I;Hr*'ceantreneazed"ph";";i;ti;;;i;;fi;';
nrjn,"*,*i:*i*il*#":glruf'+i:ikl#
La nivel pulmonar,
presiunea
crescutd a oxigenului
,for!eaz6,
Lg".ea" unei prime molecule de oxigen, in urma legdrii, F6z* din hem x pozrlioneazd, in centrul nucleului tetrapirolic ceea ce antreneazd cieplasarea histidinei
proximale gi a intregii porliuni
de lan! c5reia ii
apaltine (ng. 19). Apar aqadar modificdri conformalionale ale acestei subunitdli care duc la ruperea unor legdturi ionice s1abe,prezente in forma T. in Jrma acestor modific5ri
forma T trece in forma R care are alinitatea
crescutd pentru oxigen. Aceste modificdri sunt tralsmise subunitb.lilor urmetoare astfel ce monomerii 2, 3 Si 4 vor trece consecutiv in forma R Altfel spus prima moleculd. de oxigen se va lega greu, urmdtoarele din ce in ce mai ugor. Subunitdlile se inlluenleazd asadar reciproc, cooperand in
fixarea substratului
(frg.20). De aici no{iunea
de
cooperativitate in activitatea acestor enzime. l,a nivel tisular, datoritE. gradientului de presiune, oxigenul este descdrcat. Pierderea primei molecule de oxigen va favoriza conversia formei R in forma T, conrlersie ce se va transmite progresiv tuturor subunitdfilor. Astfel detaqarea primei molecule de oxigen va determina desprinderea din ce in ce mai rapidd a urmdtoarelor.
EE
r // ' ' U .::-:
6 ,@
lI @ [Fll li
fl C F
=:=
]@ @, @ @ @ jl j :::= @ i ll ]i /l =:= ii ll
t10 i
&Q
@@
Fig.2O - Traazitia de la forma T la forma R. Legd.turile slabe dintre monomeri prezente in forma T ( punlile albastre) se rup progresiv pe masure ce odgenul este fixat. Fixarea fiecarei molecule de oxigen antreneaza tranzifia T) R a monomerului nvecinat. Progresiv trarzitia T) R este indusa pas cu pas tuturor monomerilor.
58
Observalie: la nivel tisular descdrcarea oxigenului nu este totald ci doar in proporfie de 5O%. Aceasta se explicd prin faptul cd o descdrcare tota-ld ar duce la stabilizarea formei T care s-ar oxigena mult mai greu la nivel pulmonar.
pestrarea unui grad d.e saturare in
oxigen duce la menfinerea unei forme intermediare (hibride) ce favoizeazd, prin efect homotrop oxigenarea rapidd Ia nivel pulmonar. 1.7,1.3.
Factorii
care
regleaze
acHvitatea
enzimelor
alosterlce Activitatea enzimelor alosterice este modificatd de a$a_numitii modulatori sau efectori sau liganzi. Funclie
de natura
lor,
modulatorii
sunt
homotropi
sau
heterotropi. Modulatori homotropl in aceasti situatie modulatorul se identifici cu substratul. Cel mai adesea substratul acbveaze enzima care il transformh. Se spune ca substratul este modulator pozitiv gi genereazl un efect homotrop. Legarea unei molecule de substrat la unul din centrele active ale enzimei mare$te capacitatea de legare a celorla.lte centre active. Cu alte cuvinte monomerii se influen{eazd unii pe alfii, instatAndu_se aqanumitul efect cooperativ intre centrele active ale enzimei. Urmarea cooperdrii monomerilor este cre$terea bruscd a vitezei de reaclie observatd in cinetica sinusoidald (p.SO).Un exemplu de efect homotrop il poate constitui fixarea oxigenului la hemoglobind, acesta favorizAndu- qi propria legare. Modulatori heterotropi Modulatorii
heterotropi sunt compuqi diferili de substrat, in
general produqi de reactie sau metaboli{i qi pot genera doud. tipuri de efecte, reversibile gi anume: (a) feed-forward, de regula activator 9i (b) feed-back, de reguld inhibitor.
(J3Ifi*T.) a) Reglarea feed - forward Acest tip de reglare a activitdtii enzimatice are scopul de a imprima un anumit ritrn unei c5i metabolice. Tralsformarea substratului A in produsul final H are loc printr-o succesiune de reacsi catalizate de diferite enzime, in care reaclia calalizatA de enzima Ez (de exemplu) este limitant6 de vitezd. Aceasta insemnd cd transformarea compusului
B in C se
reaizeazA cel mai incet, ceea ce poate duce 1a acumularea lrri. Creqterea concentratiei compusului B, in mediu de reaqtie face posibild fixarea lui, tn calitate de modulator pozitiv sau activator, la enzjrrra Es. Compusul B este deci un activator al enzimei, prin urmare fxarea lui la situsul alosteric al enzimei va detepmina o cre$tere a activitd$i enzimei Es, ceea ce va asigura o fluidizare a procesului, prin prelucrarea mai rapidi. a produsului F (prezent in cantitate din ce in ce mai mare ca urmare a inilierii cSii metabolice). Altfel spus un intermediar situat in amonte intr-o cale metabolicd o enzimd situatd in aval, sd se ,pregeteasce,' pentru a lace "atenjioneazS.' fald unui a1h;x sporit de substrat. b) Reglareafeed - back Acest tip de reglare a activitdfi enzimatice se nume$te inhibipe prin produs final, feed-back sau retroinhibilie. produsril final aclioneazd ca un efector
alosteric
negativ
asupra
enzimei
reglatoare
a
procesului.
Acumu.larea de produs H, ca urmare a neutilizdrii 1ui ir acelaqi ritm cu sinteza, face posibild fixarea ]ui, in calitate de modulator negativ, la E2care cateJiznaz\, efape fimitante de vitezd a procesr.dui. Se eviti asdel atAt epuizarea substratelor cat gi producerea irr exces a compugilor.
60
I.7.2. Reglarea covalenti
(prin fosforilare_defosforilare)
Un grup important de enzime iqi regleazd activitatea prin atagarea respectiv i:rdepdrtarea unei grupdri fosfat la un rest de serina, treonin5 sau tirozinS.. Ataqarea resfuIui fosfat poartd denumirea de fosforilare qi este catalizatd de o familie de enzime numite kinaze utilizdnd ATp_ul. indepdrtarea grupdrii fosfat poartE denumirea de defosforilare qi este catalizati de o familie de enzime numite fosfataze, cu qlutorul apei.
Enz-ser-OH
Enz-ser-O-PO32-
l
g^n
Rdspunsul la fosforilare/defosforilare este diferit funcfie de enzimd: astfel in urma fosforilSrii unele enzime se activeazd, a]tele se dezactiveaz.d,. Un exemplu de reglare a unui proces metabolic in care este utilizati reglarea covalentE il constituie degradarea/sinteza glicogenului. In urma fosforilSrii glicogen-fosforilaza (enzima responsabild de degradarea glicogenr.rlui) se activeazi, in timp ce glicogen-sin tetaza (enztma responsabild de sinteza glicogenului) se dezactiveaza. Astfel prin fosforilarea simr.rltand a unor enzime, se asigurd activarea unei cdi metabolice concomitent cu blocarea ciii metabolice opuse. I.7,3. Transformarea pro_enzlmelor in eazime active Unele enzime sunt secretate irr organism in formd inactivd
de pro_ enzimS. sau zimogen. De reguld. zimogenii sunt sintetiza! lttr_un anumit compartiment i:r formd. inactivh 9i sunt activafi la locul acSunii sub inlluenla unor factori locali sau autocatalitic. Aceste transformbri au caracter ireversibil 9i implic5 hidroliza unor legdturi peptidice fcovalente)
de la capdtut N terminal 1in cete mai'riLrtte cazuri) urmatS. de indepirtarea unor oiigopeptide qi expunerea centrului activ al enzimei. Un exempiu de zimogeni il constituie enzimele pancreatice (tripsina, secretate de palcreas $i activate in intestin) (frg.21) sau enzimele implicate ir: coagulare (sintetizate in ficat qi activate in sAnge)
chimotripsina
cunoscute sub numele de factorii coasulSrii. pepsinogen-4
sauDeosina
tripsinogen-ipd!4-!gg94slqB.!!@-tripsina
chimotripsinogen
(un zlmogen,inactlv)
f,
Om--'l
tripsins > chimofipsini
|
-l Pcptid de mascare
PePstnd
lEnt€rokin|'n I
v
Centru activ
o
u
Tripsini (o prot€rz4 activl) F
it b u e)
Fig.21 - Tripsinogenrt este secretat in forme inactive in pancreas. in intestin are loc activarea la tripsine sub actiunea enterokinazei. Activarea se rea.lizeazd prin indepartarea unui fragment oligopeptidic care mascheaza centrul activ. Fragmentul oligopeptidic este situat, de reguld, la capatul N termina-I gi indepdrtare lui duce la expunerea centrului activ al enzimei 115].
