apostila microbiologia

Apostila de Microbiologia Geral (MIG)

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Importância dos microrganismos para os homens Nós vivemos em um universo microbiano. A cada respiração, milhares de microrganismos penetram no nosso organismo. Um simples punhado de solo rico pode conter bilhões de microrganismos. A grande maioria dos microrganismos beneficia os homens, reciclando os elementos da vida, produzindo muito alimentos, produtos industrializados e servindo de ferramentas para pesquisas. Outros microrganismos são causadores de doenças. Ao longo dos séculos, os costumes sociais e as tradições levaram as pessoas a aceitar e gostar de alguns alimentos produzidos por microrganismos. Por meio do processo de fermentação, os microrganismos podem transformar os constituintes orgânicos contidos nos alimentos. Por exemplo, as bactérias que existem naturalmente em pepinos multiplicam-se dentro deles e digerem parte do tecido do fruto, transformando-o em saborosos picles. Os salames resultam do crescimento microbiano que ocorrem na carne e nos temperos. São chamados de embutidos fermentados. Diferentes tipos de salames podem ser produzidos, dependendo dos tipos de carne e de temperos utilizados e do microrganismo capaz de alterar os componentes químicos da carne. Para preparar pães e rocamboles, o padeiro inclui, na massa, leveduras que metabolizarão os carboidratos, formando dióxido de carbono (CO 2), o que fará a massa crescer. Muitos produtos derivados de leite são produzidos a partir da atividade metabólica de microrganismos. Por exemplo, o queijo é feito a partir do aquecimento do leite, adição de enzimas para coagular as proteínas do leite e uma combinação de bactérias ou fungos. Durante o processo de maturação, os microrganismos produzem compostos químicos que conferem sabores diferentes aos vários tipos de queijos. Por exemplo, o sabor do queijo cheddar é originado pelos ácidos produzidos pelos lactobacilos e pelos estreptococos que crescem no coalho maduro. O iogurte é um tipo de leite no qual bactérias produziram ácidos a partir do açúcar do leite. Os microrganismos são os grandes recicladores dos elementos da natureza. Algumas bactérias, por exemplo, liberam nitrogênio a partir de resíduos animais. Outros microrganismos crescem nas raízes de plantas leguminosas, trazendo o nitrogênio de volta para o ciclo da vida e usando-o na formação de compostos orgânicos. Esses compostos são liberados no solo, onde são reutilizados como nutrientes por diversas plantas como as leguminosas (ervilha e feijão). Os microrganismos têm também emergido como novas fontes de produtos e processos para o benefício da sociedade. A gama de produtos industriais de origem microbiana é grande e inclui diversos produtos, como perfumes e antibióticos como a penicilina. Outro exemplo é a aplicação de uma protease (enzima) bacteriana na remoção de fragmentos de matéria orgânica da pele dos animais durante a manufatura do couro. Algumas bactérias produzem enzimas que aceleram a transformação de compostos orgânicos. Por exemplo, a enzima pectinase decompõe as fibras de pectina, que ligam as fibras de celulose nas plantas. Uma vez dissolvida a pectina, a celulose pode ser usada para fazer o linho. Outras bactérias são empregadas na produção de enzimas para gerar o amido, utilizado durante a produção do papel. Muitos microrganismos são usados para o estudo de processos vitais, como modelos e instrumentos de pesquisa em laboratórios. Isso é possível porque os processos químicos dos microrganismos são similares aos de outras formas de organismos vivos. Usando uma técnica chamada de engenharia genética, genes de outros organismos são inseridos em bactérias. Esta técnica é capaz de programar uma bactéria com informações genéticas que a tornam capaz de produzir determinada substância química, como a insulina humana. A insulina é um hormônio que garante o funcionamento da máquina metabólica do corpo e, assim, é essencial para a vida. Quando o diabetes mellitus se instala no jovem, o hormônio existe em quantidades muito pequenas. Durante anos, somente a insulina bovina, extraída do pâncreas de bezerro, era disponível para o tratamento do diabetes, e alguns pacientes não podiam utilizá-la. Hoje, a insulina produzida em quantidades ilimitadas por bactérias transformadas por engenharia genética pode ser ministrada para restabelecer os níveis do hormônio no corpo. Os microrganismos têm um grande potencial para ajudar na limpeza do ambiente: da decomposição de componentes de petróleo em derramamento de óleos à decomposição de herbicidas e inseticidas usados na agricultura. Além disso, muitos microrganismos têm sido utilizados como agentes biológicos, ao invés de defensivos químicos, para o controle de pragas. Apesar de todos os benefícios relatados, ao longo da história, os microrganismos têm sido

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associados somente a agentes causadores de doenças. Somente uma minoria dos microrganismos é patogênica (causadora de doenças), mas o conhecimento prático sobre eles é de extrema importância para o desenvolvimento da medicina. Vale ressaltar que quando transmitidos de uma pessoa para outra, alguns microrganismos são responsáveis por doenças como peste, catapora, febre tifóide, sífilis e SIDA (AIDS). Além disso, os microrganismos são associados frequentemente a infecções desagradáveis (exemplo: doença que ocorre no pé, causada por um fungo e chamada de pé-de-atleta), ou a inconveniências mais comuns, como comida estragada. À medida que ler sobre os microrganismos, você aprenderá a apreciar o mundo frequentemente invisível de bactérias, algas, fungos, protozoários e vírus! Atividade em equipe: Os microrganismos têm sido utilizados pelo homem em diferentes processos e de diferentes maneiras. Debata com seus colegas do grupo e descreva no mínimo três aplicações de microrganismos diferentes das citadas no texto.

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Introdução à Microbiologia O que você pensa quando ouve as palavras germe e micróbio? Pequenas criaturas que causam MAL e não se encaixam em nenhuma categoria da divisão: animal, vegetal ou mineral. Os micróbios, também chamados de microrganismos, são minúsculos seres vivos, individualmente muito pequenos para serem vistos a olho nu. O grupo inclui bactérias, fungos (leveduras e mofos), protozoários e algas microscópicas. Também inclui vírus, os quais são acelulares, muitas vezes considerados como sendo o limite entre seres vivos e não-vivos. Você será apresentado a cada um desses grupos no decorrer das aulas. Microbiologia é o estudo de organismos microscópicos. Esse nome deriva de três palavras gregas: mikros (“pequeno”), bios (“vida”) e logos (“ciência”). Assim, microbiologia significa o estudo da vida microscópica. Os cientistas deduziram que os microrganismos originaram-se aproximadamente há quatro bilhões de anos, a partir de um material orgânico complexo em águas oceânicas, ou possivelmente de nuvens que circundavam nossa primitiva Terra. Como os primeiros indícios de vida na Terra, os microrganismos são considerados ancestrais de todas as outras formas de vida. Embora os microrganismos sejam antigos, a microbiologia é uma ciência jovem. Pesquisadores observaram microrganismos pela primeira vez somente há 300 anos e eles foram pouco compreendidos durante muitos anos após sua descoberta. Existe um período de quase 200 anos entre as primeiras observações até o reconhecimento de sua importância. Em meio a muitas tentativas científicas de se obter novos conhecimentos sobre microrganismos, algumas merecem ser mencionadas por terem contribuído mais intensamente ao reconhecimento da microbiologia como ciência. A primeira delas surgiu na segunda metade do século XIX, quando os cientistas provaram que os microrganismos originaram-se de pais iguais a eles próprios e não de causas sobrenaturais ou de plantas e animais em putrefação. Mais tarde, os cientistas provaram que os microrganismos não são o resultado, mas sim a causa dos processos fermentativos no suco de uva para a produção de vinho. Eles também descobriram que um tipo específico de microrganismo causa uma doença específica. Estas informações foram o início do reconhecimento e da compreensão da influência destas “novas” formas de vida sobre a saúde e o bem-estar do homem. Durante o início do século XX, os microbiologistas aprenderam que os microrganismos são capazes de realizar muitas reações químicas, que envolvem a quebra de substâncias e a síntese de novos compostos. Igualmente importante foi a observação de que o mecanismo pelo qual as reações químicas são produzidas pelos microrganismos é muito semelhante àquele que ocorre em formas de vida superiores. Durante as últimas décadas, os microrganismos têm surgido como parte do eixo principal das ciências biológicas. Entre as razões para isto, está o conceito de “unidade em bioquímica”, que significa que muitos dos processos bioquímicos que ocorrem em microrganismos são essencialmente os mesmos em todas as formas de vida, inclusive o homem. Além disso, toda a informação genética de todos os organismos, dos microrganismos a seres humanos, é codificada pelo DNA. Em virtude da relativa simplicidade em realizar experimentos com microrganismos, associada à rápida velocidade de crescimento e de sua variedade de atividades bioquímicas, os microrganismos tornaram-se o modelo experimental de escolha para o estudo da genética e de fenômenos biológicos fundamentais. Para compreender o atual estágio da ciência da microbiologia, precisamos conhecer como ela chegou até onde estamos atualmente. A descoberta do mundo microbiano inclui histórias sobre orgulho, nacionalismo, clamor público para curas e questões sobre ética. Os primeiros cientistas que optaram por estudar microbiologia foram motivados, no decorrer de suas descobertas, por competição, inspiração e sorte. Houve conceitos errôneos que levaram a verdade, e verdades que não foram inicialmente reconhecidas. Tudo começou com indivíduos fascinados pelo que os outros não podiam ver...

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Uma breve história da Microbiologia A ciência da microbiologia iniciou há apenas algumas centenas de anos. Na verdade, os ancestrais das bactérias foram os primeiros seres vivos na Terra. As primeiras observações Uma das descobertas mais importantes na história da biologia. 1. Robert Hooke observou em um microscópio extremamente simples que amostras de cortiça eram compostas de “pequenas caixas”; ele introduziu o conceito de célula (1665). Eram as menores unidades vivas.

2. As observações de Hooke marcaram o início da teoria celular, o conceito de que todas as coisas vivas são compostas por células. Ele não tinha técnicas de coloração, por isso só viu as células e não conseguiu visualizar claramente os micróbios. 3. Antoni van Leeuwenhoek, utilizando um microscópio muito simples, foi o primeiro a observar os microrganismos vivos através de lentes de aumento (1673). Ele os chamava de animálculos. Ele fez desenhos detalhados dos animálculos de água de chuva, em líquido do qual grãos de pimenta foram submersos e no material removido de seus dentes. Eram representações de bactérias e protozoários.

O debate sobre a Geração Espontânea Após van Leuwenhoek descobrir o mundo dos microrganismos “invisíveis”, o interesse da comunidade científica voltou-se para a origem dessas minúsculas coisas vivas. Até a segunda metade do século XIX muitos cientistas acreditavam que algumas formas de vida poderiam aparecer espontaneamente da matéria morta, eles chamavam de geração espontânea. Há pouco mais de 100 anos, as pessoas facilmente acreditavam que sapos, cobras e camundongos poderiam nascer de solos úmidos; que moscas poderiam emergir do estrume; e que larvas de insetos e larvas de moscas poderiam surgir a partir de corpos em decomposição. 1. Até a metade de 1880, muitas pessoas acreditavam na geração espontânea, a ideia de que os organismos vivos poderiam surgir a partir da matéria não-viva. 2. Um forte oponente à geração espontânea Francesco Redi demonstrou que larvas de insetos surgiam na carne em decomposição somente quando moscas depositavam seus ovos sobre a carne (1668). Encheu 3 jarras com carne em decomposição e lacrou-as fortemente. Fez o mesmo com outras 3 jarras e deixando-as abertas. As larvas apareceram nas jarras abertas, após moscas entrarem nessas jarras e depositarem seus ovos, mas o conteúdo dentro das jarras lacradas não apresentou sinal de larvas.

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Antagonistas não se convenceram, eles argumentaram que o ar fresco era necessário para a geração espontânea. Iniciou novo experimento, 3 jarras foram cobertas com uma fina rede, ao invés de serem lacradas. Nenhuma larva apareceu nas jarras, embora ar fresco estivesse presente. As larvas apareciam somente se fosse permitido que moscas deixassem seus ovos sobre a carne. Foi um forte golpe mas muitos cientistas ainda acreditavam que pequenos organismos como os animálculos, eram suficientemente simples para serem gerados a partir de materiais não-vivos. 3. A favor da geração espontânea Jonh Needham declarou que os microrganismos poderiam aparecer espontaneamente em caldos nutrientes fervidos (1745). Ele descobriu que, mesmo após aquecer caldos nutrientes (caldo de galinha ou milho) antes de colocá-los em frascos cobertos, a solução resfriada era logo abundantemente ocupada por microrganismos que desenvolviam-se espontaneamente a partir de caldos.

4. 20 anos depois... Lazzaro Spallanzani repetiu os experimentos de Needham e sugeriu que os resultados de Needham eram devido aos microrganismos presentes no ar, que entravam em contato com o meio nutriente (com os caldos nutrientes após eles terem sido fervidos) (1765). Ele mostrou que os caldos nutrientes aquecidos, após terem sido primeiramente lacrados em um frasco, não desenvolviam crescimento microbiano.

Needham respondeu que a “força vital” necessária para a geração espontânea tinha sido destruída pelo calor e foi mantida fora dos frascos pelos lacres. A força vital recebeu mais crédito quando Laurent Lavoisier mostrou a importância do oxigênio para a vida. Criticaram que não havia oxigênio suficiente nos frascos lacrados de Spallanzani para sustentar a vida mirobiana. 5. Contra a abiogênese: Franz Schulze (1815-1873) e Theodor Schwann (1810-1882) 60 a 70 anos depois: realizaram experiências onde aeraram infusões fervidas, fazendo o ar atravessar soluções ácidas (Schulze), e outra que forçava o ar através de tubos aquecidos ao rubro (Schwann). Os defensores da geração espontânea não se convenciam. Em nenhum dos casos surgiram microrganismos mas eles argumentavam que o ácido e o calor alteravam o ar, fazendo com que o meio não permitisse o crescimento.

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6. Contrário a abiogênese: Schröeder e Von Dush (1850) – Tamponação com algodão. Realizaram experiência semelhante a anterior, fazendo o ar passar por um algodão para os frascos que tinham o ar aquecido. As bactérias foram retidas no algodão (filtro) e não houve crescimento de microrganismos no caldo. Nascia a técnica de fechar os tubos de ensaio e erlenmeyers com tampões de algodão. 7. A questão ainda estava sem solução quando Rudolf Virchow introduziu o conceito da biogênese: células vivas somente podem surgir a partir de células preexistentes (1858). Os argumentos sobre a geração espontânea continuaram até 1861 quando a questão foi resolvida por Louis Pasteur. 8. Louis Pasteur demonstrou que os microrganismos estão presentes no ar e em todos os lugares e ofereceu provas para a teoria da biogênese (1861). Afirmou que os microrganismos podiam contaminar soluções estéreis, embora o próprio ar por si só não criasse micróbios. Ele encheu vários frascos, que continham a extremidade da abertura no formato de um pescoço curto, com caldo de carne e ferveu seus conteúdos. Alguns deles, ele deixou que esfriassem abertos. Em poucos dias estes frascos estavam contaminados com micróbios. Os outros frascos, lacrados após fervura, estavam livres de microrganismos. Concluiu que os micróbios do ar eram os responsáveis pela contaminação da matéria não-viva, assim como os caldos nos frascos de Needham. A seguir, colocou meio de cultura em frascos com a extremidade da abertura no formato de um pescoço longo na forma da letra S. O conteúdo dos frascos foi fervido e resfriado. O meio de cultura nos frascos não apodreceu e nem mostrou sinais de vida, mesmo após meses. O modelo criado por Pasteur permitia que o ar entrasse no frasco, mas o pescoço curvado prendia qualquer microrganismo presente no ar e que pudesse contaminar o meio.

Alguns frascos originais, que foram lacrados mais tarde, estão no Instituto Pasteur – Paris, e ainda hoje não demonstram sinal de contaminação. Pasteur demonstrou que os microrganismos podem estar na matéria não-viva – sobre sólidos, dentro de líquidos e no ar. Ele demonstrou que a vida microbiana pode ser destruída pelo calor e que podem ser elaborados métodos para impedir o acesso dos microrganismos presentes no ar aos ambientes nutrientes. 9. As descobertas de Pasteur levaram ao desenvolvimento de técnicas de assepsia, utilizadas em laboratórios e nos procedimentos médicos para prevenir a contaminação pelos microrganismos não desejados. Os cientistas agora acreditavam que uma forma de geração espontânea provavelmente ocorreu na Terra primitiva, quando surgiu a primeira vida, mas que isso não aconteceu sob as condições ambientais atuais.

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A Idade de Ouro da Microbiologia 1. Os rápidos avanços na ciência da microbiologia foram obtidos entre 1857 e 1914. Chamada de Idade de Ouro. Rápidos avanços liderados por Pasteur e Robert Koch levaram ao estabelecimento da microbiologia como uma ciência. Os microbiologistas estudaram as atividades químicas dos microrganismos, aperfeiçoaram técnicas de microscopia e de cultivo dos microrganismos e desenvolveram vacinas e técnicas cirúrgicas. Fermentação e Pasteurização Etapa fundamental que estabeleceu relação entre microrganismos e doenças, ocorreu quando um grupo de mercadores franceses pediu que Pasteur descobrisse porque os vinhos e cervejas azedavam. Eles queriam impedir a deterioração destas bebidas quando elas eram enviadas a longas distâncias. Muitos cientistas acreditavam que o ar convertia o açúcares desses fluidos em álcool. 1. Pasteur descobriu que microrganismos chamados as leveduras fermentavam o açúcar a álcool (convertiam na ausência de ar). Esse processo é chamado fermentação e é usado na produção de vinho e cerveja. O azedamento e a danificação são causados por microrganismos diferentes, as bactérias e que as bactérias podem oxidar o álcool a ácido acético. 2. A solução de Pasteur foi aquecer o vinho e a cerveja o suficiente para matar a maioria das bactérias que causavam o estrago. Um processo de aquecimento, denominado pasteurização, é utilizado para matar bactérias em algumas bebidas alcoólicas e no leite. A relação entre danificação de comidas e microrganismos foi o passo mais importante para estabelecer a relação entre doenças e micróbios. A teoria do germe da doença A relação entre doenças e micróbios era desconhecida até relativamente pouco tempo. Antes disso, tratamentos efetivos para muitas doenças eram descobertos por tentativa e erro, mas as causas das doenças era desconhecidas. Essa relação alertou os cientistas para a possibilidade dos microrganismos terem relação semelhante com plantas e animais – especificamente causando doenças. Essa ideia foi chamada de Teoria do Germe da Doença. Teoria difícil de acreditar porque muitos acreditavam que a doença era uma punição para crimes ou pecados individuais ou por demônios. 1. Agostino Bassi (1835) provou que uma doença do bicho-da-seda era causada por um fungo e Pasteur (1865) provou que outra doença do bicho-da-seda era causada por um protozoário e desenvolveu método para identificar as larvas do bicho-da-seda que estavam contaminadas mostraram uma forte relação entre os microrganismos e as doenças. 2. Joseph Lister introduziu o uso de um desinfetante para a limpeza das roupas cirúrgicas, a fim de controlar as infecções nas pessoas (década de 1860). Era um cirurgião e aplicou essa teoria nos procedimentos médicos, que naquela época não desinfetavam as mãos e transmitiam infecções (febre às crianças recém-nascidas) de um paciente a outro. Conheceu trabalhos de Pasteur. Desinfetantes não eram usados mas Lister sabia que o fenol matava bactérias e começou a tratar ferimentos cirúrgicos com solução de fenol. Isso reduziu as infecções e as mortes e outros cirurgiões adotaram o procedimento. Seus estudos provaram que microrganismos são a causa das infecções cirúrgicas. 3. Robert Koch provou que os microrganismos causam doenças. Ele utilizou uma série de procedimentos, chamados de postulados de Koch (1876), que são utilizados até hoje para provar que um determinado microrganismo causa uma determinada doença. Era médico e rival de Pasteur na disputa para descobrir a causa do antraz (carbúnculo) que destruía rebanhos de gado e ovelha na Europa. Koch descobriu uma bactéria em forma de bastão (Bacillus anthracis) no sangue do gado que morrera de antraz. Ele cultivou a bactéria em meio nutriente e depois injetou amostras da cultura em animais sadios. Quando esses animais adoeceram e morreram ele isolou a bactéria de seus sangues e comparou as novas bactérias com as isoladas originalmente, e concluiu que as duas amostras tinham a mesma bactéria. Ele estabeleceu uma série de procedimentos experimentais para relacionar diretamente micróbio específico com doença específica, chamados de postulados de Koch.

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POSTULADOS DE KOCH 1. O microrganismo deve estar sempre presente nas lesões das plantas ou animais doentes (ASSOCIAÇÃO CONSTANTE) 2. O microrganismo deve ser isolado e cultivado em CULTURA PURA 3. O microrganismo isolado deve REPRODUZIR OS SINTOMAS quando inoculado em uma planta ou animal sadio 4. O microrganismo deve ser REISOLADO da planta ou animal inoculado artificialmente e corresponder, em todas as suas características, com o isolado da primeira lesão.

Vacinação Frequentemente, um tratamento ou uma medida preventiva é desenvolvido antes que os cientistas saibam como funciona. A vacina contra varíola é um exemplo disso. Em 4 de maio de 1796, quase 70 anos antes de Koch estabelecer que um microrganismo específico era o causador do antraz, Edward Jenner, jovem médico britânico, iniciou experimento para encontrar uma maneira de proteger as pessoas contra a varíola. As epidemias de varíola eram muito temidas. A doença aparecia periodicamente por toda Europa, matando milhares e liquidou 90% dos nativos na Costa Oeste norte-americana quando os colonizadores europeus levaram a infecção para o Novo Mundo. 1. Na vacinação, a imunidade (resistência a uma determinada doença) é conferida pela inoculação com uma vacina. 2. Em 1798, Edward Jenner demonstrou que a inoculação com material de vacínia proporciona imunidade aos seres humanos contra varíola. Quando uma jovem que trabalhava na ordenha de vacas informou a Jenner que ela não contrairia varíola porque já havia estado doente de vacínia – doença muito mais amena que a varíola – ele decidiu testar a história da garota. Primeiro, ele coletou amostras de feridas de vacínia. Então inoculou um voluntário saudável de 8 anos de idade com o materia retirado das feridas de vacínia por meio de pequenos arranhões no braço do garoto com uma agulha contaminada. Os arranhões deram origem às bolhas, típicas da doença. Em poucos dias, o voluntário estava medianamente doente, mas se recuperou rapidamente e nunca mais contraiu vacínia nem varíola. O processo foi chamado de vacinação, da palavra latina vacca, significando gado. Pasteur deu esse nome em homenagem ao trabalho de Jenner. A proteção contra uma doença fornecida pela vacinação (ou pela recuperação da própria doença) é chamada de imunidade. 3. Por volta de 1880, Pasteur descobriu que uma bactéria não-virulenta poderia ser utilizada como uma vacina para a cólera em aves domésticas; ele criou a palavra vacina. Anos após os experimentos de Jenner, por volta de 1880, Pasteur descobriu como funcionava a vacinação. Ele descobriu que a bactéria que causava a cólera nas aves domésticas perdia a capacidade de causar a doença (perdia a virulência ou tornava-se avirulenta) depois que era mantida por longos períodos no laboratório. Entretanto, este e

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outros microrganismos com virulência diminuída eram capazes de induzir imunidade contra infecções subsequentes de seus companheiros virulentos. A descoberta desse fenômeno forneceu a chave para o sucesso do experimento de Jenner com vacínia. Ambas, vacínia e varíola, são causadas por vírus. Mesmo que o vírus que causa vacínia não seja um derivado do vírus da varíola produzido em laboratório, sua semelhança com o vírus da varíola é tão grande que ele pode induzir imunidade para ambas as viroses. Pasteur usou o termo vacina para as culturas de microrganismos avirulentos, utilizadas para inoculação preventiva. 4. As vacinas modernas são preparadas a partir de microrganismos não-virulentos, de patógenos mortos, ou de componentes de patógenos e pela tecnologia do DNA recombinante. O experimento de Jenner foi o primeiro que ocorreu na cultura ocidental que utilizou um agente viral vivo – o vírus da vacínia – para produzir imunidade. Na China antiga, os médicos imunizavam seus pacientes pela remoção de escamas de pústulas ressecadas de pessoas que estavam sofrendo de casos moderados de varíola, transformavam essas escamas em um pó fino e inseriam esse pó nas narinas das pessoas para serem protegidas. Algumas vacinas ainda são produzidas a partir de linhagens avirulentas de micróbios, que produzem imunidade contra as linhagens virulentas. Outras vacinas são feitas a partir de micróbios mortos, de componente isolados dos microrganismos virulentos ou pelas técnicas de engenharia genética. O nascimento da quimioterapia moderna: sonhos de uma “bala mágica” Após estabelecer relação microrganismos-doenças, médicos microbiologistas direcionaram suas pesquisas para as substâncias que poderiam destruir os microrganismos patogênicos sem prejudicar os animais infectados ou os seres humanos. 1. Quimioterapia é o tratamento químico de uma doença. O tratamento das doenças utilizando substâncias químicas é chamado de quimioterapia. (Esse termo também referese geralmente ao tratamento químico de doenças não-infecciosas como o câncer.) 2. Dois tipos de agentes quimioterápicos são as drogas sintéticas (químicos preparados em laboratório) e antibióticos (substâncias produzidas naturalmente por bactérias e fungos para inibir o crescimento de outros microrganismos). A base do sucesso da quimioterapia está no fato de que alguns químicos são mais venenosos para os microrganismos que para os hospedeiros infectados por esses micróbios. 3. Paul Ehrlich utilizou um produto químico contendo arsênico, denominado salvarsan, para o tratamento da sífilis (1910). Ele disparou o primeiro tiro na revolução da quimioterapia. Como estudante de medicina, especulou a respeito de uma “bala mágica”, que poderia combater e destruir um patógeno, sem prejudicar o hospedeiro infectado. Após testar centenas de substâncias, encontrou o salvarsan, derivado de arsênico, efetivo no combate à sífilis. Salvarsan = salvação para a sífilis e por ter arsênico. Antes da descoberta o único composto químico conhecido era um extrato retirado da casca de uma árvore sul-americana, quinino, que havia sido utilizado pelos conquistadores espanhóis no tratamento da malária. No final da década de 30, haviam sido desenvolvidas outras drogas para destruir microrganismos. Muitas eram derivadas de corantes (testavam corantes sintetizados e produzidos para tecidos na busca de propriedades antimicrobianas). As sulfonamidas (drogas derivadas da sulfa) foram sintetizadas no mesmo período. 4. Alexander Fleming observou que o bolor (fungo) Penicillium inibia o crescimento de uma cultura de bactérias. Ele chamou o ingrediente ativo de penicilina (1928). O primeiro antibiótico foi descoberto por acidente. Alexander Fleming quase estava descartando algumas culturas em placas que haviam sido contaminadas por fungos quando observou cuidadosamente o curioso padrão de crescimento nas placas contaminadas. Havia uma área clara ao redor do fungo onde a cultura de bactéria havia sido inibida. Ele observou que um tipo de fungo podia inibir o crescimento da bactéria. O fungo foi mais tarde identificado como Penicillium notatum e, em 1928, Fleming nomeou

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o inibidor ativo do fungo de penicilina. Assim, penicilina é um antibiótico produzido por um fungo. Sua utilidade não foi aparente até a década de 40, quando foi testada clinicamente e produzida em grande escala.

A penicilina tem sido utilizada clinicamente como antibiótico desde a década de 40. 5. Os pesquisadores estão atacando o problema de resistência dos micróbios às drogas. PROBLEMA 1: Muitos antibióticos foram desenvolvidos. Infelizmente, antibióticos e outras drogas quimioterápicas não estão livres de problemas. Muitos químicos antimicrobianos são muito tóxicos para os seres humanos para serem aplicados; matam os micróbios patogênicos mas também prejudicam o hospedeiro infectado. A toxicidade para o homem é um problema específico no desenvolvimento de drogas para o tratamento de doenças virais. O crescimento viral depende dos processos vitais de células normais do hospedeiro. Portanto, existem poucas drogas antivirais usadas com sucesso, uma vez que um droga interfere na reprodução viral provavelmente afeta também as células saudáveis do organismo. PROBLEMA 2: Outro problema com as drogas antimicrobianas é o aparecimento e a dispersão de variedades novas de microrganismos que são resistentes aos antibióticos. A resistência a drogas resulta de mudanças genéticas nos micróbios que os torna tolerantes a uma certa quantidade de antibiótico que normalmente inibiria seu crescimento. Progressos recentes na microbiologia 1. Bacteriologia é o estudo das bactérias, micologia é o estudo dos fungos, virologia é o estudo dos vírus e parasitologia é o estudo dos parasitas e vermes protozoários. 2. Os microbiologistas estão usando a genômica, o estudo de todos os genes de um organismo, para classificar os microrganismos. “Era de ouro da classificação”. 3. As novas técnicas da biologia molecular e da microrcopia eletrônica forneceram ferramentas para o avanço do conhecimento na virologia. Desenvolvimento do microscópio eletrônico em 1940 permitiu a observação detalhada da estrutura dos vírus. 4. O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante tem promovido avanços em todas as áreas da microbiologia. Os microrganismos podem ser geneticamente manipulados para produzir grandes quantidades de hormônios humanos e outras substâncias médicas urgentemente necessárias. No final da década de 60, Paul Berg mostrou que fragmentos do DNA de seres humanos ou de animais que codificam proteínas importantes (genes) podem ser ligados ao DNA de uma bactéria. A molécula híbrida resultante foi o primeiro exemplo de DNA recombinante. Quando o DNA recombinante é inserido dentro da bactéria (e de outros micróbios), pode ser utilizado para produzir grandes quantidades da proteína desejada. A tecnologia que se desenvolveu a partir dessa técnica é chamada de tecnologia do DNA recombinante ou engenharia genética. Ela teve sua origem em duas áreas: genética microbiana, que estuda os mecanismos pelos quais os microrganismos herdam suas características, e a biologia molecular, que estuda especificamente como a informação genética é transmitida nas moléculas de DNA e como o DNA direciona a síntese das proteínas.

