DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE UNA ENZIMA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL CURSO: BIOTECNOLIGIA DE LOS P.A.I.

TEMA:

DETERMINACIÓN

DE

LOS

PARÁMETROS

CINÉTICOS DE UNA ENZIMA

INTEGRANTES:



MEDINA GARCIA, SANDRA ANNA LUCY



MINCHOLA GUTIERREZ, ROSMER EDGAR



VILLANUEVA CHUNQUE, YONEL GABRIEL

CICLO: IX

TRUJILLO – PERÚ 2011

DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE UNA ENZIMA

I. INTRODUCCIÓN En los diversos compartimientos celulares transcurre un gran número de reacciones químicas que proporcionan a la célula energía y los componentes necesarios para su mantenimiento. Las reacciones químicas en los sistemas biológicos sólo ocurren en presencia de catalizadores, que son proteínas específicas denominadas enzimas. La presencia de una enzima se detecta por las reacciones específicas que cataliza. Toda reacción enzimática puede esquematizarse como sigue:

La velocidad de una reacción catalizada por un enzima depende de 1. la concentración de moléculas de sustrato [S] 2. la temperatura 3. la presencia de inhibidores 4. pH del medio, que afecta a la conformación (estructura espacial) de la molécula enzimática

II.

OBJETIVOS Conocer los parámetros de la actividad enzimática Observar el comportamiento de una reacción enzimática en un extracto crudo vegetal. Determinar la Vm y Km de la enzima extraída de papaya

III. MARCO TEORICO Modelo de Lineweaber-Burk La ecuación Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que son mas útiles para la expresión de los datos experimentales. Una de las transformaciones se obtiene tomando los dobles reciprocos de ambos miembros de la ecuación de MichaelisMenten

Ecuación de Lineweaber-Burk 

Determinación de las constantes de Lineweaber-Burk La representación grafica de este modelo permite identificar la Km y Vmax; el punto de corte ciob el eje de ordenadasd es equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas es el valor de -1/Km. Tal representación doble-recioprica tiene la ventaja de que permite una determinación mucho mas exacta del valor Vmax ya que las representación sencilla de Vo frente a la concentración del sustrato en la curva de Michaelis Menten solo se obtiene por su valor aproximado puesto que es un valor limite a una concentración del sustrato infinita.

Figura 1. Representacion de la doble reciproca de la velocidad de reaccion

Modelo de Eadie-Hofsteen Ota aplicación útil de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene multiplicando ambos miembros de la ecuación Lineweaber-Burl por V y reordenándola se obtiene la ecuación de Eadie-Hofsteen

Ecuación de Eadie-Hofsteen

Determinación de constantes de Eadie-Hofsteen La representación de Vo frente a Vo/[S] se conoce como la representación de EadieHofsteen. Donde Vo representa la velocidad de la reacción, Km es la constante de Michaelis- Menten.

Figura 2. Representación grafica de la velocidad de reacción y constantes de Vmax y Km de Eadie-Hofsteen. Este diagrama permite visualizar rápidamente los parámetros cinéticos importantes como Km y Vmax a la vez que esta menos afectada por el margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burke, debido a que asigna el mismo peso a todos los puntos para cualquier rango de concentración del sustrato o de la velocidad de reacción.

IV. RESULTADOS 1. DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN Tabla N°01: Valores de absorbancia y concentración de almidón Tubos

Componentes Sustrato de almidón Agua deshidratada HCl 0.1 N Solución Yodada Absorbancia mg de Almidón

B 0

1 0.5

2 1

3 1.5

4 2

5 2.5

3 2.5 0.1 0 0

2.5 2.5 0.1 0.295 0.2

2 2.5 0.1 0.621 0.4

1.5 2.5 0.1 0.884 0.6

1 2.5 0.1 1.067 0.8

0.5 2.5 0.1 1.484 1

Curva de Calibracion 1.6 1.4 y = 1.4434x R² = 0.9919

1.2 1    S    B 0.8    A

0.6 0.4 0.2 0 0

0.2

0.4

0.6 0.8 mg/ml Almidon

1

1.2

Figura N°01: Curva de calibración del almidón

2. DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE MICHAELIS MENTEN (Km y Vmáx) Muestra: Papaya Tabla N°02: Valores de Absorbancia, almidón residual y velocidad. TUBO