L 62
I.7.4. Reglarea sintezei de enzime Mecanismele prezentate mai sus modifici activitatea enzimelor existente deja in orgaaism. Celule i$i pot inse regla gi cantitatea de enzimd prezentd la un moment dat, prin regrarea sintezei acesteia. in acest caz reglarea este exercitate h nivelul genelor gi este realizata prin procese de induclie sau represie. Induclia
se referd la stimularea sintezei de noi molecule de enzimd ca rdspuns la un semnal tralsmis de o moleculd de inductor Substratul poate funcliona ca inductor, acesta stimulefid de regula sinteza enzimei care il prelucreazd. Represia reprezintd blocarea sintezei de noi molecule de enzim5 ca rAspuns la prezen{a unui represor. De multe on produgii reactiei cata)izate de o anumitd enzimd., aclioneazd in ca.litate de represori limitand sinteza respectivei enzime. Acest tip de reglare opereazd,_'intermitent funcfie de condiliile frziologice la un moment dat. Un exemplu de enzima inductibild este glucokinaza, prezentd. doar in ficat, a carei sinteza este indusd de nivelele crescute de glucozi. in acest mod organismul face fald aportului crescut de glucozd,, dupa absorblie. Modificarea cantiti{ii de enzimd ca rd.spuns la prezenla unui inductor (sau absenla unui represor) qi care se traduce prin sintezd de proteine, este un fenomen Lent (ore/zite). in contrast modificdrile in activitatea enzimei, cauzate de mecanismele alosterice, se instaleazd rapid (secunde/minute). Pe ldngd" enzimele inductibile, in organism exista $i enzime care se gS.sesc in cantitate relativ constaltd., in sensul cd. rata lor de formare egaTeazdrata dispariliei lor, cauzatl.de procesele normale de degradare. Aceste enzime sunt cunoscute sub denumirea de enzime constitutive. Ele nu sunt supuse reglarii prin mecarrism de inductie/represie; sunt aqa_numitele enzime de servici,,housekeeping_ enzJmes" cu afinitate mare pentru substrat gi care saturdndu_se rapid
:i]lg
eficienla
maxima.
Un
de enzimd constitutivS. il """-ptt-, \'/ A :cnstituie hexokinaza, enzima importanta'iir metabolizarea ghtcozei. '.,
I.8. IMPORTANTA BIOMEDICALA A ENZIMELOR Importanla biomedicald a enzimelor este date de utilizarea 1or in iagnosticarea unor bo1i, precum gi de folosirea lor in scop terapeutic. I.8.1. Utilizarea enzimelor in stabilirea unui diagnostic Majoritatea proceselor enzimatice se petrec la nivel celular, in :rnp ce determinarea enzimelor se face in general in lichide biologice sange total, plasmS, ser, urin5., lichid cefa,lorahidian etc.). Enzimele :i
ri
:rezente in plasmd pot fi clasificate in doud grupe: }
enzime care aclioneazl- asupra unor substrate prezente in mod
:onstant in p1asm5.in concentralii semnificative. Astfel de enzime se tq
lunesc
enzime plasmatice funclionale qi au ro1 funclional la acest
te
rivel deoarece catalizeazd.reaclii chimice in plasmd. Ele sunt secretate
de
::r diferite organe (de ex. ficat) qi scdderea activitdlii acestor enzime in plasmd indicd lezarea orgEnului care le produce. Astfel de enzime sunt enzimele coagulSrii qi fibrinolizei.
lul . de : 1n zzd
D enzime care aclioneaze asupra unor substrate prezente in celule. -A.stfelde enzime se numesc enzime plasrnatice nefunclionale deoarece substratele pe care e1e aclioneazd nu sunt prezente in plasmd, ci in ce1u1e.Aceste enzime sunt totu$i prezente in plasma. (in concentralii constante, mici),
prezenla
1or datordrrdu-se
distrucliei
celulare,
care
normale. Enzimele plasmatice nefunclionale pot proveni: a) de 1a
rde
organe secretoare (ex. pancreas) sau b) din compartimente celulare.
[e de v t fie
rde :plngrapid
a) in
cazul enzimelor provenite de la organe secretoare,
concentralia lor plasmaticd poate varia atAt in sensul creqterii cAt si al scS.derii cantitali obstruclie
de
enzim5:
cre$terea concentratiei
indicS. o
a c5ii de secretie sau o modificare a permeabilitdlii
membranelor celulare (ex.creqterea amilazemiei), in timp ce scdderea concentraliei indicd o atrofiere a organului secretor.
64
b) In cazul enzimelor exclusiv intracelulare, prezenla lor in plasmi poate varia doar in sensul cre$terii concentra{iei lor, fapt ce indicS. o 1i25.sau o modificare a permeabilitdlii membrarare ca urnare a actiunii unor factori infecfioqi, toxici sau ca o consecinte a traumatismelor tisulare. Fiecare organ are un profil enzimatic propriu in funclie de particularitdlile metabolice legate de funclia sa. O bund" parte din enzime se gdsesc in toate organele, doar proporfia dintre ele diferd de la organ la organ. De exemplu, ficatul este bogat in glutamic_piruvic transaminaza (GTp), glutamat dehidrogenaza (GLDH) 9i succinat dehidrogenaza (SDH) fiind sarac in creatjn kinaza (CpK), in timp ce miocardui, musculatura, sunt bogate in cpK. Aceasta face ca reziunile hepatice si fie caracteri zate p:ir- cregteri ate GpT, GLDH qi SDH, iar cele musculare gi miocardice prin cregteri ale CpK. Determinarea acestui profil engimatic permite confirmarea unui diagnostic cdt Si urmdrirea evoluliei bolii prin determinarea concentratiei enzimelor specifice organului respectiv. Un exemplu este infarctui de miocard in care prolilul enzimatic este cel prezentat in frgara 22. 3
.,--'-.-
tD X
I
-
Cna.
I ;
I
o7a ett aaaj!6tard
Fig 22 - Nivelele CpK2 $i ale LDH in plasma in infarctul de miocard. CpK2 _.., atmge concentralii serice maxime iD 24 o.re ( I zil de la instalarea infarctului. LDH total creSte mai incet atingand nivele maxime intr_un interval de +8 ore (2 zile).
65
Muqchiul cardiac este singurul tesut ce contine izoenzirna CpKz (CKMs).Aparitia in sange a acestei enzime Ia trei ore dupd instalarea durerii in piept, este specificd infarctului de miocard, qi ea prezintd activitate
maximd la aprodmativ
24 ore de la insta-larea acestuia.