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Exercícios 1. Qual o conceito de célula? Qual pesquisador empregou esse conceito pela primeira vez? Que instrumento ele utilizou? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Quem foi o primeiro a observar os microrganismos vivos através de lentes de aumento? Como ele os chamava? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3. Explique o conceito de geração espontânea. Qual o outro nome dado a esse conceito? Cite exemplos das crenças relacionadas a essa teoria. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4. Explique o conceito de biogênese. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5. O que era a “força vital”? Qual sua função? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 6. Faça um resumo de cada pesquisador e do experimento por ele desenvolvido na busca de comprovar a geração espontânea ou a biogênese. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ c) Robert Koch __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 11. Explique como foi a descoberta da vacina. Qual pesquisador foi responsável? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 12. O que significa bactéria virulenta e bactéria avirulenta? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 13. Como são feitas as vacinas modernas? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 14. O que é quimioterapia? Cite e explique os dois tipos de agentes quimioterápicos. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 15. O que é penicilina? Como ela foi descoberta? Por qual cientista? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 16. Cite e explique dois problemas atuais relacionados ao uso indiscriminado de antibióticos. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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17. Pesquise na Internet e faça a correspondência entre pesquisadores e contribuições para o avanço da microbiologia. ___ Avery, MacLeod e McCarty

(a) Desenvolvimento da vacina contra a varíola

___ Beadle e Tatum

(b) Descobriu como o DNA controla a síntese de proteínas dentro de uma célula

___ Berg ___ Ehrlich ___ Fleming ___ Hooke ___ Iwanowski ___ Jacob e Monod

(c) Descobriu a penicilina (d) Descobriu que o DNA pode ser transferido de uma bactéria para outra (e) Refutou a geração espontânea (f) O primeiro a caracterizar um vírus

___ Jenner

(g) O primeiro a utilizar procedimentos cirúrgicos

___ Koch

(h) O primeiro a observar as bactérias

___ Lancefield

(i) O primeiro a observar células em material vegetal e a nomeá-las

___ Lederberg e Tatum ___ Lister ___ Pasteur ___ Stanley ___ van Leeuwenhoek ___ Virchow ___ Weizmann

desinfetantes

nos

(j) Observou que os vírus eram passíveis de serem filtrados (k) Provou que o DNA é o material hereditário (l) Provou que os microrganismos podem causar doenças (m) Preconizou que as células vivas surgem a partir de células vivas preexistentes (n) Mostrou que os genes codificam as enzimas (o) Misturou DNA animal com DNA de bactérias (p) Utilizou bactérias para produzir acetona (q) Utilizou o primeiro agente quimioterápico sintético (r) Propôs um sistema de classificação para os estreptococos com base nos antígenos de suas paredes celulares

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Classificação dos microrganismos. A célula como a unidade estrutural da vida As células são consideradas as unidades básicas de qualquer organismo, desde os microrganismos constituídos por uma única célula às formas de vida com tecidos especializados e órgãos complexos. A palavra célula surgiu em 1665 quando o inglês Robert Hooke usou-a para descrever cortes finos de cortiça que observou em um microscópio (semelhantes a um favo de mel formado pelas paredes das células). Baseado nestas e outras informações, Matthias Schleiden e Theodor Schwann desenvolveram a teoria celular em 1838-1839. Eles sugeriram que as células são as unidades estruturais e funcionais básicas de todos os organismos. Com a aceitação da teoria celular, os investigadores especularam sobre a substância dentro da célula, o protoplasma (do grego prôtos, “primeiro”; plásma, “substância formada”). O protoplasma é uma mistura complexa e gelatinosa de água e proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos. Ele é envolvido por uma membrana flexível e algumas vezes por uma parede celular rígida. Dentro das células existe uma região que controla a função celular e a hereditariedade. Em algumas células, chamadas de células eucarióticas, esta região é representada por uma estrutura denominada núcleo, que é circundada por uma membrana nuclear ou carioteca. Em células mais simples, chamadas de células procarióticas, existe um material similar, porém não é separado fisicamente do restante da célula por uma membrana. Em cada tipo celular, envolto ou não por membrana nuclear, é esse material que contém a informação genética, as instruções codificadas que permitem a transmissão de características hereditárias dos organismos para suas gerações seguintes. A outra parte do protoplasma, a área não-nuclear, é chamada de citoplasma (ver FIGURA). Em um organismo unicelular (formado por uma única célula), todos os processos vitais ocorrem dentro da célula. Se um organismo contém muitas células, ele é multicelular. Em formas de vida superior, como as plantas e os animais, estas células estão arranjadas em estruturas chamadas de tecidos ou órgãos, com funções específicas. Todos os organismos, unicelulares ou multicelulares, apresentam as seguintes características: 1- reprodução 2- utilização de alimento como fonte de energia 3- síntese de substâncias e estruturas celulares 4- excreção de substâncias 5- resposta a alterações ambientais 6- mutações, que são alterações súbitas em suas características hereditárias, embora ocorram raramente. Classificação dos organismos vivos Há cerca de 10 milhões de espécies de organismos vivos no mundo, incluindo milhares de espécies microbianas. A necessidade de organizar esta quantidade e variedade de organismos é característica da mente humana. Assim, os cientistas tentam colocá-los em grupos baseados em suas similaridades. A ciência da taxonomia inclui a classificação (arranjo), nomenclatura (nome) e identificação (descrição e caracterização) dos organismos vivos. Os biólogos agrupam os organismos que compartilham certas características comuns em grupos taxonômicos denominados taxa (singular é táxon). O táxon básico é a espécie, que é uma coleção de cepas com características similares – especialmente em seu material hereditário. (Uma cepa é formada por descendentes de uma única colônia em uma cultura pura.) Outras características usadas para agrupar os organismos em espécies incluem morfologia e exigências nutricionais. Espécies intimamente relacionadas são agrupadas em gêneros, os gêneros em famílias, as famílias em ordens, as ordens em classes, as classes em filos ou divisões, e os filos ou divisões em reinos (RE – FI – C – O – FA – G – E).

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A Tabela mostra esquemas de classificação de 3 espécies: uma bactéria, uma alga e um animal. Organismo Taxa (categorias) Reino ou grupo principal

Gato

Alga

Bactéria

Animal

Plantae

Eubacteria

Chlorophyta

Gracillicutes

Chlorophyceae

Scotobacteria

Divisão Filo

Chordata

Subfilo

Vertebrata

Classe

Mammalia

Subclasse

Eutheria

Ordem

Carnivora

Volvocales

Spirochaetales

Família

Felidae

Chlamydomonadaceae

Leptospiraceae

Gênero

Felis

Clamydomonas

Leptospira

Espécie F. domesticus C. eugametos L. interrogans O sistema de nomenclatura (nomeação) em uso atualmente para os organismos foi estabelecido em 1735 por Carolus Linnaeus. Os nomes científicos são latinizados porque o latim era a língua tradicionalmente utilizada pelos estudantes. A nomenclatura científica para cada organismo designa para cada organismo dois nomes – o gênero é o primeiro nome, sempre iniciado com letra maiúscula; o epíteto específico (nome das espécies) segue o gênero e não se inicia por letra maiúscula. Assim, o nome de uma espécie é sempre dado como uma combinação latina de duas partes (binomial): nome do gênero + nome específico que denota a espécie. O organismo é designado pelos dois nomes, o gênero e o epíteto específico, ambos sendo sublinhados ou escritos em itálico. Por tradição, após um nome científico ter sido mencionado uma vez, ele pode ser abreviado com a inicial do nome do gênero seguido pelo epíteto específico. Por exemplo, o homem pertence à espécie Homo sapiens, enquanto a bactéria que causa a doença de Lyme pertence à espécie Borrelia burgdorferi. CERTO: Staphylococcus aureus. ERRADO: Staphylococcus aureus, Staphylococcus Aureus, staphylococcus aureus, Estafilococos aureus, etc. Os nomes científicos podem, entre outras coisas, descrever um organismo, homenagear um pesquisador ou identificar os hábitos de uma espécie. Por exemplo, considerando Staphylococcus aureus, uma bactéria comumente encontrada na pele humana. O gênero Staphylo descreve o arranjo agrupado das células; coccus indica que as células possuem forma de esferas. O epíteto específico aureus significa ouro em latim, a cor de muitas colônias dessa bactéria. As bactérias do gênero Escherichia coli foram nomeadas por um cientista, Theodor Escherich, enquanto que o epíteto específico, coli, lembra-nos que E. coli vive no cólon ou no intestino grosso. Não há consenso na nomenclatura e classificação de cada táxon. Por exemplo, os zoologistas e os botânicos concordam com o arranjo das plantas e dos animais em filos (os botânicos preferem o termo divisão). Já os microbiologistas ainda não estabeleceram um filo que satisfaça aos bacteriologistas, ficologistas, protozoologistas e outros. Assim, em concordância, o gênero e a espécie permanecem como as duas taxas mais importantes entre as bactérias. Classificação dos microrganismos Durante a metade do século XVIII, todos os organismos vivos foram distribuídos por Carolus Linnaeus em dois reinos, Plantae e Animalia. Embora seu trabalho pioneiro tenha grande

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contribuição científica, este e outros sistemas de classificação iniciais apresentavam falhas ou esquemas errados, porque eram baseados em informações imprecisas. Atualmente, os sistemas de classificação, particularmente aqueles para microrganismos, estão evoluindo ainda, pois os pesquisadores estão descobrindo mais informações sobre as características físicas e químicas dos organismos. 1) Reino Protista Em seu sistema de classificação, Linnaeus colocou os protozoários no reino animal e outros microrganismos com as plantas. Mas esse conceito simples era impraticável para os microrganismos, alguns dos quais são predominantemente semelhantes às plantas, outros aos animais e outros têm características de ambos. Em 1866, Ernst H. Haeckel propôs um terceiro reino para resolver o dilema, o reino Protista, que incluía aqueles microrganismos que tinham características tanto de plantas como de animais. De acordo com ele, bactérias, algas e protozoários foram incluídos nesse reino. Mas com acesso às informações sobre as estruturas internas dos microrganismos, a validade do reino Protista foi questionada. Principais esquemas de classificação de organismos vivos. Esquema de classificação Reinos Organismos incluídos Linnaeus (1753)

Plantae Animalia

Bactérias, fungos, algas, plantas. Protozoários e animais superiores

Haeckel (1865)

Plantae Animalia Protista

Algas multicelulares e plantas. Animais. Microrganismos incluindo bactérias, protozoários, algas, bolores e leveduras.

Whittaker (1969)

Plantae Animalia Protista Fungi Monera

Algas multicelulares e plantas. Animais. Protozoários e algas unicelulares. Bolores e leveduras. Todas as bactérias (procariotos)

Woese (1977)

Archaeobacteria

Bactérias que produzem gás metano, requerem altas concentrações de sal ou altas temperaturas. Todas as outras bactérias, incluindo aquelas mais familiares aos microbiologistas, tais como causadoras de doenças, bactérias de solo e da água e bactérias fotossintéticas. Protozoários, algas, fungos, plantas e animais.

Eubacteria

Eucaryotes

2) Microrganismos procarióticos e eucarióticos Os avanços da microscopia eletrônica na década de 1940 mostrou muito mais a estrutura celular interna do que era possível com os microscópios óticos. Uma descoberta particularmente importante em termos de taxonomia foi que as células microbianas podem ser divididas em eucarióticas e procarióticas. Esta diferença é a base para a separação das bactérias de outros tipos de microrganismos e de todas as outras células, de plantas e animais. As bactérias têm uma estrutura celular procariótica e são procariotos. Outras células, incluindo algas, fungos, protozoários e células vegetais e animais têm uma estrutura celular eucariótica e são eucariotos. 3) O conceito de classificação dos cinco reinos A maneira pela qual o organismo obtém nutrientes de sua alimentação é a base do sistema de cinco reinos de classificação proposto em 1969 por Robert H. Whittaker. Ele ampliou o sistema de classificação e sugeriu 3 níveis de organização celular para acomodar os 3 modos principais de nutrição: (1) fotossíntese, o processo pelo qual a luz fornece energia para converter o dióxido de carbono (CO2) em água e açúcares; absorção, a captação de nutrientes químicos dissolvidos em água; e (3) ingestão, entrada de partículas de alimentos não-dissolvidas.

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Nesse esquema de classificação, os procariotos constituem o reino Monera, que até recentemente foi considerado o reino mais primitivo e acreditava-se que era o ancestral dos eucariotos. Os procariotos normalmente obtêm nutrientes somente por absorção, e não podem ingerir alimentos ou realizar fotossíntese (como as plantas). O reino Protista inclui os microrganismos eucarióticos unicelulares, que representam os 3 tipos nutricionais: as algas são fotossintéticas, os protozoários podem ingerir seu alimento e os fungos limosos (inferiores) somente absorvem os nutrientes. Organismos eucarióticos superiores são colocados nos reinos Plantae (plantas verdes fotossintéticas e algas superiores), Animalia (animais que ingerem os alimentos) e Fungi, organismos que têm parede celular mas não apresentam o pigmento fotossintético clorofila encontrado em outras plantas, portanto eles absorvem os nutrientes.

Assim, os microrganismos foram colocados em 3 dos 5 reinos: Monera (bactérias), Protista (protozoários e algas microscópicas) e Fungi (fungos microscópicos: leveduras e bolores). Este sistema coloca todas as bactérias no reino Monera e sugere um ancestral comum para todos os membros deste reino. Entretanto, pesquisas mais recentes sugerem um ancestral diferente entre os microrganismos. 4) Arqueobactérias, eubactérias e eucariotos Até 1977, os cientistas achavam que os procariotos eram os mais primitivos de todos os organismos. O prefixo “pro” significa “mais primitivo que”, ficando subentendido que esses organismos, por causa da simplicidade estrutural, eram os ancestrais de eucariotos mais complexos. Então Carl Woese descobriu que nenhum grupo tinha se desenvolvido a partir de outro e que os procariotos e eucariotos aparentemente tinham evoluído por vias completamente diferentes de uma forma ancestral comum.

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Evidências para sustentar essa ideia vieram de estudos com o ácido ribonucléico ribossômico, ou rRNA, que é essencial para a síntese protéica e, portanto, para a sobrevivência da célula. Foi descoberto que nos ribossomos de todos os organismos vivos, o rRNA é composto de muitas unidades pequenas denominadas ribonucleotídeos. Existem 4 tipos de ribonucleotídeos, arranjados em várias combinações para formar uma única e longa cadeia de centenas de unidades. O rRNA de qualquer organismo particular tem um arranjo distinto de ribonucleotídeos, ou seja, uma sequência nucleotídica específica. (O RNA difere do DNA por ser uma fita simples, apresentar ribose em vez de desoxirribose, e uracila (U) em vez de timina (T). As outras 3 bases adenina (A), guanina (G) e citosina (C) ocorrem tanto em RNA quanto em DNA.) Os genes que controlam a sequência nucleotídica de rRNA variam lentamente durante milhões de anos de evolução. Portanto, o rRNA pode servir como um indicador de como os organismos estão intimamente relacionados e algumas regiões da molécula de rRNA de todos os organismos vivos permanecem quase as mesmas. Esta constância sustenta a ideia de que todos os organismos têm se desenvolvido de formas ancestrais comuns. Ao mesmo tempo, a quantidade de diferenças entre as outras regiões de rRNA pode ser usada para medir o grau de relacionamento entre os organismos. Por exemplo, se as sequências de ribonucleotídeos de dois tipos de organismos diferem em grande extensão, a relação entre ambos é muito distante; isto é, os organismos divergiram há muito tempo de um ancestral comum. Porém, se as sequências mostram mais similaridades, os organismos estão intimamente relacionados e têm um ancestral em comum relativamente recente. Usando essas técnica, Woese descobriu que as moléculas de rRNA em grupos de organismos diferem no arranjo e na sequência de seus nucleotídeos. Os eucariotos possuem um tipo geral de sequência e o procariotos, um segundo tipo. Mas ele também descobriu que alguns procariotos têm um terceiro tipo de rRNA e o arranjo desse rRNA difere dos outros procariotos e dos eucariotos. Em outras palavras, existem dois tipos principais de bactérias, chamadas de arqueobactérias e eubactérias, que são tão diferentes uma das outras como também são dos eucariotos.

A explicação mais razoável é que arqueobactérias, eubactérias e eucariotos evoluíram por caminhos diferentes a partir de um ancestral comum. Woese propôs que arqueobactérias, eubactérias e eucariotos representam os 3 reinos primários da vida.

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Exercícios 1) O que é teoria celular? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) O que é protoplasma? De que ele é formado? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) Qual a diferença entre procariontes e eucariontes? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4) Qual a função do material que fica no núcleo de uma célula, envolto ou não por uma membrana? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5) Quais as 3 partes que compõem a taxonomia e a função de cada uma delas? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 6) Qual é a unidade taxonômica básica? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 7) Cite os taxa (categorias) a partir do mais específico para o mais geral. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 8) O que é uma cepa? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 9) Quais a regras para escrever o nome científico de um organismo? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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10) Escreva corretamente o nome científico dos microrganismos: a) o gênero de uma bactéria é “clostridium” e o epíteto específico é “botulinum”: ______________________________________________________________________________ b) o gênero de uma bactéria é “escherichia” e o epíteto específico é “coli”: ______________________________________________________________________________ 11) Quais os dois reinos em que Linnaeus classificava os organismos? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 12) Quais os três reinos em que Haeckel classificava os organismos? Qual continha os microrganismos? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 13) Qual a principal descoberta embasou a mudança da classificação de Haeckel para a de Whittaker? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 14) Qual é a base do sistema de classificação de cinco reinos proposto por Whittaker? Quais são os três modos principais? Descreva cada um deles. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 15) Quais são os cinco reinos propostos por Whittaker? Que organismos estão presentes em cada um deles? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 16) Em que se baseia a diferença entre as eubactérias e as arqueobactérias? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 17) Quais os três reinos da classificação de Woese? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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Metabolismo microbiano. 1. Metabolismo microbiano - Metabolismo é a soma de todas as reações químicas dentro de um organismo vivo. Como as reações químicas liberam ou requerem energia, o metabolismo é o balanceamento de energia. - Metabolismo pode ser dividido em duas classes de reações químicas: reações que liberam energia e reações que requerem (absorvem) energia. - Nas células vivas, as reações reguladas por enzimas que liberam energia estão envolvidas no catabolismo, a quebra de compostos orgânicos complexos em compostos mais simples. São reações chamadas de catabólicas ou degradativas. Essas reações são geralmente de hidrólise (reações que usam água e nas quais ligações químicas são quebradas) e são exergônicas (produzem mais energia que consomem). Exemplo: células quebram açúcares em dióxido de carbono e água. - As reações reguladas por enzimas que requerem energia estão envolvidas no anabolismo, a construção de moléculas orgânicas complexas a partir de moléculas orgânicas mais simples. São chamadas de reações anabólicas ou biossintéticas. Essas reações muitas vezes envolvem reações de síntese por desidratação (reações que liberam água) e são endergônicas (consomem mais energia do que produzem). Exemplos: formação de proteínas a partir de aminoácidos, ácidos nucléicos a partir de nucleotídeos e polissacarídeos a partir de açúcares simples. Essas reações biossintéticas geram os materiais para o crescimento celular. - As reações catabólicas fornecem os blocos construtivos para as reações anabólicas e a energia necessária para dirigi-las. Esse acoplamento (junção) de reações que requerem energia e liberam energia é possível através da molécula de trifosfato adenosina (ATP). O ATP estoca energia derivada de reações catabólicas e a libera mais tarde para dirigir reações anabólicas e realizar outros trabalhos celulares. - O ATP é formado por uma adenina, uma ribose e três grupos fosfato. Quando o grupo fosfato terminal é retirado do ATP, difosfato de adenosina (ADP) é formado, e energia é liberada para dirigir as reações anabólicas. ATP → ADP + P + energia A energia das reações catabólicas é usada para combinar ADP e um P para sintetizar novamente ATP: ADP + P + energia → ATP - As reações anabólicas estão acopladas à quebra do ATP e as reações catabólicas estão acopladas à síntese do ATP. - A composição química de uma célula viva está constantemente mudando, algumas moléculas são quebradas enquanto outras estão sendo sintetizadas. Esse fluxo balanceado de compostos químicos e energia mantém a vida de uma célula. - Vias metabólicas que existem nas células são sequências de reações químicas catalisadas por enzimas.

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2. Produção de energia - Moléculas nutrientes, como todas as moléculas, têm energia associada com os elétrons que formam as ligações entre seus átomos. - Quando essa energia está distribuída por toda a molécula, é difícil para a célula utilizá-la. - Várias reações em vias catabólicas, contudo, concentram a energia dentro das ligações do ATP, que serve como um transportador de energia. - ATP tem “ligações de alta energia”, ou “ligações instáveis”. Embora a quantidade de energia nessas ligações não seja excepcionalmente grande, ela pode ser liberada rápida e facilmente. - ATP = querosene (líquido altamente inflamável), embora uma grande tora de madeira possa eventualmente queimar e produzir mais calor que uma xícara de querosene, o querosene tem ignição mais fácil e proporciona calor mais rápido. De forma semelhante, as ligações instáveis de “alta energia” do ATP suprem a célula com energia prontamente disponível para reações anabólicas. 2.1 Reações de oxidação-redução (redox) - Oxidação = remoção de elétrons de um átomo ou molécula, uma reação que muitas vezes produz energia - Redução = ganho de elétrons de um átomo ou molécula - Exemplo de uma oxidação em que a molécula A perde um elétron para a molécula B. A molécula A sofreu oxidação (significando que ela perdeu um ou mais elétrons), enquanto a molécula B sofreu redução (significando que ela ganhou um ou mais elétrons).

redução é → A

B

A oxidada B reduzida

oxidação - Reações de oxidação-redução sempre estão acopladas, cada vez que uma substância é oxidada, uma outra é simultaneamente reduzida.

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- Os organismos liberam e armazenam energia de moléculas orgânicas por meio de uma série de reações controladas, ao invés de ser uma única explosão. Se a energia fosse liberada toda de uma só vez, como uma grande quantidade de calor, ela não poderia ser prontamente utilizada para impulsionar as reações químicas e causaria, de fato, danos à célula. Para extrair energia de compostos orgânicos e a armazenar na forma química, os organismos passam elétrons de um composto a outro por meio de uma série de reações redox. 3. Catabolismo de carboidratos - Maioria dos microrganismos oxida carboidratos como fonte primária de energia celular. Catabolismo de carboidratos para produzir energia é de grande importância no metabolismo celular. - Glicose é a fonte mais comum de energia de carboidrato utilizada pelas células, mas microrganismos também podem catalisar lipídios e proteínas para produzir energia - Para produzir energia a partir da glicose, os microrganismos usam dois processos gerais: respiração celular e fermentação. - Respiração ocorre em três etapas: glicólise, ciclo de Krebs e a cadeia (sistema) de transporte de elétrons. - Fermentação também inicia com a etapa da glicólise, mas após converter glicose em ácido pirúvico, este é convertido em um ou mais produtos diferentes, dependendo do tipo de célula, por exemplo: álcool (etanol) e ácido lático. Rendimento de ATP é menor.

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- Respiração é definida como um processo de geração de ATP em que moléculas são oxidadas e o receptor final de elétrons é (quase sempre) uma molécula inorgânica. Existem 2 tipos de respiração: aeróbica, que usa oxigênio e onde o receptor final de elétrons é o O 2; e anaeróbica, que não usa oxigênio e ainda pode ser morto por ele e o receptor final de elétrons é uma molécula inorgânica (exceto oxigênio molecular) ou raramente, uma molécula orgânica. A respiração anaeróbica é importante para ciclos de enxofre e nitrogênio (bactérias que usam nitrato e sulfato como aceptores finais de elétrons). A quantidade de ATP gerada na respiração anaeróbica varia com o microrganismo e a via. Como somente uma parte do ciclo de Krebs funciona sob condições anaeróbicas, e como nem todos os transportadores participam da cadeia transportadora de elétrons, o rendimento de ATP nunca é tão alto como na respiração aeróbica, consequentemente, os anaeróbios crescem mais lentamente que os aeróbios.

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- Fermentação: - libera energia de açúcares ou moléculas orgânicas, tais como aa, ácidos orgânicos, purinas e pirimidinas - não requer oxigênio (mas algumas vezes pode ocorrer na presença desse) - não requer uso do ciclo de Krebs ou de uma cadeia de transporte de elétrons - usa molécula orgânica como aceptor final de elétrons - produz pequenas quantidades de ATP, porque grande parte da energia original da glicose permanece nas ligações químicas dos produtos finais orgânicos, como ácido lático ou etanol. 4. Fotossíntese - em todas as vias anteriores, os microrganismos obtêm energia para o trabalho celular pela oxidação de compostos orgânicos. Mas onde os microrganismos obtêm esses compostos orgânicos? - Muitos microrganismos e animais alimentam-se de matérias produzidas por outros organismos. Ex.: bactérias podem catabolizar compostos de plantas e animais mortos ou podem obter alimento de um hospedeiro vivo. - Outros microrganismos sintetizam compostos orgânicos complexos a partir de substâncias inorgânicas simples. O principal mecanismo é a fotossíntese, usado por plantas e microrganismos. - Fotossíntese é a conversão da energia luminosa do sol em energia química. Energia química é então usada para converter o gás carbônico da atmosfera em compostos de carbono como açúcares. 6 CO2 + 12 H2O + energia luminosa → C6H12O6 + 6 O2 + 6 H2O 5. Diversidade metabólica entre os organismos - microrganismos podem ser classificados metabolicamente de acordo com seu padrão nutricional de fonte de energia e fonte de carbono. - Fonte de energia: - fototróficos: usam luz como fonte de energia primária - quimiotróficos: dependem de reações de redox de compostos orgânicos ou inorgânicos para energia - Fonte de carbono: - autotróficos: nutrição própria, usam dióxido de carbono - heterotróficos: nutrição depende dos outros, requerem fonte de carbono orgânica - Combinando as fontes de energia e carbono, surge a seguinte classificação: - fotoautotróficos - foto-heterotróficos - quimioautotróficos - quimio-heterotróficos Exercício 1) Leia o texto abaixo e faça um resumo de cada grupo: fotoautotróficos, foto-heterotróficos, quimioautotróficos e quimio-heterotróficos.

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Morfologia, reprodução e classificação bacteriana. Eucariontes – Plantae, Animalia, Protista, Fungi

células eucariontes ou eucariotas possuem a carioteca (membrana nuclear), individualizando o material nuclear da célula

Procariontes – Monera

células procariontes ou procariotas  não possuem carioteca (membrana nuclear), membrana que separa o material genético do citoplasma

Existe material genético nas duas, mas nas procariontes este está “boiando” no citoplasma, e na célula eucarionte o material genético está no núcleo – separado pela carioteca do restante da célula.

BACTÉRIAS 1) Estrutura - grego → “bakteria” = bastão - são seres microscópicos → menor ser vivo - unicelulares - célula bacteriana é procariota (material genético não envolto por membrana nuclear) - ausência de estruturas membranosas intracelulares

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Citoplasma

Membrana plasmática

Parede celular Cápsula Fímbrias

DNA associado ao mesossomo

Flagelo

a) Parede celular - complexa, semi-rígida e responsável pela forma da célula - circunda a membrana plasmática frágil - componente principal é uma rede de macromoléculas chamada PEPTIDEOGLICANO (glicoproteína) PEPTIDEO = Filas adjacentes de polissacarídeo são ligadas por polipeptídeos GLICANO = Dissacarídeo repetitivo formando polissacarídeo - “Esqueleto de carboidratos”

N-acetil-ácido murâmico Staphylococcus aureus

N-acetilglucosamina

Peptídeos

Classificação - de acordo com suas respostas à coloração de Gram, as bactérias se dividem em 2 grupos: Gram positivas: 90 % da parede formada de peptideoglicana (até 20 camadas) 30-60 nm Esquema de bactéria com parte da célula removida.

Parede celular formada por camada espessa de peptidoglicano

Membrana plasmática Esquema de parte da parede celular e da membrana plasmática de bactéria gram-positiva. Exemplo: Estreptococos; Estafilococos; Enterococos

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Gram negativas: 10 % de peptideoglicano = (1-2 camadas) 2-3 nm

Proteína

Camada lipoprotéica externa, espessa, semelhante à membrana plasmática, com lipopolissacarídeos

Parede celular

Esquema de bactéria com parte da célula removida.