ABS

C

mg de Almidón

Almidón residual

Almidón hidrolizado

Blanco * Problema1

0 0.073

0 0.073

0 0.2

0 0.05057503

0 0.14942497

Problema2 Problema3 Problema4 Problema5

0.143 0.144 0.316 0.574

0.143 0.144 0.316 0.574

0.4 0.6 0.8 1

0.09907164 0.09976445 0.21892753 0.39767216

0.30092836 0.50023555 0.58107247 0.60232784

Tabla N°03: Valores de velocidad y de cantidad de sustrato inicial, residual e hidrolizado TUBO

ABS

C

mg de Almidón

Almidón residual

Almidón hidrolizado

USC (0.1ml)

USC (100ml)

Blanco * Problema1

0 0.073

0 0.073

0 0.2

0 0.05057503

0 0.14942497

0.00747125

7.47124844

Problema2 Problema3 Problema4 Problema5

0.143 0.144 0.316 0.574

0.143 0.144 0.316 0.574

0.4 0.6 0.8 1

0.09907164 0.09976445 0.21892753 0.39767216

0.30092836 0.50023555 0.58107247 0.60232784

0.01504642 0.02501178 0.02905362 0.03011639

15.0464182 25.0117777 29.0536234 30.1163919

2.1)

REPRESENTACIÓN DE MICHAELIS MENTEN 0.045

Vm=0.0416

0.04 0.035 0.03

Vmax/2=0.0208

0.025

y = -0.0237x 2 + 0.0653x R² = 0.9838

   V

0.02 0.015 0.01 0.005

Km=0.36 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

S

Figura N°02: Diagrama de velocidad de reacción y constante de Michaelis-Menten

Tabla N°04: Valores de los parámetros de Michaelis Menten y valor de R 2 Vmax Vmax/2 Km R2

0.0416 0.0208 0.36 0.9838

2.2)

REPRESENTACIÓN DE LINEWEAVER  –  BURK Tabla N°05: Valores de cantidad de sustrato, velocidad y de sus respectivas inversas

[S]inicial (mg./ml.) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

PAPAYA Veloc. (mg./min) 0 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189

1/S

1/V

5 2.5 1.666666667 1.25 1

100.3848294 49.84575007 29.98587336 25.81433613 24.90338164

Representación de Lineweaver - Burk 120 100    V     /    1

y = 20.051x R² = 0.9912

80 60 40 20 0 0

2

4

6

1/S

Figura N°03: representación de Lineweaver – Burk 

Tabla N°06: Valores de Vmáx, Km y R 2 1/V=(Km/Vmáx)x(1/S)+(1/Vmáx) y = 19.614x + 1.4007 19.614 14.0029985 Km/Vmáx Km 1.4007 0.71392875 1/Vmáx Vmáx 0.9919 R2

2.3)

REPRESENTACIÓN DE EADIE HOFSTEE V/S = Vmáx/Km - (1/Km)*V Tabla N°07: Valores de cantidad de sustrato, velocidad y de velocidad/sustrato [S]inicial (mg./ml.) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

PAPAYA Veloc (mg./min) 0 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189

V/S

V

0.04980832 0.05015473 0.05558173 0.04842271 0.04015519

0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189

Representación de Eadie - Hofstee 0.06 y = -0.15x + 0.0531 R² = 0.1235

0.05 0.04

Series1

   S     / 0.03    V

0.02 0.01 0 0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

V

Figura N°04: Representación de de Eadie Hofstee

Tabla N°08: Valores de Vmáx, Km y R 2 V/S= Vmáx/Km - (1/Km)*V y = -0.15x + 0.0531 0.0531 Vmáx/Km 0.15 1/Km 0.354 Vmáx 6.666666667 Km 2 0.1235 R

2.4)

REPRESENTACIÓN DE LANGMUIR S/V = Km/Vmáx + S*(1/Vmáx)

Tabla N°09: Valores de cantidad de sustrato, velocidad y de sustrato/velocidad [S]inicial (mg./ml.) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

PAPAYA Veloc (mg./min)