Lactat dehidrogenaza (LDH) creqte Si ea in infarct, dar activitatea maximd. se observd la aproximativ 30-48 ore de instalarea infarctului. Astfel determinarea LDH este utild. in diagnostic pentru pacientii investigati dupd 48 de la infarct (timp la care CIG poate prezenta valori neconcludente) cd:t gi pentru
a urm5ri
evolulia
bolii,
scaderea
activitdtii LDH frind un indiciu de depdqire a infarctului. O altd modalitatea de investigare a unei afecliuni este cea a determindrii
izoenzimelor specifice unui anumit lesut. Un exemplu iI constituie tot infarctul de miocard in care poate fi determinata o izoformi, a enzirr.,ei LDH, specificd doar muqchiului
cardiac. Izoenzirrra
LDHr este specificd cordului; concentralia ei atinge valoarea maximd in 24-48 ore de la instalarea infarctului (fig. 23). in cazul enzimelor intracelulare,
diferenlierea localizdrii lor
permite aprecierea gradulgi de lezate a celulei/fesutului. enzime sunt loca-lizate doar intr-un (enzime uniloculare) prezentS. doar
in
cum
singur
ar fi: glutamat
mitocondrii,
sau
LDH
Astfel unele
compartiment
celular
dehidrogenaza (GIDH) gi
glutamic
piruvic
transaminaza (GPT)prezente numai in citoplasmd. AIte enzime sunt prezente at6.t in citozol cdt gi in mitocondrii (enzime biloculare), ca de exemplu glutamic oxalacetic transaminaza (GOT). Creqterea LDH qi GPT intr-o afectiune hepaticd sugereaze leziuni limitate la spaliul citoplasmatic. Cre$terea concomitenta gi a GOT indicd o posibild. leziune mai avansatd care intereseazS.inclusiv membranele mitocondriale. Confirmarea este data de dozarea GIDH, enzime strict mitocondriald.
66
' l.
Fig.23 - Profilul seric al lactat izoertzimeTor dehidrogenazei (LDH) in serul unui pacient sdn5tos $i in infarct. in serul normal LDHI este prezentd in concentratii mai mici decat LDHz (a). in infarct, nivelul total al LDH cu cre$te proglesiv (b), .resfPree
And|
I [ | | r 234 Tlpul l.oeddm$
c) O modalitatea
|
catod
de diagnosticare
in
sneciel
a
concentraliilor LDHI care depdqesc nivelele LDHz intre 12- 24 ore (c)- cresteri secundare ale concentrafiilor LDHs pot apare ca urmare a congestiei hepatice (c). Asfel pot fi monitorizate $i secundare ale complicaliile infarctuiui [11].
moderne
a apdrut
prin
asocierea enzimelor cu imunoglobulinele in a$a numitele teste ELISA (enzime -linked immunoabsorbent assay).
(al
lo, ln.ohr( rr i.rol rm 6ntln. r.d.nrol, ,trllltdl r. l..tl In d&sprl ry.$l{i{- Utuk.n r !.ri. d* rlr!. r|! {'tliE
G}
lNb* er .nihdit rr..m. h $n r{. nsrt mot.t wi4n, !l!*e *tnhdF*l.i hrtd.. trd d{.. r.dc {nar, ln al$Or sr.iidrrtrn tr{r Mrl!.n.
o-w€(
(dl LrubuN.r lubitr.t rDr(in( riBaonE rdlt tttll .r{a.|. h$..lltu itma.rdlhr'ql..rlFer +.*4!(Et!. rle.ru$ln DriFsrrnt. tlruan{l$nki a da.dali.
Fig 24 - Principiul tehnicii ELISA. intr-o prime etapa se fixeazd. un anticorp specific pe suportuJ solid (a). Se aplica apoi serul testat. Antigenul din ser se va fixa pe anticorpul specifrc (b), dupe care se va add.uga anticorpul specilic marcat cu enzimd (c). in ultima etapd se adauga substratul specifrc enzimei {d), care in urma acliunii acesteia va genera un compus colorat, a carui intensitate este propo4ionala cu cantitatea de antigen din serul testat I121.
Metoda consta in
generarea unor
anticorpi
specifici, prin
t
inocularea la un animal de experienl5 (qoarece,iepure) a unui antigen uman, cum ar fi virusul hepatitei. Acest anticorp specific este fixat pe o supra-fale sotdi
intr-o capsule mici
Pentru a evidenlia prezen.travirusului
de polistiren numitd. godeu. hepatitei la un pacient, serul
oblinut din sAngele acestuia, este pus in godeu. Aici are loc o primi incubare prin care antigenul din sAngele pacientului (in cazul de fafd virusul hepatititei) se combine cu anticorpul specific fixat pe godeu. Se indepdrteazS.apoi componentele nereacfionate, se fac o serie de spdldri cu solutii tampon adecvate, astfel incet pe suprafala solide rdmane doar complexul antigen-anticorp. Se realizeazd o a doua incubare prin addugarea unei solulii ce contine acelagi anticorp specific, marcat insd. cu o enzimd, adic5. un anticorp la care s-a legat covalent o enzimA, de regule o peroxidaz,e.In aceastd etape anticorpul marcat cu enzima se va fixa doar acolo unde antedor s-a fixat antigenul. DupE o procedurd
68
de spdlare in care se indepdrteazd, excesul de anticorp marcat se face o ultimd incubare prin addugarea substratului specific enzimei. Enzima va actiona asupra substratului gener6ld, de reguld, un compus colorat. Reaclia enzimaticd este apoi stopate adiugand, de reguld, un acid puternic (ex. HCI). Cu cAt culoarea generate va fi mai intensd. cu atat cantitatea de enzimi. fixatd a fost mai mare, deci qi cantitatea de antigen din ser mai mare. Altfel spus, intensitatea culorii generate este propo4ionala cu cantitatea de antigen din ser (figura 24). I.8.2. Utilizarea enzimelor in scop tetapeutic Cele mai intalnite enzime utilizate ca agenli terapeutici sunt streptokinaza Si asparagi naza. Streptokinaza
este utilizatd" in infarctul
de miocard pentru dizolvarea cheagului. Ea activeazE plasminogenul la plasmini., enzimd foarte activd in liza cheagului la elemente componente solubile. Asparaginaza este utilizatd in terapia anticanceroasd. Celulele tumorale au nevoie de cantitdli crescute de asparagind pe care o ,furd,, din sAnge, lipsind astfel celulele normale de acest amrno acid. Administrarea de asparaginaza scade nivelul acestui aminoacid si irnplicit viabilitatea celulelor tumorale. Utilitatea terapeuticS. a multor enzime este limitatd, deoarece, fiind proteine, ele pot avea rol antigenic.
69
II. COENZIMP VITAMINICE Vitaminele sunt substanfe organice cu greutate molecularA mic5., cu structuri chimice, proprietdli fizice, chimice gi biologice diferite. Ele nu pot fi sintetizate in organism de aceea trebuie aduse prin aport
a-limentar. Necesarul zilnic
de vitamine
este mic
(cateva
miligrame sau micrograme/zi), insd lipsa din alimentatie a acestora, duce
la
declangarea
unor
stari
patologice
specifice,
numite
auitaminoze. Vitaminele nu constituie sursa energeticd sau piasticd, pentru organism, dar sunt indispensabile pentru funclionarea organismului,
deoarece majoritatea vitaminelor
coenzimatici,
in
sunt
aceasta ca1itate indeplinind
normalS a
constituentl
importante
roluri
funclionale . Cercetitorul pentru
aceste
polonez, Kazirnir Funk
substantre,
considerate
a propus ca denumire atunci
factori
nutritivi
suplimentari pe lAngd glucide, lipide, proteine, numele de "vitamine" (amine vitale). Aceasta qi pentru fapful cd primui preparat izolat d,e Funk din tdrdlele de orez era din punct de vedere chimic o amind. Denumirea de vitamind se pastreaza $i astSzi, deqi s-a dovedit c5. din punct de vedere chimic, e1enu sunt toate amine. Existd grupuri de substanle cu structuri chimice inrudite cu structura diferitelor vitamine, care indeplinesc aceleagi funclii qi a cdror carenld determind aceea$i avitaminozd qi care se numesc vitamere. Existd
deasemenea
substarle
asemenatoare cu a vitaminelor,
cu
structure
chimicd
dar cu acliune antagonicd, care
administrate produc efectele avitamiozelor specifice gi care se numesc antivitaminele.