Lipoproteínas Esquema de parte da parede celular e da membrana plasmática de bactéria gram-negativa.

Membrana plasmática

Exemplos: Vibrião colérico; Clostridium; salmonelas b) Estruturas externas à parede celular - Glicocálice - cápsula = “revestimento de açúcar” - polímero viscoso e gelatinoso situado externamente à parede celular - composição variável: polissacarídeos e/ou polipeptídeos - proteção e adesão as superfícies Exemplo 1: certas espécies, cápsulas são importantes para a virulência bacteriana, protegem bactérias patogênicas da fagocitose pelas células do hospedeiro: Bacillus anthracis – somente a bactéria encapsulada causa o antraz (carbúnculo) Exemplo 2: Streptococcus pneumoniae, causa pneumonia somente quando as células são protegidas por cápsula de polissacarídeo Exemplo 3: S. mutans, causa cárie dentária pois se fixa na superfície dos dentes por meio de seu glicocálice

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- Flagelos - presença não obrigatória - apêndices longos, finos e helicoidais - originam-se na membrana plasmática - distribuídos em número variável - mobilidade por rotação (até 12.000 rpm)

Células bacterianas podem alterar a velocidade e a direção de rotação dos flagelos. São capazes de vários padrões de motilidade (capacidade de um organismo se mover por si próprio). - bactéria se move em uma direção por um período de tempo = “corrida” ou “nado” - corridas são interrompidas por alterações periódicas, abruptas e aleatórias na direção = “desvios”

- Fímbrias - presença não obrigatória - apêndices protéicos, pequenos e imóveis - adesão a substratos/superfícies, várias unidades por célula, biofilmes Fímbrias da bactéria que causa gonorreia ajudam sua fixação nas membranas mucosas para causar a doença, se não existirem (mutação genética) não ocorre colonização e não aparece doença.

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- Pili - presença não obrigatória - apêndices protéicos, pequenos e imóveis - unem células bacterianas na transferência de DNA de uma célula para outra (conjugação), geralmente 1 unidade por célula

c) Estruturas internas à parede celular - Membrana plasmática - estrutura fina no interior da parece celular que reveste o citoplasma - composição: fosfolipídeos e proteínas - permeabilidade seletiva - Citoplasma - material em solução (sais minerais, proteínas, carboidratos, lipídios) - ribossomos (RNA + proteína): síntese protéica - nucleóide: formado pelo cromossomo bacteriano (única molécula longa, contínua, em forma circular de DNA de dupla fita) DNA Citoplasma Ribossomos

- Endosporos - células de “repouso” formadas por certas bactérias gram-positivas quando nutrientes essenciais se esgotam - estruturas de resistência ao calor, radiações, ácidos, produtos químicos e enzimas - dormentes por milhares de anos, podem iniciar germinação - exemplo 1: endosporos com 7500 anos de Thermoactinomyces vulgaris do lodo congelado do lago Elk (EUA) germinou quando reaquecido e colocado em meio nutriente - exemplo 2: endosporos com 25 a 40 milhões de anos, intestino de abelha sem ferrão aprisionada em âmbar (resina de árvore endurecida) na República Dominicana germinaram quando colocados em meio nutriente. - Gênero Clostridium (gangrena, tétano, botulismo, intoxicação alimentar); gênero Bacillus (antraz ou carbúnculo e intoxicação alimentar) - indústria alimentícia - Esporulação ou esporogênese = germinação (retorno ao estado vegetativo)

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2) Morfologia - são unicelulares, exceto os actinomicetos - de acordo com a forma que apresentam, as bactérias são classificadas em: cocos, vibriões - cada grupo possui subdivisões. COCO ESFÉRICO: forma arredondada oval, alongada ou achatada em uma extremidade diplococos = em pares tétrade = grupos de 4 sarcina = grupos de 8, cubo estreptococos = cadeia estafilococos = cacho BACILO: forma de bastão diplobacilos = em pares estreptobacilos = cadeia VIBRIÕES: tem forma de vírgula espirilos = helicoidal (“saca-rolhas”) espiroquetas = helicoidal e flexível Exercício - Nomeie as figuras abaixo de acordo com a forma das bactérias.

Chlamydia trachomatis ________________________________

________________________________

Streotococcus ________________________________

________________________________

________________________________

________________________________

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Mycobacterium tuberculosis ________________________________

________________________________

________________________________

Vibrio cholerae ________________________________

Treponema pallidum ________________________________

________________________________

RESUMINDO...

a) estreptococos; b) diplococos; c) tétrade; d) sarcina; e) estafilococos

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3) Reprodução Assexuada, por bipartição ou divisão binária simples - 2 células filhas iguais, multiplicação

Sexuada, por conjugação, rara - algumas bactérias podem passar parte de seu material genético (plasmídio) para outras (Pili) - surgem assim novas variedades de bactérias

4) Respiração - Aeróbias estritas: necessitam de O2 para sua sobrevivência (ar contém 21% de O2) - Aeróbias microaerófilas: necessitam de O2 mas em concentração menor que a encontrada no ar - Aeróbias facultativas: podem crescer tanto na presença como na ausência de oxigênio. Não necessitam de O2, crescem melhor com O2. Podem usar O2 quando disponível, mas na sua ausência, são capazes de continuar seu crescimento através da respiração anaeróbia ou da fermentação. - Anaeróbias obrigatórias: não toleram O2 (letal). - Anaeróbias aerotolerantes: não necessitam de O 2, crescem melhor sem O2 pois não podem usálo para seu crescimento. AERÓBIAS ESTRITAS

ANAERÓBIAS AERÓBIAS ANAERÓBIAS MICRO ESTRITAS FACULTATIVAS AERÓFILAS AEROTOLERANTES

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5) Nutrição - Heterótrofos (maioria): - Saprófitos = decompõem material orgânico de animais e plantas mortas e absorvem os nutrientes. Reciclagem – papel ecológico - Parasitas = absorvem os nutrientes de hospedeiros vivos. Patógenos de plantas e animais - Mutualistas = associação íntima com outros organismos - Autótrofos - Fotoautotróficos = obtêm a energia na forma de luz, para a fotossíntese - Quimioautotróficos = obtêm energia pela oxidação de compostos químicos: açúcar, proteínas, gorduras, celulose, petróleo, manganês, gasolina, … 6) Importância - decompositoras, fazem a reciclagem e a fertilização do solo - fixadoras de nitrogênio atmosférico (N 2), são capazes de utilizar N gasoso diretamente da atmosfera * bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium = obtenção de N para elas e para plantas que convivem simbioticamente (leguminosas: soja, feijão) * cultivo de leguminosas = maior fertilidade do solo sem a necessidade de implementação de fertilizantes químicos, liberam nitratos (NO-3) no solo - alimentos = produção de iogurtes, queijos, pickles, chucrute, leites fermentados, vinagre, bebidas, carnes curadas (salames e embutidos), molho de soja - produtos de valor industrial = antibióticos, vitaminas, acetona, metanol, butanol, … - tratamento de esgotos = degradação dos resíduos orgânicos - usinas de reciclagem de lixo = produção de adubos de compostagem - biotecnologia = ferramentas da engenharia genética = bactérias capazes de produzir drogas terapêuticas (insulina), bactérias p/ biodegradação de lixos tóxicos (derrames de hidrocarbonetos) - cirurgia plástica = toxina botulínica (espécie de Clostridium botulinum) paralisa musculatura, relaxando-a = “Botox”, usado em pequenas quantidades p/ atenuação de rugas e marcas de expressão - bacterioses humanas = antraz, botulismo, cárie, cólera, coqueluche, febre tifóide, gastroenterites, gonorréia, hanseníase (lepra), intoxicação alimentar, meningite, pneumonia, sífilis, tétano, tuberculose Exercícios 1) Quais são as 3 formas básicas das células bacterianas? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) Quais são os arranjos celulares comuns das bactérias cocóides? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) Quais são os arranjos celulares comuns dos bacilos? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4) Qual o componente principal da parede celular bacteriana? Qual sua função para a célula bacteriana? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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5) Como as bactérias são classificadas de acordo com a coloração de Gram? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 6) Quais são as diferenças entre as paredes celulares das bactérias Gram-negativas e Grampositivas? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 7) Qual a definição de glicocálice? Quais são as suas funções? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 8) Qual a definição de flagelo? Qual é sua função? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 9) Qual a diferença entre fímbria e pili? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 10) Qual a definição de membrana plasmática? Qual é sua composição e função? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 11) De que é composto o citoplasma de uma bactéria? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 12) Qual a função dos ribossomos? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 13) O que são endosporos? Para que servem? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 14) Explique por que a formação dos endósporos nas bactérias não é um modo de reprodução da célula. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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15) Como o endosporo bacteriano pode causar problemas na indústria alimentícia? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 16) Cite duas formas de reprodução nas bactérias. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 17) Quais as formas de nutrição das bactérias? Explique-as em detalhe. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 18) Descreva 3 situações que demonstrem a importância das bactérias. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 19) Há um cuidado que deve ser tomado quando se compra um alimento enlatado. Devemos observar não só a data de fabricação e o prazo de vencimento do produto, mas também o aspecto da lata que não deve se apresentar estufada, pode ter-se desenvolvido, dentre outras bactérias, a produtora do botulismo, uma doença frequentemente fatal. a) Que tipo de respiração essa bactéria mantêm no interior da lata fechada? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ b) No caso do produto contaminado, o que causou a pressão no interior da lata, estufando a tampa? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ c) Quem é o causador do botulismo? Qual sua forma de transmissão? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 20) A bactéria não possui: a) membrana plasmática. c) parede celular. e) carioteca.

b) ribossomos. d) DNA.

21) A meningite meningocócica, cuja profilaxia, principalmente entre escolares, se fez com vacinas conhecidas como ‘tipo A’ e ‘tipo C’, é uma infecção causada: a) somente por vírus. b) por bactérias formadas por bastão ou bacilos. c) por bactérias de forma esférica. d) por vírus e bactérias. e) por vírus e riquétsias

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22) Bactérias causadoras de infecção e que são vistas ao microscópio como grupamento de glóbulos em cacho certamente são: a) estafilococos. b) estreptococos. c) diplococos. d) micrococos. e) bacilos. 23) Muitas doenças humanas são produzidas por vírus. Marque da relação seguinte a única de origem bacteriana: a) gripe b) caxumba c) tétano d) sarampo e) varíola 24) Numere a Segunda coluna de acordo com a primeira e de pois assinale a alternativa que contenha a sequência correta: Coluna I Coluna II (1) bacilos ( ) cocos em grupos densos (2) estreptococos ( ) cocos em grupos aproximadamente cúbicos (3) estafilococos ( ) cocos em fileira (4) tétrades ( ) filamentos helicoidais (5) sarcina ( ) bastonete reto em geral de 1 a 15 micra (6) espirilos ( ) cocos em grupo de quatro a) 3-2-5-6-1-4 b) 3-5-2-6-1-4 c) 3-5-2-1-6-4 d) 3-5-2-6-4-1 e) 3-5-1-2-4-6 25) Em relação a morfologia, as bactérias com formas esféricas, de bastão, em cacho de uva e em colar denominam-se, respectivamente: a) cocos, bacilos, estafilococos, estreptococos. b) bacilos, cocos estafilococos, estreptococos. c) cocos, bacilos, estreptococos, estafilococos. d) bacilos, cocos, estreptococos, estafilococos. e) estreptococos, estafilococos, bacilos, cocos. 26) Bacilos são: a) vírus em forma de bastonete. c) bactérias em forma de bastonete. e) fungos unicelulares e de forma alongada.

b) bactérias esféricas, agregadas em fio. d) hifas de fungos do grupo dos basidiomicetos.

27) Bactérias são organismos microscópicos, unicelulares, procariotos, encontrados praticamente em todos os ambientes. Afirma-se: I. Bactérias saprófitas são importantes organismos decompositores de matéria orgânica morta. II. São doenças bacterianas: cólera, difteria, pneumonia, lepra, tuberculose, tétano e disenteria bacilar. III. Esporos são células resistentes formadas quando as condições de alimento para as bactérias são favoráveis. Está correto o que se afirmou em a) I, apenas. b) II e III, apenas. c) I e III, apenas. d) I e II, apenas. e) I, II e III. 28) Assinale a afirmação incorreta para bactérias: a) Possuem núcleo individualizado. b) A maioria é heterotrófica. c) São seres vivos unicelulares. d) Algumas possuem uma camada gelatinosa ao redor da membrana celular. e) Algumas são parasitas.

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29) A água oxigenada utilizada na limpeza de ferimentos, ao entrar em contato com o sangue, libera gás oxigênio, impedindo a sobrevivência de bactérias, como as do tétano, por exemplo. Pode-se dizer, então, que a bactéria Clostridium tetani é: a) Aeróbica facultativa, pois utiliza o oxigênio, quando disponível, para a obtenção de energia. b) Anaeróbica obrigatória, pois não utiliza o oxigênio para a obtenção de energia. c) Anaeróbica facultativa, pois, na falta de oxigênio, fermentam açúcares. d) Quimiossintética, pois utiliza a energia proveniente das descargas elétricas. e) Fotossintetizante, já que utiliza o Sol para a obtenção de energia. 30) O principal tipo de reprodução das bactérias é: a) Homogonia c) Cissiparidade e) Isogamia

b) Brotamento d) Segmentação

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COLORAÇÃO DE GRAM Colorações simples tornam possível a visualização das bactérias ao microscópio, mas isso não faz distinção entre organismos de morfologia similar. Para tanto, é necessário realizar uma coloração diferencial. Existem diversos métodos de coloração utilizados para a análise de bactérias. Entre estes, o mais utilizado é a coloração desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas seqüências de coloração, com diferentes corantes, este método permite a divisão das bactérias em 2 grandes grupos. O primeiro grupo, que retém a cor do primeiro corante (o cristal violeta), é denominado Gram positivo. O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retém a cor do segundo corante utilizado (fucsina) e é denominado Gram negativo. Uma solução de iodo (lugol) é utilizada como mordente (um composto químico que fixa um corante ou outra substância ao se combinar com o mesmo e formar um composto insolúvel) para a primeira etapa da coloração. Há também um agente descorante entre a utilização de um e outro corantes. Pode-se utilizar diferentes descorantes, de acordo com a velocidade de descoloração desejada. O álcool etílico a 95% é um agente descorante mais devagar, enquanto a acetona agiliza essa etapa. Geralmente utiliza-se uma mistura de álcool etílico e acetona (95:5), obtendo uma velocidade de descoloração intermediária. A maioria dos cocos é Gram positiva com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que são os únicos Gram negativos. Assim também acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram negativos. Entre os bacilos Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium. Os víbrios são Gram-negativos. A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das bactérias é etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de material clínico bem como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da mesma. A coloração de Gram baseia-se na diferença das paredes celulares das diversas bactérias e como estas serão coradas de forma distinta. As bactérias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoproteína recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoproteínas e substâncias lipídicas. Já as consideradas Gram positivas possuem uma única e espessa camada de glicoproteína. Antes de iniciar a coloração, é necessário fazer um esfregaço, ou seja, pegar uma colônia previamente isolada ou uma alçada de uma cultura pura e transferir para uma lâmina limpa. Se for utilizada uma colônia, deve-se adicionar uma gota/alçada de solução salina a 0,9%, homogeneizando-a. É importante que o esfregaço seja bem preparado, para que, ao final da coloração, seja possível a visualização das bactérias. Também é importante não esquecer de fixaro esfregaço na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de células a ser analisada se perca durante as etapas da coloração. Na primeira etapa da coloração, o corante violeta é adicionado sobre o esfregaço. O corante, então, penetra na parede da bactéria, independente se esta é Gram positiva ou Gram negativa. Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactéria. O álcool tem papel fundamental neste método. Ao ser adicionado sobre o esfregaço corado com o Cristal violeta vai diferenciar as bactérias: - as Gram positivas, com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano serão desidratadas, e os poros na parede serão reduzidos, impedindo a saída do complexo CV-I e tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I); - as bactérias Gram negativas possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima desta camada encontra-se uma outra, de caráter lipídico (rica em LPS, lipoproteínas e outros componentes). Essa camada lipídica, em contato com o álcool, dissolve-se, deixando a camada de peptidoglicano desprotegida e permitindo a saída do complexo CV-I, tornando a célula descorada neste momento. É importante lembrar de lavar a lâmina após a etapa de descoloração, pois se restar algum resíduo de álcool, a próxima etapa não será realizada adequadamente, e os resultados poderão ser alterados.

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O esfregaço então é tratado com fucsina, que não terá efeito algum sobre as células Gram positivas, que estão com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrará na parede das células Gram negativas, corando-as de vermelho. Esta coloração é utilizada para a maioria das bactérias, mas há algumas que não se coram por este método, como as micobactérias, as bactérias espiraladas e as bactérias que não possuem parede celular. Para estes, há outros métodos de coloração, como o método de Zihel-Neelsen, o de Fontana-Tribondeau e o método de visualização em campo escuro. Alguns fatores podem influenciar nos resultados obtidos na coloração: - Os corantes empregados na técnica, se não filtrados, podem deixar resíduos (cristais) na lâmina. - Um descoramento excessivo ou insuficiente pode levar a uma incorreta diferenciação da bactéria pelo álcool. - A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram-negativas. Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos à membrana e parede da célula, como por exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes. Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula. Na prática: Preparo e fixação do esfregaço Etapas

Observações

Transferir uma alçada da cultura ou uma Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes colônia da placa para uma lâmina de culturas deve-se observar alguns detalhes: microscópio limpa. è de placa: deve-se coletar apenas 1 colônia, espalhando-a pela lâmina à isso evitará a observação de colônias diferentes na lâmina e que seja coletado um inóculo muito carregado, o que dificultará a visualização das células coradas. è de caldo: deve-se coletar apenas uma alçada e espalhá-la na lâmina à isso evita que seja coletado um inóculo muito carregado.

Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. Se Para o inóculo coletado de caldo não é tiver sido colhida colônia da placa, adicionar necessário adicionar solução salina. Mas para salina estéril para facilitar o espalhamento. colônia coletada de placa é necessário fazer a diluição na lâmina, evitando que o esfregaço fique muito concentrado o que dificulta a visualização das células coradas ao microscópio.

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Passar a lâmina com o esfregaço sobre a É importante fixar o esfregaço para que este chama do Bico de Bunsen, até que este esteja não se perca durante as etapas de lavagem completamente seco. entre a utilização de um e outro corantes

Coloração do esfregaço Etapas da coloração

O que está bactéria?

acontecendo

na pareda

da

Cobrir o esfregaço com solução de Cristal O Cristal Violeta penetra a parede de ambos os Violeta por cerca de 1 minuto. tipos de células (Gram + e Gram -)

A seguir, lavar em água corrente com o pissete. A lavagem com água é importante após cada etapa para que uma substância utilizada não interfira na ação da próxima. Nesse caso, a lavagem serve para retirar o excesso de corante.

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Cobrir o esfregaço com solução de Lugol fraco O Lugol é uma solução de Iodo e funciona por cerca de 1 minuto. como mordente neta etapa da coloração, ou seja, ele fixa o corante Cristal Violeta na parede da célula, pois forma um complexo grande: o CV-I.

Novamente lavar com água, e então lavar com O álcool absoluto, ou solução de álcoolálcool absoluto até que não saia mais corante acetona, funciona como diferenciador da da lâmina (10 – 15 segundos). coloração: è nas Gram +, o álcool desidrata a matriz glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os poros da parede e impedindo a saída do complexo CV-I, corando a célula de roxo:

è nas Gram -, o álcool dissolve a membrana externa, de caráter lipídico (lipoproteínas, fosfolipídeos, LPS), fazendo com que o complexo CV-I saia da parede, deixando a célula descorada e com os poros da matriz glicoproteica abertos:

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Lavar com água corrente em abundância, para É importante prestar bastante atenção nesta que não reste álcool sobre a lâmina. etapa, pois se restar algum álcool na lâmina a coloração não prosseguirá, já que o próximo corante não se fixará na lâmina.

Cobrir o esfregaço com fucsina por cerca de 30 A fucsina age de diferentes formas nas segundos. diferentes células: è nas Gram +, os poros estão reduzidos, impedindo que a fucsina penetre na parede celular, não alterando a cor roxa:

è nas Gram -, os poros da camada de peptidoglicano estão abertos, permitindo que a fucsina penetre, corando-as de vermelho:

Lavar com água e secar suavemente com Após secar suavemente a lâmina, observar ao papel. microscópio na objetiva de imersão (100x), com óleo de cedro/mineral e identificar a célula corada.

Sant’Anna, R.S; Cerqueira, A.M.F. Apostila de Aulas Práticas – Bacteriologia. Nutrição. Instituto biomédico. Departamento de Microbiologia e Parasitologia. Universidade Federal Fluminense, 2007.

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Exercícios Isso é só porque eu sou uma Gram negativa?

1) Em que se baseia o método da coloração de Gram? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) Por que o álcool é considerado como agente diferenciador da coloração de Gram? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) Qual é o papel do mordente (lugol)? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4) Explique a relação entre as paredes celulares das bactérias e o mecanismo da coloração de Gram. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5) Faça um esquema resumindo as etapas da coloração de Gram. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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Morfologia, reprodução e classificação dos fungos. Características do Reino Fungi - seres eucariontes, uni e pluricelulares - já foram classificados como “vegetais” por possuírem parede celular, mas sua parede possui quitina (polissacarídeo típico dos insetos e que não é encontrado em plantas) e não celulose - são quimio-heterotróficos (não produzem seu próprio alimento), por não possuírem clorofila - leveduras, mofos e cogumelos 1) Definição - Representados pelos cogumelos, bolores, mofos, orelhas-de-pau e leveduras - Organismos eucariotos - Uni ou pluricelulares - Aclorofilados - Parede celular com quitina - Quimio-heterótrofos (nutrição por absorção) - Reserva energética de glicogênio (= reserva de carboidrato dos animais) - Reprodução sexuada ou assexuada - MICOLOGIA = mykes + logos = estudo dos fungos 2) Morfologia Do ponto de vista morfológico são divididos em: a) Leveduras b) Bolores - Fungos filamentosos - Fungos dimórficos a) Leveduras - Fungos unicelulares: esféricos ou ovais, não-filamentosos. - Amplamente encontradas na natureza, pó branco cobrindo frutas e folhas.

Saccharomyces cerevisiae

Candida albicans

b) Bolores Fungos filamentosos - Maior parte dos fungos, pluricelulares, células multinucleares - Corpo = micélio (massa de filamentos) – Micélio é composto por filamentos tubulares longos de células conectadas – hifas – rápida capacidade de crescimento –

- Hifas: - septadas – com septos incompletos p/ separar as células (os poros dentro dos septos permitem a livre circulação) - cenocíticas – sem septos

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- Hifas crescem por alongamento da extremidade, e quando um fragmento é quebrado, ele pode se alongar para formar uma nova hifa. Hifa vegetativa = porção da hifa que obtém nutrientes Hifa reprodutiva ou aérea = hifa que se projeta acima da superfície sobre a qual o fungo está crescendo

Fungos dimórficos - Especialmente fungos patogênicos - Dimorfismo (duas formas de crescimento): forma de fungos filamentosos e forma de leveduras - Forma de fungo filamentoso produz hifas vegetativas e reprodutivas - Forma de levedura se reproduz por brotamento - Dependente de temperatura: 37ºC forma de levedura e 25ºC forma de fungo filamentoso

* Caso especial: Em alguns casos esporos sexuais são produzidos e o micélio se reorganiza em um corpo frutífero (chamado de cogumelo).

Corpo de frutificação: parte visível do fungo, responsável pela reprodução

Conjunto de filamentos (hifas), parte “invisível” do fungo

esporos = estruturas de dispersão dos fungos

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3) Estrutura a) Membrana citoplasmática - lipoprotéica - regula trocas com meio ambiente b) Parede celular - rígida: polissacarídeos, proteínas e lipídeos - proteção e resistência às pressões osmótica e mecânica - reconhecimento: sexual, simbioses c) Citoplasma - organelas: vacúolos, mitocôndrias, retículo endoplasmático, complexo de Golgi, ribossomos, material de reserva (glicogênio) d) Núcleo - nucléolo, vários cromossomos e proteínas, envolvidos por membrana nuclear (carioteca = eucariontes) 4) Adaptações nutricionais a) Temperaturas de crescimento - ótima: 25-30ºC - mínima: 10ºC - máxima: 40ºC - algumas espécies termófilas (> 50ºC) e psicrófilas (< 0ºC) b) pH - entre 4 e 7 c) Oxigênio - aeróbios estritos (maioria): necessitam de O2 para sua sobrevivência (ar contém 21% de O2) - anaeróbios facultativos (leveduras): podem crescer tanto na presença como na ausência de oxigênio. Não necessitam de O2 mas crescem melhor com O2. Podem usar O2 quando disponível, mas na sua ausência, são capazes de continuar seu crescimento através da respiração anaeróbia ou da fermentação. Respiração e fermentação. d) Luz - desnecessária para o crescimento vegetativo - pode ser importante para indução de estruturas reprodutivas - orientação das estruturas para descarga dos esporos e) Grau de umidade - Podem crescer sobre substâncias com baixo grau de umidade (tão baixo que impede crescimento de bactérias) f) Metabolismo de substâncias complexas - Fungos podem metabolizar substâncias complexas como lignina (componente da madeira) que bactérias não usam como nutriente 5) Nutrição a) Modo de vida: fungos são organismos quimio-heterotróficos: - Saprófitas (absorvem os nutrientes da matéria morta): principais decompositores de celulose e lignina que são os componentes principais das paredes celulares vegetais - Parasitas facultativos ou obrigatórios (absorvem os nutrientes de hospedeiros vivos) - Predadores (adaptações para capturar protistas microscópicos ou animais): secreção de substâncias mucilaginosas que levam à adesão dos organismos. As hifas invadem a presa,

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espalham‐se por todo o corpo, absorvem os nutrientes, e podem causar a morte do organismo. - Mutualistas (vivem em associação íntima com outros organismos, ambos se beneficiam) b) Nutrição por absorção - “partículas de alimentos” são muito grandes para entrarem nas hifas e serem digeridas - hifas liberam enzimas digestivas para o meio (exoenzimas), ocorrendo digestão extracelular, quebra de diferentes moléculas insolúveis (carboidratos e lipídeos) - após digestão forma-se uma grande variedade de produtos metabolizados - esses produtos são absorvidos, difundindo-se pelas hifas para todo o fungo * necessidade de água livre para difusão

corpo frutífero

hifa

micélio

hifa

substância orgânica complexa

enzimas substância orgânica absorção simples

6) Reprodução - Muitos fungos se reproduzem sexuada e assexuadamente. - Fungos filamentosos podem se reproduzir assexuadamente pela fragmentação de suas hifas. - Reprodução assexuada e reprodução sexuada podem ocorrer pela formação de esporos. - Leveduras se reproduzem de forma assexuada (divisão e esporos assexuais). a) Reprodução assexuada - sem cariogamia (fusão de núcleos) - produção de esporos assexuais no interior de um saco (esporângio) - produção de esporos assexuais nus nas pontas das hifas – conídios - simples quebra do micélio (fragmentação das hifas)

- divisão celular em fungos unicelulares (leveduras): - Leveduras de fissão: divisão simétrica. Ex: Schizosaccharomyces - Leveduras de brotamento: divisão assimétrica formando um pequena célula filha – gema. Ex: Saccharomyces

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b) Reprodução sexuada - esporos sexuais formados pela união de 2 células com fusão de seus núcleos (cariogamia) - sem diferenças morfológicas entre estruturas ♀ e ♂, apenas linhas + e – pois fungos são heterotálicos - reprodução sexual só ocorre entre talos/hifas de linhagens + e – , o que impede auto-fertilização - citoplasma de dois indivíduos com linhagens sexuais distintas ligam-se (plasmogamia) muito antes da fusão dos núcleos (cariogamia)

7) Divisões Reino Fungi é dividido em 4 grupos, baseado no modo e nas estruturas de reprodução: - Zigomiceto - Ascomiceto - Basidiomiceto - “Deuteromiceto” a) Zigomiceto - fungos pequenos e simples, filamentosos com hifas cenocíticas (sem septo) - corpo de frutificação formado apenas por uma massa pequena de esporos sobre uma haste - habitat: variado: solo, plantas e animais (parasitas) - reprodução: assexual e sexual - modo de vida: saprófitas: - importância * mofo preto do pão (Rhizopus nigrans) * Rhizopus e Mucor: produção de enzimas amilolíticas (amilases e glucoamilases) para a produção de alimentos. b) Ascomiceto - fungos de saco - grupo complexo e diversificado * fungos com micélio septado e leveduras * presença de ascos (sacos): estruturas com esporos - habitat: variado: solo, água, plantas, animais - reprodução: assexual e sexual - modo de vida: * saprófitas: decompondo diferentes tipos de materiais (excrementos, madeira, folhas, ...)