S/V

S

0 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189

20.07696588 19.93830003 17.99152402 20.6514689 24.90338164

0.2 0.4 0.6 0.8 1

Representación de Langmuir 30 25

y = 5.183x + 17.603 R² = 0.4137

20    V     / 15    S

Series1

10 5 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

S

Figura N°05: representación de Langmuir

Tabla N°10: Valores de Vmáx, Km y R 2 S/v=(Km/Vmáx)+S*(1/Vmáx) y = 5.183x + 17.603 17.603 Km/Vmáx 5.183 1/Vmáx 0.192938453 Vmáx 3.396295582 Km 2 0.4137 R

1.2

2.5)

REPRESENTACIÓN LINEAL DIRECTA Tabla N°11: Valores de la cantidad de sustrato y velocidad PAPAYA [S]inicial (mg./ml.) 0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1

Veloc. (mg./min) 0 0.0100 0.0201 0.0333 0.0387 0.0402

0.2 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1    V

0.08 0.06 0.04 0.02 0

-1

-0.5

-0.02

0

0.5

1

1.5 S

2

2.5

3

3.5

Figura N°06: Representación lineal directa -De la figura N°06, se obtienen los valores de Km y Vmáx de la siguiente manera:

Promedio Km=1.29 Vmax=0.0924

Km

Vmax

0.15 0.45 0.7 2 3.15 1.29

0.048 0.056 0.072 0.12 0.166 0.0924

4

Tabla N°12: Cuadro comparativo de los resultados finales REPRESENTACIÓN MICHAELIS MENTEN LINEWEAVER BURK EADIE HOFSTEE LANGMUIR LINEAL DIRECTA

3.

Vmáx

Km

R2

0.0416

0.36

0.9838

0.71392875

14.0029985

0.9919

0.354 2.82485876 0.98359688

6.66666667 3.39629558 6.10649019

0.1235 0.4137 -

DISCUSIONES

-La cinética de las enzimas se estudia usualmente observando las velocidades de reacción para evitar así los problemas relacionados con la inhibición por producto y con cualquier cambio de pH que pueda haber como resultado de la reacción. Esta metodología hace uso de métodos espectrofotométricos de gran rapidez . (Atkinson, 2002)

-Un inconveniente de la representación Lineal directa podría dar la dificultad de detectar las desviaciones del comportamiento de michaelis menten. La representación lineal es un método relativamente insensible a las lecturas erróneas individuales que se encuentran lejos de los valores correctos. Este método se recomienda para aquellas enzimas que se conoce que obedecen a una cinética de michaelis menten. (Doran, 1998). -Los valores de los parámetros biotecnicos obtenidos mediante la representación de langmuir son los más próximos a los de la regresión lineal, lo que indica la mayor eficacia de esta representación frente a las otras dos. ( Izquierdo,

2004)

-En los métodos utilizados podemos notar como el Km va tomando valores relativamente bajos dependiendo del método de linealizacion realizado, esto demuestra la alta afinidad de la enzima extraída de la papaya, por su sustrato de almidón. Ya que a una baja concentración de almidón, se vio solo la mitad de la velocidad máxima de la enzima.

(Doran, 1998)

-En el laboratorio trabajamos con un sustrato la cual a una velocidad máxima no puede ser medido con exactitud, a pesar de ello nos sirvió de parámetro la concentración de sustrato conocida como constante de Michaelis-Menten (Km) a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima.

(Nelson, 2000)

-Valores bajos de la constante Michaelis-Menten (Km) indican que el complejo ES está unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto. Para nuestro caso el valor de Km fue bajo (0.36), lo que indica que existe una unión muy fuerte del complejo enzima-sustrato (ES) por el sustrato.

4.

(Nelson, 2000)

CONCLUSIONES

-Se trabajó con los respectivos parámetros que determinan la velocidad enzimática aplicando graficas tales como las de cinética enzimática de Michaelis Menten (Vmax y Km) y se las pudo comparar con los obtenidos por las representaciones Lineweaver  – Burk, Eadie Hofstee, Langmuir y Lineal Directa

5.

BIBLIOGRAFÍA

-Atkinson B., REACTORES BIOQUIMICOS, Editorial reverte, 2002. -Izquierdo Felipe y col., PROBLEMAS RESUELTOS DE CINETICA DE LAS REACCIONES QUIMICAS,Ediciones de la universidad de Barcelona, 2004. - DORAN, P. 1998. “Principios de Ingeniería de los bioprocesos”. Editorial acribia SA. Zaragoza (España). -Nelson, D.L., Cox, M.M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry.(3 Ed.). Worth Publishers. New York