I 10
.
Clasiflcarea
vitaminelot
se
bazeazd, pe
cnterii
de
solubilitate: F vitamine liposolubile (solubile in grd.simi) _ A, D, E, K; F vitamine hidrosolubile (solubile in apd) _ Br, Bz
Bo, pp,
biotina, acidul pantotenic, acidul folic, Brz, vitamina C.
VITAMINE ,/\ ./\ Solubileir apn (hidrosolubile)
/\ Solubile h grnsimi
(liposolubile)
I
ComplexulB
Care nu apa4in complexuluiB
I I
t
Vitamina C (acidul ascolbic)
{
VitaminaA (retinol,p-carotenul) VitaminaD (colecalciferol) VitaminaK (filochinona,menadi Vitamina E (locoferoli)
I.
Cu tol ih eliberarc de energie
I Y
I t
Tiarnina@1) Acid folic Riboflavina@2) Vitamina Bl2 Niacina(PP) Biotina Acidul pantotenic(85)
Alrele
I
+ Vitanina86
Fig .25 _ Clasificarea vitarninelor
N. 1. VITAMINELE HIDROSOLUBILE Vitaminele hidrosolubile aparlin complexului vitaminic B {B1, Bz, Ba, Bo, PP, acid pantotenic, acid folic) vitamina C. $i
Fiind
solubile in apd nu
se acumuleaz.E in organism in concentratii toxice qi se elimind in principal pe cale renali.
Vitaminele
hidrosolubile
indeplinesc
in
organism
rol
de
coenzime, de aceea putem face referire la ele ca la coenzime derivate din
vitamine.
Altfel
spus coenzimele reprezinta
forma
activa a
II.1.1. Vitamina Br $l coenzima tlaminpirofosfat Vitamina Bl (tiamina, aneurina, vitamina anti
beri-beri,
vitaminelor.
vitamina antinevriticd) este alcEtuith dintr-un nucleu pirimidinic qi un nucleu tiazolic, substituite qi unite printr-o grupare metiienicd..
,TlY"',\--+.", H,A\n,.rcr
l.ts,.{tcu2- cH2-oH
Tiamina Absorblia tiaminei se reaTizeaz\.la nivelul intestinului
subtire,
prin procese active qi pasive; absorbtia activd presupune formarea tiamin-pirofosfat (TPP). in
organism tiamina
se gd.seqte
liberE (plasmd, LCR) 9i esterificatd ca TPP (80%), formd coenzimatica care este activd biolosic. Tiamin pirofosforilaz*,2'..t-,, kinaza 'l ll ------------->.._,/1 tt
,,**-
a.ip
\
"r' \'\H,
AMP
o Rol metabollc.
CH,
\
. N--------tr CH r I lt
O ^ ]! \y'cH;cnr-o-P-o-i-oH I OH TPP
o X IOH
Sub formd de TPP participd in calitate de
coenzimS. la unele procese metabolice, decarboxilarea oxidativd. a aceto-acizilor {acid piruvic qi acid o-cetoglutaric). De asemenea, Tpp constituie coenzima transcetolazelor, enzillr.re din calea pentozofosforicd.
'I
o Tulburiri
de aport vitaminic
Simptomele deficienlei pot fi cauzate de malnutriEe, defecte de absorblie, pierderi vitaminice d.atorate terapiei cu diuretice, hemodializd, diaree. Deficitul vitaminic poate conduce la boala numrta beri_beri. ce se caracterizeaza prin: - simptome neurologice (somnolenld, dureri de cap, newiti perifericd); - simptome gastro-intestinale; - simptome la nivelul aparatului locomotor. Simptomele moderate ale defrcienlei tiaminice includ: confuzie mintald, ataxie (inabilitatea de a realiza un controi fin al func(iilor motorii) qi oftalmoplegie (pierderea coordondrii miqc5rii ochilor). Aceste simptome Korsakoff. La
animale,
se intAlnes-c $i in r.
deficienla
tiaminicd
sindromul
conduce
la
Werrricke_ pierderea
coordondrii musculare, ca retractia capului (opistotonus), caracteristic porumbeilor cu hipovitaminozd Br. Hipervitaminoza tiaminice nu apare in mod obiqnuit. Cu totul excepfional pot apare fenomene de intoleranli (1e9in, dispnee, tahicardie).
II.1.2. Vitamira
Bz (riboflavina) gi coenzimele flavinice Apartine clasei pigmenlilor galbeni sau flavinelor naturale. Este constituita dintr-un nucleu triciclic, derivat de izoaloxazind. o catend. $i latera-ld de ribitol:
?' ?'?n "
!Hz-CH-6H-CI|CH2-OH
''"JArruYTr^ H,cA./\l$ j-NH o
in organism, riboflavina se gdsegte sub form5. liberd. (p1asm5, lapte, urinh qi retind), cAt 9i legatd (FMN, FAD, enzime flavinice) in diferite tesuturi ca rinichi, ficat, inimd, muqchi. o Rol metabollc Riboflavina flavinmononucleotid
intrd
in
structura
(FMN)
qi
formelor
sale coenzimatice,
flavinadenindinucleotid
(FAD).
Transformarea sa in ester monofosforic {FMN} are loc in toate celulele organismului, sub acliunea unei flavokinaze:
Flavin-adenin-
Riboflauina -+:gE{Ist-+ /\ ATP
FN,[,J
ADP
Prin unirea FMN cu acidul adenozin-SlP (AMP), sub influenta flavin-adenin-pirofosforilazei, se formeazd FAD-u1. Dup5. nomenclatura stricta, FMN-ul nu este un mononucleotid, iar FAD-ul nu este un dinucleotid, deoarece in loc'de
perfioze au un alcool polihidroxilic,
ribitolul, iar flavina nu este o'bazd azoIat6.adevirata.
AMP-+
Hipovltaminoza
se manifest5 prin aparilia unor leziuni ale mucoasei gastrice, buco-faringiene, leziuni cutanate. La om, carenfa este cunoscute sub denumirea de ,,pe1agr6 fdrd pelagrf', cu simptomele: stomatite angulard., leziuni umede la collurile gurii gi nasuiui, conjunctivitd, cataractd, blefaritd, cre$terea in volum a limbii. F Hipervitaminoza. determini:
Megadozele administrate timp indelungat crampe musculare, poliurie, utilizarea qi metabolizarea
defectuoasd a altor vitamine, datoritd competiliei pentru compugi de fosforilare-
.-
u'r'3' Viteoiaa Br (piridorina) si coenzimere derivate
\,rlrarnina
!6
(piridoxina,
adermina,
factor
includetrei compuqinatura.li,derivali de piridini,
prin natura radicalului
din pozilia 4:
cH2oH
QHO
oFrf)fcr,or
ou/-ycw,on
Hrc\,./
H3c\.j
"-"Ti:TTj:: fH2NH,
oHf\p-cH,on Hrc\-./ Piridoxamin6
o Rolul metabolic Piridoxalul $i piridoxamina intervin in metabolism sub formd coenzimaticd. de piridoxal_S_fosfat, respectiv piridoxamtn_S-fosfat (p5p), ln care gruparea de alcool primar din pozilia Seste fosforilatd in urma reacfiei cu ATp.
tzHo-(CH2-NH2)
otfy"rz-GporH: Hrc\..r1 Trans '*Pfidoxalfosfat
f*J -"-c{oos ]f c-H
\--
p""arboxilare
OH H:C
Vitamina
Bo intervine in multe reaclii metabolice la care participd aminoacizii: transarninare, decarboxilare a c_arrrlno _acizilot (tirozina, arginina, acid eluta'11in I Aa-^^:-^-_ ,
transsurfurare (transferul i:'ffi;J1Tll;,^1.""1".1 ":,ff,t;.
r-
sinteza cisteinei), desulfurar.