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* parasitas: plantas (os mais importantes), insetos, peixes * simbiontes: líquens, micorrizas - importância: * produção de antibióticos (Penicillium chrysogenum) * doenças: plantas, animais (Pneumocystis carinii) * micotoxinas (Aspergillus spp.) * espécies comestíveis de alto valor: trufas c) Basidiomiceto - grupo grande e diverso, inclui fungos que produzem cogumelos * esporos sexuais externos produzidos em basídios * micélio bem desenvolvido e septado - habitat: fungos terrestres: solo, plantas, animais e madeira - reprodução: * sexual: através da produção de esporos em basídios * assexual - esporos - gemulação (leveduras) - fragmentação de hifas - importância: comestíveis e venenosos - modo de vida: * decompositores: principais agentes de decomposição de celulose e lignina * simbiontes: micorrizas * patógenos: principalmente de plantas (ferrugens) Até agora... * grupos com fungos TELEOMORFOS, que produzem esporos sexuais e assexuais * alguns ascomicetos perderam a capacidade de se reproduzir sexualmente e são chamados ANAMORFOS. Exemplo: Penicillium é um anamorfo que surgiu da mutação de um teleomorfo * muitas vezes o mesmo fungo, em formas diferentes (sexual e assexual), estava classificado em dois filos diferentes e somente após a verificação que estas duas formas pertenciam ao mesmo fungo é que ele era definitivamente classificado. d) “Deuteromiceto” - Categoria de espera - Fungos em que o ciclo sexual ainda não foi observado - Uso de sequenciamento de rRNA para classificar os fungos 8) Importância - Desde a antiguidade: * vinho * pão * cerveja * uso na medicina pelos nativos - Nossas vidas estão ligadas aos fungos: descoberta da Penicilina - Decomposição da matéria orgânica * atividade de maior importância – recicladores de nutrientes do meio ambiente * liberação de nutrientes para as plantas - Destruição de produtos * madeira: postes, estradas de ferro, navios, casas, tecidos, lentes, … - Micotoxinas * ocratoxinas: Aspergillus ochraceous e Penicillium viridicatum: cereais, atrofia renal * aflatoxinas: Aspergillus flavus e A. parasiticus: grãos oleaginosos, câncer do fígado * fumonisinas: Fusarium moniliforme: milho, câncer do esôfago - Antibióticos e outros medicamentos * penicilina: Penicillium chrysogenum

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* cefalosporina: Cephalosporium acremonium * ciclosporina: Cylindrocladium lucidum, Tolypocladium infatum * Propriedades antitumorais e antivirais - Alimentos * cogumelos: cultivados desde ano 600 na China; a partir de 1650 na França, Agaricus bisporus, o champignon de Paris, Tuber melanosporum, a trufa negra. - Produção de alimentos * Queijos gorgonzola, camembert (Penicillium camembertii), roquefort (P. roquefortii) * pães * cervejas * Saquê (Aspergillus oryzae) - Produtos de valor industrial * álcool * enzimas: amilases, celulases, catalases, proteases, pectinases, lacases * ácidos orgânicos: fumárico, láctico (Rhizopus spp.), cítrico (Aspergillus niger) * vitaminas B: leveduras * reguladores de crescimento de plantas: ex. Giberelinas - Simbiontes * Micorrizas (associação entre fungos e raízes). * Líquens (associação entre algas e fungos) - Doenças de plantas * perdas econômicas * controle biológico de plantas daninhas (mico herbicidas) - Doenças no homem e animais * pouco agressivos * mais comuns em regiões tropicais * pacientes imunodeprimidos: AIDS, câncer, transplantes, ex. Candidíases, Pneumocystis carinii pneumonia em aidéticos - Envenenamentos * Amanita spp. - Alergias * esporos - Controle biológico de doenças e pragas * Trichoderma spp., Penicillium spp., Clonostachys rosea Exercícios 1) Quais microrganismos formam o grupo dos fungos? Defina esse grupo a partir das principais características. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) Como os fungos se dividem do ponto de vista morfológico? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) O que são as leveduras? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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4) Como são classificados os bolores? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5) Defina as seguintes estruturas: a) micélio __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ b) hifa __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ c) hifa cenocítica __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ d) hifa septada __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ e) hifa vegetativa __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ f) hifa reprodutiva __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 6) O que é um fungo dimórfico? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 7) Qual a diferença de crescimento entre fungos e bactérias com relação ao grau de umidade? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 8) Descreva os modos de vida dos fungos de acordo com a nutrição. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 9) Como os fungos realizam sua nutrição? Descreva com detalhes. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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10) Os fungos filamentosos e as leveduras podem realizar reprodução assexuada. Explique quais as formas para cada um dos grupos. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 11) Como ocorre a reprodução sexuada nos fungos? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 12) Quais são as divisões do Reino Fungi? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 13) Cite dois benefícios e dois prejuízos causados pelos fungos ao homem. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 14) No processo de fabricação do pão, um ingrediente indispensável é o fermento, constituído por organismos anaeróbicos facultativos. a) Que organismos formam o fermento? __________________________________________________________________________________ b) Por que o fermento faz o pão crescer? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 15) "Engana-se quem acha que uma salada com cogumelos é um prato vegetariano. Cientistas descobriram que as características genéticas dos fungos (categoria à qual pertence os cogumelos) estão muito mais próximas às dos animais do que às dos vegetais. Cite três características dos fungos que os tornam mais próximos de animais do que dos vegetais. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 16) O molho de soja mofado vem sendo usado na China, há mais de 2.500 anos, no combate a infecções de pele. Durante a 2a Guerra Mundial, prisioneiros russos das prisões alemãs, que aceitavam comer pão mofado, sofriam menos infecções de pele que os demais prisioneiros que recusavam esse alimento. a) O que é mofo? ________________________________________________________________________________ b) Por que esses alimentos mofados podem combater as infecções de pele? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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17) Planta ou animal? Os fungos não são nem uma coisa nem outra. Cite uma característica dos fungos que se assemelha aos animais e uma outra que se assemelha às plantas. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 18) Quanto a indivíduos do Reino Fungi podemos afirmar que: a) podem produzir antibióticos e fazer fotossíntese. b) podem formar micorrizas e fazer fermentação c) são exclusivamente unicelulares e procariotos d) são autotróficos e pluricelulares e) são eucariotos e quimiossintéticos 19) Certos fungos são empregados na produção de queijos, sendo responsáveis por sabores característicos. Os fungos Penicillium roquefortii e Penicillium camembertii, por exemplo, são utilizados na fabricação de queijos tipos roquefort e camembert, respectivamente. Pela análise dos nomes científicos acima citados, podemos concluir que esses seres NÃO pertencem ao (à) mesmo(a): a) gênero. b) classe. c) família. d) ordem. e) espécie. 20) Os fungos estão presentes em nossa vida diariamente, tanto na fabricação de alimentos como parasitando plantas e animais, inclusive o homem. Por apresentarem características particulares que os diferem das plantas e dos animais, constituem um reino particular: o Reino Fungi. Dentre as características a seguir, assinale aquela EXCLUSIVA dos fungos. a) Reproduzem-se por esporos. b) Armazenam glicogênio. c) São heterótrofos por absorção. d) São aclorofilados e parasitas. e) Não apresentam tecidos condutores de seiva. 21) Entende-se por micélio: a) um conjunto de hifas emaranhadas. c) o mesmo que basidiósporo. e) nenhuma das anteriores.

b) o corpo de frutificação dos fungos. d) um processo de união sexual das hifas.

22) Todos os itens indicam alguma importância ligada à atividade de fungos, exceto: a) podem causar doenças chamadas micoses. b) desempenham papel fermentativo. c) produção autotrófica de substâncias orgânicas para consumo de outros seres. d) alguns produzem antibióticos. e) participação na formação de liquens. 23) Assinale a alternativa incorreta a respeito dos fungos. a) existem espécies parasitas c) possuem reprodução sexuada e assexuada e) as suas hifas contêm basicamente celulose

b) existem alguns tipos unicelulares d) têm nutrição heterotrófica

24) Em qual das atividades humanas listada abaixo não há participação de fungos? a) Produção de álcool combustível b) Fabricação de certos antibióticos c) Indústria de cerveja e do vinho d) Pesquisas em controle biológico e) Produção industrial de iogurte 25) A ferrugem do cafeeiro, o “sapinho” da boca e a histoplasmose são doenças causadas por: a) vírus b) fungos c) bactérias d) protozoários

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Morfologia, características e propriedades gerais dos vírus. VÍRUS – UM GRUPO A PARTE - Até agora: vida se organiza em unidades mínimas, as CÉLULAS, e as organelas e as moléculas que as constituem normalmente não têm vida independente - Exceção: VÍRUS – vida organizada em estruturas mais simples que as células - Descobertos em 1935, mas suspeitavam da sua existência pois muitas doenças infecciosas não eram causadas por nenhum microrganismo visível ao microscópio comum - Apenas com microscópio eletrônico foi possível descobrir inúmeros vírus e esclarecer suas estruturas - Vírus = basicamente moléculas vivas de DNA ou RNA, envolvidas por uma cápsula protéica, e com capacidade de se reproduzir unicamente no interior de células hospedeiras – são parasitas - Primeiro vírus isolado = vírus do mosaico do tabaco (TMV) 1) Estrutura e morfologia Do ponto de vista morfológico: várias formas: cilíndricos, arredondados, poliédricos,...

- Material genético: DNA ou RNA, ambos de fita simples ou dupla - Capsídeo: camada de proteínas que envolve o material genético - Envelope ou cápsula externa (em alguns vírus): de composição lipoprotéica, semelhante à membrana plasmática das células - Parasitas obrigatórios: dependem da “máquina” celular (ribossomos, enzimas) para se multiplicar - Especificidade: cada vírus só se reproduz dentro de determinado tipo de célula, há os que parasitam apenas vegetais, apenas animais ou apenas bactérias

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- A maioria dos pesquisadores da área biológica considera complexa a tarefa de definir se os vírus são seres vivos ou seres não-vivos. - Argumentos a favor 1. Os vírus apresentam reprodução; embora necessitem da ajuda da célula hospedeira para se reproduzirem; 2. A presença de material genético (DNA ou RNA), e consequentemente a capacidade de sofrerem mutação; 3. Capacidade de adaptação. - - Argumentos contra 1. O fato dos vírus serem acelulares. 2. A ausência de metabolismo próprio,necessitando portanto, de constituintes celulares de outro organismo. 2) Retrovírus – transcrição invertida - Seres vivos celulares: DNA como material genético, transcreve para RNA que comanda a síntese de proteínas.

DNA

transcrição

RNA

traduçã o

proteína

Em alguns vírus o material genético é o RNA, eles têm uma enzima especial chamada transcriptase reversa para transformar o RNA em DNA após a infecção da célula hospedeira. Só assim podem fazer a síntese de proteínas para se reproduzir. O caminho da transcrição é invertido e por isso esses vírus são chamados de RETROVÍRUS

RNA

transcrição

DNA

transcrição

RNA

traduçã o

proteína

- Exemplo: HIV, vírus causador da AIDS (SIDA) é um retrovírus com alta especificidade pois ataca os linfócitos, células relacionadas à defesa imunológica 3) Bacteriófagos – DNA Vírus - Bacteriófagos (fagos) são vírus parasitas de bactérias - Ao se instalar em uma bactéria, o bacteriófago inicia um ciclo vital que pode ser: ciclo lítico ciclo lisogênico a) Ciclo lítico: provoca a morte da célula hospedeira.

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b) Ciclo lisogênico: não provoca a morte da célula hospedeira. Mas posteriormente pode se transformar em um ciclo lítico.

4) Vírus e as doenças - Algumas doenças humanas causadas por vírus: AIDS, sarampo, rubéola, gripe, hepatite, herpes, poliomielite, caxumba, varíola, raiva (hidrofobia), dengue, febre amarela, … - Como os vírus causam doenças? * causar lise da célula hospedeira quando eles se multiplicam * induzir organelas das células chamadas lisossomos a liberar suas enzimas no citoplasma, causando uma autodigestão da célula * produzir certas substâncias que atuam como toxinas, alterando o metabolismo celular - Alguns vírus causadores de doenças podem permanecer por anos no indivíduo, ficando ativos em certas épocas e inativos em outras. Exemplo: vírus do herpes. 5) Nossas defesas contra os vírus - Antibióticos - são eficientes contra os vírus como são contra as bactérias? - Infelizmente eles não têm nenhuma ação contra os vírus. - Os vírus dependem do equipamento bioquímico das células para se reproduzirem, dificilmente podem ser atacados por substâncias que interferem nas suas reações químicas, pois as células parasitadas também teriam seu metabolismo prejudicado! - Drogas antivirais: para a AIDS existe o AZT (inibidor da transcriptase reversa) e o Saquinavir (inibidor de protease, que impede síntese das proteínas componentes das cápsulas dos novos vírus). Coquetel é uma associação de drogas inibidoras de enzimas, reduz muito a taxa de vírus no sangue de portadores quando iniciado logo que a doença é diagnosticada. - Vacinas: melhor solução até o momento é a imunização pelas vacinas (sarampo, caxumba, rubéola, hepatite, poliomielite). Infelizmente não há vacina muito eficaz contra gripe – vírus sofrem mutações muito rapidamente. O mesmo problema acontece com o vírus da AIDS, para o qual ainda não há vacina.

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Exercícios 1) O que são os vírus? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) Como são constituídos (partes básicas)? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) Onde se reproduzem os vírus? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4) A que se deve a especificidade dos vírus? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5) Alguns estudiosos consideram que os vírus são seres vivos. Em que se baseia essa ideia? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 6) Alguns estudiosos consideram que os vírus não são seres vivos. Em que se baseia essa ideia? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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__________________________________________________________________________________ 7) O vírus responsável pela Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é um retrovírus. Qual o tipo de ácido nucléico que constitui o material genético dos retrovírus? A denominação retrovírus refere-se a que característica desse vírus? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 8) O que é um bacteriófago? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 9) Quais os ciclos vitais que um bacteriófago pode iniciar ao se instalar em uma bactéria? Explique a diferença entre os ciclos. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 10) Os antibióticos são eficazes contra os vírus? Por quê? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 11) Cite cinco exemplos de viroses humanas. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 12) A AIDS é uma doença que, sem dúvida, ameaça a humanidade. As tentativas para o desenvolvimento de uma vacina têm sido infrutíferas. Explique, do ponto de vista genético, qual a causa desse insucesso. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 13) Explique onde atua o AZT (droga que compõem o coquetel contra o HIV), o que ela impede e qual a consequência de seu uso para o vírus. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 14) Em 1917, o sábio francês d'Herelle verificou que uma cultura de bacilos da disenteria estava sendo destruída por um agente cuja visualização não era possível de ser feita. Essa foi a primeira constatação da existência de vírus que somente atacavam bactérias. Mais tarde esses vírus foram genericamente denominados: a) bacteriostáticos b) bacteriófagos c) bacteróides d) bactérios e) bactericidas

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15) O HIV (vírus da imunodeficiência humana) é o causador da AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida). Em relação a esse vírus podemos afirmar que é composto de: a) DNA e ataca as hemácias. b) RNA e ataca as hemácias. c) DNA e ataca os linfócitos T. d) RNA e ataca os linfócitos T. e) RNA e ataca as plaquetas. 16) Indique em qual dos seres vivos, citados a seguir, o ácido desoxirribonucléico (DNA) e o ácido ribonucléico (RNA) não ocorrem em um mesmo indivíduo: a) bactéria b) protozoário c) vírus d) fungos e) algas 17) Entre as características biológicas citadas a seguir, a única pode ser encontrada nos vírus é um: a) programa genético específico que permite a reprodução de novos seres do mesmo tipo. b) processo metabólico que requer compostos nitrogenados e de carbono, incluindo os produzidos pelos autótrofos. c) maquinaria biológica que pode utilizar a energia armazenada em sua célula ou obtida dos alimentos. d) maquinaria biossintética para a síntese de proteínas. e) membrana celular que estabelece um limite e regula as trocas de matéria e energia. 18) Medicina do futuro recruta vírus "bonzinhos" para vencer câncer e AIDS através de batalhas genéticas.- Utilizando vírus inofensivos como vetores de genes, cientistas estão colocando, nas células dos pacientes, o material genético que os médicos desejam. (Folha de São Paulo-dez/92). Tal técnica é possível, pois, na célula hospedeira, o DNA do vírus: a) inativa as diferentes funções vitais. b) comanda a produção de proteínas. c) inibe a respiração celular. d) induz uma mensagem deletéria. e) estimula a duplicação do DNA celular. 19) É característica do ciclo reprodutivo de um bacteriófago a: a) penetração por inteiro na célula hospedeira. b) injeção do material genético, RNA, no interior da célula hospedeira. c) injeção do material genético, DNA, no interior da célula hospedeira. d) reprodução sexuada denominada conjugação. e) reprodução assexuada denominada divisão binária. 20) O vírus da AIDS é formado por uma cápsula esférica contendo em seu interior o material genético. Este tipo de vírus é chamado RETROVÍRUS porque: a) o RNA produz um "molde" de molécula de DNA. b) o RNA, torna-se uma molécula autoduplicável. c) o DNA possui cadeia simples sem timina. d) o DNA possui mecanismos de retroação. e) o DNA e RNA não se pareiam 21) Os vírus são entidades que só apresentam propriedades de vida quando estão no interior de células vivas. Fora delas, deixam de apresentar tais propriedades e podem cristalizar-se, como os minerais. Os vírus são importantes agentes causadores de doenças humanas, como: a) AIDS, sarampo e difteria. b) sarampo, catapora e herpes. c) cólera, febre amarela e tétano. d) febre amarela, sarampo e tétano. e) disenteria bacilar, hanseníase e poliomielite.

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22) O gráfico abaixo demonstra, no organismo humano, a relação entre os linfócitos T e o vírus da imunodeficiência humana (HIV), ao longo de dez anos de curso da síndrome da deficiência imunológica adquirida (AIDS).Explique as razões das quedas das concentrações de:

a) linfócitos T __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ b) HIV. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 23) VÍRUS E ANTIBIÓTICOS Considerados como uma das maiores conquistas da ciência moderna, os antibióticos, juntamente com as vacinas e os soros, têm salvado muitas vidas. Substâncias quimicamente muito diferentes entre si, os antibióticos podem ser naturais — quando produzidos por seres vivos, como fungos e bactérias — ou sintéticos— quando produzidos em laboratório a partir de produtos químicos. Os antibióticos atuam de diferentes maneiras sobre as células bacterianas: Podem bloquear a síntese da parede celular; desorganizar estruturalmente a membrana plasmática; agir sobre a atividade dos ácidos nucléicos, quando inibem a duplicação do DNA ou interferem na síntese de proteínas, bloqueando, por exemplo, a formação do RNA mensageiro (RNAm). Mas os vírus são organismos acelulares; não possuem parede celular nem membrana plasmática e se mostram absolutamente inertes quando fora de uma célula viva. Assim, os antibióticos não fazem qualquer efeito sobre eles; os vírus são, pois, "imunes" à ação destas substâncias. Porém, graças à natureza protéica da cápsula viral, que atua como antígeno, um organismo infectado pode se defender contra os vírus produzindo anticorpos específicos, como acontece na gripe. Em alguns casos, a produção de anticorpos específicos pode ser "incentivada" através do uso de vacinas; é o caso, por exemplo, das vacinas anti-rábica e antipoliomielítica, de eficácia largamente comprovada. Sobre o texto “Vírus e antibióticos”, responda: a) Os antibióticos têm algum efeito sobre os vírus? Por quê? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ b) Como nosso organismo pode se defender contra as viroses? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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Crescimento microbiano - Crescimento microbiano refere-se ao aumento no NÚMERO de células e não ao TAMANHO das células. - Microrganismos em “crescimento” estão, na verdade, aumentando seu número e se acumulando em colônias (grupos de células que podem ser visualizadas sem o uso de microscópio) - Uma célula dará origem a duas ao fim de um certo tempo, chamado de tempo de geração ou de duplicação. - Por que estudar o crescimento microbiano? * controlar o crescimento dos microrganismos patogênicos * controlar o crescimento dos microrganismos que contaminam e degradam os alimentos * estimular o crescimento dos microrganismos que estamos interessados em estudar 1) Fatores físicos - Temperatura - pH - pressão osmótica a) Temperatura Taxa de crescimento X temperatura - Temperatura de crescimento mínima: < temperatura onde a espécie é capaz de crescer - Temperatura de crescimento ótima: onde a espécie apresenta melhor crescimento - Temperatura de crescimento máxima: > temperatura, onde ainda é possível o crescimento

- Maioria dos microrganismos cresce dentro de variações limitadas de temperatura, com somente 30 oC de diferença entre a temperatura máxima e a mínima de crescimento - Maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres humanos - Microrganismos são classificados em 3 grupos principais considerando as variações nas temperaturas de crescimento: - PSICRÓFILOS: crescem em baixas temperaturas - MESÓFILOS: crescem em temperaturas moderadas - TERMÓFILOS: crescem em altas temperaturas SURGIRAM MAIS DUAS CLASSES... Curva de crescimento característica de diferentes microrganimos Termófilos extremos

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Psicrófilos – inicialmente eram organismos capazes de crescerem a 0 oC mas existem 2 grupos diferentes capazes de crescerem a 0 oC 1o grupo: - contém somente psicrófilos, - podem crescer a 0 oC, mas temperatura ótima de crescimento é 15 oC, - são extremamente sensíveis a altas temperaturas e não crescem na temperatura ambiente (25 o C) - profundezas de oceanos, regiões polares, não causam problemas na preservação de alimentos 2o grupo: - podem crescer a 0 oC, mas crescimento ótimo entre 20 oC e 25 oC, - não crescem em temperaturas maiores que 40 oC - podem crescer nas temperaturas usadas em refrigeradores, são mais encontrados em alimentos estragados - são chamados de PSICROTRÓFICOS Mesófilos - mais encontrados - Temperatura ótima de crescimento entre 30 oC e 40 oC - se adaptaram para viver no corpo de animais: muitas bactérias patogênicas têm temperatura ótima de crescimento de 37 oC - maioria dos microrganismos que degradam alimentos e são patogênicos Termófilos - crescem em altas temperaturas - temperatura ótima de crescimento entre 60 oC e 65 oC: solo aquecido pelo sol e águas termais - muitos não crescem em temperaturas abaixo de 45 oC - endosporos de bactérias termofílicas são resistentes ao calor - podem sobreviver ao tratamento por aquecimento em alimentos enlatados - elevação da temperatura nos alimentos estocados pode permitir a germinação destes endosporos, degradando os alimentos - não são considerados um problema de saúde pública Hipertermófilos ou termófilos extremos - Temperatura ótima de crescimento = 90 oC ou superior, encontrados em fontes de águas quentes associadas à atividade vulcânica (normalmente usam enxofre no seu metabolismo) - Temperaturas mais alta em que crescimento bacteriano foi observado é de 110 oC encontrada nas regiões hidrotermais nas profundezas do oceano Refrigeração - método para preservação de alimentos pois diminui a velocidade de reprodução dos microrganismos em baixas temperaturas - microrganismos podem sobreviver em temperaturas próximas ao congelamento (dormentes) mas seu número diminui gradualmente - psicrotróficos não crescem bem em baixas temperaturas (comparado com os psicrófilos) mas dependendo do tempo de contato eles podem degradar os alimentos – micélios de fungos recobrindo alimentos podem causar alteração de cor e sabor - IMPORTANTE: manter refrigeradores com temperaturas bem ajustadas pois assim os psicrotróficos crescerão lentamente e a maioria dos patogênicos serão incapazes de crescer Quando os microrganismos se multiplicam nos alimentos? Condições ideais nutrientes, umidade e temperatura!

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Microrganismos patogênicos se multiplicam em T entre 5ºC a 60ºC (zona de perigo). Preferem T de verão ou do nosso corpo (37ºC). GELADEIRA!

Temperaturas em que ocorre degradação dos alimentos

Baixas temperaturas são importantes para evitar o crescimento de patógenos ou de microrganismos que degradam os alimentos.

b) pH (acidez ou alcalinidade de uma solução) - Bactérias: maioria cresce melhor em variações pequenas de pH, sempre perto da neutralidade (pH 6,5 – 7,5), poucas bactérias crescem em pH ácido (pH 4,0) - alimentos como chucrute, pepino em conserva e muitos queijos não sofrem deterioração, pois têm ácidos produzidos durante a fermentação bacteriana - Fungos filamentosos e leveduras: crescem em variações de pH maiores que as bactérias, com valores ótimos de pH entre 5 e 6 - Alcalinidade (base) inibe o crescimento microbiano mas é pouco usada na preservação de alimentos

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c) Pressão osmótica (concentração de sal) - Microrganismos necessitam de água para crescimento. Eles retiram da água, presente no seu meio ambiente, a maioria dos nutrientes solúveis. Cada célula possui 80 – 90 % de água. - Osmose é o movimento líquido de moléculas de solvente através de uma membrana seletivamente permeável, de uma área com alta concentração de moléculas de solvente (baixa concentração de moléculas de soluto) para uma área de baixa concentração de moléculas de solvente (alta concentração de moléculas de soluto). - Nos sistemas vivos, principal solvente é a água! - Pressão osmótica: - pressão necessária para impedir o movimento de água pura (água sem solutos) para uma solução contendo alguns solutos OU - pressão necessária para interromper o fluxo de água através da membrana seletivamente permeável - 3 tipos de soluções osmóticas: - solução isotônica - solução hipotônica - solução hipertônica

* Quando uma célula microbiana se encontrar em uma solução contendo uma concentração de solutos superior àquela do interior da célula (hipertônica), ocorrerá a passagem da água de dentro da célula, por meio da membrana plasmática, para o meio com alta concentração de solutos. A perda de água por osmose causa a plasmólise ou a diminuição (encolhimento) do citoplasma da célula.

- Qual a importância desse fenômeno? Inibe o crescimento no momento em que a membrana se separa da parede celular!

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- Como usar esse fenômeno na preservação dos alimentos? - Adição de sais (ou outros solutos como açúcar) em uma solução (causa aumento da pressão osmótica); - Alimentos como: peixe salgado, mel e leite condensado são preservados por esse mecanismo; - Alta concentração de sal ou de açúcar remove a água do interior da célula microbiana impedindo seu crescimento!!! - Classificação dos microrganismos com relação ao sal: - Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença de sal no meio - Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio - Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada - Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações para crescimento (microrganismos do Mar Morto, 30% de sal para crescimento)

2) Fatores químicos - Água - fontes de carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo - fontes de potássio, magnésio e cálcio - oligoelementos - oxigênio - fatores orgânicos de crescimento a) Água - Essencial para os microrganismos - Disponibilidade variável no ambiente - Regulação da pressão osmótica: em ambiente com baixa concentração de água, o microrganismo usa mecanismos para obter água através do aumento da concentração de solutos internos, seja pelo bombeamento de íons para o interior celular ou pela síntese de solutos orgânicos (açúcares, álcoois ou aminoácidos). - Regulação térmica b) Fontes de carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo - Carbono: - essencial para síntese dos compostos orgânicos para a viabilidade celular (elemento estrutural básico para os seres vivos) - organismos quimio-heterotróficos: obtém C a partir de materiais orgânicos (proteínas, carboidratos e lipídeos) - organismos quimio-autotróficos e os fotoautotróficos: obtém C a partir de dióxido de carbono (CO2) - Nitrogênio: síntese do “grupo amino” dos aminoácidos (proteínas), síntese dos ácidos nucléicos (DNA, RNA) e ATP (molécula energética) - Enxofre: síntese de aminoácidos contendo S (proteínas) e de vitaminas (tiamina e biotina) - Fósforo: síntese dos ácidos nucléicos (DNA, RNA), fosfolipídeos componentes da membrana celular e ATP (molécula energética)

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c) Fontes de potássio, magnésio e cálcio - também são elementos essenciais para os microrganismos - frequentemente encontrados como co-fatores para as reações enzimáticas d) Oligoelementos (elementos traços) - ferro, cobre, molibdênio, zinco - utilizados como co-fatores essenciais para atividade de algumas enzimas - água contém todos os elementos traços e) Oxigênio - extremamente importante no desenvolvimento microbiano

AERÓBIOS - Estritos ou obrigatórios: necessitam de O2 para sua sobrevivência (ar contém 21% de O2); - Facultativos (ou anaeróbios facultativos): não necessitam de O 2 mas crescem melhor com ele. Na ausência de O2 são capazes de continuar seu crescimento pela respiração anaeróbia ou fermentação. A eficiência na produção de energia diminui quando o O 2 não está disponível. Ex: Escherichia coli, - Microaerófilos: necessitam de O2 mas em concentração menor que a encontrada no ar. São sensíveis a algumas formas tóxicas de oxigênio produzidas em concentrações letais quando em altas concentrações de oxigênio. ANAERÓBIOS - Aerotolerantes: não necessitam de O2 mas crescem melhor sem ele pois não podem usá-lo para seu crescimento. Ex: Lactobacillus; - Estritos ou obrigatórios: não toleram O2 (letal). Ex: gênero Clostridium = tétano e botulismo.

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f) Fatores orgânicos de crescimento - São compostos orgânicos essenciais que o microrganismo não é capaz de sintetizar e precisam ser retirados do seu meio ambiente - Vitaminas são fatores orgânicos de crescimento para os homens, atuam como coenzimas (necessárias para atividades das enzimas) - Fatores necessários para algumas bactérias: vitaminas (coenzimas), aminoácidos, purinas e pirimidinas Exercícios 1) O crescimento microbiano se refere a um aumento de número ou de tamanho de células microbianas? Explique. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) Por que é importante estudar o crescimento microbiano? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) Quais fatores físicos são necessários para o crescimento microbiano? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4) Quais fatores químicos são necessários para o crescimento microbiano? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5) De acordo com a temperatura de crescimento, descreva os 5 grupos de classificação dos microrganismos. Desenhe o gráfico para auxiliar na descrição. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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6) Em um gráfico de Taxa de crescimento X Temperatura, quais são as 3 temperaturas que podem ser definidas? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 7) Quando se prepara uma grande quantidade de alimento, no caso arroz, como devemos proceder o resfriamento? Por quê? Observe o gráfico para auxiliar na explicação. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ______________________________________ ______________________________________ 8) Por que devemos manter os refrigeradores bem ajustados? Qual a efeito das temperaturas baixas nos microrganismos? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 9) Qual é o principal grupo, com relação a classificação por temperatura, que degrada os alimentos? Por quê? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 10) Qual o problema com os endosporos de bactérias termófilas? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 11) Qual o pH de crescimento das bactérias? E dos fungos? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 12) O que é pressão osmótica? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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13) Explique e ilustre utilizando uma célula bacteriana os 3 tipos de soluções osmóticas existentes. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

14) Como o uso de sal ou de açúcar interfere no crescimento microbiano? Explique em detalhes. Cite 2 exemplos de alimentos preservados por esse mecanismo. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 15) De acordo com a quantidade de sal, descreva os 4 grupos de classificação dos microrganismos. Desenhe o gráfico para auxiliar na descrição. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

16) Normalmente os macronutrientes (necessários em quantidades relativamente altas) são designados como CHONPS. Qual o significado de cada letra e para que cada um desses elementos é necessário? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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17) Para que são usados potássio, magnésio e cálcio? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 18) O que são elementos traços? Como podem ser chamados? Quais são? Para que servem? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 19) De acordo com as necessidades de oxigênio, descreva os 5 grupos de classificação dos microrganismos. Desenhe a figura dos tubos de ensaio para auxiliar na descrição. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

20) O que são fatores orgânicos de crescimento? Cite um exemplo __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 21) Qual das temperaturas certamente causaria a morte de um microrganismo mesofílico? a) 20 oC b) 9 oC c) 37 oC d) 60 oC 22) A denominação de oligoelementos se refere: a) aos elementos CHONPS b) às vitaminas c) ao nitrogênio, fósforo e enxofre d) aos elementos minerais necessários em pequenas quantidades e) às substâncias tóxicas

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Meios de Cultura - Definição de Meio de Cultura: “Associação equilibrada de agentes químicos (nutrientes, pH, …) e físicos (temperatura, viscosidade, atmosfera, …) que permitem o cultivo de microrganismos fora de seu “habitat” natural”. OU “Material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de microrganismos”. - grandes variações: bactérias que crescem em qualquer meio de cultura, outras precisam de meios especiais e existem aquelas que não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura já desenvolvido. - Inóculo: microrganismos colocados em um meio de cultura para iniciar o crescimento (verbo é inocular) - Cultura: microrganismos que crescem e se multiplicam nos meios de cultura - Aplicação: - Isolamento - Identificação - Quantificação - Conservação - Multiplicação

a) Critérios para escolher o meio de cultura para o crescimento de um microrganismo - Meio adequado: conhecer fisiologia dos microrganismos - Conter os nutrientes corretos para que o microrganismo de interesse possa crescer: Fonte de Carbono Fonte de Nitrogênio Fonte de Energia Fonte de Sais Minerais Vitaminas e Aminoácidos - Conter a quantidade de água necessária - pH ajustado - Quantidade específica de oxigênio ou mesmo sua ausência * Além disso, devemos saber que: - Meio deverá inicialmente ser estéril (não deverá conter microrganismos vivos, somente os microrganismos desejados que foram adicionados ao meio) - Cultura deverá ser incubada na temperatura adequada para seu crescimento - Grande variedade de meios de cultura: não há meio de cultura universal - Maioria dos meios, disponíveis em forma comercial, já contêm todos os componentes desejados, sendo necessário somente adicionar água e esterilizar b) Preparo de um meio de cultura - Pesagem dos componentes - Solubilização dos componentes - Determinação e ajuste de pH - Distribuição em recipientes adequados - tampar com “chuchu” ou outro meio adequado - acondicionar para esterilização - Esterilizar (autoclavação), temperatura 121 oC - Tempo de esterilização (ver variáveis) - Conservação – tempo e temperatura - recipientes: * Placa - sólido * Tubo

- líquido - sólido: horizontal e inclinado

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c) Classificação dos meios de cultura 1. Quanto à origem Naturais – meios que existem prontos na natureza. Ex. leite, sangue, caldo de frutas, etc. Artificiais - meios elaborados. Ex. Agar nutriente, caldo simples, etc. 2. Quanto à composição Complexos ou Indefinidos – meios que, além de todos os componentes conhecidos, contêm em sua composição sangue, ovos, extrato de levedura, leite, extratos de plantas, entre outros, que não possuem a composição química totalmente conhecida Sintéticos ou Quimicamente definidos – meios com composição química conhecida. Quantidades precisas de compostos químicos orgânicos ou inorgânicos altamente purificados, adicionados a água destilada. Ex. Meio para lactobacilos e bifidobacterias 3. Quanto ao estado físico (ou à consistência): Meios líquidos – nutrientes dissolvidos em uma solução aquosa, como um caldo. Utilizados para ativação das culturas, repiques de microrganismos, ... Meios semissólidos – possuem na sua composição, além dos nutrientes, uma quantidade de ágar (agente solidificante) na porcentagem de 0,75 a 0,5% (concentração menor que 15g/L), que confere consistência intermediária, permitindo crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e para conservação de culturas. Meios sólidos – têm uma quantidade maior do agente solidificante, cerca de 1,5% a 2% de ágar (concentração maior que 15g/L). São utilizados para cultivo, isolamento e avaliação de populações microbianas (contagens). 4) Quanto à finalidade: Meios de pré-enriquecimento – meios para dessensibilização de microrganismos injuriados, são usados em amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). Ex. Água peptonada, caldo lactosado Meios de enriquecimento – meios para estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas alguns podem inibir o crescimento de outros. Ex. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas (líquidos). Meios enriquecidos – meios que proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixo número ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos (com dificuldades de nutrição). Ex. Agar sangue, BHI (Brain Heart Infusion), Sabouraud, Meios com leite. Meios diferenciais – meios que têm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos de um determinado grupo ou espécie bacteriana facilitando a detecção do microrganismo desejado. Ex. meio Eosina Azul de Metileno, Ágar MacConkey , Ágar sangue. Meios seletivos – meios que têm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, favorecendo o crescimento do microrganismo de interesse. Ex. ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey. Meios de triagem – meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação de muitos microrganismos. Ex. ágar tríplice açúcar e ferro.

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Meios de identificação – meios para realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos a identificação. Ex. meios Oxidação/Fermentação, Agar Citrato, Caldo nitrato, Caldo triptofano. Meios de dosagem – meios para dosagem de substâncias como: vitaminas, aminoácidos, antibióticos e desinfetantes. Meios de contagem – meios para determinação quantitativa da população microbiana. Ex. Agar de Contagem em Placas, Agar Batata Dextrose (BDA). Meios de transporte, estocagem ou manutenção – meios para manter a viabilidade dos microrganismos por mais tempo. Ex: Ágar Sabouraud, Meios com leite.

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d) Ágar ou agar - ágar = agente solidificante utilizado quando se quer um meio sólido - polissacarídeo complexo obtido de algas marinhas - usado para deixar alimentos como geléias e sorvetes mais espessos - poucos microrganismos podem degradá-lo - ele se liquefaz (torna-se líquido) a cerca de 100 oC (temperatura de ebulição da água) e ao nível do mar permanece líquido até que a temperatura diminua até 40 oC - para usar em laboratório, ágar é mantido em banho-maria a uma temperatura de 50 oC, que não causa danos as bactérias quando adicionados sobre elas - após solidificação o ágar pode ser incubado até 100 oC sem perder suas características e) Armazenamento dos meios de cultura - Inicialmente devem ser guardados na geladeira dentro de plásticos para evitar a desidratação; - Tubos de ensaio devem ser isolados com “chuchus” ou rolhas e alumínio na geladeira; - Placas de petri devem ser mantidas invertidas para evitar condensação de água na tampa da placa; - Após a inoculação deve ser incubado em estufa a temperatura ambiente; - Identificação do conteúdo, data de preparação e vencimento. f) Inoculação dos meios de cultura - Utilizar procedimentos assépticos, como: - higienização das mãos, bancada ou fluxo laminar com álcool 70%, - EPI's adequados, - materiais previamente esterilizados, … - Alças de inoculação devem ser flambadas no Bico de Bunsen antes e depois da inoculação; - Deve-se esperar o resfriamento da alça de inoculação antes de colocá-la em contato com o inóculo;

- Os recipientes contendo meios e inóculo deverão ser abertos somente na zona de esterilidade gerada pelo Bico de Bunsen; - A boca do tubo de ensaio deve ser aquecida na chama do Bico de Bunsen antes e depois de ser retirado o tampão; - O tampão nunca deve ser apoiado na bancada ou na mesa do fluxo laminar; - Identificação do conteúdo e data de inoculação; - Após a inoculação as placas de Petri ou tubos de ensaio devem ser incubados em estufa na temperatura adequada. g) Métodos de inoculação 1) Placas de Petri Estriagem

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Esgotamento - Técnica mais usada para obter colônias puras de microrganismos. - Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada. - Faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possível toda a superfície da placa. A direção da semeadura está indicada por setas. A semeadura na região 1 é realizada a partir da cultura original da bactéria. A alça de inoculação deve ser esterilizada entre as fases de inoculação 1, 2 e 3. Nas fases 2 e 3 a alça é usada para retirar bactérias das fases anteriores, desta forma diluindo o número de organismos a cada semeadura.

2) Tubos de ensaio Semear - Meio líquido - Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada. - Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo e agite a alça.

Picagem profunda (até 2/3 de profundidade)- Meio semissólido horizontal - Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe é fornecida. - Faça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias no meio de cultivo semissólido.

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Estriagem - Meio sólido inclinado - Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada. - Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfície do ágar.

Exercícios 1) Defina os seguintes termos: a) meio de cultura __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ b) inóculo __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ c) cultura __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) Para que são usados meios de cultura? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) Se você quer realizar o crescimento de uma determinada bactéria, que critérios devem ser observados na escolha do meio de cultivo? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4) De modo geral, como é feita a preparação de um meio de cultivo? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5) Como são classificados os meios de cultura quanto à origem? Explique. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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6) Como são classificados os meios de cultura quanto à composição? Explique. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 7) Como são classificados os meios de cultura quanto ao estado físico. Explique. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 8) Como são classificados os meios de cultura quanto à finalidade? Explique. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 9) O que é ágar? Qual sua fonte? Para que serve? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 10) Como pode ser feita a inoculação de microrganismos em placas de Petri? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 11) Explique como é feita a técnica de esgotamento. Para que ela serve? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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12) Explique as seguintes técnicas de inoculação em tubos de ensaio contendo: a) meio líquido __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ b) meio semi-sólido __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ c) meio sólido inclinado __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ Use a informação a seguir para responder as questões 13 e 14. Dois meios de cultura foram incubados com 4 diferentes bactérias. Após a inoculação foram obtidos os seguintes resultados: Organismo Meio de cultura 1 Meio de cultura 2 Escherichia coli

Colônias vermelhas

Ausência de crescimento

Staphylococcus aureus

Ausência de crescimento

Crescimento

S. epidermidis

Ausência de crescimento

Crescimento

Salmonella enterica

Colônias incolores

Ausência de crescimento

13) O meio de cultura 1 é: a) Seletivo

b) Diferencial

c) Seletivo e diferencial

14) O meio de cultura 2 é: a) Seletivo

b) Diferencial

c) Seletivo e diferencial

15) Qual a afirmativa correta com relação ao ágar? a) É um polissacarídeo obtido de fungos b) Torna-se liquefeito na temperatura de 40 oC c) Solidifica-se na temperatura de 100 oC d) É uma fonte de nutrientes para os microrganismo quando adicionado ao meio de cultivo e) É metabolizado por poucas bactérias

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Crescimento Microbiano - Bactérias - Crescimento bacteriano = aumento do número de indivíduos e não aumento de tamanho de uma determinada célula - Bactérias normalmente se reproduzem por bipartição ou divisão / fissão binária simples = 2 células filhas iguais, multiplicação - Tempo de geração ou de duplicação = tempo necessário para uma célula se dividir (e sua população dobrar de tamanho) * 1 processo de divisão celular origina 2 células 2 processos de divisão celular origina 4 células e assim sucessivamente...

- tempo de geração depende do microrganismo e das condições ambientais, como temperatura - maioria das bactérias tem tempo de geração de 1 a 3 h, mas algumas precisam de mais de 24 h para cada geração - exemplo: bactéria E. coli em condições ideias de cultivo tem tempo de geração de 20 min. Após 20 gerações (aproximadamente 7 h), terá 1 milhão de células. Após 30 gerações (aproximadamente 10 h), terá 1 bilhão de células. Após 24 h, será um número com 21 zeros. Para representar populações tão grandes, usa-se escala logarítmica.

Logaritmo do número de células

a) Fases do crescimento - Curva de crescimento microbiano demonstra crescimento das células durante um período de tempo - 4 fases de crescimento:

Fase estacionária Fase log

Fase declínio ou morte celular

Fase lag

tempo 1) Fase lag * bactérias não se reproduzem imediatamente quando colocadas em meio de cultivo novo * pouca ou ausência de divisão celular (fase de adaptação) – pode durar até 1 hora * células em estado de latência, com intensa atividade metabólica (síntese de enzimas e moléculas variadas) 2) Fase log ou de crescimento exponencial * células iniciam processo de divisão e entram no período de crescimento ou aumento logarítmico * reprodução celular extremamente ativa e tempo de geração atinge valor constante * período de maior atividade metabólica da célula e é o estágio preferido para fins industriais (produto produzido eficientemente) * microrganismos são sensíveis as mudanças ambientais e compostos antimicrobianos

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3) Fase Estacionária * em determinado momento a velocidade de crescimento diminui, o número de morte celular é igual ao número de células novas e a população se torna estável = período de equilíbrio * nº de células vivas = nº de células mortas * não são conhecidos os motivos que induzem a fase exponencial a diminuir sua atividade, diversos fatores poderim influenciar: término de nutrientes, acúmulo de produtos da degradação, mudanças no pH, ... 4) Fase de Morte Celular ou de Declínio * nº de células mortas é maior que o de células novas * fase continua até que a população tenha diminuído para uma pequena fração do número de células da fase anterior, ou até que tenha desaparecido totalmente b) Métodos para quantificar o crescimento microbiano Quantificação direta 1) Contagem direta ao microscópio do nº. total de indivíduos, vivos ou mortos. Usa câmaras de contagem e microscópio para avaliar nº. partículas presentes em um determinado volume 2) Contagem em placas de UFC (unidades formadoras de colônias), para bactérias e leveduras. Faz diluições adequadas da suspensão e semeadura das alíquotas na superfície de meios sólidos, seguida de contagem das colônias que cresceram. Usa: - Diluição seriada + Método de espalhamento em placa OU - Diluição seriada + Método de Pour plate 3) Método do número mais provável (MNP), para bactérias que não crescem em meio sólidos. Faz o crescimento em meio líquido com diferentes diluições de bactérias e usa tabelas (95% de confiabilidade) para avaliar resultado. 4) Filtração, para regiões em que o número de bactérias se encontra muito pequeno (lagos e fontes de água) Quantificação indireta 1) Determinação de peso seco ou úmido 2) Determinação química de componentes celulares, como proteína, ácidos nucléicos 3) Turbidimetria. Medida da turvação de uma amostra microbiana pela absorbância em espectrofotômetro (massa de microrganismos presente)

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Métodos para quantificação direta Existem diferentes métodos para quantificar o crescimento microbiano. Alguns determinam o número de células e outros analisam a massa total da população, que é diretamente proporcional ao número de células. A quantificação de uma população geralmente é realizada considerando o número de células em 1 mL do meio líquido ou 1 g do material sólido. Mas como populações bacterianas são muito grandes, são usadas pequenas amostras dessas para contagem por métodos diretos ou indiretos. Depois, o resultado é colocado em fórmulas matemáticas para calcular o valor final. Ex.: um milionésimo de mL (10-6 mL) de leite azedo tem 70 bactérias. Deverá existir 70 milhões de bactérias em cada mL de leite. Trabalhar com números tão pequenos não é prático. Foram desenvolvidos métodos quantitativos usando diluições seriadas das culturas ou amostras. 1) Contagem em Placa É a técnica mais utilizada na determinação do tamanho de uma população bacteriana. VANTAGEM: as células viáveis (vivas) são quantificadas. DESVANTAGEM: tempo de incubação longo, em geral 24 h, para o aparecimento das colônias visíveis em placa. Esse tempo pode impedir o uso dessa técnica em áreas como no controle da qualidade do leite pois não é possível manter o lote por um período longo. Esse método considera que cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma bactéria. Isso nem sempre é verdade, uma vez que as bactérias frequentemente crescem em cadeias ou em grumos. Para refletir essa realidade, as contagens em placas são feitas nas chamadas unidades formadoras de colônias (UFC). Para realizar esse método, é essencial que somente um número limitado de colônias cresça em cada placa. Quando muitas colônias estão presentes, ocorre saturação impedindo o crescimento de algumas colônias e dificultando a contagem. Pela convenção do Food and Drug Administration, órgão norte-americano que controla alimentos e medicamentos, deve-se realizar a contagem em placas que contenham de 25 a 250 colônias, mas microbiologistas preferem de 30 a 300 colônias. Quando essa metodologia é empregada, deve-se utilizar o método da diluição seriada para garantir que o número de colônias na placa permaneça na faixa desejada. (FIGURA) Diluição seriada. Exemplo – amostra de leite com 10 mil bactérias / mL. A inoculação de 1 mL dessa amostra em uma placa com meio de cultivo resultará no crescimento de 10 mil colônias e será impossível fazer a contagem. Mas se 1 mL de leite for transferido para um tubo contendo 9 mL de água estéril (diluição), cada mL da amostra deste tubo conterá 1000 bactérias. Esse número ainda é grande para fazer a contagem. Portanto, uma nova diluição seriada deverá ser realizada, transferindo 1 mL (com 1000 bactérias) para um novo tubo com 9 mL de água estéril). Nesse último tubo, cada mL conterá 100 bactérias, que quando inoculado deverá originar 100 colônias, que podem ser facilmente contadas.

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Existem dois métodos para se realizar a contagem de bactérias em placa: método de espalhamento em placa e método pour plate. Método pour plate. No método pour plate o inóculo pode ser realizado com um volume de 1,0 mL ou 0,1 mL da diluição bacteriana diretamente na placa de Petri. O meio de cultivo, mantido em banho-maria a 50 oC para impedir a solidificação do ágar, é vertido sobre a amostra, que será misturada por agitação suave da placa. Após solidificação do ágar, a placa é incubada na temperatura de crescimento da bactéria. Nesse método o crescimento das colônias das bactérias ocorre dentro do meio de cultivo e na superfície do meio cultivo. DESVANTAGEM: microrganismos sensíveis ao calor podem ser danificados pelo ágar fundido (líquido a 50 oC) e podem ficar impossibilitados de formar colônias; quando alguns meios de cultivo diferenciais são usados, a aparência característica de uma colônia na superfície do meio é essencial para que haja o diagnóstico e as colônias formadas abaixo da superfície não são apropriadas para estes testes. Método de espalhamento em placa. Método mais usado. O inóculo de 0,1 mL é adicionado à superfície do meio contendo ágar já solidificado. O inóculo é, então, espalhado uniformemente na superfície com a alça de Drigalski. Esse método não tem as desvantagens do método pour plate porque as colônias crescem somente na superfície do meio e não entram em contato com o ágar fundido (líquido a 50 oC).

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2) Filtração Aplicado para contar amostras em que o número de bactérias é muito pequeno, como lagos e fontes de água. Esse método permite que a bactéria seja concentrada sobre a superfície de uma membrana de filtro de poros muito pequenos (bactéria não passa pelos poros) após passagem de um volume de 100 mL de água. Essa membrana é transferida para uma placa de Petri com um suporte embebido em nutriente líquido, que permite que as bactérias se desenvolvam sobre a membrana. Esse método é usado para detecção e registro de coliformes (indicadores de poluição fecal) em amostras de alimentos e águas. Coliformes podem ser identificados por meios de cultivo diferenciais.

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3) Método do Número Mais Provável (NMP) É uma técnica estatística com base no seguinte princípio: quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para eliminar totalmente o crescimento em tubos com meio de cultura. Esse método é mais usado quando as bactérias a serem contadas não cresceriam em meio sólido (como bactérias quimiautotróficas nitrificantes), ou quando o crescimento de bactérias em um meio líquido diferencial é usado para identificar os microrganismos (como coliformes em água, que seletivamente fermentam lactose produzindo ácido). O método fornece somente uma estimativa de 95% de probabilidade de a população bacteriana conter um número de bactérias e que o NMP da tabela é estatisticamente o número mais provável. (FIGURA)

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4) Contagem Direta ao Microscópio Nesse método um volume conhecido de solução bacteriana é colocado em uma área definida de uma lâmina especial de microscópio denominada célula de contagem Petroff-Hausser. DESVANTAGEM: dificuldade para contar bactérias móveis, células mortas acabam sendo contadas como as vivas, necessário um grande número de células de bactérias (cerca de 10 milhões de bactérias por mL) para ter uma contagem satisfatória. VANTAGEM: para quantificar as bactérias por esse método não há necessidade de períodos de incubação, portanto, ela pode ser usada quando se necessita de resultados imediatos.

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Métodos para quantificação indireta Muitas vezes não é necessário contar as células microbianas para determinar seu número. 1) Turbidimetria Em alguns experimentos é possível monitorar o crescimento bacteriano através da turbidez da cultura. Quando uma bactéria se multiplica em meio líquido, esse meio fica túrbido ou com alta densidade de células. O espectrofotômetro (ou colorímetro) é o instrumento mais usado para determinar a turbidez de uma amostra. Nele existe um feixe de luz que é transmitido através da solução de bactérias para um detector fotossensível. Com o crescimento bacteriano, menos luz atingirá o detector. Essa alteração será registrada na escada do aparelho como uma porcentagem de transmissão. Também será registrada na escala do aparelho a absorbância (densidade ótica ou OD) que é um valor usado para confeccionar gráficos de crescimento bacteriano. O gráfico Absorbância X Tempo será uma linha quase reta quando a bactéria estiver na fase log (logarítmica) de crescimento ou morte celular. Se durante as leituras de absorbância for realizada a contagem do número de células, esses valores podem ser usados para estimar o número de bactérias em experimentos futuros em que somente a turbidez seja medida. Para usar esse método é necessário ter mais de um milhão de células por mL de cultura, mas para leitura no aparelho a suspensão (solução de bactérias) deve ter entre 10 e 100 milhões de células por mL. DESVANTAGEM: difícil usar esse método quando poucas bactérias estão presentes no meio.

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2) Atividade Metabólica Nesse método é feita a determinação da atividade metabólica da população microbiana. Ele considera que a quantidade de um certo produto do metabolismo dos microrganismos, como ácido ou CO2, pode ter relação direta com o número de células presentes. DESVANTAGEM: uso restrito a alguns ensaios e microrganismos. 3) Peso Seco Os métodos apresentados até agora não têm resultados bons quando usados em bactérias filamentosas e fungos. A contagem em placa não é capaz de quantificar o aumento da massa (crescimento do micélio) dos fungos filamentosos. O número de esporos assexuais é contado na contagem em placa mas não é uma determinação satisfatória do crescimento. A melhor maneira de analisar crescimento de fungos filamentosos é pela determinação do peso seco. Para isso, o fungo é removido do meio de cultivo por filtração, para eliminar outros materiais. Depois ele é seco em dessecador e pesado. Pode-se usar a mesma metodologia com bactérias. Exercícios 1) Como as bactérias normalmente se reproduzem? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) O que é tempo de geração? Ele é igual para todos os microrganismos? Justifique sua resposta. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) Durante o preparo de um sanduíche ocorreu acidentalmente a sua contaminação com seis células de E. coli. Considerando que o tempo de geração dessa bactéria é de 20 minutos, explique quantas células deveriam existir no sanduíche após: a) 20 minutos __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ b) 1 hora __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ c) 2 horas __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4) Como são chamadas as 4 fases de uma curva de crescimento microbiano? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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5) Descreva os principais acontecimentos de cada uma das fases de crescimento. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 6) Na fase estacionária os microrganismos param de crescer. Essa informação está correta? Justifique sua resposta. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 7) Cite 4 métodos usados para quantificação direta do crescimento microbiano. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 8) Cite 3 métodos usados para quantificação indireta do crescimento microbiano. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 9) Qual é a técnica mais utilizada na determinação do tamanho de uma população bacteriana? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 10) Qual a principal vantagem e a principal desvantagem do método de contagem em placa? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 11) Qual a diferença entre o método de espalhamento em placa e o método de pour plate? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 12) Quais as desvantagens do método pour plate? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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13) O que significa UFC? Por que ela foi escolhida no lugar de “colônia” como unidade para o método de contagem em placa? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 14) Qual o número de bactérias por mL encontrado em uma amostra de leite se a placa usada para contagem apresentava 127 UFC em uma diluição seriada de 1:1000? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 15) Em que ocasião é utilizado o método de filtração? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 16) O que é o método do número mais provável? Em que ocasião esse método é usado? Qual é o nível de confiabilidade deste método? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 17) De acordo com a tabela de NMP (pag. 90) qual o número estatisticamente provável de bactérias presentes em uma amostra e os limites inferiores e superiores para as seguintes combinações de tubos positivos: a) 4-2-1: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ b) 5-1-2: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ c) 5-3-0: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 18) Quais as desvantagens da contagem direta ao microscópio? Quando essa metodologia é empregada? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 19) Em que fato se baseia o método da turbidimetria? Que instrumento é usado nesse método? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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20) Qual a relação feita no método da atividade metabólica? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 21) Para quais microrganismos é indicado o uso do método do peso seco? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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Controle do Crescimento Microbiano.

O controle científico do crescimento microbiano começou há cerca de 100 anos. Lembrese de que o trabalho de Pasteur sobre os microrganismos levou os cientistas a acreditarem que os micróbios eram uma possível causa de doenças. Na metade do século XIX, o médico húngaro Ignatz Semmelweiss e o médico inglês Joseph Lister utilizaram essa ideia em algumas das primeiras práticas de controle microbiano para procedimentos médicos. Essas práticas incluíam a lavagem das mãos com cloreto de cal, que matava os micróbios, e técnicas de cirurgia assépticas para impedir a contaminação microbiana das feridas cirúrgicas. Até aquele momento, as infecções adquiridas em hospital, ou infecções nosocomiais, eram a causa mortis em pelo menos 10% dos casos cirúrgicos, e as mortes de porturientes eram tão elevadas quanto 25%. A ignorância a respeito dos micróbios era tanta que, durante a Guerra Civil Americana, um cirurgião poderia limpar seu bisturi na sola da bota, entre as incisões. No ultimo século, os cientistas continuaram a desenvolver uma séria de métodos físico e agentes químicos para controlar o crescimento microbiano. A Terminologia do controle Microbiano Objetivo do Aprendizado: Definir os seguintes termos-chave relacionados ao controle microbiano: esterilização, desinfecção, anti-sepsia, degerminação, sanitização, biocida, germicida, bacteriostase e assepsia. Um termo frequentemente usado, e mal utilizado, ao discutir o controle do crescimento microbiano é a esterilização. Esterilização é a destruição de todas as formas de vida microbiana. O aquecimento é o método mais comum usado para matar micróbios, incluindo as formas mais resistentes, como os endosporos. A remoção de micróbios de líquidos ou gases pode ser feita por outra forma de esterilização, a filtração. As pessoas pensam que os alimentos enlatados à venda em supermercados são completamente estéreis. Na realidade, o tratamento com calor requerido para assegurar a esterilidade absoluta iria degradar desnecessariamente à qualidade do alimento. Ao invés disso, o alimento e submetido somente ao calor suficiente para destruir os endosporos de Clostridium botulinum, que pode produzir uma toxina mortal. Esse tratamento limitado de calor é denominado esterilização comercial. Os endosporos de uma série de bactérias termofílicas, capazes de causar deterioração do alimento, mas não doença humana, são consideravelmente mais resistentes ao calo que C. botulinum. Se estiverem presentes, irão sobreviver, mas sua sobrevivência normalmente não tem consequência prática; eles não crescerão nas temperaturas normais de armazenamento do alimento. Se os enlatados de um supermercado forem incubados em temperaturas na faixa de crescimento dessas termófilas (acima de 45 graus Celsius), uma grande quantidade de alimentos iria se deteriorar. A esterilização completa muita vezes não é necessária em outros cenários. Por exemplo, as defesas normais do corpo podem lidar com alguns micróbios que penetram em uma ferida operatória. Um copo ou garfo em um restaurante necessita apenas de um controle microbiano suficiente para prevenir a transmissão de micróbios possivelmente patogênicos de uma pessoa para outra. O controle voltado para a destruição de microrganismos nocivos é denominado desinfecção. Normalmente refere-se à destruição dos patógenos de vegetais (não formadores de endosporos), o que não é igual à esterilidade completa. A desinfecção pode fazer uso de substâncias químicas, radiação ultravioleta, água fervente ou vapor. Na prática, o termo é aplicado mais comumente ao uso de um produto químico (um desinfetante) para tratar uma superfície ou substância inerte. Quando esse tratamento é dirigido ao tecido vivo, é denominado anti-sepsia, e produto químico é denominado um anti-séptico. Assim, na prática, a mesma substância química pode ser denominada um desinfetante para uso e um anti-séptico para outro. É claro que muitos produtos aceitáveis para lavar uma mesa seriam muito agressivos para usar sobre o tecido vivo. Existem modificações da desinfecção e da anti-sepsia. Por exemplo, quando alguém precisa receber uma injeção, a pele é limpa com álcool – o processo de degerminação, que

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resulta principalmente da remoção mecânica, em vez da morte, da maioria dos micróbios em uma área limitada. Os copos, as louças e os talheres dos restaurantes estão sujeitos à sanitização, que é destinada a reduzir as contagens microbianas a níveis seguros de saúde pública e minimizar as chances de transmissão de doença de um usuário para outra. Isso normalmente é obtido por lavagem em alta temperatura ou, no caso das louças em um bar, lavagem em uma pia seguida por imersão em um desinfetante químico. A Tabela 1 resume a terminologia relativa ao controle do crescimento microbiano. Os nomes dos tratamentos que causam a morte direta dos micróbios possuem o sufixo -cida, significando morte. Um biocida, ou germicida mata os microrganismos (geralmente com certas exceções, como os endosporos); um fungicida mata os fungos; um viricida inativa os vírus; e assim por diante. Outros tratamentos inibem o crescimento e multiplicação das bactérias; seu nomes têm sufixo -stático ou -stase, significando parar ou diminuir, como na bacteriostase. Uma vez que o agente bacteriostático é removido, o crescimento pode ser retomado. Sepse, do termo grego para estragado ou podre, indica contaminação bacteriana, como nas fossas sépticas para tratamento de esgoto. (O termo também é usado para descrever uma condição de saúde). Asséptico significa que um objeto ou área está livre de patógenos. Assepsia é a ausência de contaminação significativa. Técnicas assépticas são importantes em cirurgia para minimizar a contaminação dos instrumentos, da equipe cirúrgica e do paciente.