1"i"t"ir.a qi homocisteind), in absorbfia din intestin gi intrarea aminoacizilor in celuld.. .
Tulburiri
de aport witaninlc
Ca semne ale delicienfei se pot menliona: stirile de nervozitate, insomnie, tulburdri de mers, afecfiuni cutanate in jurul nasului, ochilor, gurii, limfocitopenie. Carenla
vitaminei
Ba favorizeazd aparifia
cariilor
conduce la modifrcdri in metabolismul triptofanulu i, printr-o excrelie excesivd.de acid xanturenic.
dentare,
caracteizat
Medicamentul ISONIAZID (hidrazida acidului izonicotinic), uzual utilizat in tratamentul tuberculozei, reactioneazd.cu Bo pentru a forma un derivat hidrazonic, care inhibd enzimele ce con{in piridoxal_5_p. Pacienlii tratali mult timp cu isogriazid denoltl o neutropenie perifericS.,care rdspunde foarte bine 1d terapia cu 86.
Q*o-*r-NH2
+ Fc
Il "'""
UOH srontan ----,/l
I
?'r",
co--NH-N:crr5N \__/
6"ron Piriloxal hklrazona
De
asemenea, peniciiinamina
(beta-dimetii-cisteina)
uz:ual utilizatd in tratamentul pacienlilor cu boala Wilson, cistinurie qi artritd reumatoidi, reaclioneaze cu 86, pentru a forma un derivat tiazolidinic
inactiv. Pacienlii tratali
cu penicilamind
dez'olte. ocazional convulsii,
care pot fi prevenite prin tratament cu vitamind Bo. IL1.4. Blotina (witamlna Hl qi rolul ei coenzimatic Molecula biotinei este constituitd din doud nuclee condensate, un nucleu tetrahidro-imidazolic (A) qi unul tetrahidro-tiofenic (B) la care este grefatd. o catend laterald de acid n-valerialic.
Se cunosc doi
izomeri natura.li, alfa qi beta-biotina, izolali din ficat qi lapte, respectiv din gdlbenugul de ou:
o
?,,,
H-N-:-N-H t^l
H_N-;\N_H ,l
lr
r-f=1-t
^ H-t-C"--+{ t Bl H2C\^_,.c H-(cHrr-cooH lD
Dl
z
Beta-biotina
in
f",
H2C\-,.cIFqrrcH-cHr
cooH
Alh-biotina
produsele natufale
compus numit biocitine:
biotina
apare combinati
cu lizina,
-
Biotina-CO-NH-(CHr4-CH-COOH
NHz
Biocitinaza, enzimS. evidenliatd. in plasmd, ficat, pancreas, hidrolizeazl compusui, eliberAnd biotind. Enzimele care contin biotind au in centrul catalitic, resturi de lizind, prin care se fixeazd vitamina. Cu auidina, glicoproteind termolabild
din albuqul de ou crud, forrlreazl- biotin_auidina, compus stabil, rezistent la acliunea enzimelor proteolitice, nedisociabil prin dia1iz6. sub aceasta formd., vitamina nu se absoarbe in tractul disestiv.
18
o Rol metabolic Biotina
transporta
grupdri
COz active, in calitate de grupare
prosteticd a unor sisteme enzimatice de carboxilare (carboxilaze) care catafizeazE.fixarea COz pe diferite substrate. in reacliile de carboxilare, COz activat de citre
ATP, participd sub form5. de carboxi-biotin-
enzime:
*u,. - oiX"il"'",:-r"
---r*
Hcot+ArP-l----+-d ,i_#" i TfFEnz.J" oon o:5__-i,_-l t,b--r"-irnc't4-co i Biotin-Enzimi
Anhidridd-Pcarbonica
cooJ__^
coolr ^o e i Pteridini Acid pteroic-"""""""' i
Acid glutamic
-
Acid pteroilglutamic
.
Rol metabolic
Acidul tetrahidrofolic la transferul
(FH+), forma activd a acidului folic serveqte
qi utilizarea fragmentelor de un singur carbon in diferite
stdri de oxidare: -CHs, -CHz-, -CH=, -CHO, -CH=NH, care se pot fixa la Ns, N10sau ca o punte metilenicd intre Ns Si N10lig.26. Metabolismul folatului
este complex. Sursa de un atom de
carbon este serina, care transferd gmparea sa hidroximetil la FH+ formdnd Ns, N1o-metilen-FH+din care se pot forma gi alte forme active: Ns_CH3_FH+, Nro_CHg_FH+, N5,N1o-metenil-FHa,Ns-formil-FHa Coenzimele acidului folic participi homoserini
la sinteza metioninei din
(Ns-CHa-FH+),sinteza acidului timidilic din acid uridilic
(Ns, N1o-metilen-FH+),in sinteza nucleului de purind (Ns, Nro-metenilFH+ qi Nro-formil-FH+) etc.
84
H r$
ir
l.l
H,N("Y"Y;
,o
s-(cttz-Nrrn iH ,,,
No-\ I oH
Acid tetmhidrofolic (FHa)
../*-t-"\ -cH3
--NF-->
t
tl0
N\./r\slcHr-N't
rEtil
cHc N5-nEri!FHa .\ N
cH. ----------> N s ' to l'
-cH
lr0 *.,EcHr7\ ""r'
NENlO
nEtenil N5-N lo-nptenilFHa
-Q:o
--:;;;'+
.ii" "N5|"l:o '!
./N.rfN=., | ll
I N\.'\ilcH,-N-
fonnil
ro
r! N10-formilFH+
- CH ---:--> Ns ll-
./N.rr-N\ | ll I to N=,,As-}-cHr-N-
rl ' IFC-NH
frrmimino
../*-t-*\ ttr0 N\,,\s,,J_cHr-Nt" l
C:NH
I
H
N5-brmimino-FH+
N l0 formimino-FlI4
Fig 26 - Atomii implicati in transferul fragrnentelor de un atom de carbon. Ns este locul de legare a grupdrilor metil, formimino, Nro locul ae telare af grupdrilor formil gi formimino, iar gruparile metilen si metenil formeazE prtr"gi i.rt atomii Ns $i Nro. "
-::
.
Tulburirl
de aPort vitaminic
Deficienla de acid folic apare din cauza unui aport alimentar scezut, stres (sarcin5.), tulburdri implicate
in
de absorbfie, deficit de enzime sau
transport
sistemul
de
se
manifesti
terapia
cu
unele
medicamente. Carenla
exclusiv
prin
perturbarea
hematopoezei, simptomul fiind anemia megaloblasticd (cu eritrocite mari qi rare). Datoriti acidului
relafiei
strAnse dintre
folic gi cea a vitaminei
activitatea
metabolismului
812, este destul de greu de a
diferenlia simptomele clinice dintre cele doud stdri de carentd. II.1.8 Vltamina Brz {cobalamloaf si rolul el coenzimatic Vitamina antipernicios,
Bn
(cobalamina,
factor extrinsec Castle)
ciancobalamina,
factor
este un complex organo-
metalic, cu inel corinic (tetrapirolic), similar nucieului porfirinic, la care se adaugd ionul de cebalt. Nucleul corinic
are substituite
grupe -CHs, acetamidice gi propion-amidice. in centrul acestui macrociclu se gese$te ionul Co3*, cu num5.rul de coordinalie 6:4 legdturi se realizeazd cu atomii de N pirolici, o legiturS. cu gruparea -CN, iar a 6-a legdturd- se realizeaz6 cu dimetiibenzimidazol-ul. intregul complex, fird gruparea -CN, se numeqte cobalamind.. Radicalul R poate fi diferit, rezultdnd forme variate ale vitaminei, de exemplu: in ciancobalamind R=CN (ciancobalamina se formeazd in procesul de purificare qi reprezintd forma comerciald a vitaminei); in hidroxicobalamind
R=OH; in 5'-dreoxiadenozilcobalaminS. R=5'-
deoxiadenozil; in metilcobalamine
XCHg.
I 86
CHr
CH2CH2CONH.,
i
I{
cH2cH2coNHCHr-i -o-f-
?"o o
it
CH, Absorbfia intestinald
3
a vitaminei
Brz este mediatd prin receptori, in ileon, necesitdnd legarea vitaminei de o glicoproteind. foarte specificd, numitd "factor intrinsec,, secretat de celulere parietale ale mucoasei gastrice. Dupi absorblie, vitamina se leagi de o proteine plasmaticd, trapscobalamina II, in vederea transportului la tesuturi. in ficat, excesul de vitamind se depoziteazd sub formd de 5,_ deoxiadenozil-cobalamind (70%), OH_cobalamind (27o/ol sau netilcobalamind (3%), fixate pe proteine celulare. r
Rol metabolic
Vitamina Brz pdtrunde in celuld, prin endocitozd, sub formd de OH-cobalamind, metilAndu-se apoi la CHs_cobalamind. O cantitate importantd intrd in mitocondrii qi se tralsformd in 5,_ d eoxiadenozil-cobalamind. Cele cobalaminei
doud. forme sunt
coenzimatice,
implicate
in
metabolic
func{ionarea
active,
ale
a doud sisteme enzimatice: metilmalonil-C oA'izolrrrerazarespectiv homocrstein_CHs_ transferaza (sau metionin-sintaza), care catalizeaza urmatoarele reactii:
87
Homocisteind
Honncistein-transfer (CQ-cobalamina)
Metionina.
Reacfie de metilare (citoplasmi)
OH-cobalamina
L-nemmatorul-LoA
5'-deoxiadenozilcobalamina) .-=-=-.-+
Succinil_CoA
Reaclie de rearanrament innamolecular (mitocondde)
in absenla cobalaminei: a) reactia de metilare se opre$te, Ns-CHg_FH+se acumuleaze, blocAnd folatul in a$a numita l.capcarld a folatului, (fig 24). Astfel, homocisteina rdmdne nemetildtd. gi se poate elimina (homocistinurie),
prin
urind.
b) reaclia de rearanjare intramoleculara se blocheazd, acidul L_ metil-malonic se acumuleaza $i se elimina prin urina (acidurie metilmalonicd). Cobalamina $i folatul sunt implicate in diferite procese d.e metilare inclusiv metiiarea histonelor, in timpul repficarii ADN_ului
$'g.2al.
88
H,N-HC-COOH -l CH,
t-
CH, tS
cHr (metionina)
(homocisleina)
(metilcobalamind)
trirTtoerim IA
nEtlfrexat IG)
a"r ror J ' a". J dftitrofolic
,l
1\- Ll l i - r n4
1.,->NAJ)P
.-
-/
xelpu*H* ^folar-redLrtaza
I
v Timidini
t ADN
I diviziunl oehlara Fig 27 - Rolul vitaminei Brz $i al acidului folic Metabolismul acidului folic Ai al vitaminePl2 sunt intergsrelate.ln lipsa acidului folic, formele active a1e acestuia Ns-NrofFH4 qi Ns-CH37mH+, implicate in siteza de purine $i timidina necesare diviziunii delulare, sunt delicitare, prin urmare multiplicarea celulara este incetinite. Un prim simptom este anemia megaloblastica. in lipsa vitaminei Brz, metil cobalamina CHg-Brz nu se mai formeaze, procesul de metilare aI homocisteinei diminue, formarea metioninei necesara metilSrii gaor compu$i esenliali este stopat6.. Gruparea metil rSlnerle blocate pe Ns-CH3rtrFH4, folalii rdmenand sechestrati in forma metihte, asa numita capcane a folahtui. Se instaleaz6 simptomele de anemie megalolasticS, iar dace [psa vitaminei Brz este de lunge durate, apar in plus Si simptome neurologice. Din acest motiv anemia megaloblastice tratate doar prin administrarea de folali poate masca deficitul de Br2, ca-re ulterior poate genera disfunclii neurologice majore. De aceea anemia rnegaloblasticS. trebuie tratate prin administrarea combinate de acid folic $i vitamine 812.
!9
.
TulbEriri
dc aport vitaminie
Sindromul tipic al carenlei de vitamind Brz il constituie anemia pernicioasd sau anemia Biermer, caracterizati, prin eritropoezd. megaloblastica, cu modiflc5ri ale leucopoezei qi formdrii de trombocite. AlterArile hematologice, caracteristice, pot fi insolite de astenie, paloare, dispnee, atrofia mucoaseior digestive, tulburiri
neryoase
(scdderea rS.spunsurilor reflexe gi a perceperii senzoriale, greutate in vorbire qi mers), c6.t 9i tulburiri gastro-intestinale. Anemia rezultd din perturbarea sintezei ADN, care a.Iecteazd formarea nucleului noilor eritrocite. In aceste cazuri globulele rogii circulante sunt, in mare parte, forme primitive qi cu viafd scurtd.. In carenta de cobalarnini pe langa modifrcdrile hematopoetice (modificiri
int6lnite
qi in
carenla de acid folic) apar simptome
neurologice, care devin ireversibile in cazul unui deficit prelungit. IL1.9. Vitamlna C (acidul ascorbic, factor antiscorbutic) La inceput, a fost denumit acid heruronic, av6nd o structurd asemdnetoare monozaharidelor. Forma L este cea mai activd.
3
't
i__-l A
HO-C
'o-+I H - Hipervitaminoza
A
Dozele excesive de vitamini. A produc fenomene de intoxicatie acutd., manifestatS. prin amefeli, cefalee, somnolenta sau intoxicare cronicS. (anorexie, tegumente uscacte, buze uscate, ragade comisurale). Megadozele de vitamind
A produc
reabsorbfia oaselor prin
stimularea activite$i proteolitice lizozomale, stimuiarea secre(iei de parathormon (PTH) 9i efecte teratogene la femeile gravide. Consumul exagerat de caroteni produce ,,icterul carotenic,,. CAnd se depdQe$tecapacitatea de fixare a proteinei de legare a retinolului (retinol binding protien - RBC) are efecte litice asupra membranelor biologice. Lezarea membranelor eritrocitare de cdtre retinol este inhibatd de vitamina E (tocoferol). I IL2.2. Vitamina D (colecalciferol, vitamina arltirahitici) Grupul vitaminelor D este reprezentat de cinci vitamine cu structurd. chimicS. 9i acfiune asemenetoare notate de Ia 2 la 6. Provitaminele D sunt derivali sterolici cu structura urmatoare: ciclopentaloperhidrofenantren.
Ele se diferenfiazd dupd structura
radica-1ului R.
K
\,.J |
,.'"3
-CIHH
a2 -a activaresecundara ^^-- ^ 1.15-1oH12_D zJ_\Jn_u----------------
o,.{
Activatea
primari.
Transformarea
provitaminei
in vitamina
D se reaJizeaz1.prin deschiderea, sub acliunea razelor ultraviolete, a inelului B intre Cs $i Cro cu apari{ia unei duble legdturi intre Cro gi Crq. Rezulta o trien5., care constituie structura de bazd, ce conferd activitate
biologicd comund
(antira}ritica),
catenele laterale fiind
resposabile de intensitatea pctivitelii vitaminice. Suprairadierea duce la compugi toxici. .
Activarea secundari conste din dou6. procese de hidroxilare
succesive ce au loc in ficat gi rinichi. Prima hidroxilare a vitaminei Ds are 1oc in ficat, in pozi{ia 25 a catenei laterale, formdndu-se 25-hidroxi-Dg. A doua hidroxilare are loc in rinichi, unde forma hidroxilatd in pozifr.a25 suferd o noud hidroxilare in pozitia o la carbonul 1. Rezultd 1,25-dihidroxi-colecalciferolul sau 1,25-dihidroxi-Dg care este forma vitaminicd cu activitate maximi in metabolismul calciului. Derivatul monohidroxilat (25-OH-D:) este de 4-5 ori mai activ decdt vitamina D3, in prevenirea rahitismului, iar derivatul dihidroxilat 1,25-(OH)z-Ds este de 2O-30 ori mai eficient decd.t D: in transportul intestinal de Ca** Si respectiv, in prevenirea rahitismului.
98
7-Dehidrocolesterol
u.v.l(niele) YR
.^-A
,^.fl,!r f
I
T
'../W
I | Y
!7,fcllfteror (viraminaD3)
ficat
oH
25-OH-D3
' .-a>r'
"?*a$ *
al )r-
d'^.."o.,/
1,25-Dihidroxi-D3 (calcitriol)
.
Rolul metabolic d vltamlnel
24,25-Dihidroxi-D3 (inactiv)
D
Vitamina Da este privitd astdzi mai mult ca un hormon decdt ca o vitamind. 1,2S-(OH)z-Dssau calcitriolul regleazd metabolismul fosfo-ca.lcic prin acliunile exercitate asupra tesuturilor tint5.: intestin, os, rinichi (fig 28).
Fig-28. Metabolismul Si acliunea vitaminei D. Forma activa a vltamlnei Ds, 1,25_ (OH)r-D:, aclioneazd la nivel intestinal ai osos stimuland absorblia respecti" 'n""."^ calciului, iar la nivel renal impiedicAnd eliminarea lui I1l.
La niuelul intestinului
calcitriolul este transportat la locul de acliune unde se fixeazd pe proteine receptoare citoplasmatice qi >
apoi este translocat la nucleu unde printr-un acliunii
unui
hormon
steroid
induce
mecanlsm similar
sinteza
unei
proteine
I 100
transportoare
de calciu
(Calcium
Binding
protein
-
CBp) care
favoizeazi absorbtia de Ca** contra gradientului de concentrafie. Le nilur.tut htbilor renall I,2S-(OH)z-Ds stimule azE sinteza :> CaRP renale qi deci reabsorbfia, preintAmpindnd excretia de Ca**. nive1atl osului actiunea 1,25-(OH)z-Ds este mai )> ta compiicatd qi mai pulin clar6. Vitamina asiguri. fixarea Ca** qi pO+s-in spaliile libere dintre capetele nespiralate ale moleculelor de colagen gi stimuleazi"
sinteza
unei
proteine
specifice
care
leagi
Ca**,
osteocalcina. Calciul se fixeaz1. in faza minerald a osului, sub formE de hidroxiapatita, Caro(pO+)o(OH)2, aleturi de cantitdti mici de citrat, Na*, Mg** qi CO3z-. u ;y'?Fu :Arutdrl de aport vitamlnic Htpottttaminozq. D >r Formarea defectoase in piele a vitaminei Dg, aportul alimentar scdzut gi/sau defecte intestinale de absorblie a vitaminei pot duce la stdri de hipouitaminozd D. Hipovitaminozele D conduc la stdri de boali" care se manifestd prin: - defecte in mineralizarea osului. - perturbari in metabolismul mineral (Ca.. gi pOa:J Si a secretiei de parathormon (PTH); in deficienla de vitamind D absorblia de Ca2* fiind perturbatd apare hipocalcemia, insolitd secundar gi compensatoriu de cre$terea secretiei de PIH, care determini mobilizarea Ca2* din oase pentru normalizarea calcemiei. Din
punct
caracteizatd,
prin
de vedere biochimic hipocalcemie
hipovitaminoza
moderatd
sau
D
este
normocalcemie,
hipofosfatemie, activitate crescutS. a fosfatazei alcaline. nivele crescute de parathormon gi scdzute de 1,25-(OH)z-Ds. Din punct de vedere clinic, hipovitaminoza D este caracterizata de scdderea rezistenlei Hipovitaminoza
D
la
mecanice a oaselor (inmuierea oaselor). copii
se nume$te
rahitism iar
1a adult
l0l
osteomalacie.
La
adult,
rezerva
de
calciu
fiind
mai
mare,
hipovitaminoza se instaleazS.mai greu. Hipocalcemia dezvoltd 1a adult osteoporoza (reducerea masei osoase pe unitate de volum la un nivel situat sub cel necesar funcliei normale). Osteoporoza apare la femei postpartum sau dupa instalarea menopauzei, ceea ce dovedegte dependenta hormonalh a acesteia. Tratamentul cu estrogeni previne instalarea osteoporozei (se pare c5. estrogenii protejeazd osul impotriva agentilor care determind. resorblia osului, in special pTH). Sunt descrise boli genetice datorate unui defect i:r sinteza renald a 1,25-(OH)z-Ds,care produc rahitismul dependent de vitamina D (tip I) gi mai rar boli cavzate de deficienle ale receptorului
citoplasmatic
pentru 1,25-(OH)z-D:, care produc rahitism independent de vitamina D (tip II). ) Htperuita ndnoza D Dupa ingestia cronicd, oral5., a unor doze mari de vitamind D pot apare intoxicatii cu vitaminE D caracterizate prin anorexie, v5rshturi, diaree, astenie, mialgie, pierderi in greutate, hipercalcemie, hipercalciurie. Patologic are 1og calcifierea lesuturilor moi qi in special la nivel renal (nefroca-lcinoza),cornee, aortd, pldmdni, inimd.. Suprimarea
administrdrii
de vitamind" D, prin aplicarea unui
regim sdrac in Ca, produce o mobilizare lentd. a Ca din lesuturile moi qi revenirea la normal a calcemiei. Atunci cdnd nu este compromisi. grav, functia renali se normalizeazd,, IL2.3.
Vltaminele
E (tocoferolii, vitaminele
antisterilitdtii,
vitaminele de reproducere) Numele de tocoferol provine de la funclia biologicd de a favoriza fertilitatea (tokos - na$tere; phesein - a purta). Vitaminele E sunt un grup de vitamine - tocoferoli - formati dintr-un nucleu de croman substituit qi o catend lateral5" ramificati _ rtfll-
r02
cr,-Tocoferol Sunt patru tocoferoli importanli: d, p, T, 6 - care se diferenliazb. intre ei prin numdrul de grupiri metil din nucleul cromanic; proprietSlile vitaminice sunt proporlionale cu numSrul grupelor -CHs, deci o-tocoferolul va fi ce1mai activ biologic, avend trei grupdri metil, 5, 7, 8-trimetil tocol. Absorbtia vitaminelor intestinului
sublire,
in
E din a1imentalie are loc la nivelul
aceleagi condilii
ca qi celelalte vitamine
liposoiubile. De 1a intestin, pe cale limfaticd,
,tocoferolii trec in se,nge unde sunt vehiculali de p-lipoproteinele plasmatice, apoi sunt repartizafi in toate organele, depozitele fS.cAndu-sein lesutul adipos. Intracelular, vitaminele E se acumuleazd- in membranare
citoplasmatice
gi
mitocondriale
9i
fosfolipidele in
reticulul
endoplasmatic. Concentralia vitaminelor E in aceste organite este in funclie de aportul vitaminic, de peroxidanli, antioxidanfi, de seleniu alimentar gi de aportul de aminoacizi cu sulf. in procesele metabolice, tocoferolii sunt tralsformafi in compuqi chinonici, hidrochinonici care se elimind prin bild, 8Oo/o,iar restul prin urind, sub formd conjugatd cu acidul glicuronic. O E nol
biochimic.