TABELA 1

Terminologia Relacionada ao Controle do Crescimento Microbiano Definição

Comentários

Esterilização

Destruição de todas as formas Normalmente feito com vapor de vida microbiana, incluindo sob pressão ou um gás os endosporos. esterilizante como o óxido de etileno.

Esterilização Comercial

Tratamento de calor suficiente para matar os endósporos do Clotridium botulinum nos alimentos enlatados.

Desinfecção

Destruição dos patógenos dos Pode fazer uso de métodos vegetais. físicos ou químicos.

Anti-sepsia

Destruição dos patógenos em O tratamento é quase sempre vegetais em tecido vivo. por antimicrobianos químicos.

Degerminação

Remoção dos micróbios de Basicamente uma remoção uma área limitada, como a pele mecânica por um algodão em torno do local uma injeção. embebido em álcool.

Sanitização

Tratamento destinado a reduzir as contagens microbianas nos utensílios alimentares até níveis seguros de saúde pública.

Os endósporos mais resistentes das bactérias termófilas podem sobreviver, mas não irão germinar e crescer sob condições de armazenamento normais.

Pode ser feita por meio de lavagem com alta temperatura ou mergulhando em um desinfetante químico.

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TABELA 2

Métodos Físicos Usados para o Controle do Crescimento Microbiano Mecanismo de Comentário Uso Preferencial Ação

Método Calor 1. Calor úmido a. Fervura

Desnaturação Proteínas

b. Autoclave

Desnaturação Proteínas

2. Pasteurização

Desnaturação proteínas

das Mata fungos e células bacterianas vegetativas patogênicas e quase todos os vírus em 10 min; menos efetivo para endósporos. das Método muito efetivo de esterilização; em cerca de 15 psi de pressão (121 °C), todas as células vegetativas e seus endósporos são mortos em cerca de 15 minutos. das Tratamento com calor para o leite (72°C por cerca de 15 seg) que mata todos os patógenos e a maioria dos não-patogênicos.

Pratos, bacias, jarros, equipamento variado.

Meios microbiológicos, soluções, roupas de cama, utensílios, curativos, equipamento e outros itens que podem suportar temperatura e pressão. Leite, creme e certas bebidas alcoólicas (cerveja e vinho).

3. Calor seco a. Chama direta

Queima os contaminantes até se tornarem cinzas. Queima até se tornarem cinzas.

b. Incineração

c. Esterilização quente

Filtração

com

Método muito Alças de inoculação eficaz de esterilização. Método muito Copos de papel, eficaz de curativos esterilização. contaminados, carcaças de animais, sacos e panos de limpeza. ar Oxidação Método muito Vidros vazios, eficaz de instrumentos, esterilização, mas agulhas e seringas requer temperatura de vidro. de 170°C por cerca de 2 horas. Separação das Remove os Útil para esterilizar bactérias do líquido micróbios através líquidos (enzimas, de suspensão da passagem de vacinas) que são um líquido ou gás destruídos pelo calor. através de um

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material semelhante a uma tela; a maioria dos filtros em uso consiste de acetato de celulose ou nitrocelulose. Frio 1. Refrigeração

2. Congelamento profundo

3. Liofilização

Alta Pressão

Dessecação

Pressão Osmótica

Redução das reações químicas e possíveis alterações nas proteínas. Redução das reações químicas e possíveis alterações nas proteínas.

Tem efeito Conservação dos bacteriostático. alimentos, drogas e culturas.

Redução das reações químicas e possíveis alterações nas proteínas.

Conservação dos alimentos, drogas e. Culturas.

Um método eficaz para conservar culturas microbianas, em que as culturas são congeladas rapidamente a -50°C e -95°C. Método eficaz para a conservação prolongada de Conservação dos alimentos, drogas e culturas microbianas; a água é removida por alto vácuo em baixa temperatura. Conservação de cores, sabores e valores nutricionais.

Alteração da estrutura molecular de proteínas e carboidratos. Interrupção do Envolve a remoção metabolismo. de água dos micróbios; principalmente bacteriostática. Plasmólise Resulta na perda de água das células microbianas.

Conservação dos alimentos, drogas e culturas.

Sucos de fruta.

Conservação alimentos.

dos

Conservação alimentos.

dos

Radiação 1. Ionizante

Destruição do DNA.

2. Não-Ionizante

Lesão do DNA.

Não-disseminado Usado para esterilizar na esterilização de produtos rotina. farmacêuticos e suprimentos médicos e dentários. Radiação não Controle de ambiente muito penetrante. fechado com lâmpada UV (germicida).

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TABELA 3 Agente Químico

Agentes Químicos para Controlar o Crescimento Microbiano Mecanismo de Ação

Uso preferencial

Comentário

Fenol e Compostos Fenólicos 1. Fenol

Ruptura da membrana Raramente usado, plasmática, exceto como padrão desnaturação das de comparação. enzimas.

2. Compostos Fenólicos

Ruptura da membrana plasmática, desnaturação das enzimas.

3. Bifenóis

Superfícies ambientais, instrumentos, superfícies cutâneas e membranas mucosas. Provável ruptura da Sabonete para as membrana plasmática. mãos e loções hidratantes.

Biguanidas (clorexidina)

Ruptura da membrana Desinfecção da pele plasmática. especialmente para escovação cirúrgica.

Halogênicos

O iodo inibe a função das proteínas e é um forte agente oxidante; o cloro forma o agente oxidante forte ácido hipocloroso, que altera os componentes celulares.

Álcoois

O iodo é um antiséptico eficaz disponível como tintura e como iodofor; o gás cloro é usado para desinfetar o equipamento de fábricas de laticínios, utensílios para refeições, itens domésticos e vidraria. Desnaturação das Termômetros e proteínas e dissolução outros instrumentos; dos lipídeos. ao limpar a pele com álcool antes de uma injeção, a maior parte da ação desinfetante provavelmente provém de simplesmente remover (degerminar) o pó e alguns micróbios.

Raramente usado como desinfetante ou anti-séptico devido à possibilidade de irritação e odor desagradável. Os derivados do fenol são reativos mesmo em presença de material orgânico; um exemplo é o Ofenilfenol. O triclosano é um exemplo especialmente comum de um bifenol, Ampla utilização, porém mais eficaz contra grampositivos. Bactericida contra gram-positivos e gram-negativos, atóxicos, persistente. O iodo e o cloro podem agir isoladamente ou como componentes de compostos inorgânicos e orgânicos.

Bactericida e fungicida, mas ineficaz contra endósporos ou vírus nãoenvelopados; alcoóis comumente usados são o etanol e o isopropanol.

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Metais pesados e Seus Desnaturação da O nitrato de prata Os metais pesados Compostos enzimas e de outras pode ser usado para como a prata e o proteínas essenciais. prevenir a oftalmia mercúrio são biocidas. gonorréica neonatal; o mercurocromo desinfeta a pele e as membranas mucosas; o sulfato de cobre é um algicida. Agentes de Superfície 1. Sabões e Remoção mecânica dos detergentes ácido- micróbios através da aniônicos escovação. aniônicos. 2. Detergentes ácido- Incerto; pode envolver a aniônicos inativação ou ruptura das enzimas. 3. Detergentes catiônicos compostos amônio quarternário)

Inibição de enzimas, ) desnaturação das de proteínas e ruptura das membranas plasmáticas.

Ácidos Orgânicos

Inibição metabólica, afetando principalmente os bolores; ação não relacionada à sua acidez.

Aldeídos

Desnaturação proteínas.

das

Esterilizantes Gasosos

Desnaturação proteínas

das

Peroxigênios Oxidantes)

(Agentes Oxidação

Degerminação da Muitos sabões pele e remoção de antibacterianos resíduos. contêm antimicrobianos. Sanitização em Amplo espectro de indústrias de atividade; atóxicos, processamento de não-corrosivos e de lacticínios e ação rápida. alimentos. Anti-séptico para a Bactericidas, pele, instrumentos, bacteriostáticos, utensílios, objetos de fungicidas e viricidas borracha. contra vírus envelopados; exemplos de qual são o Cepacol e o Zephiram. Ácido sórbico e ácido Amplamente usados benzoico efetivos em para controlar bolores baixo pH, parabenz e algumas bactérias muito usado em AM alimentos e cosméticos, xampus; cosméticos. propianato de cálcio usado em pão. O glutaraldeído é Antimicrobianos muito menos irritante que o efetivos. formaldeído e é usado para a desinfecção de equipamentos médicos. Excelente agente O óxido de etileno é o esterilizante, mais comumente especialmente para usado. objetos que seriam danificados pelo calor. Superfícies O ozônio é contaminadas; amplamente usado alguns ferimentos como suplemento profundos, em que para a cloração; o eles são muito peróxido de efetivos contra hidrogênio é um anti-

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anaeróbicos sensíveis oxigênio.

séptico fraco, mas um ao bom desinfetante. O ácido peracético é especialmente efetivo.

RESUMO PARA ESTUDO A TERMINOLOGIA DO CONTROLE MICROBIANO 1. O controle do crescimento microbiano pode prevenir infecções e deterioração dos alimentos. 2. A esterilização é o processo de destruir toda a vida microbiana em um objeto. 3. A esterilização comercial é o tratamento com calor dos alimentos enlatados para destruir os endósporos de C. botulinum. 4. A desinfecção é o processo de reduzir ou inibir o crescimento microbiano em uma superfície inanimada. 5. Anti-sepsia é o processo de reduzir ou inibir os microrganismos em tecido vivo. 6. O sufixo -cida significa matar; o sufixo –statico significa inibir. 7. Sepse é a contaminação bacteriana. A TAXA DE MORTE MICROBIANA 1. As populações bacterianas sujeitas ao calor ou a produtos químicos antimicrobianos morrem em uma taxa constante. 2. Esta curva de mortalidade, quando representada logaritmicamente, mostra a taxa constante de morte como uma linha reta. 3. O tempo que leva para matar uma população microbiana é proporcional ao número de micróbios. 4. As espécies microbianas e fases do ciclo de vida (p. ex., endósporos) possuem diferentes suscetibilidades aos controles físico e químico. 5. A matéria orgânica pode interferir com os tratamentos de calor e agentes de controle químico. 6. A exposição mais longa a menos calor pode produzir o mesmo efeito que o período mais curto sob calor mais intenso. AÇÕES DOS AGENTES DE CONTROLE MICROBIANO Alteração da Permeabilidade de Membrana 1. A sensibilidade da membrana plasmática se deve a seus componentes lipídicos e proteicos. 2. Certos agentes de controle químico lesam a membrana plasmática, alterando sua permeabilidade. Dano às Proteínas a aos Ácidos Nucléicos 1. Alguns agentes de controle microbiano lesam as proteínas celulares ao romper as pontes de hidrogênio e as ligações covalentes. 2. Outros agentes interferem com a replicação do DNA e RNA e com a síntese proteica. MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO Calor 1. O calor é frequentemente usado para eliminar os microrganismos. 2. O calor úmido mata os micróbios pela desnaturação das enzimas. 3. O ponto de morte térmica (PMT) é a menor temperatura em que todos os micróbios em uma cultura líquida serão mortos em 10 minutos. 4. O tempo de morte térmica (TMT) é a duração de tempo necessário para matar todas as bactérias em uma cultura líquida em uma dada temperatura. 5. O tempo de redução decimal (TRD) é a duração de tempo necessária para que 90% de uma população bacteriana seja morta em uma dada temperatura. 6. A fervura (100°C) mata muitas células vegetais e vírus dentro de 10 minutos.

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7. A autoclave (vapor sob pressão) á o método mais efetivo de esterilização com calor úmido. O vapor deve entrar em contato direto com o material a ser esterilizado. 8. Na pasteurização HTST, uma alta temperatura é usada por um curto período (72°C por 15 segundos) para destruir os patógenos sem alterar o sabor do alimento, o tratamento com temperaturas ultra-elevadas (UHT) (140°C por 3 segundos) é usado para esterilizar laticínios. 9. Os métodos de esterilização com calor seco incluem a chama direta, incineração e esterilização com ar quente. O calor seco mata por oxidação. 10. Diferentes métodos que produzem o mesmo efeito (redução no crescimento microbiano) são denominados tratamentos equivalentes. Filtração 1. A filtração é a passagem de um líquido ou gás através de um filtro com poros pequenos o suficiente para reter os micróbios. 2. Os micróbios podem ser removidos do ar por filtros de partículas de alta eficiência. 3. Os filtros de membrana compostos de nitrocelulose ou acetato de celulose são comumente usados para filtrar bactérias, vírus e mesmo proteínas de alta massa molecular. Baixas Temperaturas 1. A eficácia das baixas temperaturas depende do microrganismo particular e da intensidade da aplicação. 2. A maioria dos microrganismos não se reproduz em temperaturas comuns de refrigerador (0-7°C). 3. Muitos micróbios sobrevivem (mas não crescem) nas temperaturas abaixo de zero, usadas para armazenar alimentos. Alta Pressão 1. Alta pressão desnatura as proteínas nas células vegetais. Dessecação 1. Na ausência de água, os microrganismos não podem crescer, mas podem permanecer viáveis. 2. Vírus e endósporos podem resistir à dessecação. Pressão Osmótica 1. Os microrganismos em altas concentrações de sais e açucares sofrem plasmólise. 2. Os bolores e as leveduras são mais capazes que as bactérias de crescer em matérias com baixa umidade ou alta pressão osmótica. Radiação 1. Os efeitos da radiação dependem de seu comprimento de onda, intensidade e duração. 2. A radiação ionizante (raios gama, raios X e feixes de elétrons de alta energia) tem um grau de penetração e exerce seu efeito principalmente ionizando a água e formando radicais hidroxila altamente reativos. 3. A radiação ultravioleta (UV), uma forma de radiação não-ionizante, tem baixo grau de penetração e causa lesão celular produzindo dímeros de timina no DNA, que interferem com a replicação do DNA; o comprimento de onda germicida mais efetivo é 260 nm. 4. As microondas podem matar os micróbios indiretamente à medida que as matérias de aquecem. MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE MICROBIANO 1. Os agentes químicos são usados em tecidos vivos (como anti-sépticos) e em objetos inanimados (como desinfetantes). 2. Poucos agentes químicos atingem a esterilidade. PRINCÍPIOS DA DESINFECÇÃO EFETIVA 1. Muita atenção deve ser dada às propriedades e à concentração do desinfetante a ser usado. 2. A presença de matéria orgânica, o grau de contato com os microrganismos e a temperatura também devem ser considerados.

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Avaliando um Desinfetante 1. No teste de uso-diluição, a sobrevivência bacteriana (S.choleraesuis, S. aureus e P. aeruginosa) na diluição de um desinfetante recomendado pelo fabricante é determinada. 2. Vírus, bactérias formadoras de endósporos, microbactérias e fungos também podem ser usados no teste de uso-diluição. 3. No método de disco-difusão, um disco de papel filtro é embebido com uma substância química e colocado em uma placa de agar inoculada; uma zona de inibição indica efetividade. TIPOS DE DESINFETANTE Fenol e Compostos Fenólicos 1. Os compostos fenólicos exercem sua ação lesando as membranas plasmáticas. Bifenóis 1. Bifenóis, como o triclosano (venda liberada) e hexaclorofeno (prescrito) são amplamente usados em produtos domésticos. Biguanidos 1. A clorexidina lesa as membranas plasmáticas das células vegetais. Halogênios 1. Alguns halogênios (iodo e cloro) são usados isoladamente ou como componentes de soluções inorgânicas ou orgânicas. 2. O iodo pode ser combinado com certos aminoácidos para inativar enzimas e outras proteínas celulares. 3. O iodo está disponível como tintura (em solução com álcool) ou como iodofor (combinando a uma molécula orgânica). 4. A ação germicida do cloro baseia-se na formação de ácido hipocloroso quando o cloro é adicionado à água. 5. O cloro é usado como desinfetante em forma gasosa (Cl² ou ClO²) ou em um composto, como o hipoclorito de cálcio, o hipoclorito de sódio, o dicloroisocianurato de sódio e as cloraminas. Álcoois 1. Os alcoóis exercem sua ação desnaturando as proteínas e dissolvendo os lipídeos. 2. Em tinturas, eles aumentam a efetividade de outros produtos químicos antimicrobianos. 3. O etanol aquoso (60 a 95%) e o isopropanol são usados como desinfetantes. Metais Pesados e seus Compostos 1. Prata, mercúrio, cobre e zinco são usados como germicidas. 2. Eles exercem sua ação antimicrobiana pela ação oligodinâmica. Quando os íons de metal pesado se combinam com os grupos sulfidrila (-SH), as proteínas são desnaturadas. Agentes de Superfície 1. Os agentes de superfície reduzem a tensão entre as moléculas de um líquido; os sabões e os detergentes são exemplos. 2. Os sabões possuem ação germicida limitada, mas auxiliam na remoção dos microrganismos pela escovação. 3. Os detergentes possuem ácido-aniônicos são usados para limpeza do equipamento de lacticínios. Compostos Quarternários de Amônio (Quarts) 1. Os quarts são detergentes catiônicos unidos ao NH4+. 2. Ao romper as membranas plasmáticas, eles permitem o vazamento dos constituintes citoplasmáticos para fora da célula. 3. Os quarts são mais efetivos contra as bactérias gram-positivas. Conservantes Químicos de Alimentos 1. O SO², o ácido benzoico e o ácido propiônico inibem o metabolismo fúngico e são usados como conservantes de alimentos. 2. Os sais de nitrato e nitrito impedem a germinação de endósporos de Clostridium botulinum na carne.

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Antibióticos 1. A nisina e a natamicina são antibióticos usados para conservar alimentos, especialmente no queijo. Aldeídos 1. Os aldeídos como o formaldeído e o glurataldeído exercem seu efeito antimicrobiano tornando as proteínas inativas. 2. Eles estão entre os mais efetivos desinfetantes químicos. Quimioesterilizantes Gasosos 1. O óxido de etileno é o gás mais frequentemente usado para a esterilização. 2. Ele penetra na maioria dos materiais e mata todos os microrganismos por desnaturação proteínas. Peroxigênios (Agentes Oxidantes) 1. O ozônio, o peróxido e o ácido peracético são usados como agentes antimicrobianos. 2. Eles exercem seu efeito oxidando as moléculas dentro das células. CARACTERÍSTICAS E CONTROLE MICROBIANO 1. As bactérias gram-negativas geralmente são mais resistentes que as bactérias grampositivas aos desinfetantes e anti-sépticos. 2. As microbactérias, os endósporos e os cistos e oocistos dos protozoários são muito resistentes aos desinfetantes a aos anti-sépticos. 3. Os vírus não0envelopados geralmente são mais resistentes que os vírus envelopados aos desinfetantes e anti-sépticos. 4. Os príons são resistentes à desinfecção e à autoclave. Exercícios 1) Defina os seguintes termos: a) esterilização: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ b) esterilização: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ c) desinfecção: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ d) antissepsia: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ e) degerminação: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ f) sanitização: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ g) sepse: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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h) assepsia: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ i) asséptico: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) Os alimentos enlatados à venda em supermercados são completamente estéreis? Justifique sua resposta. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) Qual a diferença entre tratamentos com sufixo -cida e os tratamentos com sufixo -stático (ou -stase)? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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Roteiros de aulas práticas de Microbiologia Geral (MIG)

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Laboratório de Microbiologia A unidade curricular Microbiologia Geral (MIG) tem como principal objetivo o aprendizado de técnicas, representadas por uma série de operações executadas segundo normas padronizadas, possibilitando o conhecimento e a manipulação de microrganismos. As técnicas microbiológicas básicas e essenciais podem ser resumidas em: a) observação microscópica: observação de microrganismos em condições adequadas à visualização em microscópio; b) cultivo artificial: multiplicação dos microrganismos fora do seu habitat natural, utilizando meios de cultura; c) esterilização: eliminação das formas vivas nos meios de cultura, utensílios e instrumentos; d) prática asséptica: prevenção do contato do material em estudo com formas microbianas indesejáveis. Laboratórios de microbiologia são locais onde se manipulam os microrganismos com os mais variados objetivos, tais como: a) identificar os microrganismos responsáveis por doenças em animais e vegetais; b) avaliar a microbiota do ar, do solo, da água, dos alimentos, entre outros; c) identificar a presença de microrganismos indesejáveis nos alimentos ou produtos industrializados; d) usar os microrganismos como modelos de estudo para a compreensão dos processos vitais; e) descobrir substâncias (remédios, vacinas, antibióticos, vitaminas, hormônios, …) que combatam microrganismos patogênicos ou favoreçam o crescimento e desenvolvimento de plantas e animais. Como no laboratório de microbiologia trabalha-se com organismos que na sua grande maioria são invisíveis a olho nu, deve-se tomar o máximo cuidado para não contaminar: a) o manipulante; b) o ambiente; c) o material em estudo. Para isso é necessário que algumas medidas sejam tomadas e que regras de trabalho sejam estabelecidas. Normas de biossegurança no Laboratório de Microbiologia O sucesso de uma experiência no laboratório depende da observação das regras estabelecidas para a segurança pessoal e ambiental. No primeiro caso, as regras dizem respeito a sua segurança pessoal de modo a evitar acidentes de laboratório. No segundo, referem-se à manutenção de um laboratório rigorosamente limpo para impedir a contaminação dos dispositivos experimentais por microrganismos estranhos ao estudo. Desse modo, um dos procedimentos mais comuns no laboratório de microbiologia é a aplicação de técnicas assépticas. Embora a virulência dos microrganismos usados nas aula práticas seja mínima e ainda diminua ao longo do tempo devido ao longo período de cultivo artificial, todos os microrganismos devem ser tratados como potencialmente patogênicos. Assim, os estudantes de microbiologia devem executar técnicas assépticas na preparação e manipulação de qualquer material. Para reduzir a microbiota presente naturalmente no laboratório e evitar acidentes e infecção de pessoas, as seguintes regras devem ser sempre observadas: 1) tratar todas as culturas de microrganismos como potencialmente patogênicas; 2) deixar materiais como bolsas, pastas, livros e cadernos na estante, na entrada do laboratório, e nunca sobre as bancadas do laboratório; 3) manter as portas e janelas fechadas durante as aulas práticas para evitar contaminação com correntes de ar; 4) lavar cuidadosamente as mãos e o antebraço com detergente, certificar-se que todo o sabão foi retirado, secar com papel toalha antes e depois da aula prática; 5) desinfetar mãos e antebraços cuidadosamente, antes e após os trabalhos no laboratório com álcool iodado. ATENÇÃO: O ÁLCOOL 96 o GL NÃO É BACTERICIDA e o álcool 70% ou álcool iodado só completa sua ação ao secar e não deve ser jogado sobre mãos ainda úmidas;

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6) se tiver algum ferimento nas mãos, avise o professor e procure não tocar no material; 7) prender cabelos longos para evitar exposição ao fogo da chama do bico de Bunsen; 8) usar equipamento de proteção individual (EPI) adequado: guarda-pó ou jaleco de mangas longas, limpo e fechado durante toda a aula, para proteger as roupas de contaminação e manchas ou descolorações com soluções; luvas cirúrgicas descartáveis; máscara, touca e óculos de proteção (estes quando necessário); 9) retirar joias, anéis, relógios e pulseiras; 10) usar calças compridas e sapatos fechados; 11) usar óculos de segurança nas tarefas que apresentarem riscos; 12) nunca aplicar maquilagem / cosméticos ou colocar / retirar lentes de contato no laboratório; 13) é expressamente proibido fumar, comer (nem balas e chicletes) ou beber no laboratório; 14) nunca colocar as mãos na boca, olhos, ouvidos e cabelos durante a aula e, caso ocorra, adotar os procedimentos de higienização adequados; 15) manter a caneta longe da boca; 16) limpar com solução desinfetante, no início e no final de cada aula, a bancada onde você trabalhou e lavar as mãos após desinfetar a bancada ; 17) nunca colocar instrumentos contaminados, como alças de platina, agulhas, pinças e pipetas ou ponteiras sobre a bancada. Alças, agulhas e pinças devem ser esterilizadas na chama (flambadas); pipetas, ponteiras e lâminas usadas devem ser colocadas em recipientes contendo desinfetante, especialmente designados pelo professor, NUNCA devem ser deixados sobre a bancada ou a pia; 18) alças, agulhas e pinças devem ser esterilizadas na chama (flambadas = aquecidas ao rubro) antes e depois de serem usadas e, antes de tocar o material de cultura, deve-se esperar que a alça esfrie próximo à chama; 19) deve-se trabalhar na zona de segurança do bico de Bunsen, que compreende a área mais próxima possível do bico de Bunsen onde o ar é livre de microrganismos; A utilização do Bico de Bunsen é essencial pois visa a diminuição de microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de Flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a Flambagem). 20) ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias inflamáveis (álcool, éter, acetona, …) por perto; 21) tubos de ensaio e placas de Petri com meios de cultura, inclusive aqueles com crescimento de microrganismos só poderão ser abertos nas proximidades da chama para evitar contaminação; 22) tubos de ensaio e placas de Petri devem ser manipulados adequadamente e NUNCA se deve colocar o tampão de algodão sobre a bancada; 23) transportar e manter os tubos de cultura (tubos de ensaio) em uma estante apropriada para evitar acidentes e contaminações de pessoas e ambiente, NUNCA colocar os tubos no bolso do jaleco ou deitados sobre a bancada; 24) manipular culturas de bactérias e fungos com muito cuidado; 25) manipular as culturas de fungo rapidamente para evitar a disseminação de suas estruturas reprodutivas (esporos) no ambiente do laboratório; 26) identificar de maneira clara e completa os materiais particulares (por exemplo: tipo de amostra, data, nome da equipe, turma, método, meio de cultivo, microrganismo inoculado, entre outras informações pertinentes); 27) todo material contaminado deve ser obrigatoriamente esterilizado antes do descarte;

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28) todo material deve ser pipetado com cuidado, lentamente e com peras específicas; 29) nunca pipetar com a boca qualquer que seja a natureza da solução (mesmo que seja água); 30) em caso de quebra ou derramamento de culturas, cobrir toda a área com toalhas de papel e derramar sobre elas o líquido desinfetante disponível no laboratório. Após 15 minutos, remover as toalhas e descartá-las de forma indicada pelo professor; 31) relatar imediatamente ao professor todo e qualquer acidente, ferimento, cortes, ocorridos durante a aula; 32) colocar, ao final de cada aula, todas as culturas e materiais no local indicado pelo professor; 33) falar claramente, manter atenção constante nas ações executadas, evitando movimentação e conversas desnecessárias que possam causar distrações e provocar acidentes; 34) ao sair do laboratório fechar os registros de gás e as torneiras, desligar as luzes e equipamentos (devidamente limpos), limpar todo o material e organizá-lo para equipes de trabalho posteriores; 35) trabalhar atentamente e com responsabilidade!!!

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Materiais usados nos Laboratórios de Microbiologia Os materiais utilizados nos Laboratórios de Microbiologia podem ser classificados da seguinte forma: - Conjunto de uso do aluno - Vidrarias - Acessórios - Equipamentos Faz-se necessário conhecer suas utilidades, características específicas e seu manuseio, para utilizá-los de maneira correta no controle microbiológico. 1. CONJUNTO DE USO DO ALUNO (Material básico): Cada aluno deve portar um jaleco (avental), uma caneta marcadora para vidraria (caneta para retroprojetor pode substituir), e um caderno de laboratório para anotações dos experimentos. O jaleco não deve ser de material semi-sintético (bastante inflamável) e sim de algodão. 2. VIDRARIAS: 2.1 Tubo de cultura ou de ensaio: São tubos de vidro, sem borda ou com tampa de plástico rosqueável. Seu tamanho pode variar de acordo com o trabalho a ser realizado. São utilizados no cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio de cultura, trazendo a vantagem de economizar meio e espaço físico. 2.2 Placas de Petri São recipientes redondos, de vidro ou plástico, com tampa rasa. Geralmente é recomendado determinar-se o seu diâmetro e altura, de acordo com o tipo de trabalho a ser realizado. As mais usadas medem cerca de 100 mm de diâmetro por 10 mm de altura. Servem para conter meio de cultura sólido; Sua superfície extensa facilita o isolamento de espécies microbianas distintas. 2.3 Pipetas graduadas (sorológicas): São utilizadas para diluições, inoculações, distribuições de meio, etc. Em microbiologia estas pipetas devem ser esterilizadas com uma porção de algodão hidrófobo na parte superior. As pipetas para uso com substâncias químicas devem ser separadas das microbiológicas. As pipetas microbiológicas são usadas preferencialmente com dispensadores automáticos. 2.4- Pipetas de Pasteur: São tubos de vidro ou polipropileno, não graduados, estirados em capilar. Servem para transferência de pequenos volumes de líquidos. Podem ser usadas com uma pequena pera de borracha na extremidade superior (tetina). 2.5- Alça de Drigalsky: É obtido pela manipulação de uma vareta de vidro à chama do maçarico. Serve para espalhar suspensões de microrganismos na Placa de Petri contendo meio de cultura sólido. Deve ser flambada á chama antes e após o uso. 2.6- Lâminas de vidro: São de vidro claro e transparente, com formato retangular. São utilizadas para exame dos microrganismos em microscópio óptico. 2.7- Lâminas escavadas: É uma lâmina específica, usada no “ensaio em gota pendente”, onde o material é observado suspenso em uma gota de líquido. Utilizada na observação da mobilidade dos microrganismos. 2.8- Lamínulas: São pequenas lâminas de vidro transparente, quadradas, finas, destinadas a cobrir as preparações contidas nas lâminas, nos ensaios a fresco. Também são usadas para o preparo de lâminas fixadas para uso por longos períodos. 2.9- Hematocitômetro de Newbauer: Lâmina de contagem ou câmara de Newbauer. São escavadas, milimetradas e permitem contar o número de células contidas em um volume determinado de suspensão microbiana. 2.10- Frascos de Cultivo Microbiano: De vidro borossilicato e tampa rosqueada de polipropileno, autoclavável. São vidrarias utilizadas para análises de água e alimentos.

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2.11- Erlenmeyer: É um frasco em balão, usado como recipiente no laboratório. Feito de material de vidro, plástico, policarbonato transparente ou polipropileno transparente, é ideal para armazenar e misturar produtos e soluções, cultivo de organismos e tecidos e em titulações. 2.12- Garrafa de Roux: Garrafas “achatadas” usadas para multiplicação de células (cultivo) e de esporos fúngicos. 2.13-Béquer Recipiente usado para experimentos ou misturas. Pode ser feito de vidro, plástico, policarbonato transparente ou polipropileno transparente. Pode ser usado, de modo grosseiro, para realizar medidas, pois é impreciso. 2.14- Tubos de Durham: São tubos de vidro pequenos e cilíndricos. Servem para captar o gás formado em uma fermentação. 2.15-Termômetros: São utilizados em estufas microbiológicas, de secagem e esterilização, banhos de água (banhosmaria), etc. Deve-se dar preferência a termômetros de álcool (bulbo vermelho). 2.16 Bastão de vidro Utilizado para auxiliar na dissolução de sal, agitações e na transferência de um líquido de um recipiente para outro, evitando perdas. 2.17 Tubos Capilares É um tubo de vidro de dimensões muitíssimo mais pequenas. Tem esta designação uma vez que só se podem introduzir no seu interior substâncias que ocupem muito pouco volume semelhante ao de um capilar. São usados em experiências que envolvam uma grande precisão e rigor e usam quantidades microscópicas de substâncias. 3. ACESSÓRIOS: 3.1 Bico de Bünsen: É um aquecedor a gás com chama, cuja temperatura varia de acordo com a regulagem. É suprido com gás liquefeito de petróleo (GLP) e proporciona uma chama que permite a realização da manipulação das análises microbianas. Deve-se verificar com freqüência se não há vazamentos de gás nas conexões. 3.2 Cabo de Kolle: É um cilindro metálico, contendo um material isolante térmico na extremidade, usado para manipulação microbiana da alça de platina (ou níquel-cromo). Na outra extremidade metálica há um orifício onde é colocada a alça ou agulha que são fixadas mediante encaixe rosqueável, utilizado como suporte para este fim. 3.3 Alça de Platina e agulhas: É um fio de platina ou outra liga metálica, medindo aproximadamente cinco centímetros, recurvado em uma de suas extremidades. É adaptado ao cabo de Kolle. Este material é utilizado para transferir inóculos sólidos ou em suspensão. A agulha é um fio de platina ou de outra liga, que fixado ao cabo de Kolle, é utilizada para semear meio sólido em profundidade. 3.4 Espátulas e pinças: Estes utensílios são normalmente produzidos em aço inoxidável. A espátula é utilizada para pesagem de pequenas massas, enquanto a pinça para manipulação de lâminas, lamínulas, etc... 3.5 Grampo de madeira: Utilizado para segurar e prender tubos de ensaio. 3.6 Lamparina: Utilizada para aquecer pequenas coisas em laboratório, que não exijam temperaturas muito altas, por meio da combustão do álcool. 3.7 Pera de sucção: É usada para auxiliar nos procedimentos de pipetagem ao ser acoplada as pipetas. 3.8 Tetina: Instrumentos de borracha para retirar líquidos do interior de frascos com pipetas Pasteur. 3.9 Pisseta (Pissete ou Frasco Lavador): Com jatos de líquido dirigido, é utilizado para lavagem de precipitado, cristais, recipientes e para

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completar e aferir volumes. 3.10 Tampão de algodão e gaze (chuchu): Tampões de diversos tamanhos que são utilizados para fechar vidrarias como erlenmeyers e tubos de ensaio para proceder a autoclavagem e/ou evitar o contato com outros meios de contaminação (como o ar, por exemplo). 3.11 Barra magnética (peixinho): Utilizada dentro de recipientes de vidro (erlenmeyers, balões e béqueres) que são colocados em agitadores magnéticos. Por meio da sua agitação, líquidos e sólidos podem ser misturados de modo mais homogêneo. 3.12 Swab: É um primo do cotonete, só que feito com uma haste de madeira com uma das pontas envoltas em algodão estéril. O "swab" inteiro é esterilizado em autoclave e usado para coletar amostras de material para culturas de fungos e bactérias. 3.13 Estilete: Formado por um cabo e uma lâmina. Utilizado para realizar pequenos cortes em estruturas e facilitar a visualização em lupas e microscópios. 3.14 Escovas: Usadas para limpeza de tubos de ensaios e outros recipientes de vidro. 4 EQUIPAMENTOS UTILIZADOS: 4.1- Agitador do tipo rotatório (Shaker): É munido de uma plataforma onde os recipientes contendo o meio líquido são fixados O mesmo gira de modo circular, agitando o meio continuamente durante a incubação e também expondo maior superfície do meio à fase gasosa. 4.2- Contador de colônias: É utilizado para contagem de colônias em Placa de Petri. É constituído de um suporte onde é colocada a placa e acima desta, em distância definida, situa-se uma lente (lupa) que possibilita o aumento de 1,5 vezes. Pode acompanhar uma caneta para contagem. Quando o equipamento está funcionando, a placa é iluminada, permitindo assim maior nitidez e realce das linhas que subdividem o suporte. 4.3 Estufa incubadora (Microbiológica): É um tipo específico de estufa que apresenta além da porta metálica, uma porta de vidro. Apresenta um sistema de aquecimento controlado por resistência elétrica. O aquecimento é controlado através de um termostato e a temperatura acompanhada com termômetro analógico ou digital. A temperatura não deve ter uma variação superior à ±0,5ºC. Para determinar a temperatura, coloca-se um termômetro com o bulbo submerso em líquido (glicerina, água, etc.) para maior homogeneidade da medida. Esse equipamento é utilizado como auxiliar no crescimento e reprodução dos microrganismos, uma vez que fornece a temperatura adequada a cada espécie microbiana. 4.4- Incubadora de banho de água (banho-maria): É um equipamento indispensável para realizações dos ensaios de coliformes termotolerantes (44,5ºC ± 0,2ºC). O mesmo é dotado de um termômetro, termostato e tampa para o controle de temperatura do banho. 4.5- Estufa de Esterilização: É um tipo específico de estufa que apresenta um sistema de aquecimento controlado por resistência elétrica, é munida de termostato e termômetro para o controle de temperatura. Em geral este equipamento é utilizado para esterilizar vidrarias. 4.6- Potenciômetro; É um equipamento muito utilizado no laboratório de Microbiologia para se determinar o pH dos diferentes tipos de meios de culturas e soluções tampão. É constituído por eletrodos, botões de ajuste e é dotado de um sistema eletrônico capaz de fornecer leituras diretas com exatidão de ±0,1 unidades de pH. 4.7- Balanças: São destinadas a pesagens das diferentes substâncias usadas no preparo dos vários tipos de meios de cultura, soluções e corantes. Podem ser analógicas ou digitais. As balanças devem ser

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mantidas sobre uma base sólida protegidas de vibrações, e também de umidade e mudanças bruscas de temperatura. 4.8- Autoclave: É um equipamento destinado à esterilização pelo calor úmido (vapor d´água sob pressão). Normalmente, são utilizados para esterilizar águas de diluições, meios de cultura que suportem temperaturas elevadas (115-120ºC), materiais contaminados que vão ser descartados e outros. O autoclave de laboratório pode ser do tipo horizontal ou vertical, contendo os seguintes acessórios: caldeira cilíndrica hermeticamente fechada por uma tampa de bronze ou cobre, dotada de manômetro, válvula de escape de ar e de segurança. Em seu interior existe uma cesta metálica (móvel) onde são colocados todos os materiais a serem esterilizados. É empregado o uso de bioindicadores ou fitas de controle para se testar a eficiência deste equipamento. 4.9 Geladeiras e Congeladores (Freezers): As geladeiras são utilizadas para a conservação de meios de cultura estéreis, soluções e amostras de contra-prova. As culturas microbianas e soluções não devem ser colocados no mesmo equipamentos que as amostras. Jamais poderá guardar refeições, lanches, bebidas ou qualquer outro alimento que irá ser consumido. Se contiver material com risco biológico deverá ser identificada com o pictograma adequado. Culturas vivas não devem ser congeladas. A verificação diária da temperatura é regra geral de controle destes equipamentos. 4.10 Agitador Magnético: É munido de uma plataforma metálica onde o recipiente contendo o meio líquido e uma barra magnética revestida de material inerte é colocado. O mesmo gira barra magnética de modo circular, agitando o meio continuamente durante a incubação e também expondo maior superfície do meio à fase gasosa, 4.11 Microscópio Ótico: Equipamento utilizado para o estudo dos microrganismos. Os equipamentos mais usados permitem o aumento de até 1.250 vezes e podem ser monocular ou binocular. Deve-se ter cuidado para não utilizar preparações a fresco com a objetiva de imersão. 4.12 Auxiliar de Pipetagem (pipeting aide): Equipamento utilizado para pipetar líquidos viscosos tais como meios de cultura e culturas microbianas. As pipetas devem ter uma proteção de algodão hidrófobo para proteger o auxiliar de possíveis contaminações. 4.13 Cabines de Fluxo Laminar Horizontal (A) e Vertical (B): As cabines de fluxo laminar podem ser horizontais ou verticais. São usadas para a manipulação de materiais estéreis como meios de cultura esterilizados, amostras de materiais estéreis (soluções injetáveis, nutrição parenteral, etc), culturas puras de microrganismos,.... As cabines de fluxo laminar horizontais não devem ser usadas para materiais muito contaminados ou culturas puras de microrganismos, pois o fluxo de ar é direcionado no sentido do operador. 4.14 Lupa: Instrumento óptico munido de uma lente com capacidade de criar imagens virtuais ampliadas. É utilizada para observar com mais detalhe pequenos objetos ou superfícies. 4.15 Espectrofotômetro: Determinar a concentração de uma espécie em solução a partir do gráfico da variação de absorvância (ou transmitância) em função da concentração de várias soluções-padrão. 4.16 Destilador equipamento utilizado para a destilação de água 4.17 Agitador mecânico Promove agitação mecânica em fluido, líquidos semi-viscosos e material em suspensão através de movimento circular de hélices. 4.18 Micro-ondas: Utilizado para aquecer soluções. 4.19 Meios de cultura Utilizados para o crescimento e manutenção de microrganismos. 4.20 Corantes As soluções corantes são utilizadas para preparação de microrganismos para a observação microscópica.

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4.21 Soluções Desinfetantes: As soluções desinfetantes são utilizadas para antissepsia das mãos (álcool 70% m/m), ou desinfecção das bancadas (hipoclorito de sódio 2,5%, álcool 70% m/m ou álcool 70% m/m+ Iodo 0,1-0,5% m/v), ou ainda para descarte de resíduos líquidos e de pipetas contaminadas (não usar solução inflamável com álcool 70%). Antes de iniciar qualquer atividade as bancadas devem ser desinfetadas e providenciado recipiente com solução de hipoclorito de sódio para descarte das pipetas. As soluções podem ser armazenadas em pissetas plásticas. Exercícios -Qual o nome dos materiais e equipamentos das figuras?

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Microscopia 1. Introdução Os microrganismos são seres vivos muito pequenos. O olho humano é incapaz de vê-los de forma clara e individualizados. Para observá-los, é preciso aumentá-los, o que se consegue com o uso de um microscópio óptico composto. O microscópio óptico composto ou microscópio de luz é um instrumento de precisão que permite a visualização de microrganismos. Ele se constitui, basicamente, de uma parte mecânica e de uma parte óptica. 1.1 Parte mecânica A parte mecânica de um microscópio óptico composto é representada pelo corpo ou braço do microscópio, que se encontra apoiado pela extremidade inferior em uma base metálica de tamanho e peso suficientes para assegurar o equilíbrio do aparelho. A extremidade superior do braço articula-se com um tubo metálico conhecido como canhão que suporta as lentes. O parafuso macrométrico possibilita deslocamentos rápidos e de grande amplitude, enquanto que o micrométrico se restringe a pequenos movimentos. Na parte inferior do tubo do microscópio, são colocadas as objetivas. De número variável, elas são rosqueadas em um dispositivo móvel especial denominado revólver que permite o intercâmbio das objetivas. Entre o canhão e a base do microscópio, existe uma plataforma metálica chamada mesa ou platina do microscópio. Sobre a platina é colocada a lâmina com a preparação a ser examinada, que será fixada por meio de presilhas, para que permaneça imóvel. Para correr todo o campo do microscópio, existe um dispositivo especial denominado charriot que, por intermédio de dois parafusos, permite o deslocamento da preparação. 1.2 Parte óptica A parte óptica de um microscópio de luz constitui-se nas lentes e no sistema de iluminação. As lentes são separadas da seguinte forma: - lentes oculares: são adaptadas na extremidade superior do tubo do microscópio. É através delas que o observador olha. A ocular geralmente produz aumentos de 10x. Há oculares que produzem aumentos de 5x, 15x e 20x. - lentes objetivas: são constituídas por um conjunto de lentes que se acham dispostas na extremidade inferior do tubo do microscópio. A maioria dos microscópios possui três objetivas (pequena, com aumento de 4x; média, com aumento de 10x; e grande, com aumento de 40x) e uma objetiva de imersão de 100x; * objetiva de imersão: dá maior aumento e permite ver o objeto com mais nitidez ao se colocar uma gota de óleo de cedro sobre a preparação e baixar a objetiva sobre a lâmina, de forma que esse líquido denso se interponha entre a objetiva e o objeto a ser examinado. Nesse caso, os raios luminosos não sofrem desvio, pois o índice de refração do óleo é igual ou muito próximo ao do vidro. O aumento final da preparação é dado pelo produto entre o valor da objetiva e o valor da ocular. Chama-se poder de resolução de uma objetiva a capacidade de ver nitidamente o menor espaço compreendido entre dois pontos. O olho humano por exemplo, geralmente não consegue distinguir por dois pontos que estejam separados por uma distância menor que 0,1 mm (100 μm).

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Os bons microscópios ópticos podem superar bastante esse limite, distinguindo em até 0,2 μm. O sistema de iluminação é representado pelo condensador, que dirige os raios de luz para o objeto, e por uma fonte de luz que pode ser direta ou refletida por um espelho. O condensador possui um diafragma com a finalidade de controlar a quantidade de luz desejada. A refração é o desvio da luz quando ela passa de um meio para outro de densidades diferentes. 1.3 Unidades de medida Como a estrutura dos microrganismos é muito pequena, nós necessitamos de medidas especiais para elas: - Micrômetro (μm): que equivale à milésima parte do milímetro. 1 μm = 10-3 mm - Nanômetro (nm): que equivale à milésima parte do micrômetro. 1 nm = 10-3 μm - Angstron (A): que equivale à décima milésima parte do micrômetro. 1 A = 10-4 μm O micrômetro é mais utilizado em microscopia óptica (m.o.), enquanto que o nanômetro e o angstron são mais utilizados em microscopia eletrônica (m.e.) 2. Como usar o microscópio Posição de descanso Ao iniciar o trabalho o aparelho deve ser encontrado na sua posição de descanso: coberto com a capa protetora, platina totalmente abaixada, lente objetiva 4x (a menor) apontada, botão liga-desliga desligado, tomada sem conexão com a luz. Início do trabalho 1) retirar a capa protetora do aparelho 2) ligar o microscópio à tomada 3) ligar o botão liga-desliga 4) regular a intensidade luminosa 5) abrir o grampo 6) colocar a lâmina 7) fechar o grampo 8) erguer a platina até o ponto máximo usando o botão (ou parafuso) macrométrico 9) regular a abertura interpupilar 10) abaixar a platina, usando o macrométrico até ver o objeto da lâmina em foco 11) ajustar a focalização com o botão micrométrico 12) trocar para a lente objetiva de aumento imediatamente superior (10x) 13) ajustar a focalização somente com o botão micrométrico 14) trocar para a lente objetiva de aumento imediatamente superior (40x) 15) ajustar a focalização somente com o botão micrométrico 16) se necessário, colocar uma gota de óleo de imersão e trocar para a lente objetiva de aumento imediatamente superior (100x) 17) ajustar a focalização somente com o botão micrométrico Vale ressaltar que o aumento total é dado pela multiplicação dos valores da objetiva e da ocular. Os itens compreendidos entre 12 e 17 só deverão ser feitos de necessário. 3. Objetivos - Reconhecer as partes e aprender a manusear o microscópio óptico; - Aprender a focalizar preparados no microscópio; - Observar atentamente os cuidados a serem tomados com o microscópio de luz; - Observar e reproduzir na forma de desenhos a morfologia dos objetos examinados durante a aula. 4. Materiais Lâminas; microscópio óptico composto; óleo de cedro (óleo de imersão); papel absorvente. 5. Métodos - Reconhecer as partes do microscópio; - Focalizar as lâminas, repetindo a focalização tantas vezes quantas forem necessárias; - Observar a morfologia dos objetos examinados.

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6. Cuidados com o microscópio após o uso - Distanciar a objetiva da lâmina; - Retirar a lâmina da platina; - Limpar todas as lentes com papel absorvente macio; - Caso tenha sido utilizado óleo de imersão, limpar a objetiva de imersão com papel absorvente; - Colocar a platina na posição totalmente abaixada; - Colocar a menor lente objetiva apontada; - Desligar o sistema de iluminação; - Retirar o aparelho da tomada; - Recobrir o aparelho com a respectiva capa protetora. 7. Aula prática Focalize as estruturas em cada lâmina e esquematize a morfologia observada no espaço correspondente.

Objeto:_________________________ Aumento final:___________________

Objeto:_________________________ Aumento final:___________________

Objeto:_________________________ Aumento final:___________________

Objeto:_________________________ Aumento final:___________________

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PARA CASA 1) Descreva o procedimento de focalizar com óleo de imersão. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 2) Qual é a finalidade do óleo de cedro na focalização em imersão? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 3) Como se calcula o aumento final do objeto após a focalização? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 4) Qual é o aumento final obtido quando: a) são utilizadas: uma objetiva de 100x e uma ocular de 10x? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ b) são utilizadas: uma objetiva de 10x e uma ocular de 10x? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ c) são utilizadas: uma objetiva de 40x e uma ocular de 10x? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 5) O que é poder de resolução de uma objetiva? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 6) Qual a finalidade do condensador? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 7) Qual a finalidade do diafragma? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________

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Averiguação da presença de microrganismos no ambiente e experimento de Price 1. Introdução O meio aquático foi, provavelmente, o ambiente de origem dos microrganismos que, posteriormente, se especializaram e colonizaram o ambiente terrestre. Hoje, eles são encontrados em toda parte, em suspensão ou assentados com poeira em várias superfícies. Como os microrganismos estão presentes nas partículas de poeira, são passíveis de entrar no organismo do indivíduo cada vez que se respira. O ar deposita-se nos cabelos, nas roupas, na pele e nas mucosas. Do ar passam para o alimento e para a bebida. Felizmente, na sua maioria, os microrganismos são inócuos ou benéficos. São relativamente poucos os que causam prejuízos ao homem. É função do microbiologista estimular e otimizar o desenvolvimento de microrganismos benéficos e inibir aqueles que causam doenças ou deterioram os alimentos e o ambiente. As mãos, por outro lado, constituem um dos elos mais importantes na cadeia da infecção cruzada. A quantidade de microrganismos constituintes da microbiota normal da pele deve ser reduzida, de modo a eliminar possíveis microrganismos patogênicos aí presentes. A desinfecção é definida como a eliminação parcial dos microrganismos presentes em um determinado ambiente. Os métodos de desinfecção visam, principalmente, destruir as formas microbianas patogênicas ao homem, através da utilização de um agente desinfetante ou agente microbiano. Os diversos tipos de agentes antimicrobianos poderiam ser divididos em três grupos: agentes físicos, agentes químicos e agentes quimioterápicos. O grau de eficiência de cada agente é dependente da concentração, das condições do ambiente e do estado das células. 2. Objetivos Reconhecer materiais, equipamentos e normas do laboratório de microbiologia; Averiguar a presença de microrganismos no ambiente; Averiguar a presença de microrganismos na pele humana e as alterações no seu número e na sua diversidade com as práticas de higienização das mãos. 3. Materiais 3.1 Meios de cultura e soluções Ágar batata dextrosado (BDA – batata dextrose ágar) Álcool 70% Sabonete líquido 3.2 Equipamentos e utensílios Placas de Petri Canetinha Filme transparente de PVC (plástico filme) Lamparina Papel toalha

Fósforo Estufa bacteriológica Cronômetro Régua

4. Procedimento 4.1 Verificação de contaminação ambiental Pegar duas placas de Petri com meio de cultivo e identificá-las com nome do grupo, data e número da placa (1 ou 2 – que identificará a condição de inoculação) na parte de trás da placa com canetinha, de modo que não comprometa a visualização dos resultados (seguindo a circunferência da placa); Remover o filme transparente de PVC ao redor de uma placa de Petri com BDA e expô-la em uma determinada condição preestabelecida:

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GRUPO 1: placa 1: ar – deixar a placa com meio de cultura exposta ao ar por 15 minutos no (a) __________ (escolher um local no Instituto) placa 2: pele – passar os dedos em vários pontos da superfície do meio de cultivo. GRUPO 2: placa 1: ar – deixar a placa com meio de cultura exposta ao ar por 15 minutos no (a) __________ (escolher um local no Instituto) placa 2: cabelo – agitar vigorosamente os cabelos em direção à superfície da placa. GRUPO 3: placa 1: ar – deixar a placa com meio de cultura exposta ao ar por 15 minutos no (a) __________ (escolher um local no Instituto) placa 2: respiração – inocular na placa, tossindo ou espirrando, diretamente sobre a superfície do meio de cultivo. GRUPO 4: placa 1: ar – deixar a placa com meio de cultura exposta ao ar por 15 minutos no (a) __________ (escolher um local no Instituto) placa 2: cabelo – inocular na placa falando diretamente sobre a superfície do meio de cultivo. Colocar filme transparente de PVC ao redor das placa de Petri; Utilizar como controle para o experimento uma placa com meio de cultivo estéril fechada; Fazer a incubação das placas a 35 oC, por 7 dias. As placas devem ser incubadas invertidas, para evitar que o meio se desidrate e que a água de condensação caia sobre a superfície do meio; Após o período de incubação, anotar a presença e a diversidade morfológica das colônias microbianas que cresceram sobre a superfície do meio de cultivo. 4.2 Experimento de Price Pegar uma placa de Petri com meio de cultivo (BDA); Dividir a parte inferior da placa de Petri em quatro partes (A, B, C e D) e identificar a placa, anotando na tampa a data, o grupo e as iniciais do nome de quem vai fazer o teste; Escolher um dedo da mão e, sem lavar, colocá-lo em contato com a superfície do meio de cultivo na área da placa assinalada com “A”; Lavar as mãos com sabonete, vigorosamente, secar ao ar e, em seguida, colocar o mesmo dedo em contato com a área “B”; Desinfetar as mãos pré-lavadas com álcool 70%, secar ao ar e colocar o dedo em contato com a área “C”; Manter a área “D” como controle (testemunha), não inoculada; Incubar a placa a 35oC, por 48 horas; Avaliar os resultados, observando os tipos e a abundância de colônias em cada parte.