Vitamina
E nu
are o functie
biologicd
specificd pentru a explica numeroasele consecinfe care apar in carenla de vitamind E la animalele de experien{5 (este vitamina in ceutarea unei boli). Acliunea qntioxidantd. Vitamina E este consideratd ce1mai / eficace antioxidant liposolubil nafural. Substanlele cele mai sensibile la peroxidare sunt
lipidele celulare gi lipidele
din membranele
103
organitelor
subcelulare,
dintre
Si
acestea in
special,
lipidele
nesaturate. Sub
acliunea
oxigenului
molecular,
acizii
polinesaturali
formeazS peroxizi lipidici prin peroxidare, proces autocatalitic, care se desfhgoard dup5. un mecanism radicalic, prin reaclii inldnfuite:
Initierc:
a-H
(QtL J9-qJJr,,. p. * H.
R'+ 02-
R-OO
Propagare:
R-H+ R-OO.-=+R_OOH
+ R.
intrerupere:
AH + R-OO.-->R-OOH
+ A
A' este un radical stabil, provenit din tocoferol, capabil sd inhibe propagarea reacfiilor radicalice in lanf din peroxidarea lipidicd..
cl- Tocoferol -->
,.CHz
Radical tocoferil putin reaotiv
Acliunea pentru
viala
antioxidantd
a vitaminei
celulei, intrucat
impreund
Tocoferil-chinond stabile
E are o importantd cu
mare
vitamina
C $i alti antioxidantri alimentari ar fi implicali in protejarea cdilor respiratorii qi mai ales a tesutului pulmonar de acliunea nocivd a aerului poluat (Os, NzO). Efectele nocive ale oxidanlilor pot fi ilustrate prin schema urmatoare:
I 104
Acizi gragipolinesaturatidin fosfolipidemembranare
I
AntioxldalF Ql @ Oxidanri (v{arruuE) (Fe2+, Cu2+,02) I Y Peroxizilipidici I
I v Degradarea acizilor gra;r din fosfolipidele membranare
/''
-''
--- _ r f^--.--. urobulero$u
I
t\ Reticul endoplasmatic
I
I Fragilitate_crescutil 5ihemolizn
I Pemreabilitate crescuE
Dezintegraxea struch.uilornecesare acliriii enzimelorprezente la acestnivel
| I Eliberareaenzimelor hidrolitice { Modificiri la nivel tisular
I n"ctivareaenzimelor
eE 2-
T:ulb:uteri de aport vltaminlc E --' gilooltatnlftoza Efectele carenlei de vitamind
E sau hipovitaminozei E se
manifestd gradat $i progresiv in funclie vitaminic.
de perioada de deficit
Semnele deficienfei de vitamind. E la om se manifesti paralel cu perturbarile absorbliei de grdsimi qi constau in: slhbiciune musculare, fragilitate
eritrocitarS., fenomene care dispar
prin
administrarea
vitaminei E. Independent de gradul de alterare a lipidelor, la animale, s-au evidenfiat tulburdri a1ecapacitdlii de reproducere la ambele sexe.
105
Nu sunt dovezi care se ateste cd vitamina E, la om, este necesard pentru fertilitate. Totugi, sunt unele date conform cd.rora concentraga sanguina de tocoferoli cre$te progresiv in sarcin5 p6ld la 50-100% sau chiar mai mult in ultima lund fald de primul trimestru de sarcind. Aceasta constituie o condifie pentru evolu{ia qi dezvoltarea lhtului.
Revenirea la valori normale se face in primele 2_5 tuni de la na$tere, insd concentratlia ei creqte in lapte. La femeiie cu avort habitual, concentratia tocoferolului in s6'ge este de 2_4 ori mai sc6zut decAt la femeile cu sarcind normald. ) Elpteruttannlnoza Administrarea duce la involulia
E
indelungati
gi abuzivd de vitamind
ovarelor, tulburdri
E, Ia om.
nervoase qi dureri ale membrelor
inferioare.
II.2.4. Vitaminele K (Fllochlnona) si rolul lor coenzimafic Grupul vitaminelor K (Filochinona, vitamina coaguldrii, vitamina
antihemoragicd,
factor
protrombinic)
sunt
derivafi
de
nafiochinond care la Cs conlin.sau nu un radical variabil de atomi de carbon.
R=
"rr"*oxlt"-,"r,-"",-lxlcHr3-H fin]l
R=
cH" t-
(CH'{H{_CH,-H dihmesil
Vitamina Kr (filochinona) are la Cs un larlt lateral de litit (20 atomi de carbon). Vitamina
I{z (farnochinona)
atomi de carbon).
conline un radical
difarnesil
{30
I 106
Vitamina IG (menadiona) - in care radicalul R este H, este sinteticd qi este solubild in apd spre deosebire de Kr Si Kz. Vitamina K este produsd in intestin de bacterii intestinale sau adusd prin aport alimentar. Absorblia vitaminelor Kr qi Kz (natura-1e)se face impreuna cu lipidele, apoi pe cale limfaticd trec in se,ngeqi de aici in ficat. Cea mai mare cantitate a vitaminelor K naturale se depoziteazd temporar in Iicat; vitaminele K sintetice frind solubile se absorb in absenla sdrurilor biliare. Ele nu se acumuleazi, excesul find eliminat prin glucurono- sau sulfo-conjugare. e ,.Y Rohtl metabolic al vitaminei K Principalul ro1 al vitaminei K este in modificarea post transcripfionali a unor proteine in principal a factorilor coagulirii, unde in calitate de coenzirrrd,participi,la 1-carboxilarea unor resturi glutamil prezente in aceste proteine.
I.
Proteinele coaguldrii: protrornbina
(factorul iI), proconvertina
(factorul VII), factorul Christmas (factorul IX), factorul Stuart (factorul X), sunt sintetizate in ficat sub formd de precursori inactivi (zimogeni). Pentru ca aceqti factori sd fie transformali in formele biologic active este necesard carboxilarea posttranscdplionald a resturilor glutamil, din precursori, la acid 1.- carboxi glutamic, carboxilare catalizate de vita-rnina K.
qoo-
-OOCI
I
CH,,
t-
CH,
I-c-cH-NlF ll
o
Glu Acid glutamic
co,
I
_--:________-__>
VitaminaK
TCOOCH /alrr'
i _C-CH_NIF
tl o Gla Acid T-carboxi-glutamic
Resturile carboxil au o mare capacitate de chelatare a ionilor de Ca2* care servesc la legarea fosfolipidelor cu protrombina interacliune
107
specifice pentru activarea protrombinei la trombina, factorul activ al coaguiSrii (fig 28).
Fig 28. Rolul vitaminei K in coagulare. precursorii factorilor coagderii sunt sinteti"ali in formi inactivd, caractirizatn de prezenla .*Li- g*pa.i carboxil. Ei sufere procesul de activare sub acliunea ,iil;"i K, conste in ;;!"" -pr*i.riu"""to, introducerea_unei g.upari carboll. !,,ffi-*i".". ""r" doue grupari carboxil (incdrcate nesativl in pozilie adiacentd, fi*;;;; u5urinta ionii Ca2*, ducr6nd la formarea lomolexului protromUinJcJcif*ii*sange. Acesta leage fosfolipidele de pe suprafal-a plachetilor, in p"-"""r.,t de coagulare "*pa-;;H;
Antivitaminele
K, dicumarolul
Si warfarina (derivali cumarinici) inhibd reaclia de carboxilare.a acidului glutamic $t sunt folosili ca agenti anticoagulanli atunci cAnd existd primejdia coaguErii sAngelui la nivelul vaselor sanguine (tromboze). o T\rlburiri de aport wltaminic Carenla de vitamind
K se instaleazd cand existd. tulburdri in absorbtia de lipide (deficit de bild), afecliuni intestinale, alterarea florei intestinale, afecliuni hepatice, boli infeclioase. Careanla
de vitamind
K duce la scdderea protrombinei. prelungirea timpului de coagulare Si aparilia de fenomene hemoragice spontane. in perioada imediat postnatale, nou n5sculii sunt predispugi la hemoragii deoarece se nasc f6r1. rezewe de vitamind K, av6nd intestinul sterii.