Testemunha

D

A

Dedo sem lavar

Dedo desinfetado

C

B

Dedo lavado

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RELATÓRIO: 1) Em relação às placas com meio de cultivo BDA inoculadas de diferentes formas pelos 4 grupos, enumere e caracterize as colônias que cresceram na superfície das placas, quanto a tamanho, cor e forma, nos esquemas a seguir: GRUPO 1 – PLACA 1 GRUPO 1 – PLACA 2

GRUPO 2 – PLACA 1

GRUPO 2 – PLACA 2

GRUPO 3 – PLACA 1

GRUPO 3 – PLACA 2

GRUPO 4 – PLACA 1

GRUPO 4 – PLACA 2

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2) Em relação às placas de Petri do experimento de Price, esquematize o resultado obtido:

Grupo / nome do aluno

Tratamentos Avaliações

A T

Grupo 1

No de colônias

Grupo 2

No de colônias

Grupo 3

No de colônias

F

B B

T

F

C B

T

F

D B

T

F

B

Grupo 4 No de colônias T = total, F = fungos, B = bactérias 3) Interprete o resultado do experimento de Price do seu grupo. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 4) O que ocorreu com a área de controle da placa de Petri usada no “Experimento de Price” (onde o dedo não foi colocado)? Justifique seus resultados. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 5) O que ocorreu com a placa de Petri usada como controle no experimento “Verificação de contaminação ambiental”? Justifique seus resultados. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 6) Qual a utilidade do bico de Bunsen ou da lamparina no laboratório de Microbiologia? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________

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Preparo de materiais e vidrarias para esterilização em autoclave 1. Introdução O acondicionamento correto de materiais e de vidrarias é de vital importância para a esterilização eficiente em autoclave. O sucesso das análises depende da obtenção de materiais livres de contaminação iniciais, a fim de que se possa determinar apenas o microrganismo presente em determinada amostra. Assim, pipetas, placas de Petri, tubos de cultura e demais instrumentos usados em microbiologia devem estar corretamente embalados, para que, depois de esterilizados, possam ser guardados sem que sofram nenhum tipo de contaminação subsequente. Placas e pipetas devem ser acondicionadas em papel de embrulho, ou em papel kraft, e identificadas antes da esterilização (Fig. 1 e 2). Tubos de ensaio e erlenmeyers (balões de fundo chato) com meio de cultura devem possuir tampão de algodão e gaze (boneca / chuchu) obtido por meio da técnica de “embuchamento” (Fig. 3 e 4). Em seguida, as bonecas de gaze devem ser cobertas por uma coifa, feita com um pedaço de papel kraft, que será amarrada com um fio ou elástico (Fig. 4). Para testar a eficiência da esterilização, pode ser realizado um processo químico com uma fita própria para autoclave (fita adesiva; Fig. 5) ou um processo biológico, com uma ampola contendo Bacillus stearothermophillus (um bastonete esporulado muito resistente ao calor; Fig. 6). Após a esterilização, a ampola com o microrganismo é incubada em estufa regulada a 37 oC, por 24 horas. Se não houver mudança na cor inicial (rosa) da ampola, a esterilização foi eficiente. Caso ocorra mudança da cor inicial, de rosa para amarelo, a esterilização não foi eficiente (Fig. 6). A mudança da cor inicial rosa para amarelo indicará ocorrência de fermentação de carboidratos existentes no líquido da ampola, demonstrando, portanto, que o microrganismo continua vivo. Compreende-se por esterilização a completa destruição de qualquer organismo vivo. Essa destruição pode ser realizada pelo chamado controle de microrganismos, sendo que o mais frequentemente usado é o que utiliza o calor como agente. O emprego de calor se faz por meio de flambagem e estufa (calor seco) e de água fervente, autoclavagem e tindalização (calor úmido). O calor seco provavelmente exerce a maioria de seus danos pela oxidação das moléculas. O calor úmido destrói os microrganismos principalmente pela desnaturação proteica, pela presença de moléculas de água, que ajudam a romper as pontes de hidrogênio, outras interações fracas que mantêm as proteínas em suas conformações tridimensionais, além de romperem membranas lipídicas. 1.1 Calor seco O calor seco (como forno ou estufa) penetra nas substâncias mais lentamente que o calor úmido (vapor). É, geralmente, usado para esterilizar objetos de metal e vidro, e é o único meio satisfatório para esterilizar óleos e pós. Os objetos são esterilizados por calor seco quando submetidos a 171 oC por 1 hora, a 160 oC por 2 horas ou mais, ou a 121 oC por 16 horas ou mais, dependendo do volume. Uma chama aberta (flambagem) é a forma de calor seco usada para esterilizar, pela incineração, alças de inoculação, bocas de tubos de ensaio e para secar o interior de pipetas. Quando os objetos forem flambados no laboratório, deve-se evitar a formação de cinzas flutuantes e aerosóis (gotículas liberadas no ar). Essas substâncias podem se constituir em um meio de espalhar agentes infecciosos, se os organismos presentes não forem mortos pela incineração como pretendido. Por essa razão, incineradores de alça especialmente desenhados, com gargantas fundas, são frequentemente usados para esterilizar alças de inoculação. 1.2 Calor úmido O calor úmido é um agente físico amplamente usado. A água fervente destrói células vegetativas da maioria das bactérias e dos fungos e inativa alguns vírus. Entretanto, não é eficiente na destruição de todos os tipos de esporos. O processo de autoclavagem utiliza água aquecida sob pressão. Seu ponto de ebulição é elevado e, assim, temperaturas acima de 100 oC podem ser alcançadas. Isso é normalmente obtido por meio de uma autoclave com pressão de 15 lb/pol 2 mantida por 15 a 20 minutos, dependendo do volume da carga. Nessa pressão, maior do que a atmosférica, a temperatura

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alcança 121 oC, que é alta o suficiente para matar os esporos, como também organismos vegetativos, e para romper a estrutura dos ácidos nucleicos nos vírus. Na tindalização, o material é submetido a três sessões de exposição a vapor de água a 100 oC, durante 20 a 45 minutos; durante 45 minutos; e durante 20 a 45 minutos, com um tempo de repouso entre elas de 24 horas. Consegue-se a esterilização visto que os esporos germinam entre duas sessões e depois são destruídos. Essa técnica é usada para soluções açucaradas ou que contenham gelatina. 2. Objetivo - Aprender a preparar materiais de forma correta para esterilização; - Observar o funcionamento de uma autoclave. 3. Materiais 1) placas de Petri 2) pipetas 3) erlenmeyer 4) béquer 5) tubos de ensaio

6) papel kraft 7) canetinhas 8) fita crepe 9) tesoura 10) algodão

11) gaze 12) barbante 13) elástico 14) folha de papel A4 15) autoclave

4. Métodos 4.1 Preparação da vidraria para esterilização Placas de Petri - Separar as placas limpas e secas; - Embalar as placas (mínimo 4 e máximo 10) para facilitar a estocagem); - Colocar as placas no centro do papel e começar a embrulhá-las firmemente, para evitar a absorção de umidade em excesso; fechar com fita crepe (Fig. 7). Pipetas - Colocar um pedaço pequeno de algodão no bocal de cada uma das pipetas; - Embrulhá-las uma a uma, identificando-as de acordo com as orientações do professor (Fig. 8). Tubos de ensaio e erlenmeyers - Preparar os tampões de algodão e gaze de acordo com o tamanho da boca de cada vidraria; - Colocar os tampões na boca dos tubos de ensaio e dos erlenmeyers de forma que fiquem firmes mas não muito apertados; - Colocar um pedaço de papel kraft sobre o tampão em cada tubo de ensaio e em cada erlenmeyer, prender com elástico ou barbante (Fig. 4). Béqueres - Colocar um pedaço de papel kraft sobre a boca do béquer e prender com elástico ou barbante. Levar todo o material preparado para o local da esterilização. 4.2 Esterilização em autoclave (Fig. 9) - Observar o nível da água, que deve estar até 1 cm abaixo da cruzeta (Fig. 10); - Colocar o cesto da autoclave; - Colocar o material a ser esterilizado dentro da autoclave, de acordo com a capacidade do equipamento; - Fechar a tampa, apertando os manípulos em cruz; - Ligar a autoclave na potência máxima e abrir o registro (válvula de escape); - Aguardar a saída do vapor por 3 a 5 minutos, fechando o registro após esse tempo; - Alcançada a temperatura de trabalho (121 oC), colocar a chave na posição média, ajustando, quando necessário, os pesos que controlam a quantidade de vapor; - Marcar o tempo, que deverá ser de 15 a 30 minutos, dependendo do material; - Terminado o tempo de esterilização, desligar a autoclave e deixar que o ponteiro do manômetro atinja a posição zero; - Abrir o registro aos poucos e aguardar a saída do vapor da autoclave de maneira que ele seja escoado completamente;

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- Em seguida, abrir os manípulos em cruz e retirar os materiais, colocando-os em estufa de secagem, e incubando-os a 100 oC por 30 minutos. Observações: • Não abrir o registro antes que o manômetro atinja a posição zero, para evitar que o material esterilizado fique muito molhado e que os papéis que o envolvem se rasguem; • Nunca abandonar o local de esterilização, conferindo sempre a temperatura da autoclave, e evitando a quebra de materiais e o RISCO DE EXPLOSÃO.

Fig. 1 – Pipetas acondicionadas com papel kraft

Fig. 2 – Placas acondicionadas com papel kraft

Fig. 3 – a) Tubo de ensaio; b) Tubo de ensaio com boneca

Fig. 4 – a) Erlenmeyer com boneca; b) Erlenmeyer com meio de cultura e coifa

líquido rosa

líquido amarelo

Fig. 6 – Ampolas de Bacillus stearothermophilus

Fig. 5 – Fita crepe para autoclave a) Autoclavado; b) Nãoautoclavado

Fig. 7 – Placas de Petri sendo embrulhadas com papel kraft

Fig. 10 vertical

–

Autoclave

Fig. 8 – Pipetas sendo embrulhadas com papel kraft

Fig. 11 – Nível da água em 1 cm abaixo da cruzeta

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EXERCÍCIOS TEXTO DA APOSTILA 1) O que é esterilização? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) Por que devemos esterilizar os materiais em microbiologia? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) Quais os dois métodos para testar a eficiência da esterilização? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4) O que indica a mudança de cor da ampola com Bacillus stearothermophillus? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5) Métodos de esterilização frequentemente usam o calor. Cite os meios que podem ser empregados. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 6) Qual a principal diferença entre calor seco e calor úmido? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 7) Descreva o procedimento necessário para preparar as vidrarias abaixo mencionadas para esterilização em autoclave. - placa de Petri: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ - pipeta: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ - erlenmeyer: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ - béquer: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 8) Como são feitas e para que servem as bonecas? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 9) Explique resumidamente o processo de autoclavagem. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 10) Por que se deve esperar sempre que a autoclave escoe todo o vapor (posição zero do manômetro) antes de proceder a abertura da tampa? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

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EXERCÍCIOS DO LIVRO 1) Qual o significado e a definição de: - PMT: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ - TMT: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ - TRD ou valor D: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2) Para que servem o PMT e o TMT? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3) O tempo de morte térmica para uma suspensão de endosporos de Bacillus subtilis é de 30 minutos em calor seco e menos de 10 minutos em autoclave. Que tipo de calor é mais efetivo? Por quê? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4) Se a pasteurização não atinge a esterilização, porque o alimento é tratado por pasteurização? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5) Preencha a seguinte tabela: Método de Temperatura esterilização

Tempo

Tipo de calor

Uso preferencial

Tipo de ação

Autoclave Ar quente Pasteurização 6) Por que os tratamentos pasteurização clássica, HTST e UHT são chamados de tratamentos equivalentes? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 7) Qual dos seguintes métodos não mata endosporos? a) autoclave d) pasteurização b) incineração e) nenhuma das alternativas c) esterilização com ar quente

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CURIOSIDADE SOBRE ESTERILIZAÇÃO COMERCIAL A esterilização comercial é um método utilizado para destruir endosporos da bactéria Clostridium botulinum e não é tão rigorosa como a esterilização completa. A razão é que se os endosporos de C. botulinum são destruídos, então qualquer outra bactéria deteriorante significativa ou patogênica também será destruída. Para garantir a esterilização comercial, aquecimento suficiente é fornecido ao tratamento 12D (12 reduções decimais), pelo qual uma população teórica de endosporos de C. botulinum irá diminuir em 12 ciclos logarítmicos. Isso significa que se existem 10 12 (1.000.000.000.000) endosporos em uma lata, após o tratamento haveria somente 1 sobrevivente. Como 10 12 é uma população supostamente grande, esse tratamento é considerado quase seguro. Algumas bactérias termofílicas que formam endosporos, possuem endosporos que são mais resistentes ao aquecimento que os de C. botulinum. Entretanto essas bactérias são termófilos obrigatórios e, geralmente, sem mantêm dormentes em temperaturas abaixo de 45 oC. Logo, elas não são um problema de deterioração em temperaturas normais de armazenamento de alimentos enlatados.

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O mundo dos fungos 1. Introdução Também conhecidos como bolores, mofos, leveduras, cogumelos, orelhas-de-pau, os fungos contribuem de forma fundamental para o ciclo da matéria nos ecossistemas, pois muitos são decompositores de matéria orgânica, o que gera a reciclagem dos nutrientes. Alguns são causadores de doenças, outros são comestíveis e outros usados na indústria para fabricação de bebidas e do pão. Alguns fungos são venenosos, como o cogumelo branco da espécie Amanita muscuria, que pode matar uma pessoa, e espécies do gênero Psilocybe, que provocam efeitos alucinógenos semelhantes ao LSD, causando sérios danos ao sistema nervoso. Algumas espécies de fungos vivem em associações mutualísticas com raízes de plantas, formando as micorrizas. Os fungos também podem se associar a algas verdes e a cianobactérias, formando os liquens, que se instalam em troncos de árvores, rochas, muros, etc. Eles podem ser unicelulares, como as leveduras, ou pluricelulares, como os fungos filamentosos. Nesta aula prática, você terá oportunidade de observar algumas estruturas dos fungos. 2. Objetivos - Entender a diversidade dos fungos; - Observar macroscopicamente e microscopicamente a estrutura dos fungos. 3. Materiais – Exemplares de fungos (mofos, cogumelos,orelhas de pau,...) – lâmina – lamínula – pinça

– – – –

microscópio lupa estilete durex

4. Procedimentos 4.1 Estrutura macroscópica e microscópica de fungos - Selecione alguns tipos de fungos e observe sua estrutura macroscópica, faça pequenos cortes e observe as estruturas em uma lupa. - Para observação microscópica, faça lâminas pela técnica do Imprint e observe no microscópio.

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5. Resultados e discussão Estrutura macroscópica e microscópica de fungos Desenhe os aspectos macroscópicos e as estruturas microscópicas dos fungos que você observou. Descreva as principais características observadas!

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O mundo dos fungos – fermentação 1. INTRODUÇÃO A fermentação alcoólica é realizada por um fungo unicelular, também chamado de fungo da cerveja ou fermento de padaria, cientificamente chamado de Saccharomyces cerevisiae. A S. cerevisiae é uma levedura que fermenta o açúcar, produzindo álcool etílico e gás carbônico. Essa levedura é utilizada na fabricação de bebidas alcoólicas (vinhos, cervejas, aguardentes, etc.) e na fabricação de pães - na qual o gás carbônico é o responsável pelas bolhas que tornam a massa mais macia. Reação: a levedura S. cerevisiae é o agente biológico da fermentação alcoólica, na qual os açúcares são transformados em etanol e dióxido de carbono, segundo a reação química: C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 + energia Glicose Etanol Dióxido de carbono 2. OBJETIVO Observar a reação química na fermentação da levedura S. cerevisiae em diferentes proporções de açúcar (alimento) e de levedura. 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 MATERIAIS ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 3.2 MÉTODOS Montar o experimento como indicado na tabela a seguir: Equipe

Água

Açúcar

S. cerevisiae

1

50mL

5g

2,5g

2

50mL

10g

2,5g

3

50mL

20g

2,5g

4

50mL

10g

10g

5

50mL

10g

–

6

50mL

–

2,5g

- Faça a pesagem em balança analítica do açúcar e da levedura, usando espátula e casinha de papel alumínio - Em um erlenmeyer (125 mL) adicione 50 mL de água destilada e a quantidade de açúcar, agite para misturar. - Feche o erlenmeyer com tampão de algodão e gaze e aqueça-o por 15 s no micro-ondas. - Adicione o fermento biológico a solução de água com açúcar do erlenmeyer. - Feche a boca do erlenmeyer com um balão de ar bem ajustado (se necessário reforce com um pedaço de barbante ou com um elástico). - Deixe repousar sobre luz direta.

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- Aguarde o início do processo de fermentação. - Agite o frasco e retire uma alíquota de leveduras com auxílio de espátula e capilar. - Faça o esfregaço em uma lâmina com essa alíquota e cubra com lamínula. - Observe no microscópio. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO a) O que aconteceu com os balões de ar quando colocados na boca dos tubos? Por que? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ b) Foi possível observar alguma alteração na solução dentro da garrafa? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ c) Explique a importância do açúcar colocado na solução com o fermento biológico. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ d) Que tipo de reprodução você pode observar em Saccharomyces? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ e) Explique as diferenças observadas no experimento. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ f) O que aconteceu nos controles? Por que é importante montar esses controles? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________

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g) Explique por que o fermento biológico faz crescer as massas de pães. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ h) Desenhe a lâmina observada e descreva as principais características.

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6. CONCLUSÃO ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________

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Preparações Microscópicas a Fresco e Fixadas Simples Objetivos: – Preparar lâminas para observação de microrganismos (bactérias e fungos); – Realizar técnicas de esfregaço, fixação e coloração simples; – Visualizar os microrganismos em microscópio. Preparações microscópicas A perfeita visualização dos microrganismos e/ou das suas estruturas só é possível se a preparação estiver adequada. A escolha do tipo de preparação depende da informação desejada e do microrganismo a ser avaliado. Duas técnicas gerais são empregadas: - A fresco Preparações deste tipo permitem o exame de organismos nas condições normais de vida e são preferencialmente utilizados para verificar mobilidade, morfologia (quando a morfologia da célula é distorcida por processos de fixação/coloração), processos fisiológicos (divisão celular, formação de esporos). As preparações a fresco podem ser realizadas com ou sem coloração. Geralmente são utilizados corantes vitais que não comprometem a viabilidade celular. Ex.: azul de metileno. - Fixados e corados As preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as características morfológicas dos microrganismos. As etapas essenciais dessas preparações são: preparo de esfregaço, fixação e coloração. O esfregaço é uma camada muito fina de material sobre a lâmina que deve ser secada ao ar. A fixação pode ser feita pela ação do calor e serve para imobilizar os constituintes celulares, ou seja, para fixar o esfregaço pela precipitação ou coagulação de proteínas. A coloração pode ser simples (1 corante, ex.: azul de metileno) ou diferenciais (mais de um corante, ex.: Gram) Roteiro da aula prática: 1) Levedura Saccharomyces cerevisae - flambar rapidamente uma lâmina de microscopia nos dois lados, “cortando” lentamente a chama da lamparina; - flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar perto da chama; - tomar o tubo com a suspensão de leveduras, agitar levemente e remover o tampão; - flambar o tubo de ensaio; - introduzir a alça de platina no interior do tubo até tocar a suspensão; - flambar novamente a boca do tubo; - fechar o tubo com o tampão e colocar na estante; - pegar a lâmina e depositar em seu centro uma gotícula da suspensão; - pingar uma gota de azul de metileno a pequena distância da suspensão e, sobre a lâmina, colocar uma lamínula; - observar ao microscópio na objetiva de 40x. 2) Bactéria (material sólido) - flambar rapidamente uma lâmina de microscopia nos dois lados, “cortando” lentamente a chama da lamparina; - flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar perto da chama; - tomar a placa com as bactérias e abrir em frente à lamparina; - introduzir a alça de platina no interior da placa até tocar as colônias de bactéria; - fehar a placa de Petri e colocar ao lado; - colocar no centro da lâmina uma pequena gota de solução fisiológica com a alça de platina; - transferir uma pequena alíquota da cultura sólida com a alça para a lâmina e espalhar o material com movimentos circulares (esfregaço); - “cortar” lentamente a lâmina na chama da lamparina 3 vezes para que o material fique bem aderente à lâmina (fixação). A fixação é feita do lado contrário ao esfregaço bacteriano; - cobrir a lâmina com o esfregaço fixado com o corante azul de metileno e deixar agir por 1 minuto; - lavar rapidamente com água; - secar e colocar uma lamínula; - observar ao microscópio na objetiva de 100x com óleo de imersão.

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3) Micélio fúngico - flambar rapidamente uma lâmina de microscopia nos dois lados, “cortando” lentamente a chama da lamparina; - flambar a agulha de platina ao rubro e deixá-la esfriar perto da chama; - tomar a placa de Petri com o micélio e, com auxílio da agulha, retirar uma pequena porção de micélio; - fechar a placa; - pegar a lâmina e depositar em seu centro uma porção do micélio; - pingar uma gota de azul de metileno a pequena distância da suspensão e, sobre a lâmina, colocar uma lamínula; - observar ao microscópio na objetiva de 40x.

Resultados Desenhar e descrever as estruturas observadas nas 5 lâminas! LÂMINA 1

________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ LÂMINA 2

________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________

LÂMINA 3

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Técnica de Coloração de Gram. Objetivos – – – –

Preparar lâminas para observação de microrganismos (bactérias); Realizar técnicas de esfregaço, fixação e coloração diferencial de Gram; Visualizar os microrganismos em microscópio; Classificar as bactérias segundo o tipo de Gram. Preparações microscópicas

A perfeita visualização dos microrganismos e/ou das suas estruturas só é possível se a preparação estiver adequada. A escolha do tipo de preparação depende da informação desejada e do microrganismo a ser avaliado. Duas técnicas gerais são empregadas: - A fresco Preparações deste tipo permitem o exame de organismos nas condições normais de vida e são preferencialmente utilizados para verificar mobilidade, morfologia (quando a morfologia da célula é distorcida por processos de fixação/coloração), processos fisiológicos (divisão celular, formação de esporos). As preparações a fresco podem ser realizadas com ou sem coloração. Geralmente são utilizados corantes vitais que não comprometem a viabilidade celular. Ex.: azul de metileno. - Fixados e corados As preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as características morfológicas dos microrganismos. As etapas essenciais dessas preparações são: preparo de esfregaço, fixação e coloração. O esfregaço é uma camada muito fina de material sobre a lâmina que deve ser secada ao ar. A fixação pode ser feita pela ação do calor e serve para imobilizar os constituintes celulares, ou seja, para fixar o esfregaço pela precipitação ou coagulação de proteínas. A coloração pode ser simples (1 corante, ex.: azul de metileno) ou diferenciais (mais de um corante, ex.: Gram). Roteiro da aula prática 1) Bactéria (material sólido – placa de Petri) - flambar rapidamente uma lâmina de microscopia nos dois lados, “cortando” lentamente a chama da lamparina; - flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar perto da chama; - tomar a placa com as bactérias e abrir em frente à lamparina; - introduzir a alça de platina na placa até tocar as colônias de bactéria; - fechar a placa e colocar ao lado; - colocar no centro da lâmina uma pequena gota de solução fisiológica com a alça de platina; - transferir uma pequena alíquota da cultura sólida com a alça para a lâmina e espalhar o material com movimentos circulares (esfregaço); - secar ao ar; - “cortar” lentamente a lâmina na chama da lamparina 3 vezes para que o material fique bem aderente à lâmina (fixação). A fixação é feita do lado contrário ao esfregaço bacteriano; - corar a lâmina pela Técnica de Gram: a) na pia, segurar a lâmina com uma pinça e cobrir a lâmina com cristal violeta, deixar agir por 1 minuto; b) lavar rapidamente a lâmina com água; c) cobrir a lâmina com solução de lugol e deixar agir por 1 minuto; d) lavar rapidamente a lâmina com água; e) lavar a lâmina com álcool (etanol) até que não se desprenda mais corante da preparação (aproximadamente 15 segundos); f) lavar rapidamente a lâmina com água; g) cobrir a lâmina com solução de safranina e deixar agir por 30 segundos; h) lavar rapidamente a lâmina com água; i) secar e colocar uma lamínula; - observar ao microscópio na objetiva de 100x com óleo de imersão.

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2) Iogurte - flambar rapidamente uma lâmina de microscopia nos dois lados, “cortando” lentamente a chama da lamparina; - flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar perto da chama; - tomar o béquer com iogurte e introduzir a alça de platina no interior dele até tocar o iogurte; - transferir uma pequena alíquota da cultura com a alça para a lâmina e espalhar o material com movimentos circulares (esfregaço); - secar ao ar; - “cortar” lentamente a lâmina na chama da lamparina 3 vezes para que o material fique bem aderente à lâmina (fixação). A fixação é feita do lado contrário ao esfregaço bacteriano; - corar a lâmina pela Técnica de Gram (descrita anteriormente); - observar ao microscópio na objetiva de 100x com óleo de imersão. 3) Leite fermentado (tipo Yakult) - flambar rapidamente uma lâmina de microscopia nos dois lados, “cortando” lentamente a chama da lamparina; - flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar perto da chama; - tomar o béquer com Leite fermentado (tipo Yakult) e introduzir a alça de platina no interior dele até tocar o Leite fermentado (tipo Yakult); - transferir uma pequena alíquota da cultura com a alça para a lâmina e espalhar o material com movimentos circulares (esfregaço); - secar ao ar; - “cortar” lentamente a lâmina na chama da lamparina 3 vezes para que o material fique bem aderente à lâmina (fixação). A fixação é feita do lado contrário ao esfregaço bacteriano; - corar a lâmina pela Técnica de Gram (descrita anteriormente); - observar ao microscópio na objetiva de 100x com óleo de imersão.

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Resultados Desenhar e descrever as estruturas observadas nas 3 lâminas! LÂMINA 1

________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________

LÂMINA 2

________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________

LÂMINA 3

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Atividades extras Microbiologia Geral (MIG)

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Resumo (individual e manuscrito) sobre o vídeo “O mundo das bactérias” Globo Repórter - Edição do dia 18/02/2011 Parte 1 (9 min e 12 s): 1) Mulher limpa a casa três vezes por dia e passa no teste de infectologistas Parte 2 (10 min e 21 s): 1) Professora ensina forma de lavar as mãos corretamente Parte 3 (11 min e 14 s): 1) Cada um grama de terra possui 100 milhões de micro-organismos 2) Especialista explica a forma correta de guardar alimentos na geladeira Parte 4 (6 min e 43 s): 1) Beijo pode transmitir doenças, mas jovens só querem aproveitar micareta 2) Ato de soprar papinha antes de dar para bebê pode transmitir bactérias Parte 5 (8 min e 37 s): 1) Bactérias do bem imunizam crianças 2) Piscinão de Ramos recebe três mil litros de cloro por dia para limpeza TODAS AS MINIRREPORTAGENS DEVEM SER RELATADAS! PRESTE ATENÇÃO!

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Anatomia Funcional das Células Procarióticas e Eucarióticas. Apesar de sua complexidade e variedade, todas as células vivas podem ser classificadas em dois grupos: procarióticas e eucarióticas, com base em sua ultraestrutura vista ao microscópio eletrônico. Plantas e animais são inteiramente compostos de células eucarióticas. No mundo microbiano, as bactérias e as arquibactérias são procariotos. Outros microrganismos como fungos (leveduras e bolores), protozoários e algas são eucariotos. Os vírus, como elementos acelulares, não se encaixam em classificações das células vivas. Agora vamos estudar as células eucarióticas e procarióticas! Atividade em grupo: ___ alunos em cada grupo. Data de entrega: ___________ ATENÇÃO: O trabalho deve ser manuscrito! Descrever resumidamente os principais componentes das células procarióticas e das células eucarióticas. –

Células procarióticas: * Glicocálice * Flagelos * Fímbrias * Pili * Parede Celular * Membrana Plasmática * Citoplasma * Área Nuclear * Ribossomos * Inclusões * Endosporos

–

Células eucarióticas * Flagelos * Cílios * Parede Celular * Glicocálice * Membrana Plasmática * Citoplasma * Núcleo * Retículo endoplasmático * Ribossomos * Complexo de Golgi * Lisossomos * Vacúolos * Mitocôndrias * Cloroplastos * Peroxissomos * Centrossomos

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Microbiologia Geral (MIG) Professora: Graciele Viccini Isaka Assista ao Filme “Osmosis Jones – Uma aventura radical pelo corpo humano” e responda as perguntas. Manuscrito e individual – entrega dia __________). 1) Identifiquem e caracterizem os seguintes personagens (quem são e qual a função – mínimo 3 linhas para cada um): a) Frank: b) Ozzy: c) Drix: d) Thrax: e) Prefeito Catarroso: 2) Cite 3 erros e/ou maus hábitos de Frank referentes à higiene pessoal e hábitos alimentares que contribuíram para que ele ficasse doente. 3) Explique como Frank poderia corrigir os erros que você citou. 4) De que forma os mecanismos e recursos de que nosso corpo é dotado, reagem a entrada de microrganismos estranhos em nosso organismo? 5) De que forma os mecanismos e recursos de que nosso corpo é dotado, reagem a medicamentos que colocamos em nosso organismo? 6) Qual a relação entre o filme e a Unidade Curricular de Microbiologia Geral? 7) Que conhecimentos você adquiriu assistindo ao filme que podem ser úteis para a sua vida?

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Microbiologia Geral (MIG) - LABORATÓRIO INFORMÁTICA Aulas Interativas de Microbiologia – Instituto Butantan 1) Acesse http://www.butantan.gov.br/home/museu_microbiologia.php# Clique em “Atividades Educativas”. Clique em “Aulas Interativas”. Assista as Aulas 1 e 2 e responda as questões referentes a cada uma delas em uma folha! Atividade individual! Ao final da aula, entregue a folha ao professor (a) responsável. Links diretos para cada aula: http://www.butantan.gov.br/home/micro_cd_aula1.php http://www.butantan.gov.br/home/micro_cd_aula2.php Questões sobre a Aula 1: Diversidade Microbiológica. a) O que a microbiologia estuda? b) Além de causar doenças, para que servem os microrganismos? c) Quais são os microrganismos celulares? d) Quais são os microrganismos acelulares? e) Os microrganismos celulares podem ser divididos em 2 grupos. Quais o nome desses grupos? Que microrganismos compõem cada um deles? f) Cite 3 diferenças entre células procarióticas e células eucarióticas. g) Desenhe e nomeie os diferentes tipos morfológicos de bactérias. h) Quais tipos de reprodução as bactérias podem fazer? i) Quais os 4 grupos de protozoários? Explique cada um deles! j) Os fungos são conhecidos por diferentes nomes. Quais são esses nomes? k) Como um fungo se reproduz e se alimenta? l) O que são as hifas? m) O que são as leveduras? n) Como as leveduras se reproduzem? o) O que são vírus? p) Se os vírus são acelulares, como eles fazem para se reproduzir? q) Qual a composição básica de um vírus? r) Quais são as duas maneiras principais de replicação viral? Questões sobre a Aula 2: Como visualizar e medir os microrganismos? a) Qual instrumento precisamos utilizar para visualizar os microrganismos? b) Descreva a composição e o funcionamento do microscópio de luz. c) Se o aumento máximo do microscópio de luz não for suficiente para ver um microrganismo, qual alternativa podemos utilizar? d) Qual é a unidade métrica utilizada para medir bactérias? E vírus? Caso tenha tempo, assista a Aula 3: Vírus da AIDS e Vírus da Gripe, e a Aula 4: Vacinas e Soros: qual a diferença? http://www.butantan.gov.br/home/micro_cd_aula3.php http://www.butantan.gov.br/home/micro_cd_aula4.php